Name: Rapid Kolorimetrik Tahliller Nitelik Biyomoleküler Örnekleri RNA ve DNA ayırt etmek (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-04T09:51:00.000+00:00
Duration: 5 min 52 s
Description: Öğrenin, RNA ve DNA'yı hızlıca ayırt etmek için kolorimetrik analiz yöntemlerini kullanmayı. Bu teknik, şeker bileşenlerinin farklı reaktivitesini temel alarak nükleik asitleri belirlemenizi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Virginia Üniversitesi ve Jeffress Memorial Trust (J-971) tarafından finanse edildi. Biz yararlı tartışmalar ve elyazmasının eleştirel okuma L. Columbus, K. Jain ve P. Randolph ederim.

1. Şekerler Azaltılması Benedict Testi <ol><li> 940 mM susuz sodyum karbonat, 588 mM sodyum sitrat dihidrat, 68 mM bakır (II) sülfat pentahidrat - Benedict&#39;in reaktif uygun bir miktar hazırlayın. Bu reaktif tepkime içinde değişiklik fark ile, en az altı ay boyunca oda sıcaklığında (RT) saklanabilir. </li><li> Yukarıdaki reaktif 6x olduğunu. Örnek test edilecek başına Böylece, 600 ul reaksiyonlar için, temiz bir 1.5 mL mikrosantrifüj tüpü (örn., Eppendorf marka) ile Benedict&#39;in reaktif 100 ul ilave edin. </li><li> 10 ul bu tüpüne örnek 500 ul yere ekleyin; optimum ses bir ilk deneme vadede renk oluşumu yoğunluğuna göre tespit edilebilir. Yeterli numune mevcut ise, daha sonraki deneylerde daha sonra seyreltik maksimum olası örnek hacmi (yani, toplam reaksiyon hacmi beş-sixths, bu durumda, örnek 500 ul) bu tür denemeler başlar, ve. </li><li> Tu için GKD 2 O ekleyinvorteks veya pipetleme çözüm karıştırmak; 600 ul son hacim getirmek olacak. </li><li> Bir kaynar su banyosu içinde 20 dakika için örnekler inkübe edin. </li><li> Banyosundan ısıtmalı örnek çıkarın ve 10 dakika oda sıcaklığında soğumaya bırakın. </li><li> &gt; 9,300 de örnek tüpü santrifüjleyin xg amacıyla sediman herhangi bir partikül madde için 5 dakika (bir FA45-24-11 Eppendorf sabit açılı rotor ~ 10.000 rpm), bu adımı nitelikten ziyade niceliği çalışmalar için daha da önemlidir. </li><li> Temiz bir küvet içine bu tüpten tablet süpernatant. </li><li> Su ile uv-vis spektrofotometre Boşluk. </li><li> 475 nm&#39;de Bu örnek absorbansları ölçülür. </li></ol> 2. Pentoz şekerler için Bial Orcinol Assay <ol><li> . Taze Bial reaktif uygun bir miktar hazırlayın - 24.2 mM orcinol monohidrat (bu bileşiğin yapısı için bakınız Şekil 2b), 6 M HCl ile% 0.025 w / v demir klorür hekzahidrat Not:Uzun süreli depolama için, Bial reaktif iki ayrı stok solüsyonlar olarak hazırlanabilir: (i) Reaktif A [konsantre HCI içinde% 0.05 w / v FeCl3 • 6H 2 O] ve (ii) Reaktif B [422 mM orcinol monohidrat 95&#39;de hazırlanmış % etanol]. Reaktif A altı ay için RT saklanabilir; Reaktif B ışığa maruz kalma sınırı folyo ile kaplı, bir ay boyunca 4 ° C&#39;de saklanabilir. Kullanımdan önce 1 (B) v / v oranı: Bu stok çözeltinin 15 (A) &#39;da karıştırılır. </li><li> Yukarıdaki reaktif 2x. Örnek test edilecek başına Böylece, bir 1.0 ml reaksiyonlar için, temiz bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpüne Bial reaktif 500 ul ilave edin. </li><li> Bu tüp 10 ul numune 500 ul yere ekleyin. Örnek yeterli olup olmadığını not 1.3 başına gibi (yukarıdaki), daha sonra maksimum olası örnek hacmi (yani, yarım toplam reaksiyon hacmi, bu durumda, örnek 500 ul) ile test reaksiyonları başlar ve oradan seyreltin. </li><li> F getirmek için tüp GKD 2 O ekleyin1.0 ml inal hacim; vorteks veya pipetleme çözüm karıştırmak. </li><li> Bir kaynar su banyosu içinde 20 dakika için örnekler inkübe edin. </li><li> Banyosundan ısıtmalı örnek çıkarın ve 10 dakika oda sıcaklığında soğumaya bırakın. </li><li> &gt; 9,300 de örnek tüpü santrifüjleyin xg amacıyla sediman herhangi bir partikül madde için 5 dakika (bir FA45-24-11 Eppendorf sabit açılı rotor ~ 10.000 rpm), bu adımı nitelikten ziyade niceliği çalışmalar için daha da önemlidir. </li><li> Görsel inceleme için temiz bir küvet içine bu tüpten tablet süpernatant. </li><li> Yarı-kantitatif analiz için, boş uv-vis su ile spektrofotometre ve 660 nm küvetini numune absorbansı ölçülür. </li></ol> 3. 2&#39;-deoxypentose Şekerler için Dische en Difenilamin Assay <ol><li> 60 mM difenilamin, 11 M glasiyal asetik asit, 179 mM sülfürik asit, v / v ethanol 62 -% Dische en difenilamin reaktif uygun bir miktar hazırlayın. Bu reaktif önceden edilebilirönceden pared ve karanlık bir kap içinde oda sıcaklığında saklanabilir veya ışığa maruz kalma sınırı, folyo ile kaplanmıştır. Pratikte reaktivitede görünen hiçbir değişiklik ile her iki-üç ayda hazırlanabilir olsa ışık hassasiyeti nedeniyle reaktif, süresiz muhafaza edilmemelidir. </li><li> Yukarıdaki reaktif 2x. Örnek test edilecek başına Böylece, bir 1.0 ml reaksiyonlar için, temiz bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpüne Dische reaktifi 500 ul ilave edin. </li><li> Bu tüp 10 ul numune 500 ul yere ekleyin. Örnek yeterli olup olmadığını not 1.3 başına gibi (yukarıdaki), daha sonra maksimum olası örnek hacmi (yani, yarım toplam reaksiyon hacmi, bu durumda, örnek 500 ul) ile test reaksiyonları başlar ve oradan seyreltin. </li><li> 1.0 ml son hacim getirmek için tüp GKD 2 O ekleyin; vorteks veya pipetleme çözüm karıştırmak. </li><li> Bir kaynar su banyosu içinde 20 dakika için örnekler inkübe edin. </li><li> Banyo ve allo gelen ısıtmalı örnek kaldır10 dk için oda sıcaklığında soğumasına o w. </li><li> &gt; 9,300 de örnek tüpü santrifüjleyin xg amacıyla sediman herhangi bir partikül madde için 5 dakika (bir FA45-24-11 Eppendorf sabit açılı rotor ~ 10.000 rpm), bu adımı nitelikten ziyade niceliği çalışmalar için daha da önemlidir. </li><li> Görsel inceleme için temiz bir küvet içine bu tüpten tablet süpernatant. </li><li> Yarı-kantitatif analiz için, boş uv-vis su ile spektrofotometre ve 600 nm küvetini numune absorbansı ölçülür. </li></ol> 4. Diğer Kullanım Notları <ol><li> Moleküllerin aşağıdaki sınıflar her bir deney için pozitif ve negatif kontrol reaksiyonları için uygun referans bileşikler şunlardır: <ul><li> Benedict&#39;in - Olumlu = ücretsiz riboz, fruktoz, glikoz; Negatif = RNA, DNA, ATP, vb. (Ücretsiz bir indirgen şeker işlevselliği olmayan herhangi bir sakarit) </li><li> Bial - Olumlu = RNA (örneğin ekmek mayası ekstresi), riboz, ATP, UMP; Negatif = sığır serum albümin (BSA), ya da başka herhangi bir protein </li><li> Dische sitesi - Olumlu = DNA (örn. calf thymus); Negatif = RNA, ATP, vb. (Herhangi bir non-2&#39;-deoksijenlenmedeki nükleotid) </li></ul></li><li> Örneğin NaCl, (NH4) 2 SO 4 ve K, 2 SO 4 müdahale etmediği gibi, örneğin genel tuzları, ve reaksiyon tarafından etkilenmez görünür; bu ölçümlerin daha çok protein saflaştırma kullanılan bileşikler için oldukça esnek olduğu tespit edilmiştir seyreltici içeriği. PH yüksek derecede bazik ise Deterjanlar veya üre gibi kaotropik ajanlar testlerinin reaktivite etkileyebilir, bir asidik pH aralığında nötr (metin ve protonlar görmek çünkü temel reaksiyon kimyası genellikle Bial ve Dische en deneyleri için en uygunudur Şekil 2b, c). Potansiyel olarak optimal reaksiyon koşulları, şüpheli interferents, vb. pozitif ve negatif kontrol deneyleri w kullanarak, bir vaka tarafından ayrı ayrı test edilmelidiri&#39;inci referans bileşikleri. </li></ol>

<ol><li>De Mey, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+DNA+and+RNA+quantification+methods+suitable+for+parameter+estimation+in+metabolic+modeling+of+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Comparison of DNA and RNA quantification methods suitable for parameter estimation in metabolic modeling of microorganisms.</a> Anal. Biochem. 353, 198-203 (2006).</li>
<li>Desjardins, P., Conklin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NanoDrop+Microvolume+Quantitation+of+Nucleic+Acids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids.</a> J. Vis. Exp. (45), e2565(2010).</li>
<li>Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAusubel%2C+FM+%22Short+Protocols+in+Molecular+Biology%3A+A+Compendium+of+Methods+from+Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22">Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology</a>. , 4th, Wiley. (1999).</li>
<li>Voet, D., Voet, J. G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aVoet%2C+D+%22Biochemistry%22">Biochemistry</a>. , 4th, John Wiley & Sons. (2011).</li>
<li>Adams, R. L. P., Knowler, J. T., Leader, D. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAdams%2C+RLP+%22The+Biochemistry+of+the+Nucleic+Acids%22">The Biochemistry of the Nucleic Acids</a>. , 10th, Chapman and Hall. (1986).</li>
<li>Rice, P. A., Correll, C. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRice%2C+PA+%22Protein-nucleic+acid+interactions%3A+Structural+biology%22">Protein-nucleic acid interactions: Structural biology</a>. , RSC Pub. (2008).</li>
<li>Bowman, J. C., Lenz, T. K., Hud, N. V., Williams, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cations+in+charge%3A+Magnesium+ions+in+RNA+folding+and+catalysis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cations in charge: Magnesium ions in RNA folding and catalysis.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. , (2012).</li>
<li>Balandina, A., Kamashev, D., Rouviere-Yaniv, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bacterial+histone-like+protein+HU+specifically+recognizes+similar+structures+in+all+nucleic+acids.+DNA%2C+RNA%2C+and+their+hybrids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The bacterial histone-like protein HU specifically recognizes similar structures in all nucleic acids. DNA, RNA, and their hybrids.</a> J. Biol. Chem. 277, 27622-27628 (1074).</li>
<li>Graslund, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+production+and+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Protein production and purification.</a> Nat. Methods. 5, 135-146 (2008).</li>
<li>Pagano, J. M., Clingman, C. C., Ryder, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+approaches+to+monitor+protein-nucleic+acid+interactions+using+fluorescent+probes%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Quantitative approaches to monitor protein-nucleic acid interactions using fluorescent probes.</a> RNA. 17, 14-20 (2011).</li>
<li>Benedict, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reagent+for+the+detection+of+reducing+sugars%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">A reagent for the detection of reducing sugars.</a> J. Biol. Chem. 277, e5(1908).</li>
<li>Endo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simultaneous+estimation+method+of+DNA+and+RNA+by+the+orcinol+reaction+and+a+study+on+the+reaction+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A simultaneous estimation method of DNA and RNA by the orcinol reaction and a study on the reaction mechanism.</a> J. Biochem. 67, 629-633 (1970).</li>
<li>Almog, R., Shirey, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+orcinol+test+for+the+specific+determination+of+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A modified orcinol test for the specific determination of RNA.</a> Anal. Biochem. 91, 130-137 (1978).</li>
<li>Dische, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+color+reactions+for+determination+of+sugars+in+polysaccharides%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Biochem.+Anal%22%5BJournal%5D)">New color reactions for determination of sugars in polysaccharides.</a> Methods Biochem. Anal. 2, 313-358 (1955).</li>
<li>Burton, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+study+of+the+conditions+and+mechanism+of+the+diphenylamine+reaction+for+the+colorimetric+estimation+of+deoxyribonucleic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">A study of the conditions and mechanism of the diphenylamine reaction for the colorimetric estimation of deoxyribonucleic acid.</a> Biochemical Journal. 62, 315-323 (1956).</li>
<li>Vogel, J., Luisi, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hfq+and+its+constellation+of+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Hfq and its constellation of RNA.</a> Nat. Rev. Microbiol. 9, 578-589 (2011).</li>
<li>Deckert, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+composition+and+electron+microscopy+structure+of+affinity-purified+human+spliceosomal+B+complexes+isolated+under+physiological+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Protein composition and electron microscopy structure of affinity-purified human spliceosomal B complexes isolated under physiological conditions.</a> Mol. Cell Biol. 26, 5528-5543 (2006).</li>
<li>Stevens, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Composition+and+functional+characterization+of+the+yeast+spliceosomal+penta-snRNP%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Composition and functional characterization of the yeast spliceosomal penta-snRNP.</a> Mol. Cell. 9, 31-44 (2002).</li>
<li>Sapan, C. V., Lundblad, R. L., Price, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colorimetric+protein+assay+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Appl.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Colorimetric protein assay techniques.</a> Biotechnol. Appl. Biochem. 29 (Pt. 2), 99-108 (1999).</li>
<li>Chomczynski, P., Sacchi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+single-step+method+of+RNA+isolation+by+acid+guanidinium+thiocyanate-phenol-chloroform+extraction%3A+twenty-something+years+on%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction: twenty-something years on.</a> Nat. Protoc. 1, 581-585 (2006).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

<html> Kolorimetrik testler hızla gibi daha ileri çalışmalar için hazırlık olarak proteinler, RNA veya tüm hücre lizat gelen kompleksleri arındırıcı karşılaşılan gibi biyomoleküler karışımlar, kimyasal yapısını değerlendirmek için basit bir yaklaşım sunmak Burada sunulan. Yapısal biyoloji gibi örnek heterojenlik gibi daha anadili gibi montajları, giderek büyük sorunlar, izlediği gibi, karmaşık ve çok bileşenli kompleksler oluşturduğu edilecektir. Supramoleküler meclisleri genellikle sadece marjinal istikrarlı ve başarılı...

Much hücre biyolojisi DNA ve RNA içeren moleküler etkileşimler aracılığıyla gerçekleşir. 4 Bunlar doğal olarak oluşan nükleik asitler (UA) (örneğin, iki değerlikli katyonlar proteinler, 6 ve in vivo küçük molekül bileşiklerinin ve ligandların bir ev sahibi ile, birbiri ile etkileşim 5 7). Etkileşimler olabilir kısa veya (kinetik) uzun ömürlü, düşük afinitesi (termodinamik dayanım) orta yüksek değişebilir, hem de kimyasal özellikleri ve özgüllüğünü önemli çeşitlilik gösterebilmesidir - bazı dernekler (örneğin, DNA oldukça özeldir · · transkripsiyon faktörleri, RNA · · · yapıştırma faktörler), diğer etkileşimleri mutlaka çok daha genel ise (örneğin, DNA · · · bakteriyel histon benzeri HU proteinler 8). UA ile Non-spesifik etkileşimler biomo karışımları içeren in vitro deneylerde pratik sonuçları olabilirlecules, bazı UA, en azından kullanılan deneysel koşullar gibi bir kısmını (iyonik kuvvet, çözeltinin pH, vs) altında, ilgi biyomolekülleri ile ilişkilendirir, mümkünse, ve hatta büyük bir olasılıktır. Escherichia coli hücre kültüründe yeniden birleştirici proteinin heterolog aşırı ekspresyonu vasıtasıyla, örneğin, ilgi (PI) bir proteinin üretimi düşünün, bu tür bir prosedür rutin olarak hemen hemen herhangi bir yapısal biyolojide laboratuvar gerçekleştirilir 9 başka deneyler için hazırlanırken, bu gibi. / biyokimyasal karakterizasyonu biyofiziksel, kristalizasyon, vb., ilk çabalar genellikle ideal olarak, kimyasal olarak homojen ve biyofiziksel monodisperse örnek olarak, mümkün olduğunca saf bir formda olarak da POI yeterli bir miktar elde edilmesi ile ilgili odak gibi. Konak hücre bozulması sonra, tipik bir arıtma akışı erken evrelerinde E. POI izole etmek için amaç coli proteinler, nükleik asitler, hücre duvarı enkaz,ve hücre lizat diğer bileşenler. Ancak konak UA&#39;lar birçok fizikokimyasal nedenlerle POI ile birlikte arındırmak olabilir - çok temel bir İÇN non-spesifik olarak açılan konak DNA / RNA olabilir; POI (örneğin, yukarıda belirtilen HU) genel NA-bağlanma aktivitesi olabilir; POI konak RNA veya DNA ile oldukça spesifik NA-bağlayıcı protein ancak sergi çapraz reaktivite olabilir; böylece ve; ana UA&#39;lar bir kromatografi matris ile etkileşim ve böylece sadece co-elute POI olabilir. NA safsızlıklar olasılıkla mansap deneyler (örneğin, POI • RNA bağlayıcı 10 floresans anizotropi testleri) ile müdahale edecek, çünkü bir İÇN&#39;ye konak UA&#39;lar ayrım gözetmeksizin, yüksek afiniteli bir can sıkıcı sorun teşkil edebilir. Bu tür etkileşimlerin POI nükleik asit bağlama kapasitesi aydınlatmak Alternatif olarak, beklenmeyen POI · · · NA dernekleri de, tesadüfen görülebilir. Her iki şekilde de, UA&#39;lar anahtar bileşenleri veya kirletici olup olmadığını, bir ilk ölçmek gerekir veakış deneyler için hazırlık içinde eş-arındırıcı NAS tipi (DNA, RNA) tanımlar. Çeşitli analitik yöntemler tespit ve bir örnek UA&#39;lar miktarlarının yapılmamış. Mevcut yöntemlerin çoğu (temelde ya (örneğin, tiazol portakal veya NA diğer floresan boya bağlayıcı) florometrik, (örneğin, A 260 absorbans değerleri ve A 260 / A 280 oranları) spektrofotometrik veya kolorimetrik olarak kimyasal reaksiyonlara nükleosidlerin duyarlılık elektromanyetik spektrumun UV-vis bölge) emici verim kromofor olarak son zamanlarda De Mey ve ark tarif. 1 Ancak, RNA veya DNA gibi polinükleotid türünü tanımlamanın önemli adım bu kantitatif çoğunun kapsamı dışındadır yaklaşımlar. Burada hızlı bir protein örnek NA bileşenlerin türleri belirlemek için kolorimetrik analizler kümesi sağlar. Protokoller burada c açıklananverimli bir potansiyel NA safsızlıkların izole ek adımlar yürütülür, ve (Şekiller 1 ve 2) 2&#39;-deoxypentoses arasında şekerler 11, 12,13 pentozlara için orcinol tahlil, difenilamin ve reaksiyon 14,15 azaltılması için Benedict&#39;in tahlil dayanmak edilmesi . Benedict&#39;in testi (Şekil 2a) +, şeker en karbonil birlikte oksidasyon ile olduğu gibi Cu 2 O-, bir karboksilat parçası ve üretim için Cu 2 azaltmak için bir aldoz şeker doğrusal, açık-zincirli (aldehit) formu yeteneği kullanır çözünmeyen kırmızı çökelti. Bu reaksiyon gibi aldoses ve ketoses (hangi enediol ara ile ilgili aldoses dönüştürmek) gibi ücretsiz indirgen şekerler ile pozitif test değil, bir DNA veya RNA polinükleotid arasında kovalent omurga parçası olarak siklik forma kilitli olduğundan pentoz şeker ile. Olacak Bir serbest hemiasetal işlevsellik minimalist gereksinimi, diğer ortak nedeniyleve bu nedenle potansiyel interferents olarak hareket - - Bu testte pozitif test edebilir mpounds α-hidroksi-ketonlar ve kısa oligosakkaritler (örn. disakkarit maltoz) içerir. Her iki Bial orcinol (Şekil 2b) ve Dische en difenilamin (Şekil 2c) reaksiyon polinükleotid omurga başlangıç ​​imha dayanır, nükleosid depurination ve daha fazla asit ya da ebeveyn nükleotidlerin baz-katalizörlü hidroliz yolu ile, furan-2 vermek üzere -karbaldehid (furfural) türevleri, bu türevleri daha sonra bu orcinol (Bial) ya da difenilamin (Dische) &#39;ın tam olarak bilinmemektedir kimyasal yapısının renkli yoğunlaşma ürünleri oluşturmak için reaktifler olarak fenol ya da bir polihidroksi ile reaksiyona girer. Dische en tahlil RNA özgüllüğü karşı DNA pentoz şeker daha diphenylamine ile reaksiyona ω-hydroxylevulinyl aldehit, oksidasyon duyarlı olmak amacıyla 2&#39;-deoksijenlenmedeki olmalıdır gerçeğinden kaynaklanmaktadırasidik koşullar altında bir parlak mavi bir yoğuşma (Şekil 2c) elde edildi. Burada tarif edilen aerodinamik protokolleri kullanılarak bu şeker özgü kolorimetrik reaksiyon, RNA ve DNA arasındaki farkı olabilir ve ayrıca bu tür bir biyomoleküler örnek olarak glikoz, früktoz, riboz ya da serbest gibi indirgeyici şekerler varlığını gösterir olduğunu bulduk.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif veya ekipman </td><td> Tedarikçi / şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar, notlar </td></tr><tr><td> Susuz sodyum karbonat </td><td> Fisher Scientific </td><td> S263 </td><td></td></tr><tr><td> Sodyum sitrat dihidrat </td><td> Sigma </td><td> S-4641 </td><td></td></tr><tr><td> Bakır (II) sülfat pentahidrat </td><td> VWR </td><td> VW3312-2 </td><td></td></tr><tr><td> Orcinol monohidrat </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> O1875 </td><td></td></tr><tr><td> Konsantre HCI </td><td> VWR </td><td> BDH3030 </td><td></td></tr><tr><td> Demir klorür hekzahidrat </td><td> Sigma </td><td> F-2877 </td><td></td></tr><tr><td> Difenilamin </td><td> Aldrich </td><td> 112763 </td><td></td></tr><tr><td> Asetik sirke asidi </td><td> Fisher Scientific </td><td> A28 </td><td></td></tr><tr><td> Sülfürik asit </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 258105 </td><td></td></tr><tr><td> Etanol </td><td> Koptec </td><td> V1101 </td><td></td></tr><tr><td> Riboz </td><td> Sigma </td><td> R-7500 </td><td> % 1 hazırlık w / H 2 O v </td></tr><tr><td> Ekmek mayası gelen Ribonükleik asit (S. cerevisiae) </td><td> Sigma </td><td> R6750 </td><td> H2O içinde 10 mg / ml &#39;de prep, -20 ° C de saklamak </td></tr><tr><td> Calf thymus gelen deoksiribonükleik asit (sodyum tuzu), </td><td> Sigma </td><td> D1501 </td><td> H2O içinde 10 mg / ml &#39;de prep, 4 ° C de saklamak </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Reaktifler, Ekipmanları ve Güvenlik Malzeme fo listelenenOnlar Protokol bölümünde göründükleri sırayla tabloya llowing. Aksi takdirde (yukarıda) Aksi belirtilmedikçe, tüm reaktifler oda sıcaklığı ve aydınlatma saklanabilir. (Örneğin, mikrosantrifüj tüpleri) Aşağıda listelenen herhangi bir ürün için, her zamanki marka / model / çeşitli standart biyokimyasal laboratuvar bulunan (örn., Eppendorf marka 1.5 ml mikrofuge&#39;de tüpler) kullanılabilir. Standart plastik mikrofüj tüpler santrifüjleme (örneğin, her bir protokol sonuna yakın tortu parçacıklı malzeme için) içeren adımlar için kullanılmalıdır. Tüpler kapalı olabilir sürece hiçbir özel malzeme, tercih edilir; biyokimya laboratuvarlarında bulunan tipik polipropilen tüpler iyi çalışır. Güvenlik kaygıları ve atık bertarafı konusunda, standart laboratuar önlemler (koruyucu gözlük, duman davlumbaz) ile birlikte çalışarak ve konsantre asetik, hidroklorik veya sülfirik asit içeren solüsyonları imha öncesi soyma olunmalıdır. Gibi organik reaktifler için orcinol veya diphenylamine, nitril eldiven ortak lateks (doğal kauçuk) çeşitli tercih edilir. </td></tr></tbody></table>

rapid kolorimetrik tahliller nitelik biyomoleküler Örnekleri rna ve dna ayırt etmek

Rapid Colorimetric Assays to Qualitatively Distinguish RNA and DNA in Biomolecular Samples

Biyokimyasal deneyler genellikle potansiyel olarak heterojen örneklerde doğru nükleik asit erken bir aşamada bilgi,,, protein ve diğer biyomoleküler bileşenleri gerektirir. Nükleik asitler kolayca ayırt edemez rağmen (örneğin, A 260), florometrik (örneğin, floresan boya bağlayıcı), veya kolorimetrik (nükleozid özel kromojenik kimyasal reaksiyonlar). 1 spektrofotometrik olarak analitik yöntemler de dahil olmak üzere birçok yerleşik yaklaşımları ile tespit edilebilir RNA DNA, A 260 de 260 nm ve öncelikle 280 nm civarındaki emer protein yakınındaki ağırlıklı emer nükleik asit, göreli içeriğinin basit ve hızlı 2 değerlendirme sunuyor / A 280 oranı genellikle istihdam edilmektedir. 1.5 3 Rasyolar &lt;saf nükleik asit (NA) oranları ile karakterize iken 0,8, &#39;saf&#39; protein örneklerinin göstergesi olarak alınır&gt;. HoWever, protein / NA içerik olarak açıkça veya güvenilir basit uv-vis spektrofotometrik ölçümler anlaşılan olamaz hangi senaryo vardır. Örneğin, (i) örnek olarak, bazı küçük RNA-bağlayıcı protein ile olduğu gibi, ≈ 280 nm (Trp, Tyr, Phe) de emilim için sorumlu aromatik amino asitler nispeten yoksun olan bir tane ya da daha fazla protein içerir, ve edebilir (ii) numuneleri protein / NA içeriği çok daha az açıktır ve hatta protein ve NA bileşenleri arasındaki bazı yüksek afinite dernek yansıtabilir ara A 260 / A 280 oranları (~ 0.8 &lt;~ 1.5), sergileyebilmektedir. Bu tür senaryolar için, biz hızla RNA, DNA ve biyomoleküllerin potansiyel karışık örnek indirgen şekerler ayırt etmek için burada kolorimetrik testlerin bir paketi açıklamak. Yöntemler Benedict&#39;in için pentozlara ve diğer karbonhidratların diferansiyel duyarlılığı güveniyor, Bial (orcinol) ve Dische nin (diphenylamine) reaktifler; aerodinamik protokolleri com olabilirmaddeleri ayırmak zorunda herhangi bir ek adıma gerek kalmadan, birkaç dakika içinde pleted. Deneyleri de, RNA ve DNA arasındaki farkı olarak, glikoz, früktoz, riboz ve (Şekil 1) gibi serbest indirgeyici şekerler arasında varlığını belirtir paralel olarak gerçekleştirilebilmektedir.

Sonuçlar bilinen referans bileşikleri için bu kolorimetrik tahlillerin uygulama için Şekil 3&#39;te de gösterilmiştir. Örnek nitel veri Benedict&#39;in (a), Bial orcinol, (b) ve en Dische difenilamin (c) deneyleri için gösterilmiştir, ve bu üç deneyleri için standart eğriler Şekil 4 &#39;de gösterilmiştir. Panelleri 3 (ac) &#39;de, sol paneller uygun bir reaktif / reaktif analit ile pozitif / negatif kontrol deneyleri göstermiştir; Protocols 1-3 (yukarıda) tarif edildiği gibi, bu sonuçl...

Kolorimetrik tahlillerin paketi hızla ayırt edici protein, RNA, DNA, ve potansiyel olarak heterojen biyomoleküler örneklerinde yeniden ducing şekerler için açıklanmıştır.

Rapid Kolorimetrik Tahliller Nitelik Biyomoleküler Örnekleri RNA ve DNA ayırt etmek

Biochemical experimentation generally requires accurate knowledge, at an early stage, of the nucleic acid, protein, and other biomolecular components in ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, potansiyel olarak heterojen bir biyomolekül örneğinin nükleik asit ve/veya indirgeyici şekerler içerip içermediğini belirlemektir. Ve eğer öyleyse, RNA ve DNA'yı şeker kısımlarının farklı reaktivitesine dayanarak ayırt edin. Bu, biyomoleküler karışımın serbest indirgeyici şekerler içerip içermediğini belirlemek için önce Benedict testinin uygulanmasıyla elde edilir.İkinci adım olarak, herhangi bir şeker bileşeninin pento halkaları içerip içermediğini belirleyen dosyalar, arsen veya tahlil kullanılır. Sonraki yemekler: Pento şekerinin DNA'daki gibi bir deoksiriboz olup olmadığını belirlemek için difenil amin reaktifi kullanılır. Sonuçlar, spektro fotometrik ölçümler kullanılarak standart eğrilere karşı analiz edilebilen, numunedeki şeker bazlı bileşenlerin diferansiyel reaktiviteleri tarafından oluşturulan, kolayca ayırt edilen renk ürünlerine dayalı biyopolimer tipini göstermektedir.Bu tekniğin floresan boyalar, pico green veya siber altın kullanan elektroforez gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, boyut, yük veya şeker bileşenine dayalı herhangi bir sınırlama olmaması ve şekerleri azaltmak için tahlil yapmak için zaman ve maliyet açısından veriml

rapid-colorimetric-assays-to-qualitatively-distinguish-rna-dna

Research

JoVE Journal

Chemistry

Kimya

Bu video, RNA kromojenik in situ hibridizasyonulama sırasında sinyal algılama protokolünü sunar. Bu teknik, sağlam bir doku örneğinde aktif bir onkojenik enfeksiyonu görsel olarak teşhis etmek için kullanılabilir.

RNA CISH Sinyal Tespiti: Sağlam Doku Örneklerinde RNA In Situ Hibridizasyon Sırasında Kromojenik Sinyalleri Tespit Etme Tekniği

Bu yayının amacı, görselleştirmek ve Drosophila çıkarılan RNA bir Geliştirilmiş Northern Blot protokolünün ameliyat adımları görüşmek embriyolar, hücreleri ve dokuları melanogaster etmektir. Bu protokol küçük RNA türünün etkin tespiti için özellikle yararlıdır.

Küçük RNA Türlerin Northern Blot Algılama geliştirilmiş Drosophila melanogaster

Galyum (III) 'ün 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole ve serbest baz analog düşük mikromolar hücre sitotoksisite arzetmemiştir. Bu yazıda corroles transkripsiyon inhibisyonunu değerlendirmek için, UV-Vis spektroskopisi ile bir RNA transkripsiyon reaksiyonu, etidyum bromür ile boyanmış jel ile görüntüleme RNA ve RNA miktarının açıklar ve antikanser aday özelliklerin değerlendirilmesi için basit bir yöntem ortaya koymaktadır.

Bir<em&gt; İn Vitro</em&gt; Enzimatik Deneyi Galyum (III) ve H Transkripsiyon İnhibisyonunu Tedbir<sub&gt; 3</sub&gt; 5,10,15-tris (pentaflüorofenil) corroles

Basitleştirilmiş (analog) bir okuma ile nükleik asitleri ölçmek için bir uç nokta dijital testi tanımlıyoruz. Damlacık bazlı dijital tahlillerin toplu floresansını özel enstrümantasyon yerine standart bir qPCR makinesi kullanarak ölçüyoruz ve sonuçlarımızı mikroskopi ile doğruluyoruz.

Dijital Nükleik Asit Kantifikasyon Tahliller Basit Toplu Saati

Burada, RNA örneklerinde genomik DNA (gDNA) kirlilik izleme için bir iletişim kuralı mevcut. Sunulan yöntem astar özel ribozomal DNA (rDNA) gen iç kopya etmek spacer bölge (ITS) için kullanır. Yöntem güvenilir ve hassas algılama DNA kirlenme çoğu Ökaryotlar ve prokaryotlar için uygundur.

DNA kirlenme ribozomal DNA tabanlı RNA örneklerinde değerlendirilmesi

Burada RNA DNAzyme bağımlı dekolte için bir protokol salıyoruz. Bu, RNA 2'-O-metilasyonun hızlı ve yere bağlı analizini sağlar. Bu yaklaşım, snoRNA aktivitesinin ön veya önemli değerlendirilmesi için kullanılabilir.

RRNA 2'-O-Metilasyonun DNAzyme bağımlı analizi

DNAzyme tabanlı nanomakineler, nükleik asitlerin son derece seçici ve hassas tespiti için kullanılabilir. Bu makale, özgür yazılım kullanılarak 10-23 çekirdekli DNAzyme tabanlı nanomakinelerin tasarımı için ayrıntılı bir protokolü ve örnek olarak bir Epstein-Barr virüs parçasının tespitinde uygulanmasını açıklamaktadır.

DNAzyme 10-23 - Nükleik Asit Tanıma için Tabanlı Nanomakineler

Burada, ligaz, nükleaz ve polimeraz enzimlerinin örnekleri kullanılarak nükleik asit metabolize edici enzimlerin tahlili için bir protokol sunulmaktadır. Test, enzim davranışının karakterizasyonuna izin veren, RNA ve/veya DNA hasarlarını veya yol ara ürünlerini taklit eden dupleksler oluşturmak için birleştirilebilen floresan etiketli ve etiketsiz oligonükleotidleri kullanır.

Nükleik asit metabolize edici enzimleri test etmek için modifiye sentetik oligonükleotidlerin kullanılması

Bu çalışma, gözenekli membran insertleri kullanarak aksonal mRNA'ları izole etmek için sağlam bir yöntem sunmaktadır; böylece toplam nöron ve nörit ayrımı ve RNA arındırmasını mümkün kılar. RTddPCR ile birleştiğinde, bu yaklaşım düşük kopyalı transkriptlerin mutlak nicelendirilmesini sağlar; mRNA taşınımı ve yerel çeviri çalışmalarını yüksek duyarlılık, tekrarlanabilirlik ve geniş deneysel uygulama ile kolaylaştırır.

Gözenekli Membran Insertleri ve RTddPCR Kullanarak Aksonal MRNA'ların İzolasyonu ve Nicelesi

Bu iki boyutlu (2D) öncülerden desenli ve yeniden yapılandırılabilir parçacıkların sentez deneysel olarak açıklanacaktır. Bu metodoloji polyhedra ve mikro ölçekte santimetre arasında değişen uzunluk ölçeklerinde kavrama cihazları dahil olmak üzere, çeşitli şekillerde de parçacıklar oluşturmak için de kullanılabilir.

Origami Inspired Desenli ve Reconfigurable Parçacıkların Self-assembly

Öğrenin, RNA ve DNA'yı hızlıca ayırt etmek için kolorimetrik analiz yöntemlerini kullanmayı. Bu teknik, şeker bileşenlerinin farklı reaktivitesini temel alarak nükleik asitleri belirlemenizi sağlar.

Rapid Kolorimetrik Tahliller Nitelik Biyomoleküler Örnekleri RNA ve DNA ayırt etmek

Daha fazla video keşfet