Kültür Hücrelerinin itibaren Kromozom Hazırlık

Bu prosedürün genel amacı, GB bantlaması ve moleküler sitogenetik testler için kromozomları toplamak ve hazırlamaktır. İlk olarak, hücreleri logaritmik faza kültürleyin. Daha sonra kromozomları smid, bir hipotonik ve bir fiksatif ile hasat edin.

Hücre süspansiyonunu slaytlar halinde bırakın. Bir slaydı lekeleyin. Kromozomal preparatın bir monitörü olarak, kalan slaytların GB bantlamasına veya moleküler tekniklerine devam edin.

GB bantlamasında son bir adım olarak, kromozomları ışık mikroskobu ve karyotipleme ile analiz edin. Sonuçta, kromozomlar ve çekirdekler karyotipleme veya balık gibi için mevcut olacaktır. İlk olarak, çeşitli organizmalardan farklı hücre türlerinde kromozom kararsızlığının tespiti ve daha sonraki moleküler sitogenetik testler için yardım talep eden diğer araştırmacılardan gelen yüksek talep nedeniyle bu yöntemi yayınlama fikrim vardı.

Bu teknik, kanser de dahil olmak üzere birçok konjenital genetik bozukluğun tanısında ve nihayetinde prognozunda esastır, çünkü tanısal olan kromozom yeniden düzenlemelerinin görüntülenmesine izin verir. Bu bozukluklar için, bu yöntem çeşitli insan hücrelerinde bulunan kromozom yeniden düzenlemeleri hakkında bilgi sağlayabilir. Ayrıca Resus Maca sıçanları ve fareler gibi diğer organizmalardan hücrelere de uygulanabilir.

% 80 akıcılığa 2 milyon yapışkan hücre ve mililitre başına 10 mikrogram 10 mikrolitre ekleyin. Mililitre hücre başına col. Hücreleri 37 santigrat derecede% 5 CO2 inkübatörde 45 dakika inkübe edin.

Daha sonra steril bir pipet kullanarak, ortamı kültürden 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve daha sonra saklayın Hücreleri yıkamak için, şişeye iki mililitre HBSS ekleyin, döndürün ve tamponu çıkarın. Ardından, şişenin tüm yüzeyini kapladığından emin olarak bir mililitre tripsin ekleyin. Hücrelerin çoğu ayrıldıktan sonra, konik tüpteki ortamı hücrelere geri pipetleyin.

Hücre süspansiyonunun 10 mililitresini 15 mililitrelik konik tüplere alın. 200 Gs'de 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatı çıkarın.

Peletleri, 37 santigrat derecelik 10 dakikalık bir inkübasyondan sonra 37 santigrat dereceye kadar önceden ısıtılacak olan 10 mililitre 75 milimolar potasyum klorür içinde yeniden askıya alın. Beş dakika boyunca 200 Gs'de santrifüjleyin. 25 santigrat derecede, süpernatanın 0,5 mililitresi hariç hepsini çıkarın ve peleti dikkatlice yeniden süspanse edin.

Hücrelere beş mililitre taze araba gürültüsü sabitleyici ekleyin. Daha sonra beş dakika boyunca 200 Gs'de beş mililitre, daha fazla fiksatif ve vorteks santrifüjü ekleyin. Resus, her hücre peletini beş mililitre fiksatif içinde askıya alın.

Hücreleri bir yıla kadar dört derecede saklayın. Hücreleri beş dakika boyunca 200 Gs'de santrifüjleyin. 25 santigrat derecede.

Peleti nazikçe askıya aldıktan sonra sadece 0,3 ila 0,5 mililitre kalana kadar supnatantı çıkarın. Yaklaşık iki inçlik bir mesafeden üç damla hücre süspansiyonunu yaklaşık 45 derecelik bir açıyla eğilmiş bir slayt üzerine pipetleyin. Ve süspansiyonun slayt boyunca yuvarlanmasına izin verin.

Slayta sabitleyici olan büyük bir damla taze araba gürültüsü ekleyin. Sürgünün arkasını bir kağıt havlu üzerine sürün ve ardından tamamen kuruması için sürgüyü dışarı oturtun. Taze gim sürdürme solüsyonu hazırlayın.

Slaytları bir boyama rafına yerleştirin. Gim sürdürme solüsyonundaki tüm slaydı kaplayın. Beş dakika sonra, slaytları damıtılmış su tahliyesi ile durulayın ve kurumaya bırakın.

Sürgüye dört damla perma montajı ekleyin ve kapak fişinin altında kabarcık olmadığından emin olarak bir kapak fişi yerleştirin. Montaj başına fazlalığı bir kağıt havluyla çıkarın. Hücreleri 10 x ve 100 x büyütme altında ışık mikroskobu ile analiz edin.

Metafaz hücreleri bol ve iyi yayılmışsa, kalan slaytlar diğer deneysel prosedürler için kullanılabilir. Dört Copeland kavanozuna 50 mililitre arıtma solüsyonu ekleyin. Her slaydı beş saniye sonra bir numaralı kavanoza daldırın.

Slaytı iki numaralı kavanozda hızlı bir şekilde durulayın. Üç numaralı kavanozda en az 30 saniye bekletin. Dört numaralı kavanozda durulayın, ardından slaytların kurumasını bekleyin.

Taze GIM sürdürme çözeltisi hazırlayın. Slaytları bir boyama rafına yerleştirin. Tüm slaydı gim sürdürme solüsyonunda beş dakika boyunca örtün.

Slaytları ve damıtılmış suyu lekelendikleri sırayla durulayın. Ardından en az 10 dakika kurulayın. Daha önce gösterildiği gibi perma montajını kullanarak bir kapak fişi yerleştirin.

Daha sonra kalan slaytlar için hücreleri ışık mikroskobu altında analiz edin. Tripsin inkübasyon süresini ayarlayın. İlk slaytın sonuçlarına göre.

Başarılı bir tahlil, iyi yayılmış ve uygun kromozom morfolojisine sahip kromozomlar verir. Gereken şekilde. GB bantlı kromozomlar, karakteristik açık ve koyu bantlama desenlerini içerir. Bu videoyu izledikten sonra, GB bantlaması için kromozomların nasıl toplanacağını ve kromozom kararsızlığının aydınlatılmasında daha fazla moleküler sitogenetik testin nasıl yapılacağını iyi anlamış olmalısınız.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu hasat tekniği uygun şekilde yapılırsa yaklaşık üç saat içinde yapılabilir. GB bantlama prosedürü için, GB bandına geçmeden önce tripsin inkübasyon süresini başlangıçta bir slaytta test etmek önemlidir. Slaytların geri kalanı.