Name: Hücre Kültürü RNA sentezi, İşleme ve Çürüme Yüksek Çözünürlük Gen İfadesi Profil için Yeni Transkripsiyonu RNA Metabolik Etiketleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-08T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: Öğrenin, 4-tiyouridin ile metabolik etiketleme kullanarak ökaryotik hücre kültürlerinde RNA sentezi, işlenmesi ve çürümesini ölçme yöntemini. Bu teknik, gen ifadesi değişikliklerini on kat daha hassas tespit eder.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz yazının dikkatli bir okuma için Amie Regan teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma LD ve CCF için DFG hibe FR2938/1-1 için NGFN Artı hibe # 01GS0801, MRC dostluk hibe G1002523 ve NHSBT hibe WP11-05 tarafından desteklenmiştir

1. 4-thiouridine ile Metabolik Etiketleme Deney düzeneği / program ayrıntılı bir plan yapın, hücre kültürü için 4SU eklemek için ne zaman ve örnekleri hasat zaman örneğin. Her durumda arasında en az 5 dakika boyunca Planı. Bir seferde sadece bir durumun hücre tedavisi. Max tutun. 3 - belirli bir zamanda 5 yemekleri. Sıcaklık ve CO2 düzeylerindeki değişiklikler en aza indirmek için mümkün olduğunca çabuk hücreleri tutun. Bu hücresel proteinlere 4SU-etiketli RNA çapraz neden olabilir 4SU eklendikten sonra parlak ışık hücreleri maruz bırakmayın. Etiketleme başlangıcı <ol><li> Çözülme 4-thiouridine (4SU) sadece steril bir Falcon tüp içine her bir durum için 4SU kullanımı ve pipet gerekli miktarda önce. </li><li> Yemekler kapalı hücre kültür ortamı gerekli miktarda (10 cm tabak başına 5 ml) alın ve 4SU içeren Falcon tüp eklemek ve iyice karıştırın. Çıkarın ve yemekleri kalan orta atın. </li> &lt;li&gt; yemekleri 4SU içeren orta geri uygulayın. </li></ol> Etiketleme sonu <ol start="4"><li> Hücrelerinden hücre kültürü ortamı çıkarın. Her plaka için Trizol 5 ml ilave edilir. Çok sayıda zaman noktasında ya da koşullar da dahil olmak üzere karmaşık bir deney için, bu adım en çok iki kişi, orta, Trizol ekleme ve lizat hasat diğer bir kaldırarak yapılır. </li><li> Tam bir hücre parçalama, oda sıcaklığında 5 dakika süreyle inkübe edilir. </li><li> Eklendi Trizol ile dikkatli bir şekilde plaka durulama bir 10 ml pipet kullanın. Bu tam hücre parçalama ve örnek kurtarma yardımcı olur. Cilt veya gözlerle temas alırken Trizol son derece tehlikeli olduğu gibi dikkatli olun! Eldeki fenol yanıklar (örneğin polietilen glikol 300 veya endüstriyel metil alkol (70:30) 400) için panzehir var. Polipropilen tüplere örnekleri aktarın. Standart Falcon tüpler) bu yüksek g kuvvetleri karşı değil lütfen unutmayın. Örnekler I Toplam RNA kadar en az bir ay süreyle -20 ° C&#39;de saklanabilirs hazırlanmıştır. </li></ol> 2. Modifiye Trizol Protokolü kullanarak RNA Hazırlık <ol><li> 1 ml kloroform (ml Trizol başına 0.2 ml) ekleyin ve 15 saniye boyunca kuvvetlice çalkalanır. 3 dakika - 2 saat oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> 4 ° C&#39;de 15 dakika 13,000 x g&#39;de santrifüjleyin ° C </li><li> Yeni bir 15 ml polipropilen tüpe sulu üst faz (RNA ihtiva eden) aktarın. </li><li> RNA ekleme ½ Çöktürme tamponu ve izopropanol hem de reaksiyon hacmi (3 ml süpernatant, örneğin, 1.5 ml RNA Çöktürme tamponu ve 1.5 ml izopropanol ekleme). </li><li> İyice karıştırın. 10 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> 4, 10 dakika boyunca 13.000 x g&#39;de santrifüje ° C Süpernatant atın. </li><li> Kısaca aşağı doğru döndürün (5000 × g 30 saniye) ve 200 ul pipet ile artık izopropanol çıkarın. </li><li> % 75 etanol eşit hacim eklemek ve topak ayrılıncaya kadar tüp çalkalanır. Geride kalan bu kadar çok küçük parçalar halinde o kırılma önlemek yapabilir kaldırmal etanol zor. </li><li> 4, 10 dakika boyunca 13.000 x g&#39;de santrifüje ° C Süpernatant atın. </li><li> Kısaca RNA aşağı Spin ve 200 ul pipet ile kalan etanol çıkarın. 20 ul pipet ile kalan etanol adım ve çıkarın tekrarlayın. Bu iki adım sonra, pelet başka bir kurutma işlemi ifa edilmelidir. </li><li> 100 mg beklenen RNA verim başına H 2 O 100 ul ekleyin ve 5 aşağı yukarı pipetleme ve ile iyice karıştırın - 6 kez RNA çözme yardımcı olmak için. </li><li> Çözülür ve 65 ısıtılarak denatüre RNA ° C&#39;de 10 dakika (çalkalama) ve hemen buz üzerine yerleştirin. </li><li> Üreticinin yönergeleri izleyerek, bir NanoDrop spektrofotometre kullanılarak 260 nm dalga boyunda konsantrasyon RNA ölçün. Bu RNA, en az bir ay boyunca -80 ° C&#39;de muhafaza edilebilir. </li></ol> 3. Yeni Transkripsiyonu RNA tiol özgü biyotinilasyon <ol><li> 60 ile başlayın - toplam hücresel RNA 80 mikrogram. </li><li> Reaksiyon etiketleme oluşturmaktadır. Aşağıdaki Pipetsipariş (başına mikrogram RNA): <ol class="lalpha"><li> 1 ul 10x biyotinilasyon Tampon </li><li> 7 ul RNA (nükleaz içermeyen H 2 O seyreltilmiş 1 mg RNA içeren) </li><li> 2 ul Biotin-HPDP (1 mg / ml DMF) </li></ol></li></ol> Her zaman biotin-HPDP son ekleyin ve pipetleme hemen karıştırın. Biyotin çökeltiler durumda, DMF içeriği% 40 arasında bir konsantrasyona kadar arttırılabilir. <ol start="3"><li> Rotasyonu ile 1.5 saat boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> Kloroform eşit hacimde ekleyin. Şiddetle karıştırın. Aşamalarını başlar ve kabarcıklar yok başlayana kadar 3 dakika - 2 inkübe edin. </li><li> 4 ° C de 5 dakika için 20,000 x g&#39;de santrifüjleyin Dikkatli bir şekilde yeni bir tüp içine, üst sulu faz transfer. </li><li> Bir kez adımları 3.4 ve 3.5 tekrarlayın. Bu RNA kaybını azaltmak için 2 ml Faz Kilidi Jel Ağır tüplerde bu adımı gerçekleştirmek isteyebilirsiniz. </li><li> RNA ayrılması: eklenti 1/10 5 M NaCI ve hacmi eşit hacimdeSu fazı, izopropanol. </li><li> 4 ° C&#39;de 20 dakika boyunca 20,000 x g&#39;de santrifüjleyin Süpernatant atın. </li><li> Supernatant 10 dakika 4 ° C&#39;de 20,000 azından% 75 etanol, santrifüj eşit bir hacmi x g ekleyin. </li><li> Kısaca Spin ve 200 ul pipet ile artık etanol çıkarın. </li><li> Kısaca Spin ve 20 ul pipet ile artık etanol çıkarın. </li><li> RNA kurumasına izin vermeyin. 50 yeniden askıya - 100 ul H 2 O (1 mcg giriş RNA başına ~ 1 ul). 6 kez - 5 yukarı ve aşağı pipetleme ile iyice karıştırın. </li><li> RNA bozulma dışlamak için electrophoretical analizi ile RNA kalitesini kontrol edin. </li></ol> 4. 4SU-Esas nokta Blot Analizi (İsteğe bağlı) 4SU ​​birleşme kolayca biyotinile edilmiş RNA dot blot analizi ile tespit edilebilir. Bu sorun giderme ve biotinlenmiş DNA oligo kontrole göre 4SU dahil oranlarının tahmin sağlayan isteğe bağlı bir adımdır. Bu tahlil için, biz rAdım 3.2 4SU-etiketli RNA biyotinilasyon için yerine biotin-HPDP bir iyodoasetil-biotin kullanarak ecommend. 4SU-RNA geri dönüşü olmayan bir biyotinilasyon ile sonuçlanır. Bu nedenle, kolon dayalı yöntemler (örneğin, RNeasy) biyotinile edilmiş RNA çok küçük miktarlarda (örneğin, 5 mg) geri kazanılması için kullanılabilir. RNA, bu tahlil için uygun olan biotin-HPDP biotinli olsa da, elde edilen sinyali (Şekil 3) ve zayıf sinyal-gürültü oranı daha az tercih edilir. <ol><li> Bölüm 1 ve 2 de tarif edildiği gibi toplam hücresel RNA 4SU-etiketleme ve izolasyonu için protokol takip edin. </li><li> Iyodoasetil-biotin ile biotin-HPDP yerine bölümünde 3 açıklanan ve tamamen aşırı iyodoasetil-biotin artıkları çıkarmak için iki kloroform ekstraksiyon gerçekleştirmek olarak Biotinylate RNA 4SU-etiketli. </li><li> Açıklanan ya da olgu RNA az miktarda ((örneğin RNeasy) bir sütun tabanlı yaklaşım kullanarak olarak izopropanol / etanol yağış biyotinlenmiş RNA Kurtar &lt;10 mg) Kullanılır. </li><li> 10 dakika süre ile sallanan nükleaz içermeyen su içinde Zeta membran inkübe edin. </li><li> Nükleaz içermeyen su dışında zar atın ve iki temiz kağıt havlu ve sıkıca basarak arasında membran yerleştirerek aşırı sıvı çıkarın. Hava ile kurutma 5 dakika boyunca zarın güzel noktalar ile sonuçlanacaktır. </li><li> Her numune için, buz gibi soğuk nokta benek bağlama tamponu (10 mM NaOH, 1 mM EDTA) kullanılarak 200 ng / ul RNA 20 ul hazırlar. Pipetleme Zeta zara bu seyreltme 5 ul (RNA yani 1 ug) ve aynı zamanda takip eden üç 10-kat seyreltme (örneğin, sırasıyla 100, 10 ve 1 ng RNA) uygulanır. Pipet uçları boş bir raf ile pipetleme eşit olarak dağıtılmış boşluk sağlamak için kullanılabilir. Seçenek olarak ise, üreticinin talimatlarına uygun olarak bir nokta lekesi cihazı kullanın. </li><li> Olumlu bir devam olarak 20 ng / ul 20 ug / ml (yani, 100-0,1 ng oligo), değişen konsantrasyonlarda biyotin-etiketli DNA oligo 5 ul uygulayınpipetleme membran rol. Negatif kontrol olarak biotinlenmiş, 4SU-naif örnek kullanın. </li><li> Açık havada kurumaya 5 dakika boyunca membran. </li><li> Sallama ile 40 ml bloke tamponu içinde 30 dakika boyunca zarın inkübe edin. </li><li> 15 dakika (5 ml PBS + 5 ml% 20 SDS + 10 ul streptavidin-yaban turpu peroksidaz) için 1:1,000, streptavidin-yaban turbu peroksidazı 10 mL &#39;si ile inkübe membran </li><li> 5 dakika boyunca 40 ml PBS +% 10 SDS (20 mi PBS + 20 ml% 20 SDS) içinde iki kez membran yıkayın. </li><li> 40 ml PBS içerisinde iki kez membran yıkayın 5 dakika boyunca +% 1 SDS (38 ml PBS + 2 ml% 20 SDS). </li><li> 40 ml PBS içerisinde iki kez membran yıkayın 5 dakika boyunca +% 0.1 SDS (40 mL PBS + 200 ul% 20 SDS). </li><li> Iki temiz kağıt havlu arasında membran yerleştirerek ve sıkıca bastırarak aşırı sıvı çıkarın. </li><li> Üreticinin talimatlarına göre ECL kullanarak membrana bağlı HRP gözünüzde canlandırın. </li><li> Plastik folyo / torbaya membran yerleştirin, hava kabarcıkları ve karanlıkta 2 dakika süreyle inkübe edin. </li><li> Membran maruz1 Film - 5 dk. </li></ol> 5. Streptavidin kaplı Manyetik Boncuk kullanarak Etiketli ve Etiketsiz RNA ayrılması <ol><li> Isı ° C bir su banyosunda 65 (örnek başına 3 ml) bir yıkama tamponu. </li><li> Nükleaz içermeyen H 2 O taze 100 mM ditiyotreitol (DTT) hazırlayın Ultra-ince terazi gözü üzerine yerleştirildi, temiz bir 50 ml Falcon tüpüne DTT toz, 30 mg - 15 şişeden bunu. Nükleaz içermeyen H 2 O gerekli miktarda tartılır ve ekleyin </li><li> Isı ° C 10 denatüre dk ve buz üzerinde hemen yer 65 RNA örnekleri biotinlenmiş. </li><li> Yer manyetik stand içine sütun μMacs. Biz bir anda birden fazla 12 örnek (- 8 örnekleri uygun olan 6) işlemek için değil tavsiye. </li><li> 1 ml oda sıcaklığında tampon yıkama ile ön dengeye Miltenyi sütunlar. Bu yaklaşık 15 dakika sürer. </li><li> Bu arada, 50 streptavidin boncuk 100 ul - biyotinile edilmiş RNA 100 ul. Rotasyonu ile 15 dakika süreyle oda sıcaklığında inkübe edin. </li> &lt;<html> li&gt; sütunları herhangi artık boşaltma başlatılan değilse bu hafifçe bir eldivenli parmak ile sütunun üstüne basarak kolaylaştırılabilir. Bir kez akışını sütunları kolayca tahliye başlamıştır. </li><li> Sütunlara RNA / boncuk uygulayın. Akış-size etiketsiz RNA fraksiyonu (bkz. bölüm 7) kurtarmak istediğiniz sürece atın. </li><li> 0.9 ml 65 ° C yıkama tampon maddesi (65 ° C&#39;de tampon pipetleme 1 ml&#39;lik pipet uçları shrink). Ile üç kez yıkayın </li><li> 0.9 ml oda sıcaklığında yıkama tamponu ile üç kez yıkayın. </li><li> Pipet 700 ul Tampon yeni 2 ml tüpler içine RLT (RNeasy MinElute Temizleme Kiti, Qiagen) ve sütunları altına koyun. </li><li> Sütununa 100 mM DTT, 100 ul ekleyerek RLT tampon içine yeni kopyalanan RNA Zehir. </li><li> 100 mM DTT başka bir 100 ul ekleyerek sonra aynı tüp içine ikinci bir elüsyon turda 3 dk gerçekleştirin. </li></ol> 6. Yeni kopyalanan RNA geri kazanımı ontent &quot;&gt; üreticinin talimatları izleyerek RNeasy MinElute Temizleme (Qiagen) protokolü ile devam edin. 25 ul nükleaz içermeyen H 2 O ölçün RNA konsantrasyonlarda Zehir bir Nanodrop Spektrofotometre kullanarak. göndermeden önce RNA çözülme ve yeniden dondurmak için ihtiyaç önlemek için bir yüksek verimli test için, hemen yeni transkripsiyonu RNA sonra cDNA hazırlanıyor tavsiye arındırılır. üreticinin talimatları cDNA sentezi için 20 ul cDNA sentezi karışımı yeni transkripsiyonu RNA 2.5 ul kullanın. 1 ile Mah-PCR kontrolleri gerçekleştirin : cDNA karışımı 10 dilüsyonları -80 ° C&#39;de saklayın RNA. 7. Etiketsiz, Sınırsız RNA (İsteğe bağlı) geri kazanımı Durumda ilişkisiz RNA geri gereken, akış yoluyla (sütunlara RNA-streptavidin boncuk çözüm ekledikten sonra) ve sonraki yağış için ilk yıkama toplamak ve birleştirmek. Genellikle thi olarak ilişkisiz RNA sadece 50% çöktürmek için yeterlidirin başlangıç ​​malzemesinin&gt;% 80 içerir. <ol><li> Izopropanol eşit hacimde (tuz yıkama tamponu önce, 1 M NaCl içeren olarak ilave edilmesi gerekir). </li><li> 4 ° C&#39;de 20 dakika boyunca 20,000 x g&#39;de santrifüjleyin Süpernatant atın. </li><li> Supernatant 10 dakika 4 ° C&#39;de 20,000 azından% 75 etanol, santrifüj eşit bir hacmi x g ekleyin. </li><li> Kısaca Spin ve 200 ul pipet ile artık etanol çıkarın. </li><li> Kısaca Spin ve 20 ul pipet ile artık etanol çıkarın. </li><li> RNA kurumasına izin vermeyin. 100 ul H 2 O içinde süspanse 6 kez - 5 yukarı ve aşağı pipetleme ile iyice karıştırın. Çalkalama ile 10 dakika boyunca 65 ° C&#39;de inkübe edilir ve buz ile doğrudan transfer. </li><li> RNA bozulma dışlamak için electrophoretical analizi ile RNA kalitesini kontrol edin. </li></ol>

<ol><li>Brown, P. O., Botstein, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+new+world+of+the+genome+with+DNA+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Exploring the new world of the genome with DNA microarrays.</a> Nature Genetics. 21, 33-37 (1999).</li>
<li>Mortazavi, A., Williams, B. A., Mccue, K., Schaeffer, L., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+and+quantifying+mammalian+transcriptomes+by+RNA-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq.</a> Nature Methods. 5, 621-628 (2008).</li>
<li>Nagalakshmi, U., Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcriptional+landscape+of+the+yeast+genome+defined+by+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The transcriptional landscape of the yeast genome defined by RNA sequencing.</a> Science. 320, 1344-1349 (2008).</li>
<li>Wilhelm, B. T., Marguerat, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+repertoire+of+a+eukaryotic+transcriptome+surveyed+at+single-nucleotide+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dynamic repertoire of a eukaryotic transcriptome surveyed at single-nucleotide resolution.</a> Nature. 453, 1239-U1239 (2008).</li>
<li>Dölken, L., Ruzsics, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+gene+expression+profiling+for+simultaneous+kinetic+parameter+analysis+of+RNA+synthesis+and+decay%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">High-resolution gene expression profiling for simultaneous kinetic parameter analysis of RNA synthesis and decay.</a> RNA. 14, 1959-1972 (2008).</li>
<li>Yang, E., van Nimwegen, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decay+rates+of+human+mRNAs%3A+correlation+with+functional+characteristics+and+sequence+attributes%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Decay rates of human mRNAs: correlation with functional characteristics and sequence attributes.</a> Genome Res. 13, 1863-1872 (2003).</li>
<li>Friedel, C. C., Dölken, L., Ruzsics, Z., Koszinowski, U. H., Zimmer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserved+principles+of+mammalian+transcriptional+regulation+revealed+by+RNA+half-life%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Conserved principles of mammalian transcriptional regulation revealed by RNA half-life.</a> Nucleic Acids Res. 37, e115(2009).</li>
<li>Nilsen, T. W., Graveley, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+of+the+eukaryotic+proteome+by+alternative+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Expansion of the eukaryotic proteome by alternative splicing.</a> Nature. 463, 457-463 (2010).</li>
<li>Windhager, L., Bonfert, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra+short+and+progressive+4sU-tagging+reveals+key+characteristics+of+RNA+processing+at+nucleotide+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Ultra short and progressive 4sU-tagging reveals key characteristics of RNA processing at nucleotide resolution.</a> Genome Res. , (2012).</li>
<li>Melvin, W. T., Milne, H. B., Slater, A. A., Allen, H. J., Keir, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporation+of+6-thioguanosine+and+4-thiouridine+into+RNA.+Application+to+isolation+of+newly+synthesised+RNA+by+affinity+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Incorporation of 6-thioguanosine and 4-thiouridine into RNA. Application to isolation of newly synthesised RNA by affinity chromatography.</a> Eur. J Biochem. 92, 373-379 (1978).</li>
<li>Cleary, M. D., Meiering, C. D., Jan, E., Guymon, R., Boothroyd, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosynthetic+labeling+of+RNA+with+uracil+phosphoribosyltransferase+allows+cell-specific+microarray+analysis+of+mRNA+synthesis+and+decay%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Biosynthetic labeling of RNA with uracil phosphoribosyltransferase allows cell-specific microarray analysis of mRNA synthesis and decay.</a> Nature Biotechnology. 23, 232-237 (2005).</li>
<li>Kenzelmann, M., Maertens, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray+analysis+of+newly+synthesized+RNA+in+cells+and+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Microarray analysis of newly synthesized RNA in cells and animals.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 6164-6169 (2007).</li>
<li>Schwanhäusser, B., Busse, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+quantification+of+mammalian+gene+expression+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Global quantification of mammalian gene expression control.</a> Nature. 473, 337-342 (2011).</li>
<li>Rabani, M., Levin, J. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+labeling+of+RNA+uncovers+principles+of+RNA+production+and+degradation+dynamics+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Metabolic labeling of RNA uncovers principles of RNA production and degradation dynamics in mammalian cells.</a> Nat. Biotechnol. , (2011).</li>
<li>Miller, M. R., Robinson, K. J., Cleary, M. D., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TU-tagging%3A+cell+type-specific+RNA+isolation+from+intact+complex+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">TU-tagging: cell type-specific RNA isolation from intact complex tissues.</a> Nat. Methods. 6, 439-441 (2009).</li>
<li>Miller, C., Schwalb, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+transcriptome+analysis+measures+rates+of+mRNA+synthesis+and+decay+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Syst.+Biol%22%5BJournal%5D)">Dynamic transcriptome analysis measures rates of mRNA synthesis and decay in yeast.</a> Mol. Syst. Biol. 7, 458(2011).</li>
<li>Weintz, G., Olsen, J. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+phosphoproteome+of+toll-like+receptor-activated+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Syst.+Biol%22%5BJournal%5D)">The phosphoproteome of toll-like receptor-activated macrophages.</a> Mol. Syst. Biol. 6, 371(2010).</li>
<li>Lipsett, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+isolation+of+4-thiouridylic+acid+from+the+soluble+ribonucleic+acid+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The isolation of 4-thiouridylic acid from the soluble ribonucleic acid of Escherichia coli.</a> Journal of Biological Chemistry. 240, 3975-3978 (1965).</li>
<li>Marcinowski, L., Liedschreiber, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+Transcriptional+Profiling+of+Cellular+and+Viral+Gene+Expression+during+Lytic+Cytomegalovirus+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Real-time Transcriptional Profiling of Cellular and Viral Gene Expression during Lytic Cytomegalovirus Infection.</a> PLoS Pathog. 8, e1002908(2012).</li>
<li>Chomczynski, P., Mackey, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+technical+reports.+Modification+of+the+TRI+reagent+procedure+for+isolation+of+RNA+from+polysaccharide-+and+proteoglycan-rich+sources%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Short technical reports. Modification of the TRI reagent procedure for isolation of RNA from polysaccharide- and proteoglycan-rich sources.</a> Biotechniques. 19, 942-945 (1995).</li>
<li>Friedel, C. C., Dölken, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+tagging+and+purification+of+nascent+RNA%3A+implications+for+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biosyst%22%5BJournal%5D)">Metabolic tagging and purification of nascent RNA: implications for transcriptomics.</a> Mol. Biosyst. 5, 1271-1278 (2009).</li>
<li>Friedel, C. C., Kaufmann, S., Dölken, L., Zimmer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HALO+-+A+Java+framework+for+precise+transcript+half-life+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">HALO - A Java framework for precise transcript half-life determination.</a> Bioinformatics. , (2010).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.

Yeni transkripsiyonu RNA Metabolik etiketleme ölçüde ilgi biyolojik soruya cevap daha uygun şablonlar sunarak mikroarrayler ve RNA-seq gibi yüksek verimli teknolojilerin gücünü artırır. İşbu Protokol kapsamlı optimizasyon yapıldı. Bu yeni transkripsiyonu RNA&gt; 1000 kat zenginleştirme sağlar ve yüksek tekrarlanabilir sonuçlar sağlar. Yeni transkripsiyonu RNA sadece 4SU hücrelerin maruz kalma döneminde gerçek zamanlı transkripsiyonel aktivitesini tasvir gibi bir 4SU-etiketleme deney deneysel...

Gen ekspresyon profili hücresel süreçleri ve ilgili karmaşık bir etkileşim ağı incelemek için kullanılan önemli bir araçtır. MRNA bolluk ile ilgili çalışmalar genellikle altta yatan moleküler mekanizmaları, temel anlayışlar elde etmek için tercih edilen yöntem olmuştur. Tam transcriptome mikroarrayler 1 ve RNA (RNA-seq) 2-4 daha yakın, yeni nesil sıralama gelişimi bu yaklaşım hızlandırdı. Bu teknolojilerin hücresel gen ifadesinin karmaşıklığı anlayışımızı devrim olsa da, onların şablon örnek doğal özelliklerine, yani toplam hücresel RNA nedeniyle önemli sınırlamalar karşı karşıya. RNA düzeylerinde İlk olarak, kısa vadeli değişiklikler transkripsiyon oranlarındaki değişimler maç, ancak RNA ilgili transkript yarı ömrü üzerinde doğal olarak bağımlı değildir. Bir transkripsiyon faktörü için kısa süreli bir transkript, örneğin kodlama beş kat indüksiyon, toplam RNA kolayca tespit olacak isebir saat içinde, bir metabolik enzim için uzun ömürlü transkript, örneğin kodlama aynı indüksiyon, neredeyse görünmez kalacaktır. Buna ek olarak, hatta bir kapatma (&gt; 1.000 kat yük atma) bir RNA beş saatlik yarılanma ömrü ile ortalama bir genin transkripsiyon oranı tam sadece sadece iki yönlü tarafından azaltmak için, toplam RNA düzeyleri için beş saat sürer . Bu nedenle, toplam RNA analizi düzenleme fonksiyonları 5 ile transkripsiyon faktörleri ve genler için kodlamak birçoğu kısa ömürlü transkript kadar düzenleme tespiti, yanadır. Ayrıca, düzenlemenin gerçek kinetik kaskad gizlenmiş ve birincil sinyal olaylar ikincil ayırt edilemez. Her ikisi de, sırayla, alt biyoinformatik analizler önemli sapmayla neden olabilir. İkinci olarak, toplam RNA düzeylerinde değişiklikler RNA sentezi ya da çürüme değişikliklere mal edilemez. Ikinci ölçümleri transcripti engelleme hücre invaziv yaklaşımlar, örneğin gerektiriraktinomisin D 6, ve zaman içinde devam eden RNA çürüme genişletilmiş izleme kullanarak. 5 memeli hücrelerinde ortalama mRNA yarı ömrü ile - 10 saat 5,7, en genlerin mRNA düzeyleri sadece iki kat transkripsiyonel tutuklama birkaç saat sonra daha az azalmıştır olacaktır. Bunlar, çok küçük farklar temel matematiksel denklem üslü doğası nedeniyle hücresel genlerin çoğu için mRNA&#39;nın yarı ömür kabaca kesin ölçümler ile sonuçlanabilir. Son olarak, süre toplam hücresel RNA RNA-seq genlerimizin yarısını yaklaşık alternatif yapıştırma olayları 8, temel kinetik hem de tam olarak anlaşılamamıştır kalır RNA işleme doku ve bağlama özgü düzenleme rehberlik dinamik mekanizmaları tabi olduğunu ortaya koydu. Buna ek olarak, RNA, özellikle katkı kodlayıcı olmayan RNA&#39;lar için, belirlenecek kalır, diferansiyel gen ekspresyonu için işlem. Toplamda, bu sınırlamalar için önemli engeller temsilaltta yatan moleküler mekanizmaların biyoinformatik kinetik modelleme. Yakın zamanda bu sorunların 5,7,9 üstesinden gelmek için, olarak adlandırılan yüksek çözünürlüklü gen ekspresyon profili, bir yaklaşım geliştirdi. Bu, 4-thiouridine (4SU-etiketleme), doğal olarak oluşan üridin türev kullanarak yeni transkripsiyonu RNA metabolik etiketleme dayalı ve hücre büyümesi ve gen ekspresyon minimal girişim (bkz. Şekil 1) 5 ile yeni transkripsiyonu transkript doğrudan erişim sağlar 10-12. Hızla alımı, 4SU-trifosfat için fosforilasyon, ve yeni transkripsiyonu RNA içine dahil edilmesi 4SU sonuçlarına ökaryot hücrelerin maruz kalma. Toplam hücresel RNA izole edildikten sonra, 4SU-işaretli RNA fraksiyonu tiol-biotin ve özellikle yeni kopyalanan RNA arasında bir disülfid bağı oluşturma biyotinile olup. &#39;Toplam hücresel RNA&#39; ardından nicel (&#39;yeni transkripsiyonu&#39;) ve etiketsiz (&#39;öncesi existin etiketli ayrılabilirStreptavidin-kaplı manyetik boncuklar kullanılarak yüksek saflıkta G &#39;) RNA dır. Son olarak, etiketli RNA sadece disülfid bağ yarma bir indirgeyici madde (örneğin, ditiyotreitol) eklenmesi ve Tanelerden yeni kopyalanan RNA bırakarak Tanelerden geri kazanılır. Yeni transkripsiyonu RNA 4SU maruz kalma süre boyunca her genin transkripsiyonel aktivitesini gösteriyor. Dakika ölçeğinde 4SU-etiketleme böylece ökaryotik gen ifadesinin bir anlık görüntü ve aşağı akım biyoinformatik analizleri (promotor analizi) için ideal bir şablon sağlar. Kararlı durum koşulları kabul edilebilir durumda, oranları yeni transkripsiyonu / toplam, yeni transkripsiyonu / etiketsiz ve etiketsiz / RNA hassas RNA yarı ömrü 7,13 için non-invaziv erişim sağlar. Buna ek olarak, 4SU-etiketleme az 5 dakika (5 dakika 4SU-RNA) sonra arıtılmış bu yeni transkripsiyonu RNA dikkat etmek önemlidir 15 ve 60 dakika 4SU-RNA daha gençtir.RNA-seq ile birlikte tek bir deneysel ortamda 4SU-etiketleme ultra-kısa ve giderek daha uzun hem yaparken, RNA işleme kinetik nükleotid çözünürlükte 9 ortaya çıkar. Son olarak, sayısal modelleme ile birlikte yeni transkripsiyonu ve toplam RNA zaman tabii ki analiz RNA sentezi ve çürüme 14 entegre bir analiz sağlar. Sonuç olarak, bu yaklaşım, ökaryotik hücrelerde RNA sentezi, işleme ve bozulmanın dinamiklerinin doğrudan analizi sağlar. Bu memeliler, böcekler (Drosophila), amfibi (Xenopus), ve maya 5,15,16 dahil olmak üzere tüm büyük model organizmalarda geçerlidir. Bu mikroarray analizi 5,17, RNA-seq 9,13,14 ile doğrudan uyumludur, ve in vivo 12,15 uygulanabilir. Burada, detaylı metodoloji, etiket izole ve kültürlü memeli hücrelerinde yeni transkripsiyonu RNA arındırmak için. Ayrıca, potansiyometre olarakal sorunlar ve tuzaklar tartışılmıştır.

<table><tbody><tr><td>4-tiouridin</td><td>Karbosynth</td><td>T4509</td><td>Steril H2O'da 50 mM stok hazırlayın, -20 ° C'de saklayın; 50-500 &mu'luk alikotlarda C; l, kullanılmayan reaktifi atın, tekrar dondurmayın.</td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596026 (100 ml), 15596018 (200 ml)</td><td><güçlü>UYARI - AŞINDIRICI ve SAĞLIĞA TEHLİKELİ !</güçlü> Fenol panzehirine (PEG-Metanol) anında erişim sağlayın; 4 ° C'de saklayın.</td></tr><tr><td>Kloroform</td><td>Sigma</td><td>372978</td><td><güçlü>UYARI - SAĞLIĞA TEHLİKELİ</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Sigma</td><td>650447</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum sitrat, nükleaz içermeyen</td><td>Sigma</td><td>C8532</td><td>Nükleaz içermeyen su kullanarak 1,6 M stok çözeltisi hazırlayın.</td></tr><tr><td>5M nükleaz içermeyen NaCl</td><td>Sigma</td><td>71386</td><td>Stok çözeltisi Nükleaz</td></tr><tr><td>içermeyen H2O</td><td>Sigma</td><td>W4502</td><td>Nükleaz içermeyen tüplerde 1 ml alikot yapın.</td></tr><tr><td>RNA çökeltme tamponu</td><td></td><td></td><td>1.2 M NaCl, nükleaz içermeyen suda 0.8 M sodyum sitrat. Kesinlikle nükleaz içermeyen koşullar altında önceden hazırlanın. Oda sıcaklığında 50 ml'lik şahin tüplerinde saklayınız.</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma</td><td>459844</td><td>% 80 etanol hazırlamak için nükleaz içermeyen su ile kullanın, -20 ° C'de saklayın.</td></tr><tr><td>1 M nükleaz içermeyen Tris Cl, pH 7.5</td><td>Lonza</td><td>51237</td><td>Stok çözeltisi</td></tr><tr><td>500 mM nükleaz içermeyen EDTA, pH 8.0</td><td>Invitrogen</td><td>15575-020</td><td>Stok çözeltisi</td></tr><tr><td>10x Biyotinilasyon Tamponu (BB)</td><td></td><td></td> <td>100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA nükleaz içermeyen suda, 1 ml'lik alikotlar yapın.</td></tr><tr><td>Dimetilformamid (DMF)</td><td>Sigma</td><td>D4551</td><td></td></tr><tr><td>EZ-Link biotin-HPDP</td><td>Pierce</td><td>21341</td><td>50 mg biotin-HPDP'yi 50 ml DMF'de çözerek 1 mg/ml stok çözeltisi hazırlayın. Nazik ısınma çözünürlüğü artırır. 4 & derecede saklayın; 1 ml'lik alikotlarda C.</td></tr><tr><td>Faz Kilit Jel Ağır tüpler 2.0 ml</td><td>Eppendorf</td><td>0032 005.152</td><td>Kloroform ekstraksiyon aşaması için isteğe bağlı.</td></tr><tr><td>Zeta membran</td><td>BIORAD</td><td>162-0153</td><td></td></tr><tr><td>10x Nokta leke bağlama tamponu</td><td></td><td></td><td>100 mM NaOH, 10 mM EDTA</td></tr><tr><td>Biotin-oligo</td><td></td><td></td><td>5'-biotin, 25 nükleotid, herhangi bir dizi</td></tr><tr><td>Sodyum dodesil sülfat</td><td>Fisher</td><td>BPE9738</td><td>100 ml% 20 stok çözeltisi için, 80 ml PBS pH 7-8'e 20 g SDS ekleyin ve hacmi 100 ml'ye ayarlayın. Tüm yüksek yüzdeli SDS çözeltilerini 20 ° C'nin üzerinde tutun. Ilık çözeltiler hafifçe SDS çökelmelidir.</td></tr><tr><td>EZ-Link İyodoasetil-LC-Biotin</td><td>Pierce</td><td>21333</td><td>50 mg iyodoasetil-biotini 50 ml DMF'de çözerek 1 mg/ml stok çözeltisi hazırlayın. Nazik ısınma çözünürlüğü artırır. 4 & derecede saklayın; 1 ml'lik alikotlarda C. Geri dönüşümsüz, tiyola özgü biyotinilasyon oluşturur.</td></tr><tr><td>Fosfat tampon salin</td><td>Gibco</td><td>10010-015</td><td></td></tr><tr><td>Nokta leke engelleme tamponu</td><td></td><td></td><td>20 ml% 20 SDS'yi 20 ml 1 x PBS pH 7-8 ile karıştırın ve 1 mM'lik nihai konsantrasyona EDTA ekleyin.</td></tr><tr><td>Streptavidin-yaban turpu peroksidaz </td><td>Vektör Laboratuvarları</td><td>SA5004</td><td>-20 ° C'de saklayın. 10 ml% 20 SDS'yi 10 ml 1 x PBS ile karıştırın. 20 &mu ekleyin; l Kullanmadan önce Streptavidin-HRP. </td></tr><tr><td>ECL reaktifi</td><td>GE Healthcare</td><td>RNP2109</td><td>Üreticinin talimatlarına göre kullanın.</td></tr><tr><td>Süper RX, X-RA Film, 18x24 cm</td><td>Fujifilm</td><td>47410 19236</td><td></td></tr><tr><td>&mu; Macs Streptavidin Kit</td><td>Miltenyi</td><td>130-074-101</td><td>Boncukları 4 ° C'de saklayın.</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Yıkama tamponu</td><td></td><td></td><td>100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA, 1 M NaCl, %0.1 Tween 20 nükleaz içermeyen H2O.</td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Sigma</td><td>43817</td><td>Nükleaz içermeyen H2O'da 100 mM DTT olarak hazırlayın, kullanmadan önce daima taze hazırlayın.</td></tr><tr><td>RNeasy MinElute Kiti</td><td>Qiagen</td><td>74204</td><td>Sütunları 4 > C, kitin oda sıcaklığında kalan bileşenleri.</td></tr><tr><td>1.5 ml vidalı polipropilen tüpler</td><td>Sarstedt</td><td>72.692.005</td><td>Dimetilformamid ile uyumlu</td></tr><tr><td>2.0 ml vidalı polipropilen tüpler</td><td>Sarstedt</td><td>72.694.005</td><td>Dimetilformamid</td></tr><tr><td>15 ml tüpler</td> ile uyumlu <td>BD Falcon</td><td>352096</td><td>Dimetilformamid 50</td></tr><tr><td>ml tüpler</td><td>ile uyumlu BD Falcon</td><td>352070</td><td>Dimetilformamid ile uyumlu</td></tr><tr><td colspan="4">Aksi belirtilmedikçe tüm çözeltiler/reaktifler oda sıcaklığında saklanmalıdır.</td></tr><tr><td colspan="4">Equipment </td></tr><tr><td>UV/VIS spektrofotometresi</td><td>Thermo Scientific</td><td>NanoDrop 1000</td><td>Veya eşdeğeri. Düşük ses seviyesi kullanın (1-2 & mu; l) aşırı numune kaybını önlemek için düşük RNA konsantrasyonlarının ölçümleri için.</td></tr><tr><td>Polipropilen 15 ml santrifüj tüpleri</td><td>VWR International</td><td>525-0153</td><td>Standart 15 ml'lik tüplerin aksine, bunlar 15.000 &# 215'e kadar tolere eder; g</td></tr><tr><td>Yüksek hızlı santrifüj</td><td>Beckman Coulter</td><td>Avanti J-25</td><td>Veya 13.000&#215'e ulaşabilen eşdeğer ekipman; g</td></tr><tr><td>Yüksek hızlı rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>JLA-16250</td><td>Veya 13.000&#215'e ulaşabilen eşdeğer ekipman; </td></tr><tr><td>g 15 ml tüpler için adaptörler</td><td>Laborger & # 228; te Beranek</td><td>356964</td><td>Veya 13.000&#215'e ulaşabilen eşdeğer ekipman; g</td></tr><tr><td>Soğutmalı masa üstü santrifüj</td><td>Eppendorf</td><td>5430 R</td><td>Veya eşdeğeri.</td></tr><tr><td>Termomikser</td><td>Eppendorf</td><td>Thermomixer kompakt</td><td>Veya eşdeğeri.</td></tr><tr><td>Manyetik stand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-109</td><td>Bir stand 8 &mu tutar; Macs sütunları.</td></tr><tr><td>Su</td><td>banyosu Hibesi</td><td>SUB Aqua 5</td><td>Veya eşdeğeri.</td></tr><tr><td>Ultra ince ölçekli</td><td>A & D</td><td>GR-202</td><td>Veya eşdeğeri.</td></tr><tr><td>E-Gel iBase Güç Sistemi</td><td>Invitrogen</td><td>G6400UK</td><td>RNA jelleri için; veya eşdeğeri.</td></tr><tr><td>E-Gel EX %1 agaroz prekast jeller</td><td>Invitrogen</td><td>G4020-01</td><td>RNA jelleri için; veya eşdeğeri.</td></tr></tbody></table>

hücre kültürü rna sentezi, İşleme ve Çürüme yüksek Çözünürlük gen İfadesi profil için yeni transkripsiyonu rna metabolik etiketleme

Metabolic Labeling of Newly Transcribed RNA for High Resolution Gene Expression Profiling of RNA Synthesis, Processing and Decay in Cell Culture

Tam transcriptome mikroarrayler ve yeni nesil sıralama gelişimi hücresel gen ifadesinin karmaşıklığı anlayışımızı devrim yarattı. Tutulan moleküler mekanizmaların daha iyi anlaşılması ile birlikte, altta yatan kinetik hassas ölçümler giderek daha önemli hale gelmiştir. Burada, bu güçlü yöntemler şablon örnekleri de çalışma, yani toplam hücresel RNA içsel özellikleri nedeniyle önemli sınırlamalar karşı karşıya. Birçok durumda toplam hücresel RNA değişiklikler yeterli çözünürlüğe sahip temel moleküler olayları ve kinetik temsil etmek için ya çok yavaş ya da çok hızlı bir şekilde ortaya çıkar. Buna ek olarak, RNA sentezi, işlenmesi ve çürüme değişiklikler katkısı kolayca ayırt edilmez. Biz son zamanlarda bu sınırlamaları aşmak için yüksek çözünürlüklü gen ekspresyon profili geliştirdi. Yaklaşımımız 4-thiouri ile yeni transkripsiyonu RNA metabolik etiketleme dayanmaktadıryemek (böylece de 4SU-etiketleme olarak anılacaktır) tiyol-spesifik bir biotinilasyon ve Streptavidin-kaplı manyetik boncuklar kullanılarak yeni kopyalanan RNA arasında sıkı bir arıtma takip eder. Bu, omurgalılarda, Drosophila ve maya da dahil olmak üzere bir organizma geniş için de geçerlidir. Biz başarılı, transkripsiyon faktörü faaliyetlerinin gerçek zamanlı kinetik çalışma RNA yarı hayatımızın hassas ölçümler sağlamak ve RNA işleme kinetik yeni bakış açıları elde etmek için 4SU-etiketleme uygulanır. Son olarak, sayısal modelleme altta yatan moleküler mekanizmaları entegre, kapsamlı bir analiz oluşturmak için kullanılabilir.

1. Başlangıç ​​Malzeme ve Beklenen Verim 4SU-maruz kalma 1 saat (saat) ardından yeni transkripsiyonu RNA yaklaşık 1 temsil - toplam hücresel RNA 4%. Artık hücre büyümesi / çoğaltma için hesaba RNA sentezi gibi bu büyüme-tutuklandı hücrelerde daha düşük olacaktır. Toplam RNA 80 mg - 1 saat etiketleme, biz 60 ile tahlil başlayan tavsiye. Biyotinilasyon adımdan sonra görmek zor olan küçük RNA pelet toplam RNA sonuçların az 30 mikrogram ile başlayan ve bu nedenle kolayca kaybolabilir. Giriş RNA düz...

Toplam hücresel RNA, kısa vadeli RNA sentezi ve çürüme değişikliklerin yanı sıra, RNA işleme kinetiğini incelemek için kötü bir şablon sağlar. Burada, 4-thiouridine ile yeni kopyalanan RNA metabolik etiketlenmesi tarif, bu sınırlılıkların üstesinden gelmek için izin veren yeni transkripsiyonu RNA tiyol-spesifik bir biotinilasyon ve saflaştırma takip etti.

Hücre Kültürü RNA sentezi, İşleme ve Çürüme Yüksek Çözünürlük Gen İfadesi Profil için Yeni Transkripsiyonu RNA Metabolik Etiketleme

The development of whole-transcriptome microarrays and next-generation sequencing has revolutionized our understanding of the complexity of cellular gene ...

Bu yöntem, ökaryotik hücre kültürlerinde RNA sentezi, işlemesi ve yıkımı kinetiğinin doğrudan ve hassas bir şekilde ölçülmesini amaçlamaktadır. Yeni transkribe edilen RNA'yı metabolik olarak işaretlemek için hücreler dört tyo-üridin varlığında inkübe edilir, ardından işaretli hücreler lizlenerek toplam hücresel RNA saflaştırılır ve yeni transkribe edilen RNA moleküllerini seçici olarak biyotinlemek için tiyol spesifik biotin donasyonu gerçekleştirilir. Daha sonra, yeni transkribe edilen transkriptleri mevcut RNA'lardan ayırmak için streptavidin kaplı manyetik boncuklar kullanılır; böylece toplam, yeni transkribe edilen ve işaretlenmemiş mevcut RNA fraksiyonları elde edilir.RNA daha sonra Q-R-T-P-C-R, mikro diziler veya yeni nesil dizileme dahil olmak üzere alt analizlere tabi tutulabilir. Yeni transkribe edilmiş RNA'nın analizine yönelik çalışmalarla karşılaştırıldığında, toplam hücre RNA analizi, gen ekspresyonundaki kısa süreli değişimlerin tespit edilmesi için yaklaşık on kat artırılmış bir hassasiyet sağlar. Bir uygulama olarak, RNA yarı ömürlerinin hassas ölçümlerini kolaylaştırır ve ilk kez RND işlemenin kinetiğini gerçekten ortaya çıkarır. Yeni sentezlenen transkriptlerin metabolik etiketlemesi, gen ekspresyonunun düzenleyici moleküler mekanizmalarını incelemek için başarıyla uygulanabilir.Bu yöntem ayrıca ops, oph ve maya gibi diğer model organizmalara da uygulanabilir. Her koşul arasında en az beş dakika süre bırakacak şekilde, deneyin detaylı bir planıyla başlayın. 4-tiyouridin işaretleyiciyi kullanımdan hemen önce çözdürün ve her koşul için gerekli miktarı steril falcon tüplerine paylaştırın.Her bir işlem koşulu için, her bir 10 santimetrelik kültür kabından beş mililitre hücre kültür ortamını thiopurine içeren tüpe aktarın ve iyice karıştırın; kültürlerin üzerinde kalan ortamı aspire ederek uzaklaştırın. Ardından, etiketli ortamı hücrelere geri ekleyin ve deneysel olarak belirlenen süre boyunca inkübe edin. Hücre kültür ortamını uzaklaştırdıktan sonra, her bir plakaya beş mililitre triol ekleyin.Hücrelerin tamamen lizis olması için oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. Plakayı eklenen triol ile dikkatlice durulayın ve örnekleri 13,000 G merkezkaç kuvvetine dayanıklı polipropilen tüplere aktarın. Örnekler daha sonra -20 °C'de saklanabilir veya triol protokolü izlenerek toplam hücresel RNA hazırlamak için hemen kullanılabilir. 60 ile 80 µg toplam hücresel RNA içeren örneklerle başlayın. İşaretleme reaksiyonu için, 7 µL nükleaz içermeyen suda seyreltilmiş 1 µg RNA'ya 1 µL 10x biotin tamponu ekleyin.Ardından, her 1 µg RNA için 1 mg/mL konsantrasyonda 2 µL biotin HPDP (DMF içinde) ekleyin ve pipetleme yaparak hemen karıştırın. Biotin çökerse, DMF içeriği artırılabilir. %40 nihai konsantrasyonda reaksiyonu, oda sıcaklığında 1,5 saat boyunca rotasyon altında inkübe edin.Ardından, eşit hacimde kloroform ekleyip kuvvetlice karıştırın ve fazlar ayrılmaya başlayıp kabarcıklar kaybolana kadar iki ila üç dakika inkübe edin. Örnekleri santrifüjleyin, ardından üstteki sulu fazı dikkatlice yeni bir tüpe aktarın. İkinci bir kloroform ekstraksiyonundan sonra, hacmin onda biri kadar beş molar sodyum klorür ve eşit hacimde izopropanol ekleyin.RNA'yı sulu fazdan çöktürmek için santrifüj ile RNA'yı peletleyin. Süpernatantı dökün ve peleti bir kez eşit hacimde %75 etanol ile yıkayın; santrifüjden sonra süpernatantı dökün. Kısa süre santrifüjleyin ve kalan etanolü 200 µL'lik bir pipetle uzaklaştırın.Tekrar santrifüjleyin ve kalıntı etanolü uzaklaştırın; 20 µL'lik bir pipetle RNA'yı 50 ila 100 µL suda, pipetleyerek iyice karıştırarak yeniden süspande edin. RNA degradasyonunu dışlamak için RNA kalitesini elektroforez ile değerlendirin.Örnek başına üç mililitre yıkama tamponunu bir su banyosunda 65 °C'ye kadar dengeleyin. Ayrıca biotinillenmiş RNA örneklerini 65 °C'de 10 dakika boyunca denatüre edin. Ardından hemen buz üzerine yerleştirin.Microm max kolonlarını manyetik standa yerleştirin. Milton e kolonlarını 1 mL oda sıcaklığındaki yıkama tamponu ile ön dengelemeye tabi tutun. Bu sırada, biotinillenmiş RNA'ya 100 µL streptavidin boncuğu ekleyin ve rotasyon altında oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe edin.Sütunlardan herhangi biri süzülmeye başlamadıysa, eldivenli bir parmakla sütunun üst kısmına hafifçe bastırın. Akış başladıktan sonra sütunlar kolayca süzülür. RNA boncuk karışımlarını sütunlara uygulayın. Eğer işaretlenmemiş RNA analiz edilecekse, işaretlenmemiş RNA fraksiyonunun akış sıvısını toplayın, ardından 65 °C yıkama tamponu ile üç kez 0,9 mL yıkayın ve bunu takip eden ortam yıkama tamponu ile üç kez 0,9 mL yıkayın.Ardından, yeni iki mililitrelik tüplere 700 µL RLT tamponu pipetleyin ve bu tüpleri kolonların altına yerleştirin. Yeni transkribe edilen RNA'yı RLT tamponuna elüe etmek için kolonlara taze hazırlanmış 100 mM DTT'den 100 µL ekleyin. Üç dakika sonra, kolona 100 mM DTT'den 100 µL daha ekleyin ve EENT'yi aynı tüpe toplayın.Üretici talimatlarında açıklandığı şekilde RNeasy Mini Elution temizleme protokolüne devam edin, kolona 25 µL nükleaz içermeyen su ekleyin ve kolonların bulunduğu tüpleri bir santrifüje yerleştirin. Bir dakikalık santrifüj işleminin ardından kolonları tüplerden çıkarın ve bir NanoDrop spektrofotometre kullanarak RNA konsantrasyonlarını belirleyin. Yeni transkribe edilmiş RNA'nın spektrofotometrik ölçümlerinin çok güvenilir olmadığını ve gerçek RNA içeriğini olduğundan fazla gösterme eğiliminde olduğunu unutmayın.RNA'yı yüksek kapasiteli bir analize tabi tutmadan önce çözme ve yeniden dondurma ihtiyacını önlemek için, yeni transkribe edilmiş RNA saflaştırıldıktan hemen sonra cDNA hazırlanmasını öneririz. Üretici talimatlarını izleyerek, 20 µL'lik bir cDNA sentez reaksiyonunda 2,5 µL yeni transkribe edilmiş RNA şablonu kullanın. cDNA örneklerini 1/10 oranında seyreltin ve 5 µL'lik cDNA seyreltisini qRT-PCR ile analiz edin.Yeni transkribe edilen RNA'nın verimli bir şekilde geri kazanımı için gereken minimum 4 SU konsantrasyonunu belirlemek amacıyla CD NA örneklerini -80 °C'de saklayın; artan 4 SU konsantrasyonları ile 4 SU etiketlemesini takiben yeni transkribe edilen RNA'yı saflaştırın ve elektroforezle analiz edin. Burada, primer insan fibroblastlarında bir saat boyunca etiketlenen yeni transkribe edilen RNA'nın geri kazanımı, 50'den 200 µM 4 SU'ya kadar önemli ölçüde artmış, ancak daha sonra plato oluşturmaya başlamıştır. Alternatif olarak, streptavidin horseradish peroksidaz konjuge kullanarak biyotinlenmiş RNA üzerinde dot blot analizi ile 4 SU inklüzyonunu ölçün.Biotin HPDP'nin biotinilasyon verimliliği, otoasetil biotininkinden yaklaşık üç kat daha düşüktür. Bu nedenle, yeni transkribe edilmişteki her üç ila dört sülfhidril kalıntısından bir tanesi biotinillenir.RNA, biotin HPDP ile biyotinlenir. Sinyal yoğunlukları, biyotinlenmiş kontrol ile karşılaştırılarak da nicelleştirilebilir. Yeni transkribe edilmiş RNA'nın DNA oligo geri kazanımı oldukça kantitatiftir.Agilent Bioanalyzer'dan elde edilen bu veriler, yeni transkribe edilen RNA'nın önemli ölçüde daha fazla miktarda büyük, eklenmemiş transkript içerdiğini göstermektedir. Son olarak, yeni transkribe edilen RNA'daki dört su'nun inklüzyon oranları, spektrofotometrik analiz ile doğrudan nicelleştirilebilir. Bu işlem, yeni transkribe edilen RNA'nın glikojen, izopropanol ve etanol ile çöktürülmesini gerektirir.330 nanometredeki ek pik, yeni transkribe edilen RNA'ya dört SU'nun katılım oranını yansıtır. Tril ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın. Bu nedenle, polietilen glikol 300 ile endüstriyel metil alkolün 70'e 30 oranında karıştırılmasıyla elde edilen fenol yanıkları için bir panzehir kolayca erişilebilir olmalıdır.Bu videoyu izledikten sonra, 6 ila 12 örnek için toplamda yaklaşık sekiz saatinizi alacak olan, yeni transkribe edilmiş RNA'nın metabolik olarak etiketlenmesi ve saflaştırılması yöntemini iyi bir şekilde kavramış olmalısınız.

metabolic-labeling-newly-transcribed-rna-for-high-resolution-gene

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu görüntüleme kullanılarak hipoksi küresel RNA sentez analizi için bir tekniği açıklar. RNA tıklayın-kimya etiketleme önceden hipoksi altında gerçekleştirilen ve tek hücre düzeyinde küresel RNA değişikliklerin görselleştirme sağlar olmamıştır. Bu yaklaşım, küresel RNA sentezinde hücreden hücreye değişiklik doğrudan görselleştirme sağlayan, mevcut ortalama RNA tekniklerinin tamamlar.

Ününüz Aşağıdaki Tek Hücre Düzeyinde Küresel RNA Sentezi Analizi

Rasyometrik bimoleküler işaretleri (RBMBs) canlı hücreler görüntü tek bir mühendislik RNA transkriptleri için kullanılabilir. Burada, RBMBs, mikroporasyonu ve gerçek zamanlı olarak tek RNA transkriptlerinin floresan görüntüleme hücrelere RBMBs teslimat hazırlanmasını ve saflaştırılmasını tanımlarlar.

Oranlı metrik Bimoleküler Fenerleri kullanma Yaşam Hücrelerde Tek Engineered RNA Transkriptlerinin Gerçek zamanlı Görüntüleme

Bu el yazması ile DNA probları fluorescently etiketli tek molekül Floresans in situ hibridizasyon (smFISH) E. colideneylerde kullanmak için bireysel mesajcı RNA (mRNA) Tutanaklar etiketleme yöntemi açıklar. smFISH eş zamanlı algılama, Yerelleştirme ve miktar tek mRNA molekülleri sabit tek tek hücreleri içinde izin veren bir görselleştirme yöntemidir.

Transkript bireysel Escherichia coli hücrelerdeki tek molekül Floresans In Situ hibridizasyon deneyleri için etiketleme yöntemi

Bu iletişim kuralı ChIP-seq, 4sU seq, toplam RNA-seq ve hücre satırları ve Primer hücre için profil oluşturma ribozom Kombinatorik kullanımını açıklar. Transkripsiyon faktörü de novo transkripsiyon, RNA işlenmesi, ciro ve çeviri zamanla, bağlama ve olayların genel gidişatı harekete geçirmek ve/veya hızla değişen hücrelerde görüntüleme izleme değişiklikleri sağlar.

Gerçek zamanlı analiz bağlama, transkripsiyon, çeviri ve ciro hücresel etkinleştirme sırasında küresel olayları görüntülemek üzere transkripsiyon faktörü

Biz orijinal bir transfer RNA analizi platformu nokta (akıcı tRNA gözlemlemek için Platform) adlı tanımlamak. Nokta aynı anda hücresel düzeyde tüm tRNA biyolojik örnekleri, sadece üç adım ve 24 saatten az bir süre ölçer.

Metabolik etiketleme ve Transfer RNA Macroarrays kullanarak profil oluşturma

Bu yöntem RNA sentezi ölçmek için kullanılabilir. 5-Bromouridine hücrelere eklendi ve sentezlenmiş RNA dahil. RNA sentezi 5 Bromouridine hedeflenmiş immunoprecipitation etiketli RNA ve analiz ters transkripsiyon ve nicel Polimeraz zincir reaksiyonu ardından hemen sonra etiketleme, RNA ayıklama ölçülür.

RNA sentezi 5-Bromouridine etiketleme ve Immunoprecipitation kullanarak incelenmesi

Burada açıklanan protokolü yeni sentezlenmiş mRNA 4-thiouracil ile etiketli Maya hücrelerinden saf genom çapında miktar temel alır. Bu yöntem mRNA decay edilişi mRNA sentezi ölçmek için sağlar ve böylece, RNA polimeraz II transkripsiyon doğru bir ölçüm sağlar.

Saccharomyces cerevisiae Metabolik 4-thiouracil ve bir miktar ile etiketleme yeni mRNA RNA polimeraz II etkinlik için bir Proxy olarak sentezlenmiş

Hassas ve özellikle maya Saccharomyces cerevisiaeyeni transkripsiyonu RNA arındırmak için tiolated urasil kullanımı .

RNA In Vivo'nun 4-Thiouracil (Ers4tU) ile Son Derece Hızlı ve Spesifik Metabolik Etiketlemesi

5-etinil-uridin (5-EU) kullanılarak Xenopus erken embriyolarında transkriptom analizi için yeni başlayan transkriptleri metabolik olarak etiketlemek ve saflaştırmak için ayrıntılı yöntemler sunuyoruz.

Xenopus erken embriyogenezinde yeni başlayan transkriptomun metabolik etiketlenmesi

Bu prosedür, birincil fare kemik iliği hematopoetik hücre kültürleri kurmak ve transfeksiyon Gene Verici MXCell elektroporasyon sistemini kullanarak takip nasıl açıklamaktadır.

Hazırlık Elektroporasyon murin Kemik İliği itibaren İlköğretim Hematopoetik Hücre Kültürleri

Öğrenin, 4-tiyouridin ile metabolik etiketleme kullanarak ökaryotik hücre kültürlerinde RNA sentezi, işlenmesi ve çürümesini ölçme yöntemini. Bu teknik, gen ifadesi değişikliklerini on kat daha hassas tespit eder.

Hücre Kültürü RNA sentezi, İşleme ve Çürüme Yüksek Çözünürlük Gen İfadesi Profil için Yeni Transkripsiyonu RNA Metabolik Etiketleme (Video) | JoVE Journal

Hücre Kültürü RNA sentezi, İşleme ve Çürüme Yüksek Çözünürlük Gen İfadesi Profil için Yeni Transkripsiyonu RNA Metabolik Etiketleme

Daha fazla video keşfet