Elektrofizyoloji Tabanlı Katı Desteklenen Membran Giriş

Desteklenmiş membran tabanlı elektrofizyoloji, kısaca SSM tabanlı elektrofizyoloji, yeni bir elektrofizyolojik yaklaşımdır. Bir dizi uygulama için konvansiyonel yöntemlere kıyasla önemli bir iyileştirme sunmaktadır.

Konvansiyonel elektrofizyolojinin temel aracı elektrolit dolgulu mikropartikül elektrottur; buna karşın SSM tabanlı elektrofizyoloji, katı destekli bir membran elektrot aracılığıyla yük translokasyonunu tespit eder. Bu yöntem, birkaç nadir istisna dışında voltaj klemp veya patch clamp yöntemleriyle incelenemeyen bakteriyel taşıyıcılar gibi konvansiyonel elektrofizyolojinin kullanılamadığı durumlarda son derece yararlıdır. Bu gibi durumlarda, SSM tabanlı elektrofizyolojinin oldukça başarılı olduğu kanıtlanmıştır.

Ayrıca, hücre içi membranlardaki fizyolojik olarak ilgili ökaryotik taşıyıcıların incelenmesinde de kullanılabilir. SSM tabanlı elektrofizyoloji deneylerini gerçekleştirmenin birçok yolu vardır. Temel araştırmalarda, kinetik parametreleri belirlemek ve taşıma mekanizmasını aydınlatmak için uygulanabilir; ancak sağlamlığı ve otomasyon potansiyeli, onu hedef belirleme çalışmalarındaki tarama uygulamaları için ideal kılar.

SSM elektrodu, altta yer alan SSM ile ilgilendiğiniz taşıma proteinini içeren proteasomların veya membran fragmanlarının benimsendiği bileşik bir membran sistemini taşır. Bileşik membranın elektriksel özellikleri, membranların kapasitif olarak eşleşmiş bir sistem oluşturduğu eşdeğer bir devre ile tanımlanabilir. Sistemdeki elektriksel davranışın, membran fragmanları veya protea lipozomlar kullanılmasına bakılmaksızın esasen aynı olduğu unutulmamalıdır.

Taşıyıcı proteindeki yük yer değiştirmesi, mesane membranının kapasitansı aracılığıyla ölçüm devresine iletilir. Bu, kapasitif eşleşme olarak adlandırılan bir tespit prensibidir. Tipik bir deneyde, VSSM'de gerçekleştirilen hızlı solüsyon değişimi, taşıyıcı protein V için substratı sağlar; proteinin ardından gelen elektrogenik taşıma aktivitesi, SSM kapasitansı aracılığıyla ölçüm sistemine bağlı bir akım oluşturur.

Aynı zamanda, elektrojenik protein aktivitesi lipozomal membranı kademeli olarak şarj ederek taşıma proteininin inhibisyonuna ve kayıt devresindeki akımın azalmasına yol açar; ölçülen akım, Enzo'ya absorbe olmuş ve her biri yaklaşık 100 taşıyıcı içeren milyonlarca protea lipozomun eşzamanlı taşıma reaksiyonlarının bir sonucudur. Düzenek, çözelti yolu bulunan bir Faraday kafesi, valf kontrolü için harici devreler, sinyal amplifikasyonu ile veri toplama ve analiz sisteminden oluşmaktadır.

EC kafesi, çözelti akış kontrolü için gerekli olan konteynerleri, valfleri ve tüplerin yanı sıra XOR çipli bir kübiti içerir. XOR çipi, SSM elektrodunu ve absorbe edilmiş prot lipozomları taşır. Vete, harici elektrik devresinin amplifikatörüne ve fonksiyon jeneratörüne bağlıdır.

SSM ölçümleri, iki çözelti kullanır; substrat hariç biri aktif diğeri ise aktif olmayan çözeltidir ve substrat yalnızca aktif çözeltide bulunur. Tekli değişim konfigürasyonunda her iki çözelti de aynı bileşime sahiptir. İki yönlü iki valf, aktif olmayan ve aktif çözeltilerin akışını kontrol eder.

Mekanik olarak bağlanan üçlü bir üç yollu vana olan terminal vana, aktive edici olmayan ve aktive edici çözeltiler arasında geçiş yapmak için kullanılır; çözeltilerden birini atık konteynerine, diğerini ise qve'ye yönlendirir. Terminal vana değiştirildiğinde, aktive edici olmayan çözeltinin akışı atığa yönlendirilir ve aktive edici çözelti qve'ye akar. Bu konfigürasyon, her iki çözeltinin aynı anda sürekli akışına olanak tanır.

Akış protokolünün herhangi bir aşamasında, akış yolu ihtiyaca göre optimize edilebilir. Ancak, SSM ile aktive etmeyen ve aktive eden çözeltilerin birleşme noktası arasındaki mesafenin mümkün olduğunca kısa tutulması gerektiği unutulmamalıdır. Çünkü bu mesafe, çözelti değişiminin zamanlamasını belirler.

Güç kartı kafesinin dışındaki akım amplifikatörü bir sensör çipine bağlıdır. Bu ayar tipik olarak 10⁸ ile 10⁹ V/A arasında bir yükseltme ve 1 ila 10 milisaniye dinlenme süresi olarak belirlenir. Referans elektroduna bir fonksiyon jeneratörü bağlanmıştır; valf kontrolü ve veri toplama yazılımına sahip bir bilgisayar ile bir ara yüz kutusu sistemi tamamlamaktadır.

Arayüz kutusu, valf sürücüsü veri toplama ve dijital çıkış donanımını içerir; çözelti akışı 0,22 bar basınçlı hava ile sağlanır. Basınç, dijital bir manometre kullanılarak izlenir. Hava kaynağı ile EC Kafesi'ndeki çözelti kapları arasına yerleştirilen bir çelik konteynerin iğne valf aracılığıyla doldurulmasıyla bu basınç korunabilir.

CVIC dört kısımdan oluşur. Zen çipi, vet tabanı ile vet başlığı arasına yerleştirilmiştir. Silindirik bir çıkış konnektörü vet başlığına vidalanmıştır ve referans elektrot düzeneğini taşır.

Referans elektrot, minyatür bir SMC konnektörlü klorlanmış gümüş telden oluşur ve poliakrilat jel tuz köprüsü ile akış yolundan izole edilmiştir. Kullanılmadığı zamanlarda, jel köprü düzeneği 100 milimolar potasyum klorür içeren 100 milimolar potasyum fosfat pH yedi çözeltisinde saklanır. İlk olarak, referans elektrot, jel köprüsünü içeren referans elektrot düzeneğine monte edilmelidir.

Referans elektrodu yerleştirirken hava kabarcıklarının oluşmasını önlemek önemlidir. Şimdi vete'nin bu parçası, önceden tampon çözelti ile doldurulmuş olan çıkış konnektörüne takılır. Tüm bağlantıların O-ringler ile sızdırmaz hale getirilmesi gerekir.

Bu SM, yapılandırılmış bir keçi kaplı cam ışık olan zor çip üzerinde oluşturulmuştur. Bu semantik yol bir milimetre çapındadır ve 0,2 milimetrelik beyaz bir kontak şeridi aracılığıyla kontak pedine bağlanmıştır. Bir yaylı kontak pini, amplifikatöre bağlantı sağlar.

Zen çipi, 10 LAR Okta Deccan tiyol etanol çözeltisi içinde karanlıkta saklanır. Arkan tiyol tabakasını korumak ve absorbe edilmemiş Okta deccan viral moleküllerini uzaklaştırmak için elektrot saf etanol ile durulanır ve azot gazı altında kurutulur. Artık fosfokolin monotabaka oluşturulabilir.

Lipid çözeltisi, mililitre başına 15 miligram DFI kolin ve mililitre başına 250 mikrogram Okta two A mine in decay içermektedir ve -20 °C'de saklanır. Elektrot şimdi SA küvetinin tabanına tam olarak yerleştirilir.

Çözeltiden bir µL, altın tabakasına temas etmeden SSM elektroduna eklenir. Lipid çözeltisinin eklenmesinin hemen ardından vete monte edilebilir. Bir O-ring ile sızdırmazlığı sağlanan vete hacmi, monte edildiğinde 17 µL'lik bir iç hacme sahip silindirik bir yapıdadır.

SSM, giriş deliğinin altına ortalanmalıdır. Bağlantı yapılmadan önce, sıvı sistemi 100 millimolar potasyum fosfat tampon çözeltisi ile önceden doldurulmalıdır. Tüplerde ve valflerde hava kabarcığı kalmadığından emin olmak önemlidir.

Şimdi cihaz tiroid günlük kafesine yerleştirilebilir; amplifikatör, çözelti akış yolunun girişi ve çıkışı ile fonksiyon jeneratörü bağlanabilir. Son olarak, küvet 100 mililitre potasyum fosfat tamponu ile durulanabilir. Bu işlem, SSM kalitesini kontrol etmek için kendiliğinden SSM oluşumuna yol açar.

Kapasitans ve kondüktans ölçümleri fonksiyon jeneratörü kullanılarak yapılır; kondüktansı ölçmek için 100 millivolt DC voltaj kullanılır. Akım sönümlenmesi, kapasitör tamamen şarj olduktan sonra membran kapasitörünün şarj olduğunu gösterir. Ölçülen akım, M'S yasası kullanılarak membran kondüktansını verir.

Burada 0,17 nS'lik bir iletkenlik gözlemliyoruz. Kapasitans, 50 mV tepe-tepe genliğinde üçgen AC voltaj ve 0,5 Hz frekans kullanılarak ölçülebilir. Ortaya çıkan kare dalga akımının genliği, kapasitörün sızıntı akımını temsil eder.

Kapasitans, aktarılan yükün uygulanan voltaja bölünmesine eşittir. Bu membran 2,3 nano kapasitans göstermektedir; yüksek iletkenlik ve düşük kapasitans, SSM'nin doğru şekilde oluşmadığını gösterir. Bu durumlarda, membran atılmalı ve yeni bir elektrot çipi kullanılarak başka bir SSM hazırlanmalıdır.

Genellikle protein lipozomları -80 °C'de dondurulmuş olarak saklanır. Homojen bir protein lipozom süspansiyonu elde etmek için numune buz üzerinde çözülür; agregatlaşmış numuneler sonikasyonu engellediği için sonikasyon işlemi esastır. Üç adet on saniyelik sonikasyon döngüsü, buz üzerinde on saniyelik soğutma aralıklarıyla ardışık olarak uygulanır.

SSM'lerini aktivasyon yapmayan çözelti ile durulayın. Ardından, çıkış konnektörünü referans elektrot örneği ile birlikte sökün. Bir pipet kullanarak, 30 µL protein örneğini vete çıkışından ette hacmine enjekte edin.

Öncelikle pipet ucunu çıkış deliğine takın. Ardından, yukarıdaki manueli aktive edilmeyen yolda açın ve protea lipozomlarını enjekte edin. Son olarak pipet ucunu çıkarın.

Çözeltinin daha fazla akışını önlemek için yukarıdaki manuel vanayı kapatın. Protea lipozomlarının SSM'ye absorbe olması için bir ila iki saatlik bir inkübasyon süresi tanıyın. Akış protokolünüzü tanımlamak için valf kontrol ve veri toplama yazılımının akış protokolü penceresini kullanın.

Substrat özgüllüğünün belirlenmesi, KM değeri veya pH bağımlılığı gibi simetrik koşullar altında ölçüm yapmak istiyorsanız, tek çözelti değişim protokolünü seçin. Her çözelti için akış süresini 0,5 ile 1 saniye arasına ayarlayın. Akım, tüm akış protokolü boyunca kaydedilir.

Amplifikasyon genellikle 10⁹ olarak ayarlanır ve örnekleme hızı için saniyede 2000 veri noktası seçilir. Son olarak, yeni protokolünüzü NA a ve a başlığı altında kaydedin. Akış protokolü penceresinin ikinci sekmesinde, qubit üzerinden aktive edici veya aktive edici olmayan solüsyon akışını kontrol etmek için belirli valflerin açık veya kapalı durumlarını tanımlayabilirsiniz.

Burada, E. coli'den gelen şeker proton simbiyotik taşıyıcısı Y'nin proteolipozomlarındaki ölçümünü gösteriyoruz. Aktive edici çözelti, taşınan substrat olan laktozu içerirken, aktive etmeyen çözelti telafi edici bir bileşik olarak aynı miktarda taşınmayan glikoz içerir. Şekerlerin yanı sıra çözeltiler, pH 7.6'da 100 millimolar potasyum fosfat ve bir millimolar DTT içerir.

Çözeltileri değiştirdikten sonra, hava kabarcıklarının giderildiğinden emin olmak için manuel valfi kullanın. Bir akış protokolüne başlamadan önce, ölçümü başlatmadan hemen önce basıncı ayarlayın. Biz rutin olarak 0.6 bar basınç kullanmaktayız; bu değer, bizim özel valf ve tüp konfigürasyonumuzda saniyede yaklaşık bir mililitre akış hızına karşılık gelmektedir.

Ardından, buradan güvenli akış protokolünü, yani NAA protokolünü seçin ve her bir ölçümü başlatmak için başlat düğmesine basın. İlk birkaç ölçüm sırasında, gevşekçe absorbe olmuş proteolipozomlar uzaklaştırılır ve bu nedenle pik akımı azalabilir. Pik akımı sabit kalana kadar ölçümü tekrarlayın.

Aktive etmeyen çözelti akışının ilk aşamasında akım sıfırdır. Aktive etmeyen çözeltiden, laktoz içeren aktive eden çözeltiye geçiş, membranın elektrogenik taşıma aktivitesini tetikler. Proteolipozomların içinde pozitif protein yükü birikir ve amplifikatör, SSM aracılığıyla gerçekleşen pozitif kenetlenme nedeniyle pozitif bir geçici akım tespit eder.

Pozitif olarak eşleşmiş bu akıma, aktive edici çözeltiden gelen V değişim on sinyali denir. Aktive edici olmayan çözeltiye geri dönüldüğünde, lipozomların dışına proton şeker kodu transportu gerçekleşir. Bu durumda, protein kinetik analizi için sözde off sinyali olan negatif bir LY eşleşmiş akımı görüntülenir.

Membran valfinin şarj durumunun anahtarlanmasının yarattığı mekanik ve elektriksel artefaktlar nedeniyle kapalı sinyali yeterince tanımlanmadığından, yalnızca açık sinyali kullanılır. Neyse ki bunlar, protein kaynaklı sinyaller gözlemlenmeden önceki bir zaman aralığıyla sınırlıdır. Valf anahtarlama artefaktları ile taşıyıcı sinyalleri arasındaki 50 milisaniyelik gecikmenin, çözeltinin terminal valften SSM Rapid Solution Exchange yüzeyine yayılması için gereken süre olduğuna dikkat edin. SSM üzerinde gerçekleştirilenler gibi bu işlem, tipik bir relaksasyon deneyini temsil eder.

Bu tür deneylerde akım, zamana bağımlı bir ön kararlı durum fazı üzerinden sabit bir kararlı duruma geçer. Reaksiyon döngüsünün güncel kinetik detayları, ön kararlı durum akımının şeklinden ve büyüklüğünden türetilebilir. Kararlı durum akımı ise sürekli membran proteini döngüsü hakkında bilgi sağlar.

Protea lipozomların SSM'lerine adsorbe olduğu ly eşleşmiş sistemde, ön kararlı durum akımları neredeyse hiç değişmez. Lipozomların şarj olması nedeniyle sabit bir kararlı durum akımı hiçbir zaman elde edilmez; bunun yerine ölçülen akım kademeli olarak azalır. Taşıyıcı akımı, ölçülen ly eşleşmiş akımından devre analizi yoluyla hesaplanabilir.

Burada, 8,5 ve 7,6 arasındaki pH aralığında şeker proton ko-taşiyıcısı Like Y kullanılarak elde edilen temsili sonuçları gösteriyoruz. Taşıyıcı akımı, reaksiyon döngüsünün son aşamasındaki elektrojenik bir reaksiyon tarafından domine edilmektedir. Bu koşullar altında, kararlı durum öncesi faz, kararlı durum değerine doğru basit bir akım artışından oluşur.

Bu durum daha sonra kapasitif etkileşim nedeniyle sönümlenir. Bizim ilgilendiğimiz nokta, kararlı durum taşıma akımıdır. Membran potansiyeli yokluğunda, bu durum yaklaşık olarak pik akımı ile temsil edilir.

Bu nedenle, farklı substrat konsantrasyonları için tepe akımları grafiğe dökülerek Ali Mein kinetiği analiz edilebilir; ancak tepe akımı genliklerinin yalnızca tek bir deneyde tek bir sensörden elde edilmişlerse kesin olarak karşılaştırılabileceği göz önünde bulundurulmalıdır. Bunun bir nedeni, absorpsiyon verimliliğindeki değişkenliktir. pH daha da düşürüldüğünde, monofazik sinyal bifazik hale gelir.

Ve son olarak, taşıma yeteneği eksik lag Y mutantı için hızlı bir geçici akım kalır. Bu hızlı geçici akımı, küçük ve daha yavaş olan negatif bir bileşen izler. Negatif bileşen, ly kenetli sistemlerde ölçülen hızlı geçici akımlar için karakteristiktir ve membran kapasitans boşalmasından kaynaklanır.

Burada pik akımı, kararlı durum taşınımını değil, aksine iyon döngüsünün başındaki geçişin elektrogenik bir onayını temsil eder; bu durum, bir la y mutantının kararlı durum taşınımı göstermemesi ve yabani tip lag y için kararlı durum taşınımının düşük pH tarafından inhibe edilmesi nedeniyle belirginleşir. Deneysel kanıtlar, kinetik modelde gösterilen lag y reaksiyon döngüsündeki yük translokasyonunun mekanistik bir yorumunu sunar. Taşınım eksikliği olan mutant için veya asidik koşullar altındaki yabani tip lag Y durumunda gözlemlenen hızlı geçici durum, laktoz bağlanmasını takip eden hızlı ve zayıf elektrogenik bir reaksiyondan kaynaklanmaktadır; daha yüksek pH değerlerinde ise sinyale, kapasitif olarak bağlı sistemde sözde plazmik proton salınımını temsil ettiği öne sürülen, reaksiyon döngüsünün sonundaki ana elektrogenik reaksiyon hakimdir.

Bu durum, Utes'lerin SSM ile güçlü etkileşimi nedeniyle Lag y'nin kararlı durum transportunu temsil eden geçici akımlara yol açar. Farklı bileşimdeki çözeltiler değiştirildiğinde elektriksel artefaktlar oluşur. Aktive etmeyen ve aktive eden çözeltilerin, özellikle pH ve iyonik kuvvetler açısından birbirine mümkün olduğunca benzer olduğundan emin olun.

Substratlar da artefaktlar oluşturabildiği için kontrol gerçekleştirilmelidir. Protein örneği eklenmeden önce, çıplak SSM kullanarak spesifik tampon sisteminizi ve akış protokolünüzü artefaktlar açısından her zaman test edin. Protein örneği eklendikten sonra, substrata yapısal olarak benzer olan substrat dışı çözeltilerle kontrol ölçümleri yapılabilir.

Ayrıca, ilgi duyulan protein içermeyen lipozomlar veya membran fragmanları kullanarak substratı artefaktlar açısından test etme imkanı vardır. Çözeltilerinize inhibitörler ekleyebilir veya bunları pipetleyebilirsiniz. Taşıyıcı sinyal inhibisyonunu ölçmek için deneyden hemen sonra vete çıkışına uygulayın; böylece proteine özgü sinyaller kaybolacak ve geriye yalnızca çözelti değişim artefaktları kalacaktır.

Protein sinyali daha sonra kolayca düzeltilebilir. Absorbe edilen protein kaybının, lipozomların veya protein degradasyonunun ölçümünüzü etkilemediğinden emin olun. Özdeş koşullar altında tekrarlanan kontrol ölçümleri gerçekleştirerek, %20'ye kadar olan bir sinyal azalması kabul edilebilir ve azalmanın lineer bir zamana bağımlılığı olduğu varsayılarak düzeltilebilir.

Bu düzenek, laboratuvarımızdaki 20 yıllık teknik geliştirme sürecinin bir sonucudur. Ayrıca, kinetik analizler için daha gelişmiş zamanlayıcı çözümlere ve pahalı substratlar için daha düşük çözelti tüketimine sahip özelleşmiş sistemler de mevcuttur. İlaç taramaları için ise daha yüksek kapasiteli, tam otomatik düzenekler kullanmaktayız.

Bugüne kadar bu yöntem kullanılarak 20'den fazla taşıyıcı karakterize edilmiştir. Bunlar arasında transport APA'lar, solunum zinciri kompleksleri, soğuk taşıyıcılar, değiştiriciler ve hatta demir kanalları yer almaktadır. Bu nedenle, probleminizi standart elektrofizyoloji ile çözemediğinizde, bunun yerine SS Mase elektrofizyolojisini kullanmayı değerlendirin.