Name: Mitokondri ilişkili ER Membranlar (MAM) ve Glycosphingolipid zenginleştirilmiştir Microdomains (GEMlerle): Fare Beyin izolasyon (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-04T12:15:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: Öğrenin, fare beyninden mitokondri ilişkili ER membranları (MAM) ve glikosfingolipid açısından zengin mikrodomain (GEM) fraksiyonlarının izolasyonunu. Bu yöntem, nörobiyoloji araştırmalarında hücresel metabolizma ve sinyal yolaklarını incelemek için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz ilk protokol tasavvur eden Renata Sano katkısını kabul. Ad&#39;A. Genetik ve Gen Terapisi Sandalye Bahşedilen Çocuklar (JFC) için Kuyumcular tutar. Bu çalışma NIH hibe GM60905, DK52025 ve CA021764 ve Amerikan Lübnan Suriye İlişkili Charities (Alsaç) tarafından finanse edildi.

<html> Aşağıdaki protokol fare beyin MAM ve GEM&#39;lerle izolasyonu ve saflaştırılması için tasarlanmıştır Çözümler mitokondri, MAM ve GEM&#39;lerle izolasyonu için gerekli Fraksiyonlama ham mitokondriyal hazırlığının sağlanması: Çözelti A: 0.32 M sukroz, 1 mM NaHCO 3, 1 mM MgCl2, 0.5 mM CaCl2 + proteaz inhibitörleri (gerektiği kadar taze ekleyin) Çözüm B: 0.32 M Sakkaroz, 1 mM NaHCO 3 + proteaz inhibitörleri (gerektiği gibi, taze ekleyin) MAM İzolasyon: İzolasyon Orta: 250 mM mannitol, 5 mM HEPES pH 7.4, 0.5 mM EGTA,% 0.1 BSA Gradyan Tamponu: 225 mM mannitol, 25 mM HEPES, pH 7.5, 1 mM EGTA,% 0.1 BSA (nihai konsantrasyon) GEM&#39;lerle İzolasyon: content &quot;&gt; GEM Ekstraksiyon Tamponu: 25 mM HEPES, pH 7.5, 0.15 M NaCl,% 1 Triton X-100 + proteaz inhibitörleri (gerektiği gibi, taze ekleyin) GEM çözündürücü Tamponu: 50 mM Tris-HCI, pH 8.8, 5 mM EDTA,% 1 SDS + proteaz inhibitörleri (gerekli olduğu gibi, taze ilave ediniz). 1. İlk Adım Subselüler Fraksiyonlama: Çekirdeğin çıkarılması, Unlysed Hücreler ve Hücresel Enkaz <ol><li> CO 2 odasında fare Euthanize. </li><li> Derhal, beyin kaldırmak yarıya, buz üzerinde 2 ml tüpler yerleştirin ve tartın. </li></ol> Not: tüm prosedür boyunca beyin yarıları ayrı tutun. Aşağıda tek beyin yarı tedavisi için de geçerlidir. <ol start="3"><li> 1 ml soğuk Çözüm A. büyük bir boşluk havaneli 15 toplam vuruş ile homojen içeren önceden soğutulmuş 2 ml cam Dounce doku öğütücü koyun yarım beyin. </li><li> Buz üzerinde, 15 ml şahin tüp aktarın ve seyreltik10 hacim w / v, örneğin, 0.225 g 2,25 ml kadar homojenat. </li><li> 4. 10 dakika için 1400 x g&#39;de santrifüje örnek ° C. </li><li> Dikkatli bir şekilde buz üzerinde, süpernatanın ve bir 30 mL yuvarlak tabanlı cam santrifüj tüpüne transferi çıkarın. Pelet rahatsız değil emin olun. </li><li> Çözüm aynı 10 cilt halinde pelletini tekrar. A küçük bir açıklık havaneli, bir defada 1 ml 3-6 vuruş ile, aynı değirmeni homojenize edilir. </li><li> 4. 10 dakika ° C için 710 xg&#39;de taze 15 ml şahin tüp ve santrifüj transfer Çekirdekler ve hücre artıkları bir tablet elde edilir. </li><li> Dikkatlice adım 1.6 kaydedilen süpernatant ile süpernatant ve havuz çıkarın. </li></ol> 2. İkinci Adım: Ham Mitokondri İzolasyon <ol><li> 4, 10 dakika için 13,800 x g&#39;de santrifüjleyin süpernatan ° C. </li><li> Buz üzerinde, bir Ultra-Clear Beckman Santrifüj Tüpü supernatant aktarın </li><li> Süspanse pelet 10 ciltlik Çözüm A. Bir küçük açıklık havaneli, bir defada 1 ml 3-6 vuruş ile, aynı değirmeni homojenize edilir. </li><li> Adım 2.1 olarak santrifüjleyin. </li><li> Adımları 2.2-2.4 tekrarlayın. </li><li> Çıkan pelet zenginleştirilmiş bir mitokondrial fraksiyonu olduğunu. Havuz süpernatantlar (sitoplazmada ve ER), parafilm ile kapak ve buz üzerinde tutmak. </li><li> Küçük bir açıklık havaneli 6 vuruş ile pelet yeniden süspanse edin, 4.8 ml / g taze bir homojenleştiricinin içinde, çözelti B (g özgün beyin ağırlığı ifade edilir). </li><li> Cam Pasteur pipet kullanarak, dikkatli bir biçimde, aşağıdaki gibi tüpün altına sonradan ekleme hiçbir baloncuklar oluşur sağlanması, bir Ultra-Sil Beckman santrifüj tüpünde bir süreksiz Sakaroz Gradyan hazırlanması: Resupended Pelet (0.32 M sukroz) 3 ml 850 mM sukroz (1 mM NaHCO 3) 3 ml 1 M sukroz (1 mM NaHCO 3) 3 ml 1.2 M Sakkaroz (1 mM NaHCO içinde3) </li><li> 4 ° C&#39;de 2 saat süreyle 82,500 x g&#39;de santrifüjleyin Degrade sonunda çıkan ayrılık üç bant ve pelet üretecek: -; 2) ER, golgi, plazma membranları (0.85 M - 1 M arayüz) 0.85 M arabirimi) 1) miyelin ve diğer membran kirleticiler (0,32 M; 3) sinaptozomlar (1 M - 1.2 M arayüzü), 4) mitokondri ham (pelet) müteakip arıtma aşamaları için kullanılan </li></ol> 3. Mitokondri ilişkili ER Membran izolasyonu, MAM <ol><li> Taze eklenmiş proteaz inhibitörleri içeren 2 ml İzolasyonu Ortamda bir beyin yarısından itibaren mitokondri taze izole ham süspanse edin. </li><li> Degrade Arabellek 8 yarım beyin ml başına ve Ultra-Clear Beckman Santrifüj Tüpü yer ile% 30 Percoll degrade hazırlayın. </li></ol> * Not: d sonra doğru final konsantrasyon elde etmek için (1.43 kat) degrade tampon daha konsantre olun% 30 Percoll iluting. <ol start="3"><li> Hazırlanan degrade üstüne Katman mitokondriyal süspansiyon YAVAŞÇA kabarcıkları önlemek için. </li><li> 30 dak, 4 ° C ve 95.000 x g&#39;de santrifüje </li><li><ol class="lroman"><li> Bir cam Pasteur pipeti ile İLK Ağır Fraksiyonu (alt bant) çıkarın ve yeni bir yuvarlak tabanlı cam tüp aktarmak, buz üzerinde. </li><li> Başka bir cam Pasteur pipeti ile İKİNCİ Işık Fraksiyonu (üst bant) çıkarın ve buz üzerinde, ayrı bir taze yuvarlak alt cam tüp transfer. </li></ol></li><li> 4. 10 dakika için 6300 x g 10 ml izolasyon Orta ve santrifüj ile adım 3,5 toplanmış ve her iki fraksiyonu ° C. seyreltilir </li><li> , Adım 3.6 &#39;de elde edilen ağır fraksiyondan süpernatan atın başka bir 10 ml izolasyon Orta ile pelet tekrar süspansiyon ve adım 3.6 gibi, yeniden santrifüjlenir. Sonuçta elde edilen topak kesir saf mitokondriyal olacaktır. </li><li> Işık Frac gelen supernatant aktarıntion buz üzerinde, bir Ultra-Clear Beckman Santrifüj Tüpü adım 3.6 elde. Pelet atın. </li><li> 1 saat, 4 ° C 100.000 xg&#39;de tüp ve santrifüj doldurmak için adım 3.8 &#39;de elde edilen süpernatant yeterli İzolasyon Orta Ekle Sonuçta elde edilen topak kesir MAM olacaktır. Dikkatlice süpernatant kaldırmak ve atın. </li></ol> Not: Bu aşamada, aynı zamanda 1 saat, 4 100,000 xg&#39;de santrifüj ° C ile adım 2.6 olarak kaydedilir süpernatant. Topak kesir ER olması ve sitosolik kısmını süpernatant olacaktır. 4. Glycosphingolipid-zenginleştirilmiş Microdomains, GEM&#39;lerle çıkarımı <ol><li> Buz üzerinde 20 dakika süreyle Ekstraksiyon tampon 500 ul-1 ml saf mitokondri ve / veya MAM kesirler Lyse. </li><li> 4 de 2 dakika için 15,300 x g&#39;de santrifüjleyin lizatları ° C. </li><li> Süpernatantlar (Triton X-100 çözünür malzeme) ve yeniden santrifüj granül Collect2 dakika için çözünür malzeme kalan çıkarmak için kullanılır. (Triton X-100 Mitokondri ekstre edilmiş ve / veya Triton X-100 ekstre MAM). </li><li> Tampon solubilising yılında pelet çözünür. Bu Çözelti halindeki materyale GEM fraksiyonlar temsil eder ve daha fazla analiz için de kullanılabilir. </li></ol>

<ol><li>Poburko, D., Kuo, K. H., Dai, J., Lee, C. H., van Breemen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organellar+junctions+promote+targeted+Ca2%2B+signaling+in+smooth+muscle%3A+why+two+membranes+are+better+than+one%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Pharmacol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Organellar junctions promote targeted Ca2+ signaling in smooth muscle: why two membranes are better than one.</a> Trends Pharmacol. Sci. 25 (1), 8-15 (2004).</li>
<li>Pani, B., Ong, H. L., Liu, X., Rauser, K., Ambudkar, I. S., Singh, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+rafts+determine+clustering+of+STIM1+in+endoplasmic+reticulum-plasma+membrane+junctions+and+regulation+of+store-operated+Ca2%2B+entry+%28SOCE%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Lipid rafts determine clustering of STIM1 in endoplasmic reticulum-plasma membrane junctions and regulation of store-operated Ca2+ entry (SOCE.</a> J. Biol. Chem. 283 (25), 17333-17340 (2008).</li>
<li>Levine, T., Rabouille, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoplasmic+reticulum%3A+one+continuous+network+compartmentalized+by+extrinsic+cues%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Endoplasmic reticulum: one continuous network compartmentalized by extrinsic cues.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 17 (4), 362-368 (2005).</li>
<li>Sano, R., Annunziata, I., Patterson, A., Moshiach, S., Gomero, E., Opferman, J., Forte, M., d'Azzo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GM1-ganglioside+accumulation+at+the+mitochondria-associated+ER+membranes+links+ER+stress+to+Ca%282%2B%29-dependent+mitochondrial+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">GM1-ganglioside accumulation at the mitochondria-associated ER membranes links ER stress to Ca(2+)-dependent mitochondrial apoptosis.</a> Mol. Cell. 36 (3), 500-511 (2009).</li>
<li>Raturi, A., Simmen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Where+the+endoplasmic+reticulum+and+the+mitochondrion+tie+the+knot%3A+The+mitochondria-associated+membrane+%28MAM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Where the endoplasmic reticulum and the mitochondrion tie the knot: The mitochondria-associated membrane (MAM).</a> Biochim. Biophys. Acta. , (2012).</li>
<li>Giorgi, C., De Stefani, D., Bononi, A., Rizzuto, R., Pinton, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+functional+link+between+the+mitochondrial+network+and+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Biochem.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural and functional link between the mitochondrial network and the endoplasmic reticulum.</a> Int. J. Biochem. Cell Biol. 41 (10), 1817-1827 (2009).</li>
<li>d'Azzo, A., Tessitore, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sano+Gangliosides+as+apoptotic+signals+in+ER+stress+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Sano Gangliosides as apoptotic signals in ER stress response.</a> Cell Death Differ. 13, 404-414 (2006).</li>
<li>Kroemer, G., Galluzzi, L., Brenner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+membrane+permeabilization+in+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial membrane permeabilization in cell death.</a> Physiol. Rev. 87, 99-163 (2007).</li>
<li>Rizzuto, R., Brini, M., Murgia, M., Pozzan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microdomains+with+high+Ca2%2B+close+to+IP3-sensitive+channels+that+are+sensed+by+neighboring+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Microdomains with high Ca2+ close to IP3-sensitive channels that are sensed by neighboring mitochondria.</a> Science. 262, 744-747 (1993).</li>
<li>Lynes, E. M., Bui, M., Yap, M. C., Benson, M. D., Schneider, B., Ellgaard, L., Berthiaume, L. G., Simmen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palmitoylated+TMX+and+calnexin+target+to+the+mitochondria-associated+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Palmitoylated TMX and calnexin target to the mitochondria-associated membrane.</a> EMBO J. 31 (2), 457-470 (2011).</li>
<li>Fujimoto, M., Hayashi, T., Su, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+cholesterol+in+the+association+of+endoplasmic+reticulum+membranes+with+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">The role of cholesterol in the association of endoplasmic reticulum membranes with mitochondria.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 417 (1), 635-639 (2012).</li>
<li>Grimm, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ER-mitochondria+interface%3A+the+social+network+of+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">The ER-mitochondria interface: the social network of cell death.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1823 (2), 327-334 (2012).</li>
<li>Vance, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipid+synthesis+in+a+membrane+fraction+associated+with+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Phospholipid synthesis in a membrane fraction associated with mitochondria.</a> J. Biol. Chem. 265, 7248-7256 (1990).</li>
<li>Wieckowski, M. R., Giorgi, C., Lebiedzinska, M., Duszynski, J., Pinton, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mitochondria-associated+membranes+and+mitochondria+from+animal+tissues+and+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation of mitochondria-associated membranes and mitochondria from animal tissues and cells.</a> Nat. Protoc. 4 (11), 1582-1590 (2009).</li>
<li>Pizzo, P., Viola, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphocyte+lipid+rafts%3A+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Lymphocyte lipid rafts: structure and function.</a> Curr. Opin. Immunol. 15 (3), 255-260 (2003).</li>
</ol>

Yazarların hiçbiri bildirmek için herhangi bir çıkar çatışması var.

Intrasellüler membranlar arasında veya organel ve hücre plazma zarı arasındaki temas siteleri temel hücresel süreçler için dinamik sinyal platformlarda temsil etmektedir. Fizyolojik ve patolojik koşullarda hem altında işlev ve kompozisyon doğru karakterizasyonu güvenilir ve tekrarlanabilir arıtma protokolü gerektirir. Burada ayrıntılı yöntemler özellikle erişkin fare beyin MAM ve bunlara karşılık gelen GEM&#39;lerle izolasyonu ve saflaştırılması için laboratuvar tarafından optimize edilmiştir. Bu protokol başarıyla çocu...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif / Malzeme Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog Numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> REAKTİFLER </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Damıtma </td></tr><tr><td> Sakaroz </td><td> Fisher Scientific </td><td> S5-500 </td><td></td></tr><tr><td> Sodyum bikarbonat </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S-5761 </td><td></td></tr><tr><td> Magnezyum Klorür, hekzahidrat </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP214-500 </td><td></td></tr><tr><td> Kalsiyum Klorür, Dihydrate </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C-5080 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> MAM </td></tr><tr><td> D-Manitol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M9546-250G </td><td></td></tr><tr><td> Hepes </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP310-500 </td><td></td></tr><tr><td> EGTA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E4378-250G </td><td></td></tr><tr><td> BSA, Fraksiyon V, Isı Şok, liyofilizat </td><td> Roche </td><td> 03-116-964-001 </td><td></td></tr><tr><td> Percoll </td><td> GE </td><td> 17-0891-02 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> GEM </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T9284-500 ml&#39;lik </td><td></td></tr><tr><td> Sodyum klorür </td><td> Fisher Scientific </td><td> S271-3 </td><td></td></tr><tr><td> Tris Baz </td><td> Roche </td><td> 03-118-142-001 </td><td></td></tr><tr><td> HCl </td><td> Fisher Scientific </td><td> A144S-500 </td><td></td></tr&gt; <tr><td> EDTA </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP120-500 </td><td></td></tr><tr><td> Sodyum dodesil sülfat (SDS) </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP166-500 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Ortak </td></tr><tr><td> Komple Proteaz İnhibitörleri tabletler, EDTA-ücretsiz </td><td> Roche </td><td> 11-873-580-001 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> EKİPMAN </td></tr><tr><td> 2 ml Douce All-Cam Doku Değirmenleri </td><td> Kimble Chase </td><td> 885300-0002 </td><td></td></tr><tr><td> 15 ml Polipropilen Konik Santrifüj Tüpleri, BD Falcon </td><td> BD </td><td> 352097 </td><td></td></tr><tr><td> 30 ml Yuvarlak Dipli Cam Santrifüj Tüpleri </td><td> Kimble Chase </td><td> 45500-30 </td><td></td></tr><tr><td> 15 ml Yuvarlak Dipli Cam Centrifüg Tüpler </td><td> Kimble Chase </td><td> 45500-15 </td><td></td></tr><tr><td> Ultrasantrifüj tüpler, Ultra Clear, Thinwall, 14x89 mm </td><td> Beckman-Coulter </td><td> 344059 </td><td></td></tr><tr><td> Parafilm </td><td> Cole-Parmer </td><td> PM996 </td><td></td></tr><tr><td> Tek borosilikat Cam Pasteur pipetler, 9 &quot; </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-678-20C </td><td></td></tr></tbody></table>

mitokondri ilişkili er membranlar (mam) ve glycosphingolipid zenginleştirilmiştir microdomains (gem&#39;lerle): fare beyin izolasyon

Mitochondria-associated ER Membranes (MAMs) and Glycosphingolipid Enriched Microdomains (GEMs): Isolation from Mouse Brain

Hücre içi organel ve hücre şekli özel akışı içsel ve dışsal uyaranlara maruz bileşim, değişen yüksek dinamik yapılardır. Onların membranlar genellikle sinyal molekülleri ve membran bileşenlerinin 1,2,3,4 alışverişi için hub haline tanımlanan temas sitelerde, yan yana. Endoplazmik retikulum (ER) ve + kanal mitokondri ilişkili-ER membran veya MAM 4,5,6 olarak bilinir IP3 duyarlı Ca 2 açılışında mitokondri arasında oluşan inter-organel zarı microdomains. Protein / lipit bileşimi ve bu membran temas sitelerin biyokimyasal özellikleri yaygın, özellikle hücre içi Ca 2 + 4,5,6 düzenlenmesinde kendi rolü ile ilgili olarak çalışılmıştır. ER +, ve bu sıfatla Ca 2 mansap hücresel süreçlerin sayısız düzenleyen hücre içi Ca 2 primer deposu olarak hizmet + sinyalizasyon dahiltranslasyon sonrası protein katlanması ve protein maturation7 uding. Mitokondri, diğer taraftan, bu şekilde alt-Ca 2 + balanssızlık 4,8 apoptotik yollarının önlenmesi başlatma sitosolik Ca2 + konsantrasyon tamponlama göre, Ca2 + homeostazını korumak. MAM ve dinamik yapısı onları ideal sitesi Ca 2 + sinyalizasyon ve mitokondrial Ca 2 + konsantrasyonu, lipit biyosentezi ve taşınması, enerji metabolizması ve hücre sağkalımı 4,9,10,11,12 düzenlenmesi de dahil olmak üzere temel hücresel mekanizmaları incelemek için yapar. Birçok protokol karaciğer doku ve kültürlenmiş hücrelerde 13,14 bu microdomains saflaştırılması için tarif edilmiştir. Dikkate önceden yayınlanmış yöntemleri alırsak, biz yetişkin fare beyin mitokondri ve MAM ve izolasyonu için bir protokol adapte var. Bu prosedür için biz ekstra bir saflaştırma adımı, yani bir Triton X100 ekstraksiyon, eklemiş hangi enables MAM arasında glycosphingolipid zenginleştirilmiş microdomain (GEM) fraksiyonu izolasyonu. Bu GEM hazırlıklar plazma zarı veya diğer intrasellüler membranların elde caveolae ve lipid sallar, birkaç protein bileşenleri paylaştığı ve reseptör proteinlerinin kümeleme için puan toplamak olarak ve protein-protein etkileşimleri 4,15 için çalışması önerilmiştir.

Biz güvenle MAM, GEM&#39;lerle ve fare beyin mitokondriyal kesirler izolasyonu ve saflaştırılması için tavsiye ederim bu protokolü kullanarak bizim deneyimlerine dayanarak. Özetlenen prosedür yüksek oranda tekrarlanabilir ve tutarlıdır. Şekil 1&#39;de bir Percoll degrade (adım 3.4) üzerine bir şekilde saf mitokondri ve MAM tabakasının temsilcisi görüntüsünü gösterebilir. MAM fraksiyonu mitokondri üzerinde yaygın ve geniş bant yukarı yapar iken içeren tanımlanmış, sütlü bandı, ultrasantrifüjdeki tüpün di...

Bu işlem yetişkin fare beyin mitokondri ilişkili ER membranlar veya MAM ve MAM ve mitokondriyal hazırlıkları glycosphingolipid zenginleştirilmiş microdomain fraksiyonları izole etmek için nasıl göstermektedir.

Mitokondri ilişkili ER Membranlar (MAM) ve Glycosphingolipid zenginleştirilmiştir Microdomains (GEM&#39;lerle): Fare Beyin izolasyon

Intracellular organelles are highly dynamic structures with varying shape and composition, which are subjected to cell-specific intrinsic and extrinsic ...

Bu prosedürün genel amacı, fare beyninden mitokondri, endoplazmik retikulum membranı, mikro alanlar veya MAM'lar izole etmektir. Gliko-parmak lipidce zenginleştirilmiş mikro alan fraksiyonlarını veya GEM'leri elde etmek için purifiye edilmiş MAM'lar daha sonra ekstrakte edilir. Bu işlem, öncelikle fare beyninin diseke edilmesi ve ardından Dounce homogenizatör kullanılarak spesifik bir tampon çözeltide homogenize edilmesiyle gerçekleştirilir. Elde edilen homogenat, çekirdekleri, parçalanmamış hücreleri ve hücresel kalıntıları uzaklaştırmak için düşük hızda santrifüjlenir.İkinci adım, kaba bir mitokondriyal fraksiyon hazırlamaktır. Süpernatantın daha fazla santrifüj edilmesiyle elde edilen pelet yeniden süspanse edilir ve süreksiz bir sükroz gradyanı kullanılarak daha fazla ayrıştırılır. Ardından, kaba mitokondriyal fraksiyon bir peral gradyanına uygulanır.Santrifüjleme ve birkaç yıkama adımının ardından, saf mitokondriyal fraksiyon ve MAM'lar elde edilir. Son adım, gliko-parmak lipidce zengin mikro domain fraksiyonu gem'i özütlemek için MAM'ların TRITTON X 100 içeren bir solüsyonla işlenmesidir. Son olarak, fraksiyonların saflığı, çeşitli organel fraksiyonlarının karakteristik protein markerlarına karşı antikorlar kullanılarak yapılan western blot analizleri ile doğrulanır.Bu prosedürün mevcut yöntemlere göre temel avantajı, nispeten küçük miktardaki çalışma materyali kullanılarak yetişkin fare beyninden mitokondri, MAM ve GEM fraksiyonlarının izolasyonu için adapte edilmiş olmasıdır. Bu optimize edilmiş prosedür oldukça tekrarlanabilirdir ve özellikle nörobiyoloji alanındaki araştırmacıların ilgilendikleri proteinlerin analizi için kullanabilecekleri yeterli miktarlarda farklı organel fraksiyonlarının izole edilmesine olanak tanır. Prosedür, laboratuvarımdan bir teknisyen tarafından gösterilecektir.Karbondioksit ile ötanize edilmiş bir fareden beyin çıkarıldıktan sonra, bu prosedüre beyni ikiye bölerek başlayın. Her bir yarıyı buz üzerinde ayrı iki mililitrelik tüplere yerleştirin. Teraziyi sıfırlamak için önceden soğutulmuş boş bir iki mililitrelik tüp kullanarak tüpleri tartın ve buz üzerinde saklayın.Beynin yarısını, içerisinde 1 mL soğuk fraksiyonlama çözeltisi bulunan, önceden soğutulmuş iki mililitrelik cam bir doku öğütücüye aktarın. Geniş açıklıklı bir havan eli ile toplam 15 darbe uygulayarak homojenize edin. Homojenatı buz üzerinde steril 15 mL'lik bir Falcon tüpüne yerleştirin ve numune ağırlığına göre 10 hacme kadar soğuk fraksiyonlama çözeltisi A ile seyreltin.Ardından örneği 4 °C'de 10 dakika boyunca 1.400 ×g'de santrifüjleyin. Pellete zarar vermemeye dikkat ederek süpernatantı dikkatlice uzaklaştırın ve buz üzerinde 30 mL'lik yuvarlak tabanlı cam santrifüj tüpüne aktarın. Sonrasında, pellet'i aynı miktarda (10 hacim) fraksiyonlama çözeltisi içinde yeniden süspande edin.Yeniden süspande edilen peleti, aynı öğütücüde, her seferinde bir mililitre olacak şekilde homogenize edin. Bu sefer, düşük toleranslı bir havan eli ile üç ila altı darbe uygulayın. Homojen karışımı 15 mililitrelik bir Falcon tüpünde birleştirin ve 4 °C'de 10 dakika boyunca 710 ×g hızında santrifüjleyin.Bu işlem, çökelmiş çekirdeklerin ve hücre kalıntılarının oluşmasıyla sonuçlanır. Süpernatantı dikkatlice uzaklaştırın ve mitokondriyal izolasyona başlamak için bunu önceki santrifüjlemeden saklanan önceki süpernatant ile birleştirin; süpernatantları 4 °C'de, 13.800 ×g hızda 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Ardından, süpernatantı buz üzerinde bir UltraClear Beckman santrifüj tüpüne aktarın.Mitokondri fraksiyonunu içeren peletleri, 10 hacim fraksiyonlama çözeltisi A içerisinde yeniden süspande edin ve her seferinde bir mililitre olacak şekilde homojenize edin. Bu kez, küçük açıklıklı bir Pele kullanarak üç ila altı strok uygulayın ve homojenatları buz üzerinde yeni bir 30 mililitrelik yuvarlak tabanlı cam santrifüj tüpünde birleştirin. Bu adımları bir kez daha tekrarlayarak örneği daha fazla saflaştırın.Homojenatı santrifüj edin. S süpernatanlarını çekin ve hücre peletini 10 hacim çözelti A içinde süspande ettikten sonra her seferinde bir mililitre olacak şekilde yeniden homojenize edin. Bir sonraki adım, zenginleştirilmiş mitokondriyal fraksiyonu içeren peleti, orijinal beyin ağırlığının gramı başına 4,8 mililitre fraksiyonlama çözeltisi B ile yeniden süspande etmek ve yeni bir homojenizatörde küçük boşluklu bir havan eliyle altı darbe kullanarak homojenize etmektir; bu homojenatı buz üzerinde saklayın. Ardından, bir UltraClear Beckman santrifüj tüpünde süreksiz bir sükroz gradyenti hazırlayın.İlk olarak, resüspande edilmiş peleti ekleyin ve ardından üç mililitre 850 millimolar sükroz, üç mililitre bir molar sükroz ve son olarak üç mililitre 1.2 molar sükroz ekleyin. Kabarcık oluşmadığından emin olmak için çözeltiyi alttan yavaşça eklediğinizden emin olun. Son olarak, dört derece Celsius'ta iki saat boyunca 82,500 ×g'de santrifüjleyin.Elde edilen ayrıştırma sonucunda üç bant oluşacak ve bir süpernatant meydana gelecektir. Süpernatant, sonraki saflaştırma basamaklarında kullanılacak olan ham mitokondrileri içerir. Bir beyin yarısından yeni izole edilmiş ham mitokondrileri iki mililitre izolasyon ortamı ile yeniden süspande edin.Ardından, temiz bir UltraClear Beckman santrifüj tüpüne sekiz mililitre %30'luk çekirdek gradyanı ekleyin. Herhangi bir kabarcık oluşumunu önlemek için mitokondriyal süspansiyonu, hazırlanan gradyanın üzerine çok yavaş bir şekilde katmanlayın. Daha sonra, gradyan ayrıştırmasını takiben dört santigrat derecede 30 dakika boyunca 95.000 xg hızında santrifüjleyin.İlk olarak, alt bant olan ağır fraksiyonu bir cam pasta pipet yardımıyla alın ve taze bir yuvarlak tabanlı cam tüpe aktarın. Tüpü buz üzerinde saklayın. Ardından, üst bant olan hafif fraksiyonu yeni bir cam pasta pipetle alın ve ayrı bir taze yuvarlak tabanlı cam tüpe aktarın.Bu tüpü de buza yerleştirin. Her iki fraksiyonu 10 mililitre izolasyon ortamı ile seyreltin ve 4 °C'de 10 dakika boyunca 6.300 ×g'de santrifüjleyin. Ağır fraksiyondan süpernatantı uzaklaştırın ve peleti başka bir 10 mililitre izolasyon ortamı ile yeniden süspande edin.Örneği aynı koşullar altında tekrar santrifüjleyin. Elde edilen pelet, saf mitokondriyal fraksiyon olacaktır. Ardından, hafif fraksiyondaki süpernatantı buz üzerinde bir UltraClear Beckman santrifüj tüpüne aktarın.Bu fraksiyondan elde edilen pelet, kontamine mitokondriler içerdiği için atılır. Hafif fraksiyon süpernatına, tüpü dolduracak miktarda izolasyon ortamı ekleyin ve dört derece santigrat sıcaklıkta bir saat boyunca 100, 000 ×g hızında santrifüjleyin. Elde edilen pelet, mitokondri ile ilişkili ER membranlarını veya MAM'ları içerecektir.Süpernatantı dikkatlice uzaklaştırın ve atın. MAM fraksiyonunu, buz üzerinde 20 dakika boyunca 500 µL ila 1 mL ekstraksiyon tamponu ile inkübe ederek gliko-parmak lipidce zengin mikro alanların veya gemlerin ekstraksiyonuna başlayın. Ardından, lizatı 4 °C'de iki dakika boyunca 15.300 ×g ile santrifüjleyin.Süpernatanı toplayın ve geri kalan tüm Triton X-100 çözünür malzemeleri uzaklaştırmak için peleti iki dakika boyunca santrifüjleyin ve son olarak peleti çözündürme tamponu ile yeniden süspande edin. Bu çözünmüş malzeme GEM fraksiyonlarını temsil eder ve daha ileri analizler için kullanılabilir. Sitozolik fraksiyondaki endoplazmik retikulum, sitozolik proteinler ve mitokondriyal markerların saflığını ve dağılımını kontrol etmek için Western blot analizleri gerçekleştirilmiştir.Endoplazmik retikulum fraksiyonu, saf mitokondriyal fraksiyon ve MAM fraksiyonları. Western blot analizleri ayrıca, gemlerin bir cli belirteci olan cavi in one için pozitif, endoplazmik retikulum ve mitokondriyal proteinler için ise negatif olduğunu göstermiştir. Öte yandan, bu prosedür uygulanmaya çalışıldığında, Triton X 100 ile ekstrakte edilen MAM'lar endoplazmik retikulum ve mitokondriyal belirteçler için pozitif sonuç vermiş ve çok az cavi in one göstermiştir.Taze diseke edilmiş beyin dokusu kullanmanın ve ardından tüm solüsyon, örnek ve tüpleri buz üzerinde tutmanın önemli olduğunu unutmamak gerekir. Ayrıca, saflaştırma prosedürünün genel başarısını immunoblotting yoluyla belirleyebilmek için fraksiyonlamanın her adımından küçük bir örnek miktarının saklanması önerilir.

mitochondria-associated-er-membranes-mams-glycosphingolipid-enriched

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Memeli beyin dokusundan mitokondriyal görselleştirme ve analiz zorlu bir iştir. Burada, bu kritik enerji üreten organelin morfolojik ve hacimsel analizi hakkında bilgi edinmek için seri blok yüz taramalı elektron mikroskobundan (SBFSEM) elde edilen üç boyutlu (3D) rekonstrüksiyon analizinin nasıl kullanılabileceğini açıklıyoruz.

Seri Blok-Yüz Taramalı Elektron Mikroskop Kullanarak Beyin Mitokondri Analizi

Burada, sabit hücrelerde endoplazmik retikulum ve mitokondri arasındaki endojen etkileşimleri görselleştirmek ve yüksek hassasiyet ile ölçmek için bir prosedür açıklanmaktadır. Protokol, bir mitokondri ilişkili zar arayüzünde inositol 1,4,5-trifosfat reseptörü / glukoz-regüle proteini 75 / voltaj bağımlı anyon kanalı / siklofilin D kompleksi hedefleyen in situ yakınlık ligasyonu deneyinde optimize özellikleri.

Endoplazmik retikulum ve mitokondri Etkileşimleri Çalışma ile<em&gt; In Situ</em&gt; Proximity ligasyon Testi Sabit Hücrelerde

Genetik modifikasyondan sonra tüm hücrelerde mitokondri ve endoplazmik retiplinin dağılımını incelemek için bir protokol sunuyoruz, askorbat peroksidaz 2 ve horserpu peroksidaz boyama da dahil olmak üzere bağıntılı ışık ve hacim Elektron Mikroskopisi kullanılarak aynı bölümde hedef geni olan ve olmayan hücrelerin seri bölümlemesi ve elektron mikroskobu ile seri görüntüleme.

Göreli ışık ve hacim elektron mikroskobu ile mitokondri ve endoplazmik reticulum görüntüleme

Biz yetişkin bir fare beyin yarımkürenin farklı parçalanmış bölgelerinden mikroglia izolasyoniçin bir protokol sağlamak, tam uzunlukta transkripsiyon derin tek hücreli RNA sıralama için yarı otomatik kütüphane hazırlık izledi. Bu yöntem, sağlık ve hastalık mikroglia fonksiyonel heterojenite açıklığa kavuşturmak için yardımcı olacaktır.

Derin Tek Hücreli RNA Sıralamaiçin Bir Yetişkin Fare Beyin Yarımküre'den Bölgeye Özgü MikrogliaNın İzolasyon

İnsan kaynaklı pluripotent kök hücre türevi beyin organoidlerinin üretimi ve mitokondriyal hastalıkların modelinde kullanımları için ayrıntılı bir protokol açıklıyoruz.

Mitokondriyal Hastalık Modellemesi için İnsan Beyni Organoidlerinin Üretimi

Serebral parankimal arteriollerden sağlam fare serebral endotelyal "tüplerinin" yoğun bir şekilde hazırlanması, serebral kan akışı regülasyonunu incelemek için gösterilmiştir. Ayrıca, bu endotel çalışma modelinin floresan görüntüleme ve anahtar hücresel sinyal yollarının elektrofizyoloji ölçümü için, hücre içi [Ca2+] ve membran potansiyelindeki değişiklikler de dahil olmak üzere deneysel güçlerini gösteriyoruz.

Fare Beyin Parankiminin Arteriyolar Endotelinin İzolasyonu ve Fonksiyonel Analizi

Proteom ölçeğinde protein keşfi ve nicelleştirmesi ile uyumlu yüksek kaliteli mitokondri izolasyonu için iki aşamalı bir protokol sunuyoruz. Protokolümüz genetik mühendisliği gerektirmez ve bu nedenle herhangi bir birincil hücre ve dokudan mitokondri incelemek için uygundur.

Gelişmiş protein keşfi ve nicelleştirme için mitokondrinin iki aşamalı etiketsiz izolasyonu

Burada, mitokondri ile ilişkili endoplazmik retikulum (ER) membranlarının (MAM'lar) yapısal stabilizatörlerinin aksonal taşıma hızını, Alzheimer hastalığı (AD) nöronlarından nörotoksik β-amiloid (Aβ) üretimini gerçek zamanlı olarak artırarak veya sürdürerek MAM stabilizasyonunu ölçmek ve AD terapötiklerinin geliştirilmesine yardımcı olmak için doğrudan ve kantitatif bir metrik olarak hizmet etmeyi açıklıyoruz.

Alzheimer Hastalığının (AD) Nöral Modelinde Mitokondri ile İlişkili Endoplazmik Retikulum Membranı (MAM) Stabilizasyonunun Kantitatif Analizi 

Bu protokol, sadece küçük miktarlarda numune mevcut olduğunda solunum süper komplekslerinin analizi için bir tekniği tanımlar.

Küçük Doku ve Hücre Kültürü Örneklerinden Mitokondriyal Süperkompleks Analizi için Mitokondri İzolasyonu 

Mikroglial hücrelerden saflaştırılmış mitokondrinin hazırlanması, N-glikan salınımı için mitokondriyal proteinlerin izolasyonu ve yüksek çözünürlüklü doğru kütle analizörü kütle spektrometresine bağlı kızılötesi matris destekli lazer desorpsiyon elektrosprey iyonizasyonu kullanılarak hücre altı, mitokondriyal glikanların hızlı tespiti için bir protokol geliştirilmiştir.

Glikan Analizi için Microglia'dan Mitokondriyal Hazırlık

Öğrenin, fare beyninden mitokondri ilişkili ER membranları (MAM) ve glikosfingolipid açısından zengin mikrodomain (GEM) fraksiyonlarının izolasyonunu. Bu yöntem, nörobiyoloji araştırmalarında hücresel metabolizma ve sinyal yolaklarını incelemek için kullanılır.

Mitokondri ilişkili ER Membranlar (MAM) ve Glycosphingolipid zenginleştirilmiştir Microdomains (GEM'lerle): Fare Beyin izolasyon

Daha fazla video keşfet