Name: Elektrofizyoloji Tabanlı Katı Desteklenen Membran Giriş (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 19 min 56 s
Description: Keşfedin katı desteklenmembran tabanlı elektrofizyoloji yöntemini, bakteri ve ökaryotik taşıyıcıları karakterize etmek için. Bu yöntem, geleneksel tekniklerle incelenemeyen elektrojenik membran taşıyıcılarını araştırmada güçlü bir araçtır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz destek ve yararlı tartışmalar için dantelli ölçümleri ve E. Bamberg katkı J. Garcia-Celma, ben Smirnova ve R. Kaback teşekkür ederim.

1. SSM tabanlı Elektrofizyoloji için bir cihaz ayarlama Detayları da şematik çizimler ve küvetler fotoğraflarını içeren ve 1, 2 kurmak teknik yayınlar, iki verilmiştir. Farklı bir çözüm Döviz yapılandırmaları ve akış protokolleri aynı zamanda yöntemi kağıt 2 tartışılmıştır. Aşağıda bir kaç son gelişmeler ve video sunumu için doğrudan ilgili olan teknik ayrıntıları ekleyin. Valf kontrolü ve veri toplama Arayüz kutusu ticari bir USB dijital çıkış / analog giriş arabirimi (NI USB 6009 National Instruments) ve valf sürücüleri içerir. Bu çözelti akışını kontrol ve veri toplama için sorumludur. Vanalar normalde hızlı vanalar 18 kadar bir gerilim ile tahrik V. Videoda bir 12 V güç kaynağı kullanmak olabilir geçiş için, Ancak 12 ile tahrik V. vardır. &lt;/ P&gt; Vana sürücü devre kartı dört valf çalışabilir. Bu Biyofizik Max Planck Enstitüsü servis tarafından imal edilmiştir. Vanalar ön panelde anahtarı üzerinden bilgisayar veya el ile kontrol edilebilir. İkinci temizlik işlemleri ve yıkama için uygundur. Ölçüm sırasında, arayüz kutusu bir vana kontrolü ve veri toplama yazılımı (surfe 2 R yazılımı, IonGate Biosciences) kullanarak bilgisayar kontrollü olduğunu. 2. Hazırlıklar Bu bölümde bir SSM-tabanlı deney elektrofizyoloji hazırlanması için farklı protokoller bahsedilmiştir. 2.1 SSM oluşumu için Lipid çözüm yapma <ol><li> 25 ul oktadesilamin (Kloroform içerisinde 5 mg / ml) ve bir cam şişe içinde 375 ul Diphytanoylphosphatidylcholine (Kloroform içinde 20 mg / ml) karıştırın. </li><li> Bir döner buharlaştırıcı ve sürekli bir nitrojen gazı akışı kullanılarak, için kloroform buharlaşmasıyaklaşık 30 dakika. </li><li> N-dekan 500 ul ile çalkalayarak cam şişe duvarlarından lipid çıkarın. Nihai lipit konsantrasyonuna 1:60 (w / w) oktadesilamindir ile 15 mg / ml &#39;dir. </li><li> Cam saklama kabı çözüm aktarın. -20 ° C&#39;de lipid çözüm Mağaza </li></ol> Referans elektrotunun 2.2 Klorlama Referans elektrotlar aşınma nedeniyle düzenli aralıklarla klorlu gerekir. <ol><li> Klorlama işleminden önce ince zımpara kullanarak eski gümüşklorid tabakasının dayanağını çıkarın. </li><li> 1 M hidroklorik asit solüsyonu içine bir platin elektrot ile birlikte gümüş tel yerleştirin ve 0,5 mA, 15 dakika boyunca klorlama. Klorlama tamamladıktan sonra, gümüş tel homojen bir koyu gri rengini değiştirir. </li></ol> Poliakrilamid jel köprünün 2.3 hazırlanması <ol><li> 100 mM pH değerinde KPI = 7, 100 mM KCI, 6 ihtiva eden bir çözelti hazırlayın% Acrylamid. </li><li> % 0.3 APS (% 10 Stok) ekleyin ve% 0.6 TEMED ve kısa bir pipet ile çözüm karıştırın. </li><li> Hemen çözelti karıştırıldıktan sonra, boş jel köprü kabına karışım, 30 ul enjekte etmek için bir pipet kullanın. Bu enjeksiyon sırasında hava kabarcıklarını önlemek için önemlidir. </li><li> 20 dakikalık bir inkübasyon süresi sırasında jel polimerize olur. </li><li> Polimerizasyon sonrası jel köprü çözeltisi (100 mM KPI pH 7, 100 mM KCI) depolanır. Jel köprünün ömrünü uzatmak için, çözelti 4 ° C sıcaklıkta saklanır </li></ol> Ölçüm çözümler 2.4 hazırlanması Farklı bileşimin çözümler değiştirilmesi durumunda, SSM çözünenlerin kuvvetli etkileşime bağlı olarak, elektrik eserler oluşturulur. Bu nedenle, solüsyonların hazırlanması için önemli bir adımdır. Çözüm Döviz eserler en aza indirmek için çözüm hazırlık sürecinde aşağıdaki önlemleri alın. <ol><li> Olmayan aktive ve bir partiden çözümler aktive olun, pH ve iyonik kuvvet ayarlayın. </li><li> Yüksek tuz arka plan çözüm Döviz eserler azaltmaya yardımcı olur. </li><li> Iki cilt halinde toplu çözüm bölün. </li><li> Aktive çözeltisine aktive edici bileşik ekleyin. Mümkün olduğunca benzer ozmolarite ve her iki çözüm iyonik gücünü tutmak için olmayan aktifleştirici çözelti içinde bir telafi edici bileşiğin kullanımı. </li><li> Çözümleri 4 ° C&#39;de saklanır ise, sıcaklık hatta küçük farklılıklar eserler üretebilir çünkü tüm çözümler, bir ölçüm başlamadan önce oda sıcaklığına ulaşıldığında emin olun. </li></ol> 3. Bir SSM tabanlı Elektrofizyoloji Deney Burada bir SSM-tabanlı bir deney elektrofizyolojik için tipik bir protokol mevcut. 3.1 SSM Kurulum hazırlanması SSM Kurulum kullanımda değilken tüpleri% 30 etanol ile doldurulur/ Su çözeltisi bakteri büyümesini önlemek için. <ol><li> Küvet monte etmeden önce, borunun ikinci etanolü ortadan kaldırmak için saf su ile yıkama sistemi. Su kapları ile etanol kaplar değiştirin. Yüksek basınç (0.6 ila 1.0 bar) yaklaşık 20-30 ml su ile sistem temiz kullanma. </li><li> PH 7.6 ya da olmayan aktive çözüm bir 100 mM KPI tampon kullanarak temizleme işlemi tekrarlayın. </li><li> Hava kabarcıkları sıvı sistemde kalır emin olun. </li></ol> 3.2 küvet Montaj <ol><li> Referans elektrot bir o-ring takın </li><li> Saklama çözeltisinden jel köprüyü ve referans elektrotu, bağlayın. </li><li> Önceden doldurunuz olmayan aktive tamponu ile çıkış konektörü, bir o-ring takın ve referans elektrot montaj tamamlamak için jel köprü bağlayın. Hava kabarcığı jel köprü ve çıkış çözelti akış yolunun kavşağında olduğunu özel dikkat gösterin. </li><li> Cuve ana parçası Preassembleyaylı kontak pin (amplifikatör bağlantısı), giriş borusu (terminal vana bağlantı), o-ring (SSM için sızdırmazlık) ve vidaları ekleyerek tte. </li><li> Bir cımbız kullanarak, depolama çözümü (etanol içinde 10 mM octadecanethiol) ve sensör çipi çıkarın. </li><li> Bir pipet kullanarak, yakl kalan çözüm yıkayın. Saf etanol, 5 ml. </li><li> Azot gazı altında elektrot kurutun. </li><li> Giriş küvetin ana parçanın menfezi, böylece küvet taban kısmının üzerine doğru bir sensör çipi yerleştirin sensörün dairesel aktif alanına yönlendirilir. </li><li> Sensör çipin aktif alanın lipid çözeltinin 1 ul ekleyin. Altın tabakası tam lipid kapalı olduğundan emin olun. </li><li> Hemen lipid çözeltisi ilave edildikten sonra, önceden monte edilmiş bir ana bölümü ekleyerek küvet kapatın. </li><li> Faraday kafesi içine küvet monte etmeden önce, tüm yüzeyler tamamen kuru olduğundan emin olun. </li><li> Idareterminal valf için yaylı kontak pin ve giriş tüp amplifikatör ect. Daha sonra Faraday kafesi içindeki vida ile küvet düzeltmek. </li><li> Küvet en üstüne çıkış konektörü takın. Son olarak, çıkış konektörü ve referans elektrot için voltaj jeneratörüne çıkış borusuna bağlanabilir. </li><li> Hemen montaj sonra küvet 0,6 barda tamponu ile yıkama sistemi. Bu kendiliğinden SSM oluşumuna yol açar. </li></ol> 3.3 Ölçüm membran parametreleri SSM kalitesini kontrol etmek için, kapasite ve iletkenlik fonksiyon jeneratörü kullanılarak ölçülür. <ol><li> Fonksiyon jeneratörü kullanarak, iletkenlik ölçmek için 100 mV DC gerilim uygulanır. </li><li> Iletkenlik hesaplayın: Mevcut çürüme membran kondansatör şarj gösterir. Kapasitör sonra tam olarak ölçülen akım verimleri Ohm kanunu kullanarak membran iletkenlik tahsil edilir. Basitlik uğruna biz cu kullanınrrent 1 saniye voltaj sonra iletkenlik G = I / ABD hesaplamak için uygulanan </li><li> Genlik ve kapasite ölçmek için 0,5 Hz frekans zirve için 50 mV tepe bir üçgen AC gerilim uygulanmalıdır. </li><li> Kapasite hesaplayın: elde edilen kare dalga akım genliği kapasitör şarj akımları temsil eder. Kapasite C transfer yüküne eşittir Q = ΔU = 100 mV bölünmesiyle IΔt. (Ben üçgen gerilim fark mevcut olumlu eksi negatif eğim olduğu için ΔU iki kez 50 mV uygulanan gerilimdir.) </li><li> Art arda membran için yaklaşık her 10 dakikada bir elektriksel parametreler izleyin. Sabit değerler ulaşana kadar 30 ila 40 dk. 1-0,6 yaklaşık bar aralığında yüksek basınçta KPI tamponu ile arasında yıkayın. </li><li> SSM kalitesi tahmin: optimal koşulların 0,1-0,2 nS ve 2-3,5 nF aralığında bulunmaktadır. 1 nF altında 0.8 nS ve düşük kapasite üzerinde bir yüksek iletkenlik gösterirSSM doğru oluşmuş olmadığını. 4 nF üzerinde bir yüksek kapasite aktif bölge SSM tarafından tamamen kapalı olmadığını anlamına gelebilir. </li><li> Parametreleri uygun aralık içinde değilse, membran atılmalıdır ve başka SSM taze hazırlanmış bir elektrot çipi kullanılarak hazırlanmıştır. </li></ol> Çözüm Döviz eserler için 3.4 Denetimi Membran parametreleri kontrol edildikten sonra, ölçüm tamponlar çözüm alışverişi eserler için test edilmelidir. <ol><li> Sıvı sistemi için ilgili çözelti kapları yerleştirin. </li><li> Manuel vanalar kullanarak, akışkan sistem hava kabarcıklarını çıkarın. </li><li> Veri toplama yazılımı kullanmak, deneyde kullanmak istediğiniz akış protokolü seçti. </li><li> 0,6 bar basınç ayarlayın ve ölçüm başlar. </li><li> Ayrı mekanik kapak anahtarlama eserler, ideal bir eser akım ölçülmelidir ya da çok SMA olmalıdırbeklenen protein taşıma sinyalleri daha ller. Çözüm Döviz eserler gözlenmesi halinde, deney devam etmeden önce tampon kompozisyon ve / veya hazırlık işlemi optimize etmek için deneyin. </li></ol> 3.5 protein örnek ekleme Ortalama proteoliposomes ya da zar parçalarının -80 ° C&#39;de saklanır Bir ölçüm için yaklaşık 30 ul&#39;lik bir kısım gereklidir. <ol><li> Olmayan bir aktive edici çözeltisi ile SSM durulayın. </li><li> Buz üzerinde protein örnek çözülme. </li><li> Üç 10-saniye sonikasyon döngüleri buz üzerinde 10 sn soğutma aralıklarla dönüştürülebilir. Proteoliposomes banyo sonikatör kullanarak sonicated vardır. Membran parçaları için bir ipucu sonikatör (50W, 30 kHz, 1 mm sonotrode çapı, yoğunluğu% 20, çevrim 0.5) kullanılır. Son Sonication adımdan sonra buz geri örnek koymayın, ancak küvet içinde hemen enjekte. </li><li> Sökün çıkış referans elektrot asse ile birlikte konektörümontajları. </li><li> Bir pipet kullanarak, protein örnek 30 ul aspire ve delik prizine pipet monte edin. </li><li> Atık kaba olmayan aktive yolunda manuel vanasını açın ve küvet hacmi içine proteoliposomes enjekte. Sensör ile küvet hacmi içine hava enjekte dikkat edin. </li><li> Pipet çıkarmadan önce, daha fazla çözüm akışını önlemek için el vanasını kapatın. </li><li> Proteoliposomes 1 ile 2 saat bir inkübasyon süresi için SSM yapışır izin verin. Bu, gece boyunca inkübe etmek de mümkündür. </li></ol> Bir SSM-tabanlı deney 3,6 Genel Prosedür <ol><li> 4 ° C&#39;de saklandığında, zaman içinde ölçüm tamponlar Isınma Tüm ölçüm tamponlar eserler önlemek için ölçüm başlamadan önce oda sıcaklığında olması gerekir. </li><li> Çözümler değiştirirken, ilk olmayan bir tüylenme doku ile çözüm kaplar içindeki tüpler temizleyin, sonra yeni şişe yerleştirin. </li><li> Ölçüm başlamadan önce, değişen işlem evrimleşmiş olabilir hava kabarcıkları, kaldırmak için el vanaları kullanın. </li><li> Sadece bir ölçüm başlamadan önce basıncını ayarlayın. Biz rutin özel valf ve boru yapılandırması, yaklaşık 1.0 ml / sn &#39;lik bir akış hızı sağlar 0.6 barlık bir basınç kullanımı. </li><li> İlk birkaç ölçümler birbiri ardına düz bir yapılabilir ve tepe akımı sabit kalır kadar reddedilmelidir. Solüsyonları pH farklılık varsa, en az 3 dakika arasında bir inkübasyon süresi ölçümlerine başlamadan önce proteoliposomes iç pH değerini ayarlamak için gereklidir. </li><li> Şimdi kurulum ölçüm için hazırdır. Gürültüyü azaltmak için en az 3 ölçüm yapılmış ve ortalaması alınmalıdır. </li></ol> 3.7 Kontrol Ölçümleri Ölçümler bir dizi sırasında bir sinyal özet protein yıkımı veya adsorpsiyon bir kaybı nedeniyle oluşabilir. Her SSM deney i olmalıdıryıkık bir denetim nclude. Bu aynı çözümleri ile tekrarlanan ölçümler yapılır. En az bir özet kontrolü aynı çözeltisi kullanılarak, tek bir ölçüm başında ve deney sonunda biri anlamına gelir. Biz deney en yüksek tepe genlik bekliyoruz koşullar altında yıkık kontrolü yapmak için tavsiye. Bu daha kolay sinyalin özet ölçmek için yapar. Sinyal özet iki özet kontrollerin zirve amplitüdleri arasında bir karşılaştırma ile tayin edilebilir. Elde edilen yüzde değeri hatlarıyla lineer bir zaman bağımlılığı varsayılarak ölçülen sinyallerin düzeltmek için kullanılabilir. 3.8 Artifact kontrolleri Mümkünse deney sonra ilgi inhibe protein, sonuçlarınızı doğrulamak için deneyin. Kalan sinyalleri muhtemelen çözüm Döviz eserler bulunmaktadır. Sinyallerin, daha sonra ölçülen eserler için düzeltilmesi gerekir. <ol><li> Saf 20-30 ml su ve% 30 etanol / 20-30 ml su ile yıkama sistemi. Sistem kullanımda değilken etanolik çözüm bakteri üremesi önler. </li><li> Bu temizleme işleminden sonra, sistemden basıncı serbest bırakmak ve tüm aletleri kapatın. </li><li> Faraday kafesi gelen küvet çıkarın ve bağlantısını kesmek. Küvet tüm parçaları bir banyo sonikatörü kullanılarak, gerekirse su ve saf etanol ile temizlenebilir. </li><li> Saf etanol ile bir cam beher sensör çipi yerleştirin. Banyo sonikatör kullanılarak 2-1 dakika boyunca sonikasyon beher. </li><li> Azot gazı altında sensör çipi kurutun. </li><li> 10 mM&#39;lik bir Octadecanthiol etanolik çözelti içinde ışıktan uzak sensör çipi saklayın. Yaklaşık 30 dakika arasında bir inkübasyon süresinden sonra sensör çipi yeniden kullanım için hazırdır. </li></ol>

<ol><li>Seifert, K., Fendler, K., Bamberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Charge+transport+by+ion+translocating+membrane+proteins+on+solid+supported+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Charge transport by ion translocating membrane proteins on solid supported membranes.</a> Biophys. J. 64, 384-391 (1993).</li>
<li>Schulz, P., Garcia-Celma, J. J., Fendler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SSM-based+electrophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">SSM-based electrophysiology.</a> Methods. 46, 97-103 (2008).</li>
<li>Garcia-Celma, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+activation+of+the+melibiose+permease+MelB+immobilized+on+a+solid-supported+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Rapid activation of the melibiose permease MelB immobilized on a solid-supported membrane.</a> Langmuir. 24, 8119-8126 (2008).</li>
<li>Mager, T., Rimon, A., Padan, E., Fendler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transport+mechanism+and+pH+regulation+of+the+Na%2B%2FH%2B+antiporter+NhaA+from+Escherichia+coli%3A+an+electrophysiological+study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Transport mechanism and pH regulation of the Na+/H+ antiporter NhaA from Escherichia coli: an electrophysiological study.</a> J. Biol. Chem. 286, 23570-23581 (2011).</li>
<li>Zhou, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Charge+translocation+during+cosubstrate+binding+in+the+Na%2B%2Fproline+transporter+of+E.coli%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Charge translocation during cosubstrate binding in the Na+/proline transporter of E.coli.</a> J. Mol. Biol. 343, 931-942 (2004).</li>
<li>Ganea, C., Fendler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+transporters%3A+charge+translocation+and+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Bacterial transporters: charge translocation and mechanism.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1787, 706-713 (2009).</li>
<li>Schulz, P., Werner, J., Stauber, T., Henriksen, K., Fendler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+G215R+mutation+in+the+Cl-%2FH%2B-antiporter+ClC-7+found+in+ADO+II+osteopetrosis+does+not+abolish+function+but+causes+a+severe+trafficking+defect%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">The G215R mutation in the Cl-/H+-antiporter ClC-7 found in ADO II osteopetrosis does not abolish function but causes a severe trafficking defect.</a> PLoS ONE. 5, e12585(2010).</li>
<li>Schulz, P., Dueck, B., Mourot, A., Hatahet, L., Fendler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+ion+channels+on+solid+supported+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Measuring ion channels on solid supported membranes.</a> Biophys. J. 97, 388-396 (2009).</li>
<li>Garcia-Celma, J. J., Smirnova, I. N., Kaback, H. R., Fendler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+characterization+of+LacY%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological characterization of LacY.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 7373-7378 (2009).</li>
<li>Garcia-Celma, J. J., Ploch, J., Smirnova, I., Kaback, H. R., Fendler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delineating+electrogenic+reactions+during+lactose%2FH%2B+symport%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Delineating electrogenic reactions during lactose/H+ symport.</a> Biochemistry. 49, 6115-6121 (2010).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

1. SSM-tabanlı elektrofizyoloji avantajları geleneksel yöntemlere göre SSM tabanlı elektrofizyoloji elektrofizyolojik araç değerli bir araç olarak kendini kanıtlamıştır. Bu kongre elektrofizyoloji, yani yama kelepçe ve gerilim kelepçe yöntemleri, uygulanamaz durumlarda özellikle yararlıdır: Apart birkaç nadir istisnalar dışında bakteriyel nakil nedeniyle bakterilerin küçük boyutu ve bu nedenle gerilim kelepçe veya yama kelepçe yöntemleri kullanılarak incelenmiştir edilemez Bu memeli hücrelerinde veya oositlerde ifade etmek zordur. Ama aynı zamanda fizyolojik ilgili memeli nakil incelenebilir. Bu durumda SSM tabanlı elektrofizyoloji hücre içi membranlardan ve nedeniyle sağlamlık ve otomasyon potansiyelinin ilaç keşfi tarama uygulamaları için taşıyıcılar için cazip. Şeffaf SSM-basedUsing geleneksel elektrofizyoloji, zaman çözülmesi karakterizasyonuorters zordur. Nakil cirosu düşük olduğu için bir &#39;dev yama&#39; ya da &#39;tam hücre&#39; yapılandırma gereklidir, bir çözüm değişim deneyde bir doğal düşük zaman çözünürlüğe sahip olan. Komplikasyon fotolitik yüzey sürümü kullanılarak aşılabilir. Bununla birlikte, yüzeyler arasında sadece sınırlı sayıda bu yaklaşım için uygundur. Burada SSM&#39;de hızlı çözüm Döviz keyfi maddeleri kullanarak yüksek zaman çözünürlüğü ile elektrofizyolojik çalışmalar yapmak için eşsiz bir fırsat sunuyor. 2. Sınırlamalar ve kritik adımlar Yama kelepçe ve voltaj-kıskaç teknikleri aksine, SSM-tabanlı elektrofizyoloji potansiyel bir uygulamak için kullanılamaz. Transporter karakterizasyonu bu nedenle membran potansiyeli güvenmeyin modları taşıma ile sınırlıdır. Genel olarak, SSM tabanlı elektrofizyoloji (Elektrojenik) taşıyıcı türüne ilişkin herhangi bir sınırlama vardır. Ama gerilim clbağlayıcı proteinler gibi hücre içi bileşenleri protein işlevleri için ise amfi veya yama kelepçe yöntemleri, avantajları olabilir. Çözüm Döviz büyük eser akımları oluşturursa Sınırlamalar, ortaya çıkabilir. Alt tabaka lipofilik bileşiklerin durumunda olduğu gibi, SSM ile güçlü bir etkileşim meydana gelir. Artefaktı kontroller ölçülen sinyallerin düzeltmek için kullanılabilir. Tüm ölçüm tampon Ayrıca yüksek tuz arka plan eserler azaltmak için kullanılabilir. Ancak durumlarda, insan yapımı büyüklüğü protein sinyali ile karşılaştırılabilir olduğu, bu obje ikinci protein ilişkili sinyal izole etmek için hemen hemen imkansızdır. Neyse ki, yüksek eserler bir optimize edilmiş bir çözüm karşılığında sıradışı. Bir SSM tabanlı elektrofizyoloji deney başarılı gerçekleşmesi için kritik olan birkaç adım vardır. Protein numunesinin hazırlanması en önemli bir parçasıdır. Proteoliposomes kullanıldığında, emin olun reconsAnayasasının süreci yeterli LPR bir temiz, tekrarlanabilir örnek verir ve taşıyıcı doğru şekilde aydınlatmaktadır. Antikorlar olup olmadığını LPR bir ELISA deneyle dondurma kırık elektron mikroskobu ve yönünü kontrol edilebilir. Sadece protein inkübe için en iyi parametreleri gösteren bir SSM kullanın. Protein enjeksiyonu bir başka önemli bir adımdır. Sonikasyon önemlidir ve hava kabarcıkları enjeksiyon sırasında kaçınılmalıdır. Hava kabarcıkları, sensör çip adsorbe protein örnek kaldırır, çünkü örnek inkübasyondan sonra ölçümler kendisi kritik bir öneme sahiptir. Bu nedenle her zaman çözüm değiştirdikten sonra hava kabarcıklarını çıkarmak. Yine de bir sinyal özet oluşabilir. Olası bir sinyal özet düzeltmek için, bu deney sırasında yıkık kontrolleri gerçekleştirmek için gereklidir. 3. İhtisas Sistemleri SSM-Kur, uygulamaya göre değiştirilebilir. Ayrıca tburada mevcut tamamen farklı, son derece uzmanlaşmış kurulumları vardır. PH degrade altında örneğin asimetrik koşullar altında protein sinyalleri ölçmek için olasılığı vardır. Üçüncü bir çözüm içinde ve proteoliposomes dışında asimetrik tampon kompozisyonlar kurmak, dinlenme çözüm, ortaya konulmak zorundadır ve bu bir çift değişim yapılandırma gerektirir. Burada olmayan aktive ve dinlenme çözümleri arasında geçiş ek bir üç yollu vana gereklidir. Biz terminal kapak eksik, ancak küvet farklı bir türü kullanılarak bir alternatif akım yolu geliştirilen sistemin zaman çözünürlüğü artırmak için. Burada aktive olan ve olmayan aktive çözüm kavşak SSM önünde 3 mm, küvet içinde yer almaktadır. Bu kurulum iyi hızlı ulaşım süreçlerinin kinetik analizi için uygundur. Bu 2 msn gibi düşük bir zaman çözünürlüğü mümkün olduğu gösterilebilir. Ticari fully otomatik sistemler ilaç tarama için daha yüksek verim amaçlayan mevcuttur. Bir hareketli birim çözümler toplar ve standart bir mikrotiter levha formatında 96-yuvalı plakalar içinde sensör yüzeye enjekte eder.

Burada Elektrojenik membran proteinlerin karakterizasyonu için sağlam bir destek zar (SSM) dayalı yeni bir elektrofizyolojik yaklaşım göstermektedir. Katı destek, bir cam slayt, sensör çipi üzerinde ince bir altın tabakası oluşur. Hidrofilik altın yüzey, bir alcanethiol reaktif tiyol grubuna bağlamak için kullanılır. Daha sonra, selfassembly bir fosfatidilkolinin monolyer en SSM oluşumunu tamamlar. Zar proteinlerinin Elektrojenik tepkisini ölçmek için, proteoliposomes veya zar parçaları SSM (Şekil 1) ile absorbe edilir. Membran ve SSM içeren protein daha sonra bir kapasitif olarak birleştirilmiş zar sistemi oluşturur. Bu nedenle, protein ihtiva eden membran şarj translokasyon SSM ile kapasitif kuplaj ile tespit edilebilir. Bu yöntem yalnızca geçici akımlar verir. Akım tepe sabit taşıma aktivitesini temsil eder. Zamana bağlı taşıyıcı currents devre analizi ile yeniden olabilir. Sensör çipi bir küvet sistemi (Şekil 2) içine monte edilir. Küvet 17 ul silindirik bir küvet hacmi (o-ring ile net ses monte). Bir yaylı kontak pin amplifikatör için temas oluşturur. Bir çıkış konektörü ana kısmının üstüne vidalanır ve referans elektrot, klorlanmış bir gümüş tel taşır. Küvet bir Faraday kafesi olarak monte edilir. Bu, hızlı bir çözelti değişimi (Şekil 3) karşılık olarak membran proteini taşınma aktivitesi sağlamak için kullanıldığı, bir sıvı yolu, bağlanır. Tek bir çözüm değişimi protokolü iki çözüm, bir aktive edici olmayan ve bir aktive edici bir çözüm, gereklidir. Akış bir arayüz kutusu üzerinde bir bilgisayar veya el anahtarları üzerinde bir vana kontrol yazılımı kullanarak basınçlı hava ile kontrol edilir.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Materials</td></tr><tr><td>Waterbath Sonicator</td><td>Bandelin</td><td>RK 52 H</td><td></td></tr><tr><td>Tip Sonicator</td><td>Hielscher Ultrasonics GmbH</td><td>UP50H</td><td></td></tr><tr><td>2 vana</td><td>NResearch, West Caldwell, ABD</td><td>NR225T011</td><td></td></tr><tr><td>Terminal valfi</td><td>NResearch, West Caldwell, ABD</td><td>NR225T031</td><td></td></tr><tr><td>Manometresi</td><td>Greisinger elektroniği</td><td>GDH 14 AN Faraday</td><td></td></tr><tr><td>kafesi</td><td>Max Planck Biyofizik</td><td></td><td></td>Enstitüsü</tr><tr><td>Küveti</td><td>Max Planck Biyofizik</td><td></td><td></td>Enstitüsü</tr><tr><td>100 ml çözelti kapları</td><td>Kartell</td><td>1623</td><td></td></tr><tr><td>O-ringler</td><td>Seal Science Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Osiloskop</td><td>Tektronix</td><td>TDS 1002</td><td></td></tr><tr><td>Referans elektrodu Max</td><td>Planck Biyofizik</td><td></td><td></td>Enstitüsü</tr><tr><td>Fonksiyon üreteci</td><td>Max Planck Biyofizik</td><td></td><td></td>Enstitüsü</tr><tr><td>Borular</td><td>SAINT-GOBAIN Performans Plastikleri</td><td>AAC00006</td><td></td></tr><tr><td>Sensör çipi</td><td>Fraunhofer Institut f&#252; r Schicht und Oberfl&#228; chentechnik</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Arayüz kutusu</td><td>Max Planck Biyofizik</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Enstitüsü Amplifikatör</td><td>Keithley</td><td>427</td><td></td></tr><tr><td>Manuel dişli</td><td>Vygon GmbH</td><td>876</td><td></td></tr><tr><td>USB analogdan dijitale dönüştürücü</td><td>National Instruments</td><td>6009</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Regeants</td></tr><tr><td>1,2&#8209; Difitanoil-sn-glisero-3-fosfatidilkolin</td><td>Avanti Polar Lipidler, Inc.</td><td></td><td></td>850356</tr><tr><td>Akrilamid / Bis-akrilamid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3574</td><td></td></tr><tr><td>Amonyum persülfat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>D- (+) - Glikoz </td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Ditiyotreitol </td><td>Sigma Aldrich</td><td>43819</td><td></td></tr><tr><td>Etanol absolut</td><td>VWR AnalaR NORMAPUR</td><td>603-002-00-5</td><td></td></tr><tr><td>Doğal E. coli lipidleri polar özü</td><td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td><td>100600</td><td>LacY sulandırma</td></tr><tr><td>için n-Dekane</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D901</td><td></td></tr><tr><td>Oktadekanetiol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>O1858</td><td></td></tr><tr><td>Oktadesilamin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>74750</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum klorür</td><td>Merck</td><td>1049360500</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum fosfat dibazik</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3786</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum fosfat monobazik</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9791</td><td></td></tr><tr><td>Tetrametiletilendiamin</td><td>BIO RAD</td><td>1610801</td><td></td></tr><tr><td>&alfa;-Laktoz monohidrat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L8783</td><td></td></tr></tbody></table>

elektrofizyoloji tabanlı katı desteklenen membran giriş

Introduction to Solid Supported Membrane Based Electrophysiology

Biz mevcut elektrofizyolojik yöntem altın kaplamalı sensör çipi ve üstüne bir fosfatidilkolinin tek tabaka üzerinde kimyasal olarak bir octadecanethiol tabakası oluşan sağlam bir desteklenen membran (SSM) dayanmaktadır. Bu meclis referans elektrot, bir klorlu gümüş tel içeren bir küvet sisteme monte edilir. Membran fragmanları ya da ilgi membran proteini içeren proteoliposomes adsorpsiyonu sonra, hızlı bir çözüm değişimi membran proteini taşıma etkinliği indüklemek için kullanılır. Tek bir çözüm değişimi protokolü iki çözüm, bir aktive edici olmayan ve bir aktive edici bir çözüm, ihtiyaç vardır. Akış, bir Faraday kafesi içinde basınçlı hava ve bir valf ve boru sistemi ile kontrol edilir. Elektrojenik taşımacılık faaliyetinin kinetik SSM ve proteoliposomes veya membran parçaları arasında kapasitif bağlantı yoluyla elde edilir. Bir yöntem olup, bu nedenle, sadece transien verimlerit akımları. Akım tepe sabit taşıma aktivitesini temsil eder. Zamana bağlı taşıyıcı akımları devre analizi ile yeniden olabilir. Bu yöntem özellikle yama kelepçe veya gerilim kelepçe yöntemlerle incelenmiştir edilemez hücre içi zarlar, gelen prokaryotik taşıyıcılar veya ökaryot taşıyıcılar için uygundur.

Şimdiye kadar, SSM-tabanlı elektrofizyoloji çoğunlukla prokaryotik kökenli 20&#39;den fazla taşıyıcılar, örneğin MELB 3, 4 ve NhaA PutP 5 (6 özetlenmektedir) karakterize etmek için kullanıldı. Ama aynı zamanda hücre içi zarlar ökaryotik taşıyıcılar, örneğin ClC7 7 hem de iyon kanalları, nikotinik asetilkolin reseptörü 8 araştırılmıştır örn. Burada 5 9 bir LPR, 10 Lacy odaklı dışarı en az% 85 sağ tarafı ile proteoliposomes kullanarak Escherichia coli Lacy şeker / H + kotransportuna bir örnek ölçümleri olarak sunuyoruz. Bu taşıyıcı protein asgari bir kinetik model giden ana adımları odaklanın. 1. Wild tip Lacy Elektrofizyolojik karakterizasyonu İlk adım, farklı pH değerinde ölçülmesi ile Elektrojenik Reaksiyon genel bir karakterizasyonu ( <strong<html> &gt; Şekil 4), substrat konsantrasyonları (Şekil 5) ve alt tabakalar. Teknik doğrulamak için, literatürde verilen K M ve pKa değerleri yeniden üretildi. Lacy arasında pH bağımlılığı iki farklı Elektrojenik reaksiyon gösterir. PH 5 ila pH 8.5 arasında, aynı zamanda, kapasitif birleştiğinde akımı arttıkça şekil değiştirir. Asidik pH değerinin, sadece hızlı bir reaksiyon Elektrojenik kalır değerleri ise alkalin koşullar altında, kararlı durum taşıma görülmektedir. Biz taşıyıcı akımları (Şekil 6) yeniden oluşturmak için devre analizi kullanılan hızlı Elektrojenik reaksiyonlardan kararlı durum sinyalleri ayırt etmek. PH 7 &#39;de tek fazlı sinyali iki fazlı olur. Bu aynı zamanda iki farklı Elektrojenik tepkiler olduğunu gösterir. Transfer yük (sinyallerinin integrali) tahmin edilen, iki reaksiyon yaklaşık% 6 ve taşıma döngüsünün toplam electrogenicity% 94 vardır. Elektrojenik reaksiyonların ove_step &quot;&gt; 2. Atama Lacy bir reaksiyon döngüsünde belirli adımlar için iki Elektrojenik reaksiyonları atamak için, E325A dantelli varyant (Şekil 7) ölçüldü. Bu varyant sadece laktoz Döviz gösterir ama çünkü proton sürümü inhibisyonunun, tüm aktif taşıma modları için eksiktir. Lacy E325A bir sinyal hızlı geçici temsil eder ve tüm ölçülen pH değerleri için sabittir. Sinyalin şekli ve büyüklüğü, asidik koşullar altında Lacy vahşi tip bir sinyal benzer. Ayrıca biz kapasitif birleştiğinde sistemlerinde ölçülen hızlı geçici akımlar için karakteristik olan azalan tepe akımı, sonra küçük bir negatif faz gözlemlemek. Laktoz bağlayıcı ve serbest Elektrojenik olmadığı için, hızlı geçici laktoz bağlayıcı ardından bir Elektrojenik yapısal geçiş ile ilişkili olmalıdır. Bu proton bırakma adım hızı limiti olduğu bilinmektedirlaktoz konsantrasyonu farkı motorlu taşıma modunda Lacy ciro için ng. Proton serbest tercih edilir, çünkü bu durumda biz, alkali pH ile taşıma hızı bir artış bekliyoruz. Bu, kararlı durum nakil Lacy vahşi tip sinyal korelasyon için geçerlidir. Üstelik sadece iç pH dantelli en kararlı durum taşıma (yayınlanmamış) etkilediğini pH degrade ölçümü ile gösterilebilir. Bu nedenle büyük Elektrojenik reaksiyon proton serbest adıma atanabilir. 3. Kinetik analizi için ölçüm Taşıma oranları ve kapalı Elektrojenik reaksiyonların belirlenmesi sonra yaklaşık 4.5 msn, yüksek zaman çözünürlüğü ile SSM Kurulum kullanılarak belirlenmiştir. Bir reaksiyon sinyal hakim Bu, koşullar altında mümkündür. Bu durumda hız sabitleri, tekrarlanan bir en küçük kareler de kullanılarak sinyallerin zaman çözünürlüğü göz önünde bulundurularak, geçici akımlar türetilebilir<html> evrişim algoritması (Şekil 8). Belirlenen hız sabitleri hem de önerilen minimum kinetik model (Şekil 9) nihayet taşıyıcı kinetik simülasyonu için kullanılmıştır. Simüle eğrileri ek olarak kinetik model kanıtlıyor SSM verileri yeniden. <img src="/files/ftp_upload/50230/50230fig1.jpg" alt="Şekil 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50230/50230fig1highres.jpg"/> Şekil 1. SSM hakkında proteoliposomes adsorpsiyonu geometrisi. SSM bir sensör çipi, yapısal bir altın kaplı cam slayt oluşur. Membran proteinlerinin Elektrojenik reaksiyonları ölçmek için, proteoliposomes veya membran parçaları SSM için emilirler. Iki geo-zar, bir kapasitif akuple sistemi oluşturur. Sadece geçici akımlar tespit edilir nedeni budur. tp_upload/50230/50230fig2highres.jpg &quot;/&gt; Şekil 2. SSM küvet sensör çipi ve referans elektrot taşır. Sensör çipi küvet taban ve küvet kafası arasında sıkışmış. Referans elektrot, bir poliakrilamid jel tuz köprüsü tarafından akış yolu izole edilir. <img src="/files/ftp_upload/50230/50230fig3.jpg" alt="Şekil 3," fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50230/50230fig3highres.jpg"/> Şekil 3,. SSM Kur sıvı Yolu ve Elektrik Devre. Tek bir çözüm değişim protokolü sadece olmayan bir aktive (NA) ve bir aktive (A) çözümü gereklidir. Akışı iki 2 yollu vana (V1) ve bir uç kapak (V2) tarafından kontrol edilir. Olmayan aktive ve aktive çözümleri arasında Terminal vana anahtarları, küvet ve bir atık kabı (W) için başka bir çözüm için çözümlerden birini yönetiyor. Sensör çipi (SSM), yükseltici (I / U) bağlanmıştır<html> referans elektrot (AgCl) harici elektrik devresindeki fonksiyon jeneratörü (F) bağlıyken. Bir bilgisayar (PC) ve bir arayüz kutusu kapak operasyonu ve veri toplama için kullanılır. <img src="/files/ftp_upload/50230/50230fig4.jpg" alt="Şekil 4," fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50230/50230fig4highres.jpg"/> Şekil 4. Aktive edici çözelti 100 mM laktoz içerirken, farklı pH değerlerinde, 100 mM laktoz konsantrasyonunda atlar sonra yabani tip Lacy proteoliposomes ile ölçülmüştür geçici akımlar. Olmayan aktifleştirici çözelti 100 mM glukoz içermektedir. Bütün çözeltiler, 1 mM DTT, belirtilen pH&#39;da 100 mM potasyum fosfat tamponu içinde hazırlanmıştır. Bu ölçüm koşulları ile ilgili ayrıntılı bilgileri ve aşağıdaki rakamlar 9 ve 10 bakınız. <html> ftp_upload/50230/50230fig5highres.jpg &quot;/&gt; Şekil 5,. Ortalama Normalize Tepe akımları farklı konsantrasyonlarda ve pH değerlerinde laktoz konsantrasyonunda atlar sonra yabani tip Lacy proteoliposomes ile ölçüldü. K M değerleri hiperbolik uyan elde edilir. <img src="/files/ftp_upload/50230/50230fig6.jpg" alt="Şekil 6," fo:content-width="4.25in" fo:src="/files/ftp_upload/50230/50230fig6highres.jpg"/> 6 Şekil. Taşıyıcı akımların İmar. Geçici akımlar (A) taşıyıcı akımları (B) yeniden oluşturmak için kullanılan pH 8.5 (mavi iz) ve pH 5.2 (kırmızı iz) de 100 mM laktoz konsantrasyonu atlar sonra vahşi tip Lacy proteoliposomes ile ölçüldü. PH 5.2 de hızlı bir Elektrojenik tepkime meydana pH 8.5 sürekli cirosu görülmektedir. Bu, açık bir şekilde yeniden akımı (B) &#39;de görülmektedir. files/ftp_upload/50230/50230fig7.jpg &quot;alt =&quot; Şekil 7 &quot;fo: içerik-width =&quot; 4in &quot;fo: src =&quot; / files/ftp_upload/50230/50230fig7highres.jpg &quot;/&gt; Şekil 7. Geçici akım pH 5.2 100 mM laktoz konsantrasyonu atlamadan sonra E325A Lacy proteoliposomes ile ölçüldü. Bu Lacy varyant taşıma döngüsünün proton serbest adımda inhibe ve bu nedenle ulaşım eksikliği olduğunu. Gözlenen küçük negatif bileşeni kapasitif olarak bağlı sistemler ölçülür hızlı geçici akımlar için karakteristik olan ve hızlı bir reaksiyon Elektrojenik sonra membran kapasitans deşarj neden olur. Bu zaman sabiti π0 sistemi (Şekil 1) kapasitans ve iletkenlikleri tarafından belirlenir. <img src="/files/ftp_upload/50230/50230fig8.jpg" alt="Şekil 8," fo:content-width="4.25in" fo:src="/files/ftp_upload/50230/50230fig8highres.jpg"/> Şekil 8. Vahşi tip Lacy proteoliposomes ile ölçülen geçici akımlar aftepH 5.2 de r farklı laktoz konsantrasyonu atlar. Bu koşullar altında herhangi bir kararlı durum ulaşım görülen, ancak laktoz üzerine bir Elektrojenik yapısal geçiş bağlama edilir. Kesikli bir çizgi, sistemin zaman çözünürlüğü temsil transfer fonksiyonunu gösterir. Ilave verilere bir hiperbolik oturuş gözlenen oranı sabit Kobs gelen hız sabitleri ve kapalı belirlenmesi gösterir. Gözlemlenen hız sabiti, tekrarlanan bir en küçük kareler ters evrişim algoritması 10 ile geçici akımlar tespit edildi. <img src="/files/ftp_upload/50230/50230fig9.jpg" alt="Şekil 9," fo:content-width="4.25in" fo:src="/files/ftp_upload/50230/50230fig9highres.jpg"/> 9 Şekil. Lacy. İki Elektrojenik adımların reaksiyon döngüsü için bir kinetik model tespit ve SSM ölçümleri ile karakterize edilebilir. Tepki olarak toplam yük deplasman ~% 94 temsil eden güçlü Elektrojenik tepkidöngüsü sadece nötr ve temel pH değerlerinde görülmektedir. Bu proton serbest adım (mavi ok) atanabilir. Yabani tip Lacy devamlı bir devir inhibe edildiğinde bir zayıf Elektrojenik aşamasında asidik pH&#39;ta görülmektedir. Biz reaksiyon döngüsünde toplam yük deplasman 6% temsil laktoz bağlama, üzerine bir Elektrojenik yapısal geçiş için bu tepki atanmış.

Burada Elektrojenik membran nakil karakterizasyonu için uygulamaları odaklı sağlam desteklenen membranlar dayalı bir elektrofizyolojik yöntem mevcut.

Elektrofizyoloji Tabanlı Katı Desteklenen Membran Giriş

The electrophysiological method we present is based on a solid supported membrane (SSM) composed of an octadecanethiol layer chemisorbed on a gold coated ...

Desteklenmiş membran tabanlı elektrofizyoloji, kısaca SSM tabanlı elektrofizyoloji, yeni bir elektrofizyolojik yaklaşımdır. Bir dizi uygulama için konvansiyonel yöntemlere kıyasla önemli bir iyileştirme sunmaktadır.Konvansiyonel elektrofizyolojinin temel aracı elektrolit dolgulu mikropartikül elektrottur; buna karşın SSM tabanlı elektrofizyoloji, katı destekli bir membran elektrot aracılığıyla yük translokasyonunu tespit eder. Bu yöntem, birkaç nadir istisna dışında voltaj klemp veya patch clamp yöntemleriyle incelenemeyen bakteriyel taşıyıcılar gibi konvansiyonel elektrofizyolojinin kullanılamadığı durumlarda son derece yararlıdır. Bu gibi durumlarda, SSM tabanlı elektrofizyolojinin oldukça başarılı olduğu kanıtlanmıştır.Ayrıca, hücre içi membranlardaki fizyolojik olarak ilgili ökaryotik taşıyıcıların incelenmesinde de kullanılabilir. SSM tabanlı elektrofizyoloji deneylerini gerçekleştirmenin birçok yolu vardır. Temel araştırmalarda, kinetik parametreleri belirlemek ve taşıma mekanizmasını aydınlatmak için uygulanabilir; ancak sağlamlığı ve otomasyon potansiyeli, onu hedef belirleme çalışmalarındaki tarama uygulamaları için ideal kılar.SSM elektrodu, altta yer alan SSM ile ilgilendiğiniz taşıma proteinini içeren proteasomların veya membran fragmanlarının benimsendiği bileşik bir membran sistemini taşır. Bileşik membranın elektriksel özellikleri, membranların kapasitif olarak eşleşmiş bir sistem oluşturduğu eşdeğer bir devre ile tanımlanabilir. Sistemdeki elektriksel davranışın, membran fragmanları veya protea lipozomlar kullanılmasına bakılmaksızın esasen aynı olduğu unutulmamalıdır.Taşıyıcı proteindeki yük yer değiştirmesi, mesane membranının kapasitansı aracılığıyla ölçüm devresine iletilir. Bu, kapasitif eşleşme olarak adlandırılan bir tespit prensibidir. Tipik bir deneyde, VSSM'de gerçekleştirilen hızlı solüsyon değişimi, taşıyıcı protein V için substratı sağlar; proteinin ardından gelen elektrogenik taşıma aktivitesi, SSM kapasitansı aracılığıyla ölçüm sistemine bağlı bir akım oluşturur.Aynı zamanda, elektrojenik protein aktivitesi lipozomal membranı kademeli olarak şarj ederek taşıma proteininin inhibisyonuna ve kayıt devresindeki akımın azalmasına yol açar; ölçülen akım, Enzo'ya absorbe olmuş ve her biri yaklaşık 100 taşıyıcı içeren milyonlarca protea lipozomun eşzamanlı taşıma reaksiyonlarının bir sonucudur. Düzenek, çözelti yolu bulunan bir Faraday kafesi, valf kontrolü için harici devreler, sinyal amplifikasyonu ile veri toplama ve analiz sisteminden oluşmaktadır.EC kafesi, çözelti akış kontrolü için gerekli olan konteynerleri, valfleri ve tüplerin yanı sıra XOR çipli bir kübiti içerir. XOR çipi, SSM elektrodunu ve absorbe edilmiş prot lipozomları taşır. Vete, harici elektrik devresinin amplifikatörüne ve fonksiyon jeneratörüne bağlıdır.SSM ölçümleri, iki çözelti kullanır; substrat hariç biri aktif diğeri ise aktif olmayan çözeltidir ve substrat yalnızca aktif çözeltide bulunur. Tekli değişim konfigürasyonunda her iki çözelti de aynı bileşime sahiptir. İki yönlü iki valf, aktif olmayan ve aktif çözeltilerin akışını kontrol eder.Mekanik olarak bağlanan üçlü bir üç yollu vana olan terminal vana, aktive edici olmayan ve aktive edici çözeltiler arasında geçiş yapmak için kullanılır; çözeltilerden birini atık konteynerine, diğerini ise qve'ye yönlendirir. Terminal vana değiştirildiğinde, aktive edici olmayan çözeltinin akışı atığa yönlendirilir ve aktive edici çözelti qve'ye akar. Bu konfigürasyon, her iki çözeltinin aynı anda sürekli akışına olanak tanır.Akış protokolünün herhangi bir aşamasında, akış yolu ihtiyaca göre optimize edilebilir. Ancak, SSM ile aktive etmeyen ve aktive eden çözeltilerin birleşme noktası arasındaki mesafenin mümkün olduğunca kısa tutulması gerektiği unutulmamalıdır. Çünkü bu mesafe, çözelti değişiminin zamanlamasını belirler.Güç kartı kafesinin dışındaki akım amplifikatörü bir sensör çipine bağlıdır. Bu ayar tipik olarak 10⁸ ile 10⁹ V/A arasında bir yükseltme ve 1 ila 10 milisaniye dinlenme süresi olarak belirlenir. Referans elektroduna bir fonksiyon jeneratörü bağlanmıştır; valf kontrolü ve veri toplama yazılımına sahip bir bilgisayar ile bir ara yüz kutusu sistemi tamamlamaktadır.Arayüz kutusu, valf sürücüsü veri toplama ve dijital çıkış donanımını içerir; çözelti akışı 0,22 bar basınçlı hava ile sağlanır. Basınç, dijital bir manometre kullanılarak izlenir. Hava kaynağı ile EC Kafesi'ndeki çözelti kapları arasına yerleştirilen bir çelik konteynerin iğne valf aracılığıyla doldurulmasıyla bu basınç korunabilir.CVIC dört kısımdan oluşur. Zen çipi, vet tabanı ile vet başlığı arasına yerleştirilmiştir. Silindirik bir çıkış konnektörü vet başlığına vidalanmıştır ve referans elektrot düzeneğini taşır.Referans elektrot, minyatür bir SMC konnektörlü klorlanmış gümüş telden oluşur ve poliakrilat jel tuz köprüsü ile akış yolundan izole edilmiştir. Kullanılmadığı zamanlarda, jel köprü düzeneği 100 milimolar potasyum klorür içeren 100 milimolar potasyum fosfat pH yedi çözeltisinde saklanır. İlk olarak, referans elektrot, jel köprüsünü içeren referans elektrot düzeneğine monte edilmelidir.Referans elektrodu yerleştirirken hava kabarcıklarının oluşmasını önlemek önemlidir. Şimdi vete'nin bu parçası, önceden tampon çözelti ile doldurulmuş olan çıkış konnektörüne takılır. Tüm bağlantıların O-ringler ile sızdırmaz hale getirilmesi gerekir.Bu SM, yapılandırılmış bir keçi kaplı cam ışık olan zor çip üzerinde oluşturulmuştur. Bu semantik yol bir milimetre çapındadır ve 0,2 milimetrelik beyaz bir kontak şeridi aracılığıyla kontak pedine bağlanmıştır. Bir yaylı kontak pini, amplifikatöre bağlantı sağlar.Zen çipi, 10 LAR Okta Deccan tiyol etanol çözeltisi içinde karanlıkta saklanır. Arkan tiyol tabakasını korumak ve absorbe edilmemiş Okta deccan viral moleküllerini uzaklaştırmak için elektrot saf etanol ile durulanır ve azot gazı altında kurutulur. Artık fosfokolin monotabaka oluşturulabilir.Lipid çözeltisi, mililitre başına 15 miligram DFI kolin ve mililitre başına 250 mikrogram Okta two A mine in decay içermektedir ve -20 °C'de saklanır. Elektrot şimdi SA küvetinin tabanına tam olarak yerleştirilir.Çözeltiden bir µL, altın tabakasına temas etmeden SSM elektroduna eklenir. Lipid çözeltisinin eklenmesinin hemen ardından vete monte edilebilir. Bir O-ring ile sızdırmazlığı sağlanan vete hacmi, monte edildiğinde 17 µL'lik bir iç hacme sahip silindirik bir yapıdadır.SSM, giriş deliğinin altına ortalanmalıdır. Bağlantı yapılmadan önce, sıvı sistemi 100 millimolar potasyum fosfat tampon çözeltisi ile önceden doldurulmalıdır. Tüplerde ve valflerde hava kabarcığı kalmadığından emin olmak önemlidir.Şimdi cihaz tiroid günlük kafesine yerleştirilebilir; amplifikatör, çözelti akış yolunun girişi ve çıkışı ile fonksiyon jeneratörü bağlanabilir. Son olarak, küvet 100 mililitre potasyum fosfat tamponu ile durulanabilir. Bu işlem, SSM kalitesini kontrol etmek için kendiliğinden SSM oluşumuna yol açar.Kapasitans ve kondüktans ölçümleri fonksiyon jeneratörü kullanılarak yapılır; kondüktansı ölçmek için 100 millivolt DC voltaj kullanılır. Akım sönümlenmesi, kapasitör tamamen şarj olduktan sonra membran kapasitörünün şarj olduğunu gösterir. Ölçülen akım, M'S yasası kullanılarak membran kondüktansını verir.Burada 0,17 nS'lik bir iletkenlik gözlemliyoruz. Kapasitans, 50 mV tepe-tepe genliğinde üçgen AC voltaj ve 0,5 Hz frekans kullanılarak ölçülebilir. Ortaya çıkan kare dalga akımının genliği, kapasitörün sızıntı akımını temsil eder.Kapasitans, aktarılan yükün uygulanan voltaja bölünmesine eşittir. Bu membran 2,3 nano kapasitans göstermektedir; yüksek iletkenlik ve düşük kapasitans, SSM'nin doğru şekilde oluşmadığını gösterir. Bu durumlarda, membran atılmalı ve yeni bir elektrot çipi kullanılarak başka bir SSM hazırlanmalıdır.Genellikle protein lipozomları -80 °C'de dondurulmuş olarak saklanır. Homojen bir protein lipozom süspansiyonu elde etmek için numune buz üzerinde çözülür; agregatlaşmış numuneler sonikasyonu engellediği için sonikasyon işlemi esastır. Üç adet on saniyelik sonikasyon döngüsü, buz üzerinde on saniyelik soğutma aralıklarıyla ardışık olarak uygulanır.SSM'lerini aktivasyon yapmayan çözelti ile durulayın. Ardından, çıkış konnektörünü referans elektrot örneği ile birlikte sökün. Bir pipet kullanarak, 30 µL protein örneğini vete çıkışından ette hacmine enjekte edin.Öncelikle pipet ucunu çıkış deliğine takın. Ardından, yukarıdaki manueli aktive edilmeyen yolda açın ve protea lipozomlarını enjekte edin. Son olarak pipet ucunu çıkarın.Çözeltinin daha fazla akışını önlemek için yukarıdaki manuel vanayı kapatın. Protea lipozomlarının SSM'ye absorbe olması için bir ila iki saatlik bir inkübasyon süresi tanıyın. Akış protokolünüzü tanımlamak için valf kontrol ve veri toplama yazılımının akış protokolü penceresini kullanın.Substrat özgüllüğünün belirlenmesi, KM değeri veya pH bağımlılığı gibi simetrik koşullar altında ölçüm yapmak istiyorsanız, tek çözelti değişim protokolünü seçin. Her çözelti için akış süresini 0,5 ile 1 saniye arasına ayarlayın. Akım, tüm akış protokolü boyunca kaydedilir.Amplifikasyon genellikle 10⁹ olarak ayarlanır ve örnekleme hızı için saniyede 2000 veri noktası seçilir. Son olarak, yeni protokolünüzü NA a ve a başlığı altında kaydedin. Akış protokolü penceresinin ikinci sekmesinde, qubit üzerinden aktive edici veya aktive edici olmayan solüsyon akışını kontrol etmek için belirli valflerin açık veya kapalı durumlarını tanımlayabilirsiniz.Burada, E. coli'den gelen şeker proton simbiyotik taşıyıcısı Y'nin proteolipozomlarındaki ölçümünü gösteriyoruz. Aktive edici çözelti, taşınan substrat olan laktozu içerirken, aktive etmeyen çözelti telafi edici bir bileşik olarak aynı miktarda taşınmayan glikoz içerir. Şekerlerin yanı sıra çözeltiler, pH 7.6'da 100 millimolar potasyum fosfat ve bir millimolar DTT içerir.Çözeltileri değiştirdikten sonra, hava kabarcıklarının giderildiğinden emin olmak için manuel valfi kullanın. Bir akış protokolüne başlamadan önce, ölçümü başlatmadan hemen önce basıncı ayarlayın. Biz rutin olarak 0.6 bar basınç kullanmaktayız; bu değer, bizim özel valf ve tüp konfigürasyonumuzda saniyede yaklaşık bir mililitre akış hızına karşılık gelmektedir.Ardından, buradan güvenli akış protokolünü, yani NAA protokolünü seçin ve her bir ölçümü başlatmak için başlat düğmesine basın. İlk birkaç ölçüm sırasında, gevşekçe absorbe olmuş proteolipozomlar uzaklaştırılır ve bu nedenle pik akımı azalabilir. Pik akımı sabit kalana kadar ölçümü tekrarlayın.Aktive etmeyen çözelti akışının ilk aşamasında akım sıfırdır. Aktive etmeyen çözeltiden, laktoz içeren aktive eden çözeltiye geçiş, membranın elektrogenik taşıma aktivitesini tetikler. Proteolipozomların içinde pozitif protein yükü birikir ve amplifikatör, SSM aracılığıyla gerçekleşen pozitif kenetlenme nedeniyle pozitif bir geçici akım tespit eder.Pozitif olarak eşleşmiş bu akıma, aktive edici çözeltiden gelen V değişim on sinyali denir. Aktive edici olmayan çözeltiye geri dönüldüğünde, lipozomların dışına proton şeker kodu transportu gerçekleşir. Bu durumda, protein kinetik analizi için sözde off sinyali olan negatif bir LY eşleşmiş akımı görüntülenir.Membran valfinin şarj durumunun anahtarlanmasının yarattığı mekanik ve elektriksel artefaktlar nedeniyle kapalı sinyali yeterince tanımlanmadığından, yalnızca açık sinyali kullanılır. Neyse ki bunlar, protein kaynaklı sinyaller gözlemlenmeden önceki bir zaman aralığıyla sınırlıdır. Valf anahtarlama artefaktları ile taşıyıcı sinyalleri arasındaki 50 milisaniyelik gecikmenin, çözeltinin terminal valften SSM Rapid Solution Exchange yüzeyine yayılması için gereken süre olduğuna dikkat edin. SSM üzerinde gerçekleştirilenler gibi bu işlem, tipik bir relaksasyon deneyini temsil eder.Bu tür deneylerde akım, zamana bağımlı bir ön kararlı durum fazı üzerinden sabit bir kararlı duruma geçer. Reaksiyon döngüsünün güncel kinetik detayları, ön kararlı durum akımının şeklinden ve büyüklüğünden türetilebilir. Kararlı durum akımı ise sürekli membran proteini döngüsü hakkında bilgi sağlar.Protea lipozomların SSM'lerine adsorbe olduğu ly eşleşmiş sistemde, ön kararlı durum akımları neredeyse hiç değişmez. Lipozomların şarj olması nedeniyle sabit bir kararlı durum akımı hiçbir zaman elde edilmez; bunun yerine ölçülen akım kademeli olarak azalır. Taşıyıcı akımı, ölçülen ly eşleşmiş akımından devre analizi yoluyla hesaplanabilir.Burada, 8,5 ve 7,6 arasındaki pH aralığında şeker proton ko-taşiyıcısı Like Y kullanılarak elde edilen temsili sonuçları gösteriyoruz. Taşıyıcı akımı, reaksiyon döngüsünün son aşamasındaki elektrojenik bir reaksiyon tarafından domine edilmektedir. Bu koşullar altında, kararlı durum öncesi faz, kararlı durum değerine doğru basit bir akım artışından oluşur.Bu durum daha sonra kapasitif etkileşim nedeniyle sönümlenir. Bizim ilgilendiğimiz nokta, kararlı durum taşıma akımıdır. Membran potansiyeli yokluğunda, bu durum yaklaşık olarak pik akımı ile temsil edilir.Bu nedenle, farklı substrat konsantrasyonları için tepe akımları grafiğe dökülerek Ali Mein kinetiği analiz edilebilir; ancak tepe akımı genliklerinin yalnızca tek bir deneyde tek bir sensörden elde edilmişlerse kesin olarak karşılaştırılabileceği göz önünde bulundurulmalıdır. Bunun bir nedeni, absorpsiyon verimliliğindeki değişkenliktir. pH daha da düşürüldüğünde, monofazik sinyal bifazik hale gelir.Ve son olarak, taşıma yeteneği eksik lag Y mutantı için hızlı bir geçici akım kalır. Bu hızlı geçici akımı, küçük ve daha yavaş olan negatif bir bileşen izler. Negatif bileşen, ly kenetli sistemlerde ölçülen hızlı geçici akımlar için karakteristiktir ve membran kapasitans boşalmasından kaynaklanır.Burada pik akımı, kararlı durum taşınımını değil, aksine iyon döngüsünün başındaki geçişin elektrogenik bir onayını temsil eder; bu durum, bir la y mutantının kararlı durum taşınımı göstermemesi ve yabani tip lag y için kararlı durum taşınımının düşük pH tarafından inhibe edilmesi nedeniyle belirginleşir. Deneysel kanıtlar, kinetik modelde gösterilen lag y reaksiyon döngüsündeki yük translokasyonunun mekanistik bir yorumunu sunar. Taşınım eksikliği olan mutant için veya asidik koşullar altındaki yabani tip lag Y durumunda gözlemlenen hızlı geçici durum, laktoz bağlanmasını takip eden hızlı ve zayıf elektrogenik bir reaksiyondan kaynaklanmaktadır; daha yüksek pH değerlerinde ise sinyale, kapasitif olarak bağlı sistemde sözde plazmik proton salınımını temsil ettiği öne sürülen, reaksiyon döngüsünün sonundaki ana elektrogenik reaksiyon hakimdir.Bu durum, Utes'lerin SSM ile güçlü etkileşimi nedeniyle Lag y'nin kararlı durum transportunu temsil eden geçici akımlara yol açar. Farklı bileşimdeki çözeltiler değiştirildiğinde elektriksel artefaktlar oluşur. Aktive etmeyen ve aktive eden çözeltilerin, özellikle pH ve iyonik kuvvetler açısından birbirine mümkün olduğunca benzer olduğundan emin olun.Substratlar da artefaktlar oluşturabildiği için kontrol gerçekleştirilmelidir. Protein örneği eklenmeden önce, çıplak SSM kullanarak spesifik tampon sisteminizi ve akış protokolünüzü artefaktlar açısından her zaman test edin. Protein örneği eklendikten sonra, substrata yapısal olarak benzer olan substrat dışı çözeltilerle kontrol ölçümleri yapılabilir.Ayrıca, ilgi duyulan protein içermeyen lipozomlar veya membran fragmanları kullanarak substratı artefaktlar açısından test etme imkanı vardır. Çözeltilerinize inhibitörler ekleyebilir veya bunları pipetleyebilirsiniz. Taşıyıcı sinyal inhibisyonunu ölçmek için deneyden hemen sonra vete çıkışına uygulayın; böylece proteine özgü sinyaller kaybolacak ve geriye yalnızca çözelti değişim artefaktları kalacaktır.Protein sinyali daha sonra kolayca düzeltilebilir. Absorbe edilen protein kaybının, lipozomların veya protein degradasyonunun ölçümünüzü etkilemediğinden emin olun. Özdeş koşullar altında tekrarlanan kontrol ölçümleri gerçekleştirerek, %20'ye kadar olan bir sinyal azalması kabul edilebilir ve azalmanın lineer bir zamana bağımlılığı olduğu varsayılarak düzeltilebilir.Bu düzenek, laboratuvarımızdaki 20 yıllık teknik geliştirme sürecinin bir sonucudur. Ayrıca, kinetik analizler için daha gelişmiş zamanlayıcı çözümlere ve pahalı substratlar için daha düşük çözelti tüketimine sahip özelleşmiş sistemler de mevcuttur. İlaç taramaları için ise daha yüksek kapasiteli, tam otomatik düzenekler kullanmaktayız.Bugüne kadar bu yöntem kullanılarak 20'den fazla taşıyıcı karakterize edilmiştir. Bunlar arasında transport APA'lar, solunum zinciri kompleksleri, soğuk taşıyıcılar, değiştiriciler ve hatta demir kanalları yer almaktadır. Bu nedenle, probleminizi standart elektrofizyoloji ile çözemediğinizde, bunun yerine SS Mase elektrofizyolojisini kullanmayı değerlendirin.

introduction-to-solid-supported-membrane-based-electrophysiology

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Düzlemsel çift katlı lipit katmanını da adlandırılan yapay çift katlı lipit katmanını, çalışma izin iyon iletken, iyi tanımlanmış bir ortamda kanal. Burada, bilayeri odası hazırlamak için gerekli bireysel adımlar, elektrotlar ve nasıl bilayeri tek kanal ölçümleri için uygun olup olmadığını test etmek için ortaya koymaktadır.

Elektrofizyoloji Deneyler Yapay Bilayers hazırlanması

Biz nasıl bir iyon kanalı fonksiyonu tek bir nokta mutasyonu etkisinin araştırılması gösterecektir.

İyon Kanalları ve Fonksiyonel Analiz Mutagenez Heterologously Memeli Hücreleri cinsinden ifade edilir

Bu biyolojik membranlar elektrik modelleri kullanarak nasıl anlaşılabilir bir gösteri. Ayrıca öğrenci yönelik laboratuarlar için kerevit ventral sinir kordonundan aksiyon potansiyelleri kayıt prosedürleri göstermektedir.

Devre Biyolojik Membranlar Modelleme ve Aksonlar Elektrik Sinyalleri Ölçme: Öğrenci Laboratuvar Egzersizler

Bu protokol, zebra balığı embriyolarında Mauthner nöronlarının ve diğer retikülospinal hücrelerin elektriksel özelliklerini incelemek için bir yöntem olan tam hücre yama kelepçesi elektrofizyolojisi adı verilen bir tekniği tanımlar.

Tüm Hücre Yama Kelepçesi Elektrofizyolojisi: Nöronların Elektriksel Özelliklerini İncelemek İçin Bir Yöntem

Multi-elektrot patch-kelepçe kayıtları karmaşık bir görev oluşturmaktadır. Burada, deneysel adım birçok otomatik olarak, performans ve kayıtların sayısı kaliteyi iyileştirmek yol açan sürecini hızlandırmak için nasıl mümkün olduğunu gösterir.

Bilgisayar destekli Çoklu elektrot Patch-kelepçe Sistemi

Kapalı döngü protokolleri günümüz elektrofizyolojisinde giderek yaygınlaşmaktadır. Kortikal piramidal nöronlarda in vitro olarak karmaşık elektrofizyolojik protokolleri gerçekleştirmenin basit, çok yönlü ve ucuz bir yolunu sunuyoruz.

Gerçek zamanlı Elektrofizyoloji: Probe Nöronal Dynamics ve Ötesi Kapalı çevrim Protokolleri Kullanma

Bu el yazması proton taşıma sistemlerinin etkinliğini ölçmek için proton-seçici elektrot ve yöntemleri sıkma yama uygulamaları açıklar. Bu yöntemleri teknikleri proton taşıma etkinlik, ılımlı duyarlılık, zaman çözünürlüğü ve yetersiz hücre içi ortam denetimi gibi çalışma için yaygın olarak kullanılan bazı sınırlamalarının üstesinden gelir.

Elektrofizyoloji ölçüm uygulanması elektro-tarafsız taşıyıcılar etkinlik çalışması için

Burada, bir kişi kabarcık bilayer yöntemiyle lipid bilayers oluşumu için bir iletişim kuralı mevcut. Mademki bir monolayer su-yağ arayüzü oluşan organik bir çözücü içine su balonu patladı. İki pipetler bir bilayer oluşturmak için ve baloncuklar sabitlemek için manipüle edilir.

Lipid Bilayer deneyler ile iletişim balonu Bilayers yama-Clampers için

Bu protokol, biyoelektronik araştırmaları için hassas kardiyak stimülasyon, kayıt ve enfarktüs modellemesi sağlayan optik ve elektriksel çift yönlü biyoarayüz için gelişmiş malzeme üretimi ve ex vivo sıçan kalbi yöntemlerini ana hatlarıyla belirtir.

Sağlıklı ve İskemik Ex Vivo Sıçan Kalplerinde Çift Yönlü Elektrik ve Optoelektronik Arayüzler

Burada, epitel dokusu homeostazının elektromekanik regülasyonunu incelemek için benzersiz bir iki katmanlı mikroakışkan cihaz üretmek için bir protokol sunuyoruz. Cihaz, doku düzlemine dik olarak statik fizyolojik elektrik akımları uygulayarak hücre-hücre yapışmasını, çoğalmasını ve ekstrüzyonunu etkiler. Canlı hücre görüntüleme ve mekanik stres ölçümleri, bu süreçlerin mekanizmalarını ortaya çıkarır.

İki katmanlı mikroakışkan cihaz kullanarak doku homeostazının elektromekanik kontrolünün ortaya çıkarılması

Gramicidin A-doped damlacık arayüz çift katmanlarını bir yere toplamak, elektriksel olarak uyarmak ve analiz etmek için deneysel bir protokol sunulur. Lipid-protein yapı-fonksiyon ilişkileri, membran alanı, iyonik akı ve tek kanal iletkenliğindeki değişiklikler ölçülerek ve bu yanıtların, elektriksel sinapslardan ilham alan bir membran modelinde iyonik iletkenlikteki plastisite benzeri değişikliklerle ilişkilendirilmesiyle nicelendirilir.

Damlacık Arayüz Bilayerları Kullanarak Lipid-Protein Zar Yapı-Fonksiyon Karakterizasyonu

Keşfedin katı desteklenmembran tabanlı elektrofizyoloji yöntemini, bakteri ve ökaryotik taşıyıcıları karakterize etmek için. Bu yöntem, geleneksel tekniklerle incelenemeyen elektrojenik membran taşıyıcılarını araştırmada güçlü bir araçtır.

Elektrofizyoloji Tabanlı Katı Desteklenen Membran Giriş

Daha fazla video keşfet