Rapid Kolorimetrik Tahliller Nitelik Biyomoleküler Örnekleri RNA ve DNA ayırt etmek

Aşağıdaki deneyin genel amacı, potansiyel olarak heterojen bir biyomolekül örneğinin nükleik asit ve/veya indirgeyici şekerler içerip içermediğini belirlemektir. Ve eğer öyleyse, RNA ve DNA'yı şeker kısımlarının farklı reaktivitesine dayanarak ayırt edin. Bu, biyomoleküler karışımın serbest indirgeyici şekerler içerip içermediğini belirlemek için önce Benedict testinin uygulanmasıyla elde edilir.

İkinci adım olarak, herhangi bir şeker bileşeninin pento halkaları içerip içermediğini belirleyen dosyalar, arsen veya tahlil kullanılır. Sonraki yemekler: Pento şekerinin DNA'daki gibi bir deoksiriboz olup olmadığını belirlemek için difenil amin reaktifi kullanılır. Sonuçlar, spektro fotometrik ölçümler kullanılarak standart eğrilere karşı analiz edilebilen, numunedeki şeker bazlı bileşenlerin diferansiyel reaktiviteleri tarafından oluşturulan, kolayca ayırt edilen renk ürünlerine dayalı biyopolimer tipini göstermektedir.

Bu tekniğin floresan boyalar, pico green veya siber altın kullanan elektroforez gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, boyut, yük veya şeker bileşenine dayalı herhangi bir sınırlama olmaması ve şekerleri azaltmak için tahlil yapmak için zaman ve maliyet açısından verimli olmasıdır. 940 milimolar susuz, sodyum karbonat 588 milimolar, sodyum sitrat dihidrat ve 68 milimolar bakırdan oluşan uygun bir hacimde altı x Benedict reaktifi hazırlayın. İki sülfat penta hidrat.

Tahlil edilecek her numune için, 1.5 mililitrelik mikro santrifüj tüpüne 100 mikrolitre altı x Benedict reaktifi ekleyin. Her tüpe 10 ila 500 mikrolitre numune ekleyin ve son hacmi 600 mikrolitre girdap veya pipete getirmek için çift damıtılmış su ekleyin. Çözeltiyi karıştırmak için.

Numuneleri kaynar su banyosunda 20 dakika inkübe edin ve ardından beş dakika boyunca yaklaşık 10.000 RPM'de santrifüjlemeden önce 10 dakika soğumaya bırakın. Herhangi bir parçacıklı malzemeyi çökeltmek için, UV ve Spektrofotometreyi 475 nanometrede su ile körelttikten sonra supinatı temiz bir damara aktarın.

Pento şekerleri için tahlil edilecek numunenin emilimini ölçün. Metin protokolüne göre 24.2 milimolar, altı molar hidrojen klorür ve hacim başına 0.025 Ağırlık ferrik klorür hekzahidrat ile taze iki x BAL reaktifi hazırlayın. Her numune için, bir mikro santrifüj tüpüne 500 mikrolitre safra reaktifi ekleyin.

Her tüpe 10 ila 500 mikrolitre numune ekleyin ve son hacmi bir mililitreye getirmek için çift damıtılmış su ekleyin. Bir karışım. Numuneleri 20 dakika kaynatın, ardından partikül malzemeyi çökeltmek için numuneyi döndürdükten sonra 10 dakika oda sıcaklığında soğutun, boş su kullanarak 660 nanometrede absorbasyonu ölçün.

60 milimolar difenil amin, yedi molar buzlu asetik asit, 179 milimolar kükürt asit ve hacim başına %62 hacimden oluşan iki x tabak difenil amin reaktifi hazırlayın. Etanol. Her reaksiyon için, toplam hacmi bir mililitreye getirmek için 500 mikrolitre reaktif, numune ve çift damıtılmış suyu birleştirin. Numuneleri 20 dakika kaynattıktan, oda sıcaklığında soğuttuktan ve döndürdükten sonra, absorbansı 600 nanometrede ölçün.

Burada, Benedicts Biles cephaneliği ve yemekleri için temsili nitel verileri, bilinen referans bileşikler için difenil amin tahlilleri gösterilmektedir. Sol paneller hem pozitif hem de negatif kontrolleri gösterir ve sağ paneller tahlillerin görünür algılama aralığını gösterir. Bu panel, yemeğin değişen heterojenlikteki numunelerle reaksiyonunu göstererek tahlillerin sağlamlığını göstermektedir.

Örneğin, RNA'lı DNA veya proteinli DNA. Dish'in tahlilinin olumlu sonuçlarının, kontamine RNA veya protein varlığında bile DNA içeren numuneler için korunduğunu unutmayın. Önceki numunelerdeki seyreltme aralıkları değişir çünkü her reaksiyonun farklı bir görsel algılama sınırı vardır.

Test edilen şekerin türüne bağlı olarak, bu standart eğride gösterildiği gibi ölçüm aralıklarını iyileştirmek için görsel algılama yerine spektrum fotometrisi kullanılabilir. Benedict testi için, Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa 30 dakikadan kısa sürede yapılabilir.