Hücre Kültürü RNA sentezi, İşleme ve Çürüme Yüksek Çözünürlük Gen İfadesi Profil için Yeni Transkripsiyonu RNA Metabolik Etiketleme

Bu yöntem, ökaryotik hücre kültüründe RNA sentezi, işlenmesi ve bozunmasının kinetiğini doğrudan ve hassas bir şekilde ölçmeyi amaçlamaktadır. Yeni kopyalanan RNA'yı metabolik olarak etiketlemek, daha sonra etiketli hücreleri parçalamak ve toplam hücresel RNA'yı saflaştırmak için dört tiyo üridin varlığındaki hücreler, yeni kopyalanan RNA molekülleri olan seçici biyoatete tiyol spesifik bir biyotin bağışı gerçekleştirir. Daha sonra, streptavidin kaplı manyetik boncukları kullanarak, önceden var olan RNA'dan, toplam, yeni kopyalanmış ve etiketlenmemiş RNA fraksiyonlarından uzakta, yeni kopyalanmış dört etiketli transkripti yakalayın. Preexisting.

RNA daha sonra Q-R-T-P-C-R, mikrodiziler veya yeni nesil dizileme dahil olmak üzere aşağı akış analizine tabi tutulabilir Yeni kopyalanan toplam hücre RNA analizi üzerine yapılan çalışmalarla karşılaştırıldığında, RNA, gen ekspresyonundaki kısa vadeli değişiklikleri tespit etmek için duyarlılıkta yaklaşık on kat artış sağlar. Bir tion, R yarı ömürlerinin hassas ölçümlerini kolaylaştırır ve ilk kez RND işlemenin kinetiğini ortaya çıkarır. Yeni sentezlenen transkriptlerin metabolik etiketlemesi, gen ekspresyonunun diseksiyon düzenleyici moleküler mekanizmalarına başarılı bir şekilde uygulanabilir.

Ops, oph ve maya gibi diğer model organizmalara da uygulanabilir. Her koşul arasında en az beş dakika bırakarak deneyin ayrıntılı bir planıyla başlayın. Kullanmadan hemen önce dört tiyo üridin etiketini çözün ve her koşul için gereken miktarı steril şahin tüplerine ayırın.

Her tedavi koşulu için, her 10 santimetrelik kültür kabından beş mililitre hücre kültürü ortamını dört tiyopurin içeren tüpe aktarın ve kalan ortamı kültürlerden iyice aspire edin. Daha sonra ortam içeren etiketi hücrelere geri ekleyin ve deneysel olarak tanımlanan süre boyunca inkübe edin. Hücre kültürü ortamını çıkardıktan sonra, her plakaya beş mililitre triol ekleyin.

Tam hücre lizizi için oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. Plakayı eklenen triol ile dikkatlice durulayın ve numuneleri 13.000 G'de santrifüjlemeye dayanabilen polipropilen tüplere aktarın, numuneler daha sonra eksi 20 santigrat derecede saklanabilir veya triol protokolünü takiben toplam hücresel RNA'yı hazırlamak için hemen kullanılabilir. 60 ila 80 mikrogram toplam hücresel RNA örnekleriyle başlayın Etiketleme reaksiyonu için, yedi mikrolitre nükleaz içermeyen su içinde seyreltilmiş bir mikrogram RNA'ya bir mikrolitre 10 x biyotin tamponu ekleyin.

Daha sonra mililitre başına bir miligramda iki mikrolitre biotin HPDP, bir mikrogram RNA başına DMF ekleyin ve hemen pipetleyerek karıştırın. Biyotin çökelirse, DMF içeriği arttırılabilir. % 40'lık nihai konsantrasyonReaksiyonu oda sıcaklığında rotasyon altında 1.5 saat inkübe edin.

Daha sonra, eşit hacimde kloroform karışımı ekleyin, fazlar ayrılmaya başlayana ve kabarcıklar kaybolmaya başlayana kadar iki ila üç dakika kuvvetlice inkübe edin. Numuneleri santrifüjleyin, ardından üst sulu fazı dikkatlice yeni bir tüpe aktarın. İkinci bir kloroform ekstraksiyonundan sonra, hacminin 10'da biri olan beş molar sodyum klorür ve eşit hacimde izopropanol ekleyin.

RNA'yı sulu fazdan çökeltmek için, RNA'yı santrifüjleme yoluyla peletleyin. Süpernatanı atın ve peleti santrifüjlemeden sonra eşit hacimde% 75 etanol ile bir kez yıkayın, süpernatanı atın. Kısa bir süre döndürün ve kalan etanolü 200 mikrolitrelik bir pipetle çıkarın.

Tekrar döndürün ve artık etanolü 20 mikrolitrelik bir pipet yeniden süspansiyonu ile çıkarın, RNA 50 ila 100 arasındadır. Mikrolitre su pipetleme ile iyice karıştırılır. RNA bozulmasını dışlamak için RNA kalitesini elektroforez ile değerlendirin.

Numune başına üç mililitre yıkama tamponunu bir su banyosunda 65 santigrat dereceye dengeleyin. Ayrıca biyotinile edilmiş RNA örneklerini 65 santigrat derecede 10 dakika boyunca denatüre edin. Sonra hemen buzun üzerine yerleştirin.

Mikrom max sütunlarını manyetik standın içine yerleştirin. Milton e kolonlarını bir mililitre oda sıcaklığında yıkama tamponu ile önceden dengeleyin. Bu arada, biyotinile edilmiş RNA'ya 100 mikrolitre streptavidin boncuk ekleyin ve rotasyon altında 15 dakika oda sıcaklığında inkübe edin.

Sütunlardan herhangi biri boşalmaya başlamadıysa, eldivenli bir parmakla sütunun üstüne hafifçe bastırın. Akış başladığında, sütunlar kolayca boşalır, RNA boncuk karışımlarını sütunlara uygulayın. Etiketlenmemiş RNA analiz edilecekse, etiketlenmemiş RNA fraksiyonunun akışını toplayın, ardından 0.9 mililitre 65 santigrat derece yıkama tamponu ile üç kez yıkayın, ardından 0.9 mililitre ortam yıkama tamponu ile üç kez yıkayın.

Daha sonra 700 mikrolitre pipetleyin, RLT'yi yeni iki mililitrelik tüplere tamponlayın ve bunları sütunların altına yerleştirin. Yeni kopyalanan RNA'yı RLT tamponuna elüte etmek için sütunlara 100 mikrolitre taze hazırlanmış, 100 milimolar DTT ekleyin. Üç dakika sonra, kolona 100 mikrolitre 100 milimolar DTT daha ekleyin ve EENT'yi aynı tüpe toplayın.

Üreticilerde talimatlarda açıklandığı gibi RN kolay mini ganimet temizleme protokolüne devam edin, kolona 25 mikrolitre nükleaz içermeyen su ekleyin ve tüplerdeki kolonları bir santrifüje koyun. Bir dakikalık bir döndürmeden sonra, sütunları tüplerden çıkarın ve bir nano damla spektrofotometresi kullanarak RNA konsantrasyonlarını belirleyin. Yeni kopyalanan RNA'nın spektrum fotometrik ölçümlerinin çok güvenilir olmadığını ve gerçek RNA içeriğini abartma eğiliminde olduğunu unutmayın.

RNA'yı yüksek verimli bir tahlillere göndermeden önce çözme ve yeniden dondurma ihtiyacını önlemek için, yeni kopyalanan RNA saflaştırıldıktan hemen sonra CDNA'yı hazırlamanızı öneririz. Üreticinin talimatlarını izleyerek 20 mikrolitrelik bir CDNA sentez reaksiyonunda yeni kopyalanan RNA şablonunun 2,5 mikrolitresini kullanın. CD NA örneklerini bir ila 10 arasında seyreltin ve Q-R-T-P-C-R ile beş mikrolitre CD NA seyreltmesini analiz edin.

Yeni kopyalanan RNA'nın verimli bir şekilde geri kazanılması için gereken minimum dört SU konsantrasyonunu belirlemek için CD NA örneklerini eksi 80 santigrat derecede saklayın, yeni kopyalanan RNA'yı dört SU etiketlemesini takiben artan dört SU konsantrasyonlarıyla saflaştırın ve elektroforez ile analiz edin. Burada. Primer insan fibroblastlarında bir saat boyunca işaretlenmiş yeni kopyalanan RNA'nın geri kazanımı, 50'den 200 mikromolar dört su'ya önemli ölçüde arttı, ancak daha sonra platoya başladı. Alternatif olarak, bir streptavidin yaban turpu peroksidaz konjugatı kullanılarak biyotinile edilmiş RNA üzerinde nokta leke analizi ile dört SU katılımını ölçün.

Biyotinin biyotin asyon etkinliği. HPDP, Otto asetil biotin'inkinden yaklaşık üç kat daha azdır. Böylece üçte biri dört su kalıntısı yeni kopyalanır.

RNA aslında biotin HPDP tarafından biyotinile edilir. Sinyal yoğunlukları, biyotinile kontrol ile karşılaştırılarak da ölçülebilir. Yeni kopyalanan RNA'nın DNA oligos geri kazanımı oldukça kantitatiftir.

Agilent Bioanalyzer'dan elde edilen bu veriler, yeni kopyalanan RNA'nın önemli ölçüde daha fazla miktarda büyük unpled transkript içerdiğini göstermektedir. Son olarak, yeni kopyalanan RNA'ya dört su'nun dahil edilme oranları, spektrum fotometrik analizi ile doğrudan ölçülebilir. Bu, yeni kopyalanan RNA'nın glikojen ve izopropanol ve etanol ile çökeltilmesini gerektirir.

330 nanometredeki ek tepe noktası, dört SU'nun yeni kopyalanan RNA'ya dahil edilme oranını yansıtır. Tril ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın. Bu nedenle, endüstriyel metillenmiş ispirtolarla karıştırılmış polietilen glikol 300'den oluşan fenol kemikleri için bir panzehir, 70 ila 30 arasında kolayca bulunmalıdır.

Bu videoyu izledikten sonra, yeni kopyalanan RNA'nın nasıl metabolik olarak etiketleneceğini ve saflaştırılacağını iyi anlamış olmalısınız, bu da sonuçta altı ila 12 örnek için yaklaşık sekiz saatinizi alacaktır.