Diabetes Mellitus ve Metabolik Belleğinin Zebrafish Modeli

Metabolik bellek diyabetik komplikasyonlar inat ve öglisemi farmasötik elde edildikten sonra bile engelsiz ilerleme hangi olgudur. İşte biz metabolik bellek mitotik bulaşıcı epigenetik bileşenlerinin incelenmesi için izin verdiği benzersiz bir diyabet zebrafish modeli açıklamak

Bu prosedürün genel amacı, diabetes mellitus komplikasyonlarının moleküler temelini keşfetmek ve daha da önemlisi kalıcılıklarının genetik temelini belirlemek için kullanılabilecek bir tip bir diabetes mellitus zebra balığı modeli oluşturmaktır. Bu, ilk önce diyabetojenik ilaç STZ'nin bir dizi enjeksiyonu ile hiperglisemiyi indükleyerek ve balığın düşük bir sıcaklıkta kuluçka etmesiyle gerçekleştirilir. Daha sonra, üç hafta sonra, hiperglisemik durumun indüklendiğinden emin olmak için açlık kan şekeri seviyeleri belirlenir ve beta hücre iyileşmesini başlatmak için ilaç durdurulur.

Daha sonra kaudel yüzgeci ampute edilir ve metabolik hafızanın genetik olarak aktarılabilir bileşenlerini izole etmek ve önceki hiperglisemik ortamın potansiyel olarak karmaşık faktörlerini ortadan kaldırmak için yenilenmesine izin verilir. Son olarak, yüzgeç rejenerasyonunda kalıcı bir azalmayı belgelemek ve ilgilenilen bir test yoluyla kesilen dokuda indüklenen değişiklikleri belirlemek için bir yüzgeç rejenerasyon testi yapılır. Diyabetik zebra balığı modelinin mevcut modellere göre en büyük avantajı, metabolik hafızanın gerçek bir U glisemik ortamda, pankreas nakli sonrası hastalarda görülenlere kadar incelenebilmesidir.

Modelin, metabolik hafızanın altında yatan epigenetik modifikasyonların keşfi ve diyabetik komplikasyonların kalıcılığı için kullanılması beklentimizdir Diabetes mellituslu zebra balığı oluşturmak için, normal balık suyu ile bir geri kazanım tankı ve bir davlumbaz altında iki fenoksietanolün bir ila 1000 oranında seyreltilmesi ile bir anestezik balık suyu tankı hazırlayın. İki mililitre% 0.09 sodyum klorüre altı miligram STZ ekleyerek% 0.3'lük bir STREPTOZOTOCIN veya STZ çözeltisi hazırlayın ve çözeltiyi hemen ayrı bir tüpe buz üzerine yerleştirin. Aliquot kontrol için yeterince tuzlu su.

Balıklar, 27 buçuk gauge iğne ile donatılmış yarım CC'lik bir şırıngayı STZ veya kontrol solüsyonları ile doldurarak hava kabarcıklarının sıkışmamasını sağlar. Tek bir balığı anestezik suya koyarak ve yüzme hareketi durana kadar yaklaşık bir ila iki dakika bekleyerek anestezi uygulayın. Anestezi uygulandıktan sonra, fazla suyu emmesi için balığı kısa bir süre kağıt havlu üzerine koyun, ardından balığı bir yol teknesine yerleştirin ve tartın.

Ardından, balığı sağlam bir yüzeye yerleştirin. Daha sonra iğneyi eğimden geçerek ventral peritonun arka yüzüne yerleştirin ve enjeksiyonu takiben balığın periton boşluğuna gram TZ başına 0.35 miligram veya eşdeğer bir kontrol solüsyonu enjekte edin. Balıkları geri kazanım suyu tankına yerleştirin ve normal yüzme aktivitesi için izleyin.

Deney için yeterli miktarda balık enjekte ettikten sonra, onları normal yaşam tanklarına aktarın ve 22 ila 24 santigrat derece arasında bir sıcaklıkta tutun. Azaltılmış sıcaklık, uzun süreli çok yüksek hiperglisemi durumunu indüklemek için hipergliseminin verimli bir şekilde indüklenmesi için kritik öneme sahiptir, indüksiyon fazı sırasında sık sık enjeksiyonlar programını takip edin, ardından kan toplamak için burada gösterildiği gibi haftalık bakım enjeksiyonları yapın. FBGL'yi belirlemek için, beş mikrolitre normal salin içeren her kan örneği için etiketli bir PCR tüpü hazırlayın.

Balığa anestezi uygulandıktan sonra fazla suyu kurulayın, balığı bir mikroskop lamına yerleştirin ve bir neşter kullanarak, operkülomun tabanındaki kafayı çıkarın, slaytta salınan kanı toplayın ve hızlı bir şekilde steril PCR tüpüne ekleyin, kanın hemen pıhtılaşmadığından emin olmak için yukarı ve aşağı normal salin pipetleme numuneyi buz üzerine yerleştirin. Tüpteki sıvının toplam hacmini ölçerek ve beş mikrolitre salini çıkararak kan örneği hacmini belirleyin. Her bir PCR tüpünden seyreltilmiş kanın beş mikrolitresini 1.5 mililitrelik bir mikro füj tüpüne aktarın ve kan şekeri konsantrasyonunu belirlemek için üreticinin talimatlarına göre kuantum krom glikoz test kitini kullanın.

Bir balığı uyuşturduktan sonra, onu bir Petri kabına yerleştirin ve bir diseksiyon dürbünü altında, testin rejeneratif büyüme aşaması için ilk lipid trakea dallanma noktasına proksimalde düz bir çizgi keserek coddle yüzgecini kesmek için steril bir 10 numara neşter kullanın. Yenileyici yüzgeçleri görüntülemek için balığı 33 santigrat derecede bir geri kazanım tankına yerleştirin. Bir balığı uyuşturduktan sonra, yüzgeci tamamen uzatılacak şekilde açın ve bir kamera ve NIS eleman yazılımı ile donatılmış bir diseksiyon dürbünü kullanın.

Rejeneratif büyümeyi ölçmek için görüntüleri bir x büyütmede toplayın. Görüntüleri yazdırın ve izlemenin doğruluğu için yeni büyümenin tüm alanını izlemek için görüntü J yazılımını ve bir çizim defterini kullanın. Gölge veya su damlacığı olmadığından emin olun ve ortalamayı hesaplamak için her ölçümü beş kez yapın.

Ölçümleri normalleştirmek için, dorsal ventral eksen boyunca amputasyon bölgesinin uzunluğunu ölçün ve önceden belirlenen alanı bu ölçüme bölün. 21 günde bir DM BALIĞI grubu ve kontrolleri oluşturulduktan sonra, grubun bir alt kümesi için FBGL'yi belirleyin ve deney süresince DM balığını iki alt gruba bölün. İkinci grup için DM kontrolleri STZ enjeksiyonlarını durdurur ve balıkları normal sıcaklıkta kuluçkaya yatırırken, gruplardan biri için haftalık STZ enjeksiyonlarına devam edin.

14 gün içinde, bu zebra balığı pankreas rejenerasyonu yoluyla normal kan insülini ve glikoz kontrolünü geri kazandıracaktır. Bu balıklar artık metabolik hafıza veya MM olarak adlandırılmaktadır, ilacın çıkarılmasından 30. gün sonra balıklar, metabolik hafıza dokusunun büyümesine izin vermek için bu videoda daha önce gösterildiği gibi kontrol DM ve MM balıklarının coddle yüzgeçlerini keser. 60. günde 30 gün boyunca yüzgeç rejenerasyonu için balıkları normal su koşullarına geri getirin.

30 ila 60 gün arasında rejenere olan doku içinde ikinci bir amputasyon gerçekleştirin ve bir coddle fin rejenerasyon testi yapın, dokuyu izole edin ve ilgilenilen bir test yapın. Birinci tip diyabetik zebra balığı sadece retinopati ve nefropatinin bilinen ikincil komplikasyonlarını göstermekle kalmaz, aynı zamanda amputasyondan 72 saat sonra burada görülebileceği gibi ek bir komplikasyon olan yavru yüzgeci rejenerasyonunu da sergiler. Bu komplikasyon, burada gösterildiği gibi hiperglisemik bir dönemi takiben normal glikoz kontrolünü geri kazanmış balıklarda metabolik hafıza nedeniyle devam eder, mm zebra balıkları, kontrol balıklarına kıyasla yüzgeç rejenerasyonunda yaklaşık% 40'lık bir eksiklik sergiler ve bozulma amputasyondan 150 gün sonra gözlenmiştir.

Bu videoyu izledikten sonra, zebra balıklarında hiperglisemik durumun nasıl başlatılacağını, açlık kan şekeri seviyelerinin nasıl ölçüleceğini, yüzgeç rejenerasyon çalışmalarının nasıl yapılacağını ve nihayetinde metabolik hafıza balıklarının nasıl oluşturulacağını iyi anlamış olmalısınız.