Elektrofizyoloji Tabanlı Katı Desteklenen Membran Giriş

Bu nedenle, SSM tabanlı elektrofizyoloji olarak kısaltılan membran tabanlı elektrofizyoloji desteklenir. Bu yeni bir elektrofizyolojik yaklaşım. Bir dizi uygulama için geleneksel yöntemlere kıyasla önemli bir gelişme sunar.

Konvansiyonel elektrofizyolojinin temel aracı elektrolit dolgulu mikropartikül elektrot iken, M tabanlı elektrofizyolojisi katı destekli bir membran elektrot aracılığıyla yük translokasyonunu tespit eder. Konvansiyonel elektrofizyolojinin kullanılamadığı durumlarda, örneğin bakteri taşıyıcıları söz konusu olduğunda, birkaç nadir istisna dışında, gerilim kelepçesi veya patch cam yöntemleri ile araştırılamayan durumlarda son derece yararlıdır. Bu gibi durumlarda, SSM tabanlı elektrofizyoloji çok başarılı olmuştur.

Hücre içi zarlarda fizyolojik olarak ilgili ökaryotik taşıyıcıları araştırmak için de kullanılabilir. SSM tabanlı elektrofizyoloji deneylerini gerçekleştirmenin birçok yolu vardır. Temel araştırmalarda, kinetik parametreleri belirlemek ve taşıma mekanizmasını netleştirmek için uygulanabilir, ancak sağlamlığı ve otomasyon potansiyeli, onu iz keşfindeki tarama uygulamaları için ideal kılar.

SSM elektrodu, altta yatan SSM'den ve ilgilendiğiniz taşıma proteinini içeren evlat edinilmiş proteazomlardan veya zar parçalarından oluşan bir bileşik zar sistemi taşır. Bileşik zarın elektriksel özellikleri, zarların kapasitif olarak bağlanmış bir sistem oluşturduğu eşdeğer bir devre ile tanımlanabilir. Sistemin elektriksel davranışının, zar fragmanları veya protea lipozomları kullanılıp kullanılmadığına bakılmaksızın temelde aynı olduğuna dikkat edin.

Taşıma proteinindeki yük yer değiştirmesi, mesane zarının kapasitansı aracılığıyla ölçüm devresine iletilir. Kapasitif kuplaj adı verilen bir algılama prensibi. Tipik bir deneyde, VSSM'de hızlı çözelti değişimi, proteinin elektrojenik taşıma aktivitesini takip eden taşıma proteini V için substratı sağlar, bu da SSM kapasitansı aracılığıyla ölçüm sistemine ly ile bağlanan bir akım oluşturur.

Aynı zamanda, elektrojenik protein aktivitesi, taşıma proteininin inhibisyonuna ve kayıt devresinde azalan akıma yol açan lipozomal zarı kademeli olarak yükler, ölçülen akım, Enzo'ya emilen milyonlarca protea lipozomunun eşzamanlı taşıma reaksiyonlarının bir sonucudur. Her biri yaklaşık 100 taşıyıcı içerir. Kurulum, bir çözüm yoluna sahip bir Faraday kafesi, valf kontrolü için harici devreler, sinyal amplifikasyonu ve ayrıca veri toplama ve analizinden oluşur.

EC kafesi, çözelti akış kontrolü için gerekli kapları, valfleri ve tüpleri ve ayrıca XOR çipli bir arşını içerir. XOR çipi, SSM elektrodunu ve emilen prot lipozomlarını taşır. Vete, harici elektrik devresinin amplifikatörüne ve fonksiyon üretecine bağlanır.

SSM ölçümleri, yangına yol açar, sadece aktive edici çözeltide bulunan substrattan ayrı olarak biri aktive edici diğeri aktive olmayan iki çözelti. Her iki çözüm de tek değişim konfigürasyonunda aynı bileşime sahiptir. İki, iki vanalar, yeniden etkinleştirilmeyen ve aktive edici çözeltilerin akışını kontrol eder.

Mekanik olarak bağlanmış üç üç bir vana olan terminal vanası, aktive olmayan ve aktive eden çözeltiler arasında geçiş yapmak için kullanılır, çözümlerden birini atık kabına ve diğer çözeltiyi qve'ye yönlendirir. Terminal vanası değiştirildiğinde, aktive olmayan çözeltinin akışı atığa yeniden yönlendirilir ve aktive edici çözelti qve'ye akar. Bu yapılandırma, her iki çözümün aynı anda sürekli akışına izin verir.

Akış protokolü sırasında herhangi bir zamanda, akış yolu ihtiyaca göre optimize edilebilir. Bununla birlikte, SSM ile aktive olmayan ve aktive olan çözümlerin birleşme yeri arasındaki mesafenin mümkün olduğunca kısa tutulması gerektiği unutulmamalıdır. Çözüm değişiminin zamanlayıcı çözümünü belirlediği için.

Güç güvertesi kafesinin dışındaki akım amplifikatörü bir sensör çipine bağlanır. Tipik olarak, bu, 10 ila sekiz ila 10 gücüne, amper başına dokuz volt gücüne ve bir ila 10 milisaniye dinlenme süresine kadar bir amplifikasyona ayarlanır. Referans elektroduna bir fonksiyon üreteci bağlanır ve valf kontrolü ve veri toplama yazılımı olan bir bilgisayar ve sistemi tamamlayan bir arayüz kutusu bulunur.

Arayüz kutusu, valf sürücülerinin veri toplamasını içerir ve dijital çıkış donanım çözeltisi akışı, oh 0.22'lik basınçlı hava ile korunur. Bir bar basınç, dijital bir milimetre kullanılarak izlenir. EC Kafesindeki hava beslemesi ile çözelti kapları arasına monte edilen çelik bir kabın bir iğneli valf aracılığıyla doldurulmasıyla bakımı yapılabilir.

CVIC dört bölümden oluşmaktadır. Zen çipi, veteriner tabanı ile veteriner kafası arasına sıkıştırılmıştır. Silindirik bir çıkış konektörü veteriner kafasına vidalanır ve referans elektrot tertibatını taşır.

Referans elektrodu, minyatür bir SMC konektörüne sahip klorlu bir gümüş telden oluşur ve bir poli akrilik jel tuz köprüsü ile akış yolundan izole edilir. Kullanılmayan jel köprüsü düzeneği, 100 milimolar potasyum klorür içeren 100 milimolar potasyum fosfat pH yedi çözeltisinde saklanır. İlk olarak, referans elektrotun geo köprüsünü içeren referans elektrot düzeneğine monte edilmesi gerekir.

Referans elektrodu takarken hava kabarcıklarından kaçınmak önemlidir. Şimdi vete'nin bu kısmı, tampon çözeltisi ile önceden doldurulmuş olan çıkış konektörüne bağlanmıştır. Tüm bağlantılar O halkaları ile kapatılmalıdır.

Bu SM, yapılandırılmış bir keçi kaplı cam ışık olan bir zor çip üzerinde oluşturulmuştur. Bu sematik bir yol bir milimetre ve çapındadır ve temas pedine oh 0.2 milimetre beyaz temas şeridi ile bağlanır. Bir yaylı kontak pimi, amplifikatöre bir temas oluşturur.

Zen çipi karanlıkta 10 LAR Okta Deccan tiyol etanol çözeltisinde saklanır. Emilmemiş Okta deccan viral moleküllerini uzaklaştırmak için gizli thi tabakasını korumak için, elektrot saf etanol ile durulanır ve elektrot nitrojen gazı içinde kurutulur. Artık fosfokolin mono tabakası monte edilebilir.

Lipid çözeltisi mililitre başına 15 miligram DFI kolin ve mililitre başına 250 mikrogram içerir. Okta iki A madeni çürümekte ve eksi 20 derecede depolanmaktadır. Elektrot şimdi SA arşınının tabanına doğru bir şekilde yerleştirilmiştir.

Çözeltinin bir mikrolitresi, altın tabakaya dokunmadan SSM elektroduna eklenir. Lipid çözeltisini ekledikten hemen sonra, vete monte edilebilir. Bir O halkası ile kapatılan vete hacmi, monte edildiğinde 17 mikrolitrelik bir iç hacme sahip silindiriktir.

SSM, giriş deliğinin altında ortalanmalıdır. Veterineri bağlamadan önce, sıvı sistemi 100 milimolar potasyum fosfat tampon çözeltisi ile önceden doldurulmalıdır. Boruda ve valflerde hava kabarcığı olmadığından emin olmak önemlidir.

Artık veteriner tiroid gündüz kafesine monte edilebilir, amplifikatörü, çözelti akış yolunun giriş ve çıkışını ve fonksiyon jeneratörünü bağlayabilir. Son olarak, arşın 100 milimetrelik bir potasyum fosfat tamponu ile durulanabilir. Bu, SSM'nin kalitesini kontrol etmek için spontan SSM oluşumuna yol açar.

Kapasitans ve iletkenlik fonksiyon üreteci kullanılarak ölçülür, iletkenliği ölçmek için 100 milivolt DC gerilim kullanılır. Akım azalması, kondansatör tamamen şarj olduktan sonra membran kondansatörünün şarj olduğunu gösterir. Ölçülen akım, M'S yasasını kullanarak membran iletkenliğini verir.

Burada oh 0.17 nano Siemens'in iletkenliğini gözlemliyoruz. Kapasitans, 50 milivolt tepeden tepeye genlikli üçgen AC voltajı ve oh 0.5 hertz frekans kullanılarak ölçülebilir. Elde edilen kare dalga akımının genliği, kapasitörün değerlendirme akımını temsil eder.

Kapasitans, aktarılan yükün uygulanan voltaja bölünmesine eşittir. Bu zar 2.3 nano kapasitans, yüksek iletkenlik ve düşük kapasitans SSM'nin doğru şekilde oluşmadığını gösterir. Bu durumlarda, zar atılmalı ve yeni bir elektrot çipi kullanılarak başka bir SSM hazırlanmalıdır.

Genellikle prot lipozomlar Eksi 80'de donmuş olarak saklanır. Buz sonikasyonu üzerindeki numunenin TRE esastır, çünkü toplanmış bir numune, homojen bir prot lipozom süspansiyonu elde etmek için kasnağı SSM'ye emer. Üç on saniyelik sonikasyon döngüsü, buz üzerinde on saniyelik soğutma aralıkları ile değiştirilir.

SSM'lerini aktive olmayan solüsyonla durulayın. Ardından çıkış konektörünü referans elektrot numunesi ile birlikte sökün. Bir pipet kullanarak, 30 mikrolitre protein örneğini vete çıkışından ette hacmine enjekte edin.

Önce pipet ucunu çıkış deliğine monte edin. Ardından yukarıdaki kılavuzu aktive olmayan yolda açın ve protea lipozomlarını enjekte edin. Pipet ucunu indirgemeden önce.

Daha fazla çözelti akışını önlemek için yukarıdaki kılavuzu kapatın. Protea lipozomlarının bir ila iki saatlik bir inkübasyon süresi boyunca SSM'ye emilmesine izin verin. Akış protokolünüzü tanımlamak için vana kontrol ve veri toplama yazılımının akış protokolü Penceresini kullanın.

Substrat özgüllüğünün, KM değerinin veya pH bağımlılığının belirlenmesi gibi simetrik koşullar altında ölçüm yapmak istiyorsanız, tek çözelti değişim protokolünü seçin. Her çözelti için akış süresini oh 0,5 ila bir saniye olarak ayarlayın. Akım, tüm akış protokolü boyunca kaydedilir.

Amplifikasyon genellikle 10 üzeri dokuz olarak ayarlanır ve örnekleme hızı için saniyede 2000 veri noktası seçeriz. Son olarak, yeni protokolünüzü NA a ve a başlığı altında kaydedin. Akış protokolü penceresinin ikinci dokunuşunda, etkinleştirilmeyen veya etkinleştirilen çözümün akışını kübit aracılığıyla kontrol etmek için belirli valflerin açık veya kapalı durumunu tanımlayabilirsiniz.

Burada, E coli'den Y gibi şeker protonu ithalatı olan protea lipozomlarının ölçümünü gösteriyoruz. Aktive edici çözelti, taşınan substrat laktozunu içerirken, aktive olmayan çözelti, telafi edici bir bileşik olarak aynı miktarda taşınmamış glikoz içerir. Şekerlere ek olarak, çözeltiler pH 7.6'da 100 milimolar potasyum fosfat ve bir milimolar DTT içerir.

Solüsyonları değiştirdikten sonra, hava kabarcıklarının giderildiğinden emin olmak için manuel valfi kullanın. Bir akış protokolüne başlamadan önce, ölçüme başlamadan hemen önce basıncı ayarlayın. Rutin olarak Ø 0,6 bar basınç kullanıyoruz, bu da özel valf ve boru konfigürasyonumuzda saniyede yaklaşık bir mililitrelik bir akış hızı sağlar.

Ardından burada güvenli bir akış protokolü, NAA protokolü seçin ve her ölçümü başlatmak için başlat düğmesine basın. İlk birkaç ölçüm sırasında gevşek bir şekilde emilir, protea lipozomları çıkarılır ve bu nedenle tepe akımı düşebilir. Tepe akımı sabit kalana kadar ölçümü tekrarlayın.

Aktive olmayan çözelti akışının ilk aşaması sırasında akım sıfırdır. Laktoz içeren aktive edici olmayan çözeltiden aktive edici çözeltiye geçiş, zarın elektrojenik taşıma aktivitesini indükler. Protein pozitif yük, prote lipozomların içinde birikir ve amplifikatör, SSM aracılığıyla pozitif eşleşme nedeniyle pozitif bir geçici akım algılar.

Bu pozitif pozitif eşleşmiş akım, aktive edici çözeltiden açık sinyal V değişimi olarak adlandırılır. Aktive edici olmayan çözeltiye geri dönmek, lipozomlardan proton şeker kodu taşınmasını indükler. Bu durumda, protein kinetik analizi için kapalı sinyal olarak adlandırılan negatif bir LY birleştirilmiş akım görüntülenir.

Membran valf anahtarlamasının şarj durumu nedeniyle kapalı sinyali zayıf bir şekilde tanımlandığından, yalnızca açma sinyali kullanılır, mekanik ve elektriksel artefaktlar oluşturur. Neyse ki, bunlar protein kaynaklı sinyaller gözlemlenmeden önceki bir zaman aralığı ile sınırlıdır. Valf anahtarlama artefaktları ve taşıyıcı sinyalleri arasındaki 50 milisaniyelik gecikmenin, çözümün terminal valfinden SSM Hızlı Çözüm Değişiminin yüzeyine yayılması için gereken süre olduğunu unutmayın, SSM'de gerçekleştirilen gibi, tipik bir gevşeme deneyini temsil eder.

Bu tür deneylerde, akım, zamana bağlı bir kararlı durum öncesi faz boyunca sabit bir kararlı duruma gevşer. Reaksiyon döngüsünün akım kinetik detayları, kararlı durum akımının şeklinden ve büyüklüğünden türetilebilir. Kararlı durum akımı, sürekli zar protein döngüsü hakkında bilgi sağlar.

Protea lipozomların SSM'lerine emildiği ly bağlantılı sistemde, ön kararlı durum akımları hemen hemen değişmez. Sabit bir sabit durum akımı hiçbir zaman elde edilmezken, bunun yerine lipozomların yüklenmesi nedeniyle ölçülen akım yavaş yavaş azalır. Taşıyıcı akım, devre analizi vasıtasıyla ölçülen birleştirilmiş akımdan hesaplanabilir.

Burada, 8.5 ile 7.6 arasındaki PA aralığında Y gibi şeker proton yardımcı taşıyıcısını kullanarak Temsili sonuçları gösteriyoruz. Taşıyıcı akıma, reaksiyon döngüsünün sonlarında bir elektrojenik reaksiyon hakimdir. Bu koşullar altında, kararlı durum öncesi yüz, kararlı durum değerine basit bir akım artışından oluşur.

Bu daha sonra kapasitif kuplaj nedeniyle bozulur. Kararlı durum ulaşım akımı ile ilgileniyoruz. Bir membran potansiyelinin yokluğunda, bu, tepe akımı ile iyi bir yaklaşımla temsil edilir.

Bu nedenle Ali Mein kinetiği, farklı substrat konsantrasyonları için tepe akımlarının lekelenmesiyle analiz edilebilir, ancak tepe akım genliklerinin yalnızca bir deneyde tek bir sensörden elde edildiklerinde titizlikle karşılaştırılabileceğini düşünün. Bunun bir nedeni, absorpsiyon verimliliğinin değişkenliğidir. PH daha da düştüğünde, monofazik sinyal iki fazlı hale gelir.

Ve son olarak, taşıma eksikliği için hızlı bir geçici kalır gecikme Y mutant. Hızlı geçici durumu küçük, daha yavaş bir negatif bileşen takip eder. Negatif bileşen, ly bağlantılı sistemlerde ölçülen hızlı geçici akımlar için karakteristiktir ve membran kapasitans deşarjından kaynaklanır.

Burada, tepe akımı kararlı durum taşınımını temsil etmez, daha ziyade iyon döngüsünün başlarında geçişin elektrojenik bir onayını temsil eder, bu da a la y mutantın kararlı durum taşınımı göstermemesi nedeniyle belirginleşir ve vahşi tip gecikme için, y kararlı durum taşınması düşük bir pH tarafından engellenir. Deneysel kanıtlar, kinetik modelde gösterilen gecikme y'nin reaksiyon döngüsünde yük translokasyonunun mekanik bir yorumunu sağlar. Taşıma eksikliği olan mutant için gözlenen hızlı geçici durum veya asidik koşullarda vahşi tip gecikme Y durumunda, daha yüksek pH değerlerinde laktoz bağlanmasını takiben hızlı bir haftalık elektrojenik reaksiyondan kaynaklanır, sinyale, kapasitif olarak bağlanmış sistemde yalancı plazmik proton salınımını temsil ettiği öne sürülen reaksiyon döngüsünün sonlarında ana elektrojenik reaksiyon hakimdir.

Bu, Utes'in güçlü etkileşimi nedeniyle Lag y'nin kararlı durum taşınmasını temsil eden geçici akımlara yol açar. SSM ile, farklı bileşimdeki çözeltiler değiş tokuş edildiğinde elektriksel artefaktlar üretilir. Aktive edici olmayan ve aktive edici çözeltilerin, özellikle pH ve iyonik kuvvetleri açısından mümkün olduğunca benzer olduğundan emin olun.

Kontrol yapılmalıdır çünkü substratlar da artefaktlar üretebilir. Protein örneği eklenmeden önce her zaman çıplak SSM'yi kullanarak özel tampon sisteminizi ve akış protokolünüzü artefaktlar için test edin. Protein numunesi eklendikten sonra, yapısal olarak substrata benzer olan substrat olmayan çözeltiler ile kontrol ölçümleri yapılabilir.

Ayrıca, ilgilenilen protein olmadan lipozomlar veya zar parçaları kullanarak artefaktlar için substratı test etme olasılığı vardır. Ayrıca solüsyonlarınıza inhibitörler ekleyebilir veya pipetleyebilirsiniz. Taşıyıcı sinyal inhibisyonunu ölçmek için deneyden sonra doğrudan vete çıkışına gittikten sonra, proteine özgü sinyaller kaybolacak ve geriye sadece çözelti değişim artefaktları kalacaktır.

Protein sinyali daha sonra kolayca düzeltilebilir. Emilen prot, lipozom kaybı veya protein bozulmasının ölçümünüzü etkilemediğinden emin olun. Aynı koşullar altında tekrarlanan kontrol ölçümleri gerçekleştirilerek, %20'ye kadar bir sinyal özeti kabul edilebilir ve özetin doğrusal bir zaman Bağımlılığı varsayılarak düzeltilebilir.

Bu kurulum, laboratuvarımızdaki 20 yıllık teknik geliştirmenin bir sonucudur. Ayrıca, kinetik analiz için daha yüksek zamanlayıcı çözümüne ve pahalı alt tabakalar için daha düşük çözelti tüketimine sahip özel sistemler de mevcuttur. İlaç taraması için, daha yüksek verime sahip tam otomatik kurulumlar kullanıyoruz.

Bugüne kadar, 20'den fazla taşıyıcı bu yöntem kullanılarak karakterize edilmiştir. Bunlara taşıma APA'ları, solunum zinciri kompleksleri, soğuk taşıyıcılar, eşanjörler ve hatta demir kanallar dahildir. Bu nedenle, probleminizi standart elektrofizyoloji ile çözemediğinizde, bunun yerine SS Mase elektrofizyolojisini kullanmayı düşünün.