Name: Ca aynı anda Ölçümler İnsan Atriyal miyositlerin izolasyonu 2 + Geçici ve Membran Akımlar (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: Öğrenin insan atriyal miyositlerinin izolasyonunu ve Ca²⁺ geçişleri ile membran akımlarının eşzamanlı ölçümünü. Bu yöntem, kardiyak hastalıkların moleküler temelini anlamak için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Buna ek olarak, onların mükemmel teknik destek için insan atriyal doku ve Claudia Liebetrau, Katrin Kupser ve Ramona Nagel sağlanması için Heidelberg Üniversitesi&#39;nde kalp cerrahlar teşekkür ederim. Onun yararlı öneriler ve Ca 2 + geçici ölçümlerin kuruluş aşamasında danışmanlık için de Andy W. Trafford için teşekkür etmek istiyorum. Onlar hücresel elektrofizyoloji ve kardiyomiyosit izolasyon temel teknikleri ve becerileri öğrenmek için bize sunulan fırsatı için Teknoloji Dresden Üniversitesi: Yazarlar Farmakoloji ve Toksikoloji Anabilim Dalı (Ursula Ravens kafa) üyelerine en derin şükranlarımızı ifade etmek istiyoruz. Yazarlar araştırma Alman Araştırma Vakfı (Do769/1-1-3), Atriyal fibrilasyon Yetkinlik Ağı aracılığıyla Eğitim ve Araştırma Alman Federal Bakanlığı (01Gi0204) ve Kardiyovasküler Araştırma için Alman Merkezi aracılığıyla Avrupa Birliği tarafından desteklenmektedir EuAtriyal fibrilasyon içinde Translational Araştırma Sanatlar Lisesi, Avrupa Ağı (EUTRAF, FP7-SAĞLIK-2010, büyük ölçekli entegre proje, Teklif No 261057) ve Avrupa-Kuzey Amerika Atriyal fibrilasyon Araştırma Birliği (ENAFRA) Vakfı Leducq (07CVD03) bir hibe. Video dosyası gösterilen şematik bir genel Servier, tıp tekniğinde kullanılarak üretildi.

Deneysel protokolleri, yerel etik kurul tarafından onaylanmış ve tüm hastalarda yazılı onay vermek gerekir gerekir. Araştırma Tıp Fakültesi Mannheim etik kurul, Heidelberg Üniversitesi (# 2011-216N-MA) tarafından onaylandı ve insan refahı için tüm, kurumsal, ulusal ve uluslararası kurallar uygun olarak yapıldı. Tüm hastalar yazılı onam verdi. 0. İnsan Atriyal Doku Alınması Aşılama kardiyopulmoner bypass için açık kalp ameliyatı geçiren hastalarda rutin kanülasyon prosedürleri sırasında, sağ atriyal apendiks ucunda genellikle kaldırılır ve atriyal kardiyomiyositlerinin izolasyonu için kullanılabilir. BDM, kasılma önleyici, miyosit c önlenmesi; eksizyon sonrası doku örneği 2,3-bütandion monoxime (Tablo I içeren +-ücretsiz ulaşım çözümü steril Ca 2 ile 50 ml Falcon tüp içine hemen aktarılır) ontracture. 30 ve 45 dakika arasında ulaşım zaman ile, izole atriyal kardiyomiyositlerinin sayısı ve kalitesini göre soğutma veya oksijenasyon bir avantaj tanımadı. Laboratuara genel ulaşım mümkün olduğunca hızlı olmalıdır. Daha uzun süre taşıma süresi önlenemez Ancak, 4 de ulaşım ° C oksijenli çözüm avantajlı olabilir. 1. Prearrangements <ol><li> Ceketli beher (Tablo II) sıcaklık kontrol thermocirculator, açın. Kabı içindeki sıcaklık 37 ° C ye eşit olduğundan emin olun Tüm süreç boyunca izolasyon beher içinde sabit bir sıcaklığı korumak için bir cam kapak ile kabı kapsamaktadır. </li><li> Üç cam bardak içine kollajenaz I ve Proteaz XXIV tartılır ve oda sıcaklığında saklayın. Enzimler, kullanımdan hemen önce seyreltildi edilecektir. </li><li> Ca 2 Mağaza 20 ml 4 bir Petri kabındaki + ücretsiz bir çözüm ° C </li><li>Ca 2 deposu 250 ml 37 ° C&#39;de su banyosunda + serbest çözeltisi ° C </li></ol> 2. Doku temizliği <ol><li> Bir Petri kabı (~ 10 cm çapında) içine taşıma çözümü ile birlikte doku örneği aktarın ve yaklaşık makas kullanılarak yağ doku kaldırmak. </li><li> Doku örneği tartılır. 200 ila 600 mg hücre izolasyonu için kullanılır. Kalan doku daha sonra biyokimyasal analiz için likit nitrojende dondurulmuş olabilir. </li><li> 20 ml Ca 2 içeren Petri kabı içine doku örneği aktarmak 4 de + ücretsiz bir çözüm ° C (adım 1.3) ve boyutu yaklaşık 1 mm 3 küçük parçalar halinde doku örneği doğrayın. </li><li> Aşağıdaki adımlar% 100 O 2 ile 37 ° C de ve sürekli gazlama altında yürütülmelidir. Bir pipet güçlü köpüren önlemek ve sürekli hava akışı oluşturmak için oksijen tüpü üzerine yerleştirilebilir. </li><li> Içinde Ca2 + içermeyen bir çözüm ile birlikte doku parçaları transferceketli beher ve bir manyetik karıştırma çubuğu ile yaklaşık 3 dakika boyunca dikkatli bir şekilde karıştırın. </li><li> Karıştırma durdurmak ve doku parçaları birkaç saniye yerleşmek için izin verir. Bir naylon örgü (200 mikron, Tablo II) ile süpernatant dikkatlice süzün. Forseps kullanarak beher içine örgü gelen ölçülü doku parçaları dönün. </li><li> Ca 2 ile doldurun beher + serbest çözeltisi ile yıkama aşaması 2.4 ve 2.5 &#39;da iki kez tekrarlayın. </li></ol> 3. İlk Enzimatik Sindirim <ol><li> Kolajenaz ve proteaz ihtiva eden 20 ml enzim çözeltisi E1 (Tablo I) ile doku parçaları yeniden askıya ve 10 dakika boyunca dikkatli bir şekilde karıştırın. </li><li> 20 uM Ca2 + bir son konsantrasyon elde etmek için 10 mM CaCl2-çözeltisinin 40 ul ekle. </li><li> 35 dakika doku parçaları çoğu beher kalır bir şekilde bir naylon örgü (200 mikron, Tablo II) dikkatle süpernatant süzün sonra. Dinlenme dönörgü gelen behere doku parçaları yağmur yağdı. </li></ol> 4. İkinci Enzimatik Sindirim <ol><li> Sadece 20 mL enzim çözeltisi içeren E2 kolajenaz (Tablo I) ile tekrar doku parçaları yeniden süspanse edin. Hemen 20 uM Ca2 bir son konsantrasyon elde etmek için 10 mM CaCl2-çözeltisi 40 ul +. </li><li> İkinci sindirim kullanımı makas sırasında daha fazla bazen doku pıhtıları kesmek için. </li><li> 5 dakika sonra hücrelerin ayrışma kontrol etmek için bir Pasteur pipeti kullanarak bir örnek almak. Çubuk şeklinde, çizgili kardiyomiyositler görünene kadar bu 2-3 dk her tekrarlayın. </li><li> Karıştırma durdurmak ve doku parçaları yaklaşık 20-30 saniye yerleşmek için izin verir. </li><li> 50 ml&#39;lik bir Falcon tüp (tüp A) içine, naylon elekten (200 mm, Tablo II) ile dikkatli bir şekilde yüzer süzün. Behere örgü gelen ölçülü doku parçaları dönün. </li><li> 20 ml Stora ile beher doku parçaları yeniden askıyaGE çözeltisi (Tablo I) &#39;in 10 ve daha fazla dağıtıcı içeren bir 20 mL serolojik bir pipet kullanarak yumuşak mekanik öğütülerek hücreleri ayırmak. Kabarcıklar hücre sağkalım ve kalite için zararlı olduğu için kabarcık oluşumunu önlemek için deneyin. </li><li> 50 ml Falcon Tüp (Tüp B) bir naylon örgü (200 mikron, Tablo II) dikkatle süpernatant süzün. </li></ol> 5. Final Ca 2 Son Hazırlık ve Ayar + Konsantrasyon <ol><li> 10 dakika 95 xg&#39;de Falcon tüpler A ve B (adım 4.5 ve 4.7) hem de santrifüj. </li><li> Aspirasyon tarafından dikkatli bir şekilde her iki tüpleri süpernatantı. Pelet rahatsız etmemek için emin olun. Süpernatantı atın. </li><li> 1.5 ml saklama solüsyonu (Tablo I) &#39;in her biri (oda sıcaklığı) her iki pelet yeniden askıya. </li><li> İki kez her Falcon için 10 mM CaCl2 çözüm 7.5 ul ekleyin ve dikkatli bir şekilde karıştırın. Her adım, sonra 10 dakika süreyle inkübe edin. </li><li>0.2 mM nihai bir Ca2 + konsantrasyonu elde etmek için 10 mM CaCl2 çözeltisi 15 ul ekle. </li></ol> 6. Floresan Ca 2 +-göstergesi Fluo-3 AM (Şekil 1) ile miyositlerin yükleme <ol><li> 2 ml mikrosantrifüj tüpü (Eppendorf tüp) içine hücre süspansiyonu, 1.5 ml (tüp A ve / ya da tüp B) aktarın. </li><li> Aşağıdaki adımlar floresan Ca 2 + Gösterge Fluo-3 ışık hassasiyeti dikkate alınarak yürütülmelidir. </li><li> Pluronik F-127 (Tablo III) stok çözeltisi (% 20 susuz DMSO içerisinde ağırlık / hacim olarak) elde etmek için 44 ul içerisinde Fluo-3 membran geçirgen asetoksimetil ester türevi (Fluo-3 AM, Tablo III) &#39;ün 50 mg çözülür 1 mM Fluo-3 en az 1 hafta boyunca -20 ° C&#39;de saklanabilir stok solüsyonu, Am. </li><li> 15 ul ekle Fluo-3 hücre süspansiyonu, 1.5 ml (adım 6.1) ve ajitasyon içeren mikrosantrifüj tüpüne stok solüsyonu AMdikkatli. </li><li> Bir optik olarak donuk olan bir kutuda 10 dakika boyunca hücre süspansiyonu inkübe edin. </li><li> Kısaca yaklaşık 6000 rpm santrifüj. </li><li> Süpernatantı atın ve 1.5 ml banyo solüsyonu (Tablo IV) pelet yeniden askıya. </li><li> Deneyleri ile başlamadan önce de-esterifikasyon için yaklaşık 30 dakika boyunca bir hücre süspansiyonu bırakın. </li></ol> 7. Eşzamanlı Patch-kelepçe ve epifluorescent Ca 2 + Ölçümler Yama-kelepçe ölçümleri bu yorumu en önemli konu olmadığı, bu tekniğin derinlemesine bir açıklama daha sağlayan diğer yayınlar için ilgilenen okuyucu bakın. 11-14 bütünlüğü uğruna biz ölçmek için bir protokol kısa bir özetini aksiyon potansiyelleri veya L-tipi Ca 2 + akımları, eş zamanlı Ca 2 +-geçici kayıtları ile birlikte hem. Deneyler sırasında miyositler banyo soluti ile 37 ° C&#39;de superfused edilirhızlı bir perfüzyon sistemi (Octaflow IITM, ALA Scientific Instruments, NY) ile (Tablo IV). Voltaj-kıskaç deneyleri için, K + akımlarının banyo solüsyonuna 4-aminopiridin (5 mg / L) ve BaCl 2 (0.1 mmol / L) eklenerek bloke edilmiştir. Borosilikat cam Mikroelektronlar kullanılır ve pipet çözüm (Tablo V) ile dolu zaman MQ 2-5 dirençleri ucu olmalıdır. Fluo-3 ek olarak (adım 6), miyosit yükleme PM, Flu-3, aynı zamanda pipet çözeltisi (Tablo V) &#39;de yer almaktadır. Floresan 488 nm heyecanlı ve yayılan ışık (&lt;520 nm) [Ca 2 +] i varsayarak dönüştürülür <img alt="Denklem 1" fo:content-width="1.540in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50235/50235eq1.jpg" /> burada K, D Fluo-3 sabiti = çözünme (864 KM), K = Fluo-3 floresan;. Fmax = Ca2 her deney sonunda elde edilen + doymuş floresan 12 elektrik sinyalleri ve Epifluorescent Ca2 + hem de görüntü sinyallerini da kaydedilir. Aksiyon potansiyelleri 1.2x eşik gücü 1 msn akım darbeleri kullanarak akım kelepçe modunda 0,5 Hz uyarılır. L tipi Ca2 + akımları, 100 milisaniye ile hızlı-Na + akımı, ardından etkisiz hale getirmek için -80 mV değerinde bir tutma potansiyeli -40 mV&#39;a bir 100-msn rampa darbe ile voltaj-kelepçe modunda ölçülür 0,5 Hz +10 mV test darbe.

<ol><li>Wakili, R., Voigt, N., Kaab, S., Dobrev, D., Nattel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+the+molecular+pathophysiology+of+atrial+fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Recent advances in the molecular pathophysiology of atrial fibrillation.</a> J. Clin. Invest. 121, 2955-2968 (2011).</li>
<li>Margaret, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulsation%2C+migration+and+division+in+dissociated+chick+embryo+heart+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Zoology%22%5BJournal%5D)">Pulsation, migration and division in dissociated chick embryo heart cells in vitro.</a> Journal of Experimental Zoology. 128, 573-589 (1955).</li>
<li>Bustamante, J. O., Watanabe, T., Murphy, D. A., McDonald, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+single+atrial+and+ventricular+cells+from+the+human+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Can.+Med.+Assoc.+J%22%5BJournal%5D)">Isolation of single atrial and ventricular cells from the human heart.</a> Can. Med. Assoc. J. 126, 791-793 (1982).</li>
<li>Dobrev, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G-Protein+%CE%B23-subunit+825T+allele+is+associated+with+enhanced+human+atrial+inward+rectifier+potassium+currents%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">G-Protein β3-subunit 825T allele is associated with enhanced human atrial inward rectifier potassium currents.</a> Circulation. 102, 692-697 (2000).</li>
<li>Voigt, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+phosphorylation-dependent+regulation+of+constitutively+active+and+muscarinic+receptor-activated+IK%2CACh+channels+in+patients+with+chronic+atrial+fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Differential phosphorylation-dependent regulation of constitutively active and muscarinic receptor-activated IK,ACh channels in patients with chronic atrial fibrillation.</a> Cardiovasc. Res. 74, 426-437 (2007).</li>
<li>Voigt, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+IK%2CACh+current+may+contribute+to+clinical+efficacy+of+class+I+and+class+III+antiarrhythmic+drugs+in+patients+with+atrial+fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22Naunyn.+Schmiedebergs+Arch.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of IK,ACh current may contribute to clinical efficacy of class I and class III antiarrhythmic drugs in patients with atrial fibrillation.</a> Naunyn. Schmiedebergs Arch. Pharmacol. 381, 251-259 (2010).</li>
<li>Dobrev, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+G+protein-gated+potassium+current+IK%2CACh+is+constitutively+active+in+patients+with+chronic+atrial+fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">The G protein-gated potassium current IK,ACh is constitutively active in patients with chronic atrial fibrillation.</a> Circulation. 112, 3697-3706 (2005).</li>
<li>Voigt, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Left-to-right+atrial+inward+rectifier+potassium+current+gradients+in+patients+with+paroxysmal+versus+chronic+atrial+fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Arrhythm.+Electrophysiol%22%5BJournal%5D)">Left-to-right atrial inward rectifier potassium current gradients in patients with paroxysmal versus chronic atrial fibrillation.</a> Circ. Arrhythm. Electrophysiol. 3, 472-480 (2010).</li>
<li>Amos, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+between+outward+currents+of+human+atrial+and+subepicardial+ventricular+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Differences between outward currents of human atrial and subepicardial ventricular myocytes.</a> J. Physiol. 491 (Pt. 1), 31-50 (1996).</li>
<li>Feng, J., Xu, D., Wang, Z., Nattel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrarapid+delayed+rectifier+current+inactivation+in+human+atrial+myocytes%3A+properties+and+consequences%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Ultrarapid delayed rectifier current inactivation in human atrial myocytes: properties and consequences.</a> Am. J. Physiol. 275, H1717-H1725 (1998).</li>
<li>Voigt, N., Makary, S., Nattel, S., Dobrev, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage-clamp-based+methods+for+the+detection+of+constitutively+active+acetylcholine-gated+IK%2CACh+channels+in+the+diseased+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Voltage-clamp-based methods for the detection of constitutively active acetylcholine-gated IK,ACh channels in the diseased heart.</a> Methods Enzymol. 484, 653-675 (2010).</li>
<li>Trafford, A. W., Diaz, M. E., Eisner, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel%2C+rapid+and+reversible+method+to+measure+Ca2%2B+buffering+and+time-course+of+total+sarcoplasmic+reticulum+Ca2%2B+content+in+cardiac+ventricular+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">A novel, rapid and reversible method to measure Ca2+ buffering and time-course of total sarcoplasmic reticulum Ca2+ content in cardiac ventricular myocytes.</a> Pflugers Arch. 437, 501-503 (1999).</li>
<li>Voigt, N., Nattel, S., Dobrev, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proarrhythmic+atrial+calcium+cycling+in+the+diseased+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Exp.+Med.+Biol%22%5BJournal%5D)">Proarrhythmic atrial calcium cycling in the diseased heart.</a> Adv. Exp. Med. Biol. 740, 1175-1191 (2012).</li>
<li>Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+patch-clamp+techniques+for+high-resolution+current+recording+from+cells+and+cell-free+membrane+patches%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches.</a> Pflugers Arch. 391, 85-100 (1981).</li>
<li>Voigt, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+sarcoplasmic+reticulum+Ca2%2B+leak+and+increased+Na%2B-Ca2%2B+exchanger+function+underlie+delayed+afterdepolarizations+in+patients+with+chronic+atrial+fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Enhanced sarcoplasmic reticulum Ca2+ leak and increased Na+-Ca2+ exchanger function underlie delayed afterdepolarizations in patients with chronic atrial fibrillation.</a> Circulation. 125, 2059-2070 (2012).</li>
<li>Berry, M. N., Friend, D. S., Scheuer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphology+and+metabolism+of+intact+muscle+cells+isolated+from+adult+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Morphology and metabolism of intact muscle cells isolated from adult rat heart.</a> Circ Res. 26, 679-687 (1970).</li>
<li>Farmer, B. B., Mancina, M., Williams, E. S., Watanabe, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+calcium+tolerant+myocytes+from+adult+rat+hearts%3A+review+of+the+literature+and+description+of+a+method%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Isolation of calcium tolerant myocytes from adult rat hearts: review of the literature and description of a method.</a> Life Sci. 33, 1-18 (1983).</li>
<li>Zimmerman, A. N., Hulsmann, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paradoxical+influence+of+calcium+ions+on+the+permeability+of+the+cell+membranes+of+the+isolated+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Paradoxical influence of calcium ions on the permeability of the cell membranes of the isolated rat heart.</a> Nature. 211, 646-647 (1966).</li>
<li>Bielecki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+changes+in+pH+of+the+perfusion+fluid+on+the+occurrence+of+the+calcium+paradox+in+the+isolated+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc.+Res%22%5BJournal%5D)">The influence of changes in pH of the perfusion fluid on the occurrence of the calcium paradox in the isolated rat heart.</a> Cardiovasc. Res. 3, 268-271 (1969).</li>
<li>Kramer, J. H., Chovan, J. P., Schaffer, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+taurine+on+calcium+paradox+and+ischemic+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effect of taurine on calcium paradox and ischemic heart failure.</a> Am. J. Physiol. 240, H238-H246 (1981).</li>
<li>Rich, T. L., Langer, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+depletion+in+rabbit+myocardium.+Calcium+paradox+protection+by+hypothermia+and+cation+substitution%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Calcium depletion in rabbit myocardium. Calcium paradox protection by hypothermia and cation substitution.</a> Circ. Res. 51, 131-141 (1982).</li>
<li>Isenberg, G., Klockner, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+tolerant+ventricular+myocytes+prepared+by+preincubation+in+a+%22KB+medium%22%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Calcium tolerant ventricular myocytes prepared by preincubation in a "KB medium".</a> Pflugers Arch. 395, 6-18 (1982).</li>
<li>Diaz, M. E., Trafford, A. W., Eisner, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+exogenous+calcium+buffers+on+the+systolic+calcium+transient+in+rat+ventricular+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">The effects of exogenous calcium buffers on the systolic calcium transient in rat ventricular myocytes.</a> Biophys. J. 80 (01), 1915-1925 (2001).</li>
<li>Worthington, K., Worthington, V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWorthington%2C+K+%22Worthington+Enzyme+Manual%22">Worthington Enzyme Manual</a>. , (1993).</li>
<li>Christ, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathology-specific+effects+of+the+IKur%2FIto%2FIK%2CACh+blocker+AVE0118+on+ion+channels+in+human+chronic+atrial+fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Pathology-specific effects of the IKur/Ito/IK,ACh blocker AVE0118 on ion channels in human chronic atrial fibrillation.</a> Br. J. Pharmacol. 154, 1619-1630 (2008).</li>
<li>Dobrev, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+of+downregulation+of+G-protein-coupled+inward+rectifying+K%2B+current+IK%2CACh+in+chronic+human+atrial+fibrillation%3A+decrease+in+GIRK4+mRNA+correlates+with+reduced+IK%2CACh+and+muscarinic+receptor-mediated+shortening+of+action+potentials%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Molecular basis of downregulation of G-protein-coupled inward rectifying K+ current IK,ACh in chronic human atrial fibrillation: decrease in GIRK4 mRNA correlates with reduced IK,ACh and muscarinic receptor-mediated shortening of action potentials.</a> Circulation. 104, 2551-2557 (2001).</li>
<li>Hatem, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+compartments+of+sarcoplasmic+reticulum+participate+in+the+excitation-contraction+coupling+process+in+human+atrial+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Different compartments of sarcoplasmic reticulum participate in the excitation-contraction coupling process in human atrial myocytes.</a> Circ. Res. 80, 345-353 (1997).</li>
<li>Heidbuchel, H., Vereecke, J., Carmeliet, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+different+potassium+channels+in+human+atrium.+Contribution+to+the+basal+potassium+conductance%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Three different potassium channels in human atrium. Contribution to the basal potassium conductance.</a> Circ. Res. 66, 1277-1286 (1990).</li>
<li>Hove-Madsen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atrial+fibrillation+is+associated+with+increased+spontaneous+calcium+release+from+the+sarcoplasmic+reticulum+in+human+atrial+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Atrial fibrillation is associated with increased spontaneous calcium release from the sarcoplasmic reticulum in human atrial myocytes.</a> Circulation. 110, 1358-1363 (2004).</li>
<li>Molina, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+adenosine+monophosphate+phosphodiesterase+type+4+protects+against+atrial+arrhythmias%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Coll.+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Cyclic adenosine monophosphate phosphodiesterase type 4 protects against atrial arrhythmias.</a> J. Am. Coll. Cardiol. 59, 2182-2190 (2012).</li>
</ol>

Worthington Biyokimyasal Corp video dosyasının üretim maliyetleri kapsayan bu yayın destekledi. Fon bir çalışma tasarımında rol, veri toplama ve analizi, yayınlamak karar, ya da yazının hazırlanması vardı.

Burada açık kalp cerrahisi uygulanan hastalarda elde edilen sağ atriyal uzantıları insan atriyal miyositlerin izolasyonu için bir yöntem açıklanmaktadır. Sitosolik Ca2 ölçümleri için bu miyositler kullanmak için + Eğer saklama çözeltisinden EGTA ihmal edilmesi ile daha önce tarif edilen yöntem 4-11 uyarlanmıştır. Zaten 1970 yılında bu miyositler + sindirim sırasında Ca 2 varlığında ayırmak rağmen, hepsi nedenle kontraktürü ve cansız. 16,17 içinde olduğu gözlenmiştir, hücre izolasyonu Ca 2 +-ücretsiz bir çözüm yapılır. Ancak, Ca 2 fizyolojik konsantrasyonlarının yeniden giriş + hızlı Ca 2 + akını ve hücre ölümüne neden oldu. Bu aslında Zimmerman ve Hulsman ile perfüze gözlenmiştir Ca2 + paradoks bir olgu olarak tarif edilmiştir. 7.0 pH azaltılması da dahil olmak üzere yalıtım ortamı 18 Değişiklikler &lt;taurin 20 veya Ca 2 + (adım 3.2 ve 4.1 &#39;e bakınız), 21 yanı sıra, depolama çözelti 22 EGTA ihtiva eden izole miyosit depolama küçük miktarlarda&gt; 19, ek destek Ca2 + paradoksu. 17 engellemek için öne sürülmüştür Bununla birlikte, iyi bir Ca2 + EGTA ile tampon L-tipi Ca 2 + akımı genliği ile indüklenen Ca2 + geçici genlik ve Ca2 + geçici bifazik bir çürüme ile sonuçlanır azalttığı bilinmektedir. 23. Bu nedenle, EGTA ihmal Tipik özellikleri ve tek fazlı bozunur olan Ca2 + geçici elde etmek için, tüm süreç boyunca izolasyon. Ca 2 + hücreleri korumak için paradoks biz 0.2 mM kadar kademeli bir şekilde depolama çözeltinin nihai Ca2 + konsantrasyonu artar. Kollajenaz seçimi muhtemelen başarılı miyosit izolasyon için en önemli adımdır. Geleneksel collagenases Clostridium histolyticum elde edilen ham preparatlar olup diğer proteinazlar polysaccharidases ve lipazlar arasında bir dizi ek kolajenaz içerir. Kendi genel kompozisyon kolajenazlar göre farklı bölünmüştür. 24 Worthington kollajenaz Türleri I ve II başarıyla anda açıklanan protokolde insan atriyal miyositlerin izolasyonu. 4-10,15,25-30 için kullanılmıştır biz kollajenaz kullanılmasını tavsiye biz de kollajenaz Tip II kullanarak canlı hücreler kabul edilebilir miktarda elde etmek mümkün olmasına rağmen, ben yazın. Ancak, hatta tek bir kollajenaz tip içinde enzim faaliyetleri ile ilgili önemli bir toplu-seri farklılıklar vardır. Bu varyasyonlar dikkatli toplu seçimi ve izolasyon prosedürü optimize etmek için çeşitli gruplar test gerektirir. Worthington Biyokimyasal Corp (den online olarak mevcuttur toplu-seçim aracı <a href="http://www.worthington-biochem.com/cls/match.php" target="_blank">http://www.worthington-bio</a>chem.com / CLS / match.php), insan atrial miyosit izolasyonu için uygun olduğu gösterilmiştir bir bileşim ile uygun gruplar bulmak için de kullanılabilir. Şu anda kollajenaz 250 U / mg kollajenaz aktivite, 345 U / mg caseinase aktivite, 2.16 U / mg clostripain aktivite ve 0.48 U / mg triptik aktivite (lot # 49H11338) ile tip I kullanın. Bu makalede tarif edilen prosedür kullanılarak elde edilen hücreler patch-clamp çalışmaları, Ca2 + geçici ölçümleri ve ek olarak her iki. 15 bir kombinasyonu için 8 saat içinde kullanılabilir, bu hücrelerin elektrik alanı uyarılmasına tepki olarak hücre daralma ölçümü sağlar ya da elektrik stimülasyonu yama-kelepçe pipet (yayınlanmamış gözlemler) kullanarak.

Yama klemp tekniği ve + taşıma anormallikleri izole kardiyomiyositlerin gerektiren hücresel Ca 2 arama ile kardiyak iyon kanallarının elektrofizyolojik özellikleri incelenmesi. Bunlar genellikle sindirim enzimleri kardiyak doku örneklerinin in vitro maruz kalma (kolajenaz, hiyaluronidaz, peptidaz vb) ardından elde edilir. 1.955 2&#39;de canlı kalp miyositlerin izolasyonu ilk rapordan bu yana protokoller büyük miktarda fare, sıçan, tavşan, köpek, kobay ve insan dahil olmak üzere farklı türlerden tek atriyal ve ventriküler kardiyomiyositlerde hasat için geliştirilmiştir. Bu derlemede insan atriyal miyositlerin izolasyonu odaklanın. Biz Worthington Biyokimyasal Corp, ABD (tarafından sağlanan &quot;Worthington Doku Ayrılma kılavuzu&quot; bölümüne bakın diğer türlerden miyositlerin izolasyonu için prosedürleri ile ilgili <a href="http://www.tissuedissociation.com" target="_blank">www.tissuedissociation.com</a> ). <p class= &quot;Jove_content&quot;&gt; İnsan atriyal miyosit izolasyon protokolleri genellikle Burada amacıyla önceden yayınlanmış bir yöntem uyarlanan bir teknik bir adım-adım bir açıklaması, sağlamak Bustamante, ve diğ. 3 açıklanan yöntem kullanılarak elde edilmiştir Patch-clamp deneyler için değil, aynı zamanda eş zamanlı olarak hücre içi Ca2 + ölçümü için sadece uygun atrial miyositlerinde elde edilir. 4-11

<table><tbody><tr><td> </td><td></td><td></td><td>&lt;em&gt;Taşıma çözeltisi&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>Albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3059</td><td>&lt;em&gt;Saklama çözeltisi&lt;/em&gt;: 1%</td></tr><tr><td>BDM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31550</td><td>&lt;em&gt;Taşıma çözeltisi&lt;/em&gt;: 30</td></tr><tr><td>DL-β-Hidroksibütirik asit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6501</td><td>&lt;em&gt;Saklama çözeltisi&lt;/em&gt;: 10</td></tr><tr><td>Glikoz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td>&lt;em&gt;Taşıma çözeltisi&lt;/em&gt;: 20&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Ca2+ içermeyen çözelti&lt;/em&gt;: 20&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Enzim çözeltisi E1 ve E2&lt;/em&gt;: 20&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Saklama çözeltisi&lt;/em&gt;: 10</td></tr><tr><td>L-Glutamik asit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1251</td><td>&lt;em&gt;Saklama çözeltisi&lt;/em&gt;: 70</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck</td><td>1049360250</td><td>&lt;em&gt;Taşıma çözeltisi&lt;/em&gt;: 10&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Ca2+ içermeyen çözelti&lt;/em&gt;: 10&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Enzim çözeltisi E1 ve E2&lt;/em&gt;: 10&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Saklama çözeltisi&lt;/em&gt;: 20</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td>&lt;em&gt;Taşıma çözeltisi&lt;/em&gt;: 1.2&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Ca2+ içermeyen çözelti&lt;/em&gt;: 1.2&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Enzim çözeltisi E1 ve E2&lt;/em&gt;: 1.2&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Saklama çözeltisi&lt;/em&gt;: 10</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9397</td><td>&lt;em&gt;Taşıma çözeltisi&lt;/em&gt;: 5&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Ca2+ içermeyen çözelti&lt;/em&gt;: 5&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Enzim çözeltisi E1 ve E2&lt;/em&gt;: 5</td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1254</td><td>&lt;em&gt;Taşıma çözeltisi&lt;/em&gt;: 5&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Ca2+ içermeyen çözelti&lt;/em&gt;: 5&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Enzim çözeltisi E1 ve E2&lt;/em&gt;: 5</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td>&lt;em&gt;Taşıma çözeltisi&lt;/em&gt;: 100&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Ca2+ içermeyen çözelti&lt;/em&gt;: 100&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Enzim çözeltisi E1 ve E2&lt;/em&gt;: 100</td></tr><tr><td>Taurin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>86330</td><td>&lt;em&gt;Taşıma çözeltisi&lt;/em&gt;: 50&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Ca2+ içermeyen çözelti&lt;/em&gt;: 50&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Enzim çözeltisi E1 ve E2&lt;/em&gt;: 50&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Saklama çözeltisi&lt;/em&gt;: 10</td></tr><tr><td>Kollajenaz I</td><td><a href="http://www.worthington-biochem.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> Worthington</a></td><td>4196</td><td>&lt;em&gt;Enzim çözeltisi E1 ve E2&lt;/em&gt;: 286 U/ml</td></tr><tr><td>Proteaz XXIV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8038</td><td>&lt;em&gt;Enzim çözeltisi E1 ve E2&lt;/em&gt;: 5 U/ml*</td></tr><tr><td>pH</td><td></td><td></td><td>&lt;em&gt;Taşıma çözeltisi&lt;/em&gt;: 7.00&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Ca2+ içermeyen çözelti&lt;/em&gt;: 7.00&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Enzim çözeltisi E1 ve E2&lt;/em&gt;: 7.00&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Saklama çözeltisi&lt;/em&gt;: 7.40</td></tr><tr><td>ayarlanan madde</td><td></td><td></td><td>&lt;em&gt;Taşıma çözeltisi&lt;/em&gt;: 1 M NaOH&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Ca2+ içermeyen çözelti&lt;/em&gt;: 1 M NaOH&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Enzim çözeltisi E1 ve E2&lt;/em&gt;: 1 M NaOH&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Saklama çözeltisi&lt;/em&gt;: 1 M KOH</td></tr><tr><td colspan="4">Aksi belirtilmedikçe konsantrasyonlar mM cinsindendir. BDM, 2,3-Butandiyon monoksim. *Proteaz XXIV sadece Enzim çözeltisi E1'de yer alır.</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Tablo I. Çözeltiler.&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Naylon ağ (200 &amp;#956;m)</td><td>VWR-Almanya</td><td>510-9527</td><td></td></tr><tr><td>Ceketli reaksiyon beheri</td><td>VWR</td><td>KT317000-0050</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Tablo II. Özel ekipmanlar.&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dimetil sülfoksit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-3 AM (özel paketleme)</td><td>Invitrogen</td><td>F-1242</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Invitrogen</td><td>P6867</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Tablo III. Miyositlerin Fluo-3 AM ile yüklenmesi için kullanılan maddeler.&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4-aminopiridin*</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A78403</td><td>&lt;em&gt;Banyo çözeltisi&lt;/em&gt;: 5</td></tr><tr><td>BaCl2*</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>342920</td><td>&lt;em&gt;Banyo çözeltisi&lt;/em&gt;: 0.1</td></tr><tr><td>CaCl2 &amp;#215; 2H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5080</td><td>&lt;em&gt;Banyo çözeltisi&lt;/em&gt;: 2</td></tr><tr><td>Glikoz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td>&lt;em&gt;Banyo çözeltisi&lt;/em&gt;: 10</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9136</td><td>&lt;em&gt;Banyo çözeltisi&lt;/em&gt;: 10</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck</td><td>1049360250</td><td>&lt;em&gt;Banyo çözeltisi&lt;/em&gt;: 4</td></tr><tr><td>MgCl &amp;#215; 6H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0250</td><td>&lt;em&gt;Banyo çözeltisi&lt;/em&gt;: 1</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td>&lt;em&gt;Banyo çözeltisi&lt;/em&gt;: 140</td></tr><tr><td>Probenesid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8761</td><td>&lt;em&gt;Banyo çözeltisi&lt;/em&gt;: 2</td></tr><tr><td>pH</td><td></td><td></td><td>&lt;em&gt;Banyo çözeltisi&lt;/em&gt;: 7.35</td></tr><tr><td>ayarlanan madde</td><td></td><td></td><td>&lt;em&gt;Banyo çözeltisi&lt;/em&gt;: 1 M HCl</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Tablo IV. Yama-kenetleme (patch-clamp) banyo çözeltisi.&lt;/strong&gt; *4-aminopiridin ve BaCl sadece voltaj-kenetleme deneyleri için eklenmiştir.</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DL-aspartat K+ tuzu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2025</td><td>&lt;em&gt;Pipet çözeltisi&lt;/em&gt;: 92</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4378</td><td>&lt;em&gt;Pipet çözeltisi&lt;/em&gt;: 0.02</td></tr><tr><td>GTP-Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9002</td><td>&lt;em&gt;Pipet çözeltisi&lt;/em&gt;: 0.1</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9136</td><td>&lt;em&gt;Pipet çözeltisi&lt;/em&gt;: 10</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck</td><td>1049360250</td><td>&lt;em&gt;Pipet çözeltisi&lt;/em&gt;: 48</td></tr><tr><td>MgATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9187</td><td>&lt;em&gt;Pipet çözeltisi&lt;/em&gt;: 1</td></tr><tr><td>Na2ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2383</td><td>&lt;em&gt;Pipet çözeltisi&lt;/em&gt;: 4</td></tr><tr><td>Fluo-3**</td><td>Invitrogen</td><td>F3715</td><td>&lt;em&gt;Pipet çözeltisi&lt;/em&gt;: 0.1</td></tr><tr><td>pH</td><td></td><td></td><td>7.20</td></tr><tr><td>ayarlanan madde</td><td></td><td></td><td>1 M KOH</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Tablo V. Yama-kenetleme (patch-clamp) pipet çözeltisi*. &lt;/strong&gt;*Deney günlerinde pipet çözeltisi kullanıma kadar buz üzerinde saklanır. **Fluo-3, deney günlerinde 1 mM'lik stok çözeltiden eklenir.</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ca aynı anda Ölçümler İnsan atriyal miyositlerin izolasyonu<sup&gt; 2 +</sup&gt; geçici ve membran akımlar

Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents

Yama klemp tekniği ve kalp hücresel Ca 2 arama ile kardiyak iyon kanallarının elektrofizyolojik özelliklerinin çalışma + taşıma anomaliler izole kardiyomiyositlerin gerektirir. Buna ek olarak, bu yöntemler kullanılarak hastaların miyositleri araştırmak için olasılık, bu tür atriyal fibrilasyon (AF) ve kalp hastalıklarının moleküler temeli aydınlatmak için çok değerli bir gerekliliktir. 1 Burada her iki için uygun olan insan atrial miyositlerinde bölgesinin izolasyonu için bir yöntem tarif Patch-clamp çalışmaları ve hücre içi Ca2 + konsantrasyonu aynı anda ölçümleri. İlk olarak, açık kalp cerrahisi uygulanan hastalarda elde edilen sağ atriyal uzantıları küçük doku parçaları (&quot;yığın yöntemi&quot;) içine doğranmış ve +-ücretsiz bir çözüm Ca 2 yıkanır. Daha sonra doku parçaları 20 mcM Ca 2 + ile çözümler içeren kollajenaz ve proteaz sindirilir. Bundan sonra, izole edilmiş olan miyosit Harvedoku süspansiyonu filtrasyon ve santrifüj ile sted. Son olarak, hücre depolama çözelti içinde Ca2 + konsantrasyonu 0.2 mM kademeli bir şekilde ayarlanır. Biz kısaca + ve Ca 2 + izolasyon işlemi sırasında tampon ve aksiyon potansiyelleri ve membran akımlarının temsilcisi kayıtları sağlamak, her ikisi birlikte aynı anda Ca 2 + geçici ölçümler, bu izole miyositler yapılan ile Ca 2 anlamını tartışmak.

Şekil 2A izole insan sağ atriyal miyositlerden üç temsilci örnekler gösterir. Bir CellFinder mikroskop lamı (üzerine hücre süspansiyonu (adım 5.5) 10 ul pipet hücre verimi ölçmek için <a href="http://www.antenna.nl/microlab/index-uk.html" target="_blank">http://www.antenna.nl/microlab/index-uk.html</a> ). 16.5 ± 3.1 cells/10 ul (n = 29) vs 5.1 ± 2.3 cells/10 ul: Şekil 2B&#39;de Ortalama hücre verim açıkça kronik AF (CAF) daha düşük hücre verim eğilimi hasta örnekleri (tüp bir olduğunu gösterir (n = 10) sırasıyla SR ve Caf, p &lt;0.05; tüp B: 17.9 ± 3.9 cells/10 ul (n = 29) vs 5.9 ± SR ve Caf 2.0 cells/10 ul (n = 9), , p = 0.107). Aksiyon potansiyel ölçümleri ve sitosolik Ca2 +, aynı anda geçici kayıtları için temsili örnekler, Şekil 3&#39;te verilmiştir. Incelenmiştir hücreler, T arasında yaklaşık% 90o aksiyon potansiyeli-tetiklenen Ca 2 + sürümü açık ve normal bir cep kasılmalar neden olur. Önceden bildirildiği gibi, hücre bütünlüğü için kabul edilen bir göstergesidir istirahat membran potansiyeli, -73.9 hakkında ortalama ± 2.7 mV (n = 23/10 miyositler / hasta) ve -77,7 ± 1,8 mV (n = 19/8 miyositler / hasta ) sırasıyla SR ve Caf (p&gt; 0,05). 15 Şekil 4 voltaj bağımlı L-tipi Ca 2 + akımları ve sitozolik Ca 2 + geçici temsilcisi eş zamanlı kayıtları gösterir. Seçici olmayan β-adrenoseptör agonisti izoprenalin (1 uM) Uygulama sağlam β-adrenerjik sinyal transdüksiyon kaskadının düşündüren bir Ca, L ve sitosolik Ca2 + hem de geçici amplitüdlerinin artırır. <img alt="Şekil 1" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50235/50235fig1.jpg" /> FŞEKIL 1. miyositler Fluo-3 akış şeması (adım 6.1-6.5 bakınız) protokolü yükleme AM. m / v, kütle / hacim. <img alt="Şekil 2," fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50235/50235fig2.jpg" /> Şekil 2. Depolama çözümü bir saat sonra bir, izole insan sağ atriyal miyositler. B, depolama çözümü hücrelerin 10 ul sayılır hücre verim ± SEM (adım 5.5) ortalama. n, her bir grup içinde preparatların sayısını ifade eder. * P &lt;0.05. <img alt="Şekil 3," fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50235/50235fig3.jpg" /> Aksiyon potansiyeli-tetiklenen Ca 2 sinüs ritmi bir atriyal miyosit içinde +-geçici (Cat) ve chr Şekil 3. Temsilcisi kayıtlarıonic atriyal fibrilasyon hasta. Top: Enjekte stimülasyon (0.5 Hz) için kullanılan akım membran (I M). Aşağıda: membran potansiyeli (V M) ve tetiklenen Cat (alt) aynı anda kayıt. (Voigt ve ark izniyle Replotted. 2012) 15 <img alt="Şekil 4," fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50235/50235fig4.jpg" /> L-tipi Ca 2 izoprenalin (1 mcM) etkisi Şekil 4. Temsilcisi kayıtları + akım tetiklenen Ca 2 sinüs ritmi ve kronik atriyal fibrilasyon hasta bir atriyal miyosit içinde +-geçici (Cat). Top: Gerilim-kelepçe protokolü (0.5 Hz). Aşağıda: Mevcut toplam net membran Eş zamanlı kayıt (I M), ağırlıklı olarak L-tipi Ca 2 + akım (orta) ve tetiklenen Cat (alt) yansıtan. (Voigt izni ile Replotted,ve ark. 2012) 15 <img src="/files/ftp_upload/50235/50235table1.jpg" alt="Tablo 1" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235table1highres.jpg" /> Tablo I. Çözümler. <img src="/files/ftp_upload/50235/50235table2.jpg" alt="Tablo 2" fo:content-width="2in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235table2highres.jpg"/> Tablo II. Özel ekipman. <img src="/files/ftp_upload/50235/50235table3.jpg" alt="Tablo 3" fo:content-width="2in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235table3highres.jpg"/> Tablo III. Fluo-3 ile miyositlerin yükleme için maddeler var. <img src="/files/ftp_upload/50235/50235table4.jpg" alt="Tablo 4" fo:content-width = &quot;2,5 inç&quot; fo: src = &quot;/ files/ftp_upload/50235/50235table4highres.jpg&quot; /&gt; Tablo IV. Yama-kelepçe için banyo çözüm. <img src="/files/ftp_upload/50235/50235table5.jpg" alt="Tablo 5" fo:content-width="2.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235table5highres.jpg"/> Yama-kelepçe * için Tablo V. Pipet çözüm.

Bu hücre içi Ca için kullanılabilecek insan atriyal miyosit izolasyonunu anlatır<sup&gt; 2 +</supElektrofizyolojik patch-clamp çalışmaları ile birlikte&gt; ölçümleri.

Ca aynı anda Ölçümler İnsan Atriyal miyositlerin izolasyonu<sup&gt; 2 +</sup&gt; Geçici ve Membran Akımlar

The study of  electrophysiological properties of cardiac ion channels with the patch-clamp  technique and the exploration of cardiac cellular Ca2+ ...

Bu prosedürün genel amacı, kalsiyum geçişlerinin ve membran akımlarının eş zamanlı ölçümleri için uygun insan atriyal miyositlerini izole etmektir. Sağ atriyal örnek, açık kalp ameliyatı geçiren hastalardan alınır ve prosedüre başlamak üzere hızla nakledilir. Prosedürün ilk adımı, dokuyu temizlemek ve küçük doku parçaları halinde kesmektir.İkinci adım, izole atriyal miyositlerin elde edilmesi için dokunun proteolitik enzimlerle iki aşamalı enzimatik sindirim işlemidir. Son adım, miyositlerin kalsiyuma duyarlı floresan bir boya ile yüklenmesini kapsar. Nihayetinde, epi-floresan mikroskopi ve patch-clamp tekniğinin birlikte kullanımı, kalsiyum geçişlerinin membran akımları veya aksiyon potansiyelleri ile eş zamanlı kayıtlarının alınmasını sağlar.Bu yöntem, atriyal fibrilasyon gibi kardiyak hastalıkların temelinde yatan hücresel kalsiyum yönetimi anomalilerinin moleküler temelini anlamaya yardımcı olabilir; yöntemi laboratuvarımızın kıdemli teknisyeni Claudia Lira uygulamaktadır. Koroner bypass grefti veya mitral kapak değişimi için açık kalp ameliyatı geçiren hastalardan alınan insan atriyal dokusu, taşıma solüsyonu içerisinde hızla laboratuvara nakledilmelidir. Laboratuvara ulaşıldığında, doku örneği ve solüsyon 10 santimetrelik bir kaba aktarılır. Ardından, yağ dokusu makas yardımıyla kaba bir şekilde temizlenir.Ardından, doku örneğini tartın. Hücre izolasyonu için 200 ile 600 miligram arasını ayırın ve geri kalanını biyokimyasal analiz için sıvı azot içinde dondurun. Hücre izolasyonu için ayrılan dokuyu soğuk kalsiyumsuz çözelti içeren bir kaba aktarın ve dokuyu yıkamak için bir kübik milimetrelik parçalar halinde doğrayın.Kalsiyumsuz çözelti ile birlikte ceketli behere aktarın. 37 °C'ye ısıtın. Güçlü kabarcıklanmayı önlemek için pipet ucuyla kapatılmış bir hat üzerinden oksijen sağlayın.Dokuyu manyetik bir karıştırma çubuğu ile yaklaşık üç dakika boyunca dikkatlice karıştırın. Ardından dokunun çökmesini bekleyin. Şimdi süpernatanı 200 mikronluk bir naylon süzgeçten dikkatlice süzün.Dokunun çoğu beherde kalmalıdır. Beheri 37 dereceye ısıtılmış kalsiyumsuz çözelti ile yeniden doldurun. Ardından, süzgeçteki doku parçalarını pens kullanarak behere geri aktarın ve yıkama işlemini iki kez tekrarlayın.Prosedürün bu bölümüne, kollajenaz ve proteaz içeren 37 °C'ye ısıtılmış 20 mililitre E bir enzim çözeltisi hazırlayarak başlayın. Son yıkama adımından sonra kalsiyum içermeyen çözeltiyi dikkatlice süzün ve yıkanmış dokuyu E bir çözeltisi içinde yeniden süspande edin. Elek üzerinde toplanan dokuyu behere geri aktarın.Süspansiyonu 10 dakika boyunca dikkatlice karıştırın. Ardından 40 µL 10 mM kalsiyum klorür ekleyin ve karıştırma işlemine 35 dakika daha devam edin. Son olarak, süpernatantı bir naylon süzgeçten dikkatlice süzün.Dokunun çoğu beherde kalmalıdır. Sadece kollajenaz bir içeren 20 mililitre enzim çözeltisi E iki hazırlayın ve beheri yeniden doldurmak için bunu kullanın. Elek üzerinde toplanan dokuyu behere geri aktarın.Ardından, ikinci sindirim sırasında hemen 40 µL 10 mM kalsiyum klorür çözeltisi ekleyin ve doku pıhtılarını parçalamak için ara ara makas kullanın. Beş dakika sonra, hücrelerin disosiyasyonunu mikroskop altında kontrol etmek için süspansiyondan bir örnek alın. Çubuk şeklinde çizgili kardiyomiyositler net bir şekilde görülene kadar her iki ila üç dakikada bir örnek almaya devam edin.Ardından karıştırmayı durdurun ve dokunun çökmesini bekleyin. Çökme gerçekleştikten sonra, süpernatantı bir naylon süzgeç yardımıyla dikkatlice süzerek 50 mililitrelik plastik bir tüpe aktarın. Sonrasında, dokuyu 20 mililitre saklama çözeltisi içinde süspande edin ve süzgeçteki doku parçalarını tekrar behere geri koyun.Hücreleri hafif mekanik agitasyonla daha fazla ayrıştırın. 20 mililitrelik bir pipet kullanarak kabarcık oluşumundan kaçınmaya çalışın. Ardından, süpernatantı dikkatlice bir naylon süzgeçten geçirin ve süzme işlemi sonrası, her iki süpernatant koleksiyonunu da 90 5G'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin.Hücreleri peletlemek için, peleti bozmadan süpernatanları aspirasyon yoluyla uzaklaştırın. Her bir peleti oda sıcaklığında 1,5 milliliters saklama çözeltisi içinde süspande edin. Ardından, her tüpe 7,5 microliters 10 millimolar kalsiyum klorür çözeltisi ekleyin ve 10 dakika bekleyin.Ardından 7,5 µL daha kalsiyum klorür ekleyin ve 10 dakika daha bekleyin. Bekleme süresinin ardından, çözeltideki kalsiyum klorürün nihai konsantrasyonunu 0,2 mM'ye getirmek için 10 mM kalsiyum klorürden üçüncü bir 15 µL hacim ekleyin. Bu izolasyonun amacı, hücre içi kalsiyum ölçümleri için uygun hücreler elde etmektir.Bu nedenle, saklama solüsyonundan EGGA gibi kalsiyum tamponlarının çıkarılması kritik bir gerekliliktir. Hücre süspansiyonunun 1.5 mililitresini iki mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne aktarın. Sonraki adımlar, floresan kalsiyum indikatörünün ışığa duyarlılığı göz önünde bulundurularak uygulanmalıdır.Flu O three. Öncelikle, 1 mM Flu O three stok çözeltisi hazırlayın. Bu çözelti, -20 °C'de bir haftaya kadar saklanabilir.Ardından, 1,5 mililitrelik hücre süspansiyonuna 15 µL flu oh 3:00 AM stok çözeltisi ekleyin. Karışımı dikkatlice çalkalayın ve süspansiyonu oda sıcaklığında, opak bir kutu içerisinde 10 dakika boyunca inkübe edin. İnkübasyonun ardından, dokuyu yaklaşık 6.000 RPM hızında kısa süre santrifüjleyin.Ardından süpernatanı atın ve peleti 1,5 milliliters banyo çözeltisi içinde yeniden süspanse edin. Deneylere başlamadan önce, deesterifikasyon için hücre süspansiyonunu yaklaşık 30 dakika bekletin. Sonrasında, belirtilen protokolü kullanarak eş zamanlı patch clamp ve epi-floresan kalsiyum ölçümleriyle devam edin.Miyositler atriyal dokudan izole edildi ve bir hücre bulucu mikroskop lamı üzerinde sayıldı. Ortalama hücre verimleri, kronik atriyal fibrilasyonu olan hastalardan alınan örneklerde hücre veriminin daha düşük olma eğiliminde olduğunu açıkça göstermektedir. Fluo-3 yüklü miyositler, aksiyon potansiyellerini ortaya çıkarmak için akım kenetleme konfigürasyonunda 0,5 hertz frekansında stimüle edildi ve incelenen hücrelerin yaklaşık %90'ı düzenli kasılmalar gösterdi.Bu stimülasyona yanıt olarak, floresans mikroskobuna geçiş, sarkoplazmik retikulumdan tetiklenen ve hücresel kontraksiyonu başlatan aksiyon potansiyeli kaynaklı kalsiyum salınımını görselleştirir. Sinüs ritmine ve atriyal fibrilasyona sahip hastalardan alınan temsili kayıtlar şunu göstermektedir: Hastaların aksiyon potansiyelleri tipik olarak bir spike ve dome (kubbe) şekline sahipken, aksiyon potansiyeli triyangülasyonu ve kısalması atriyal remodeling'in tipik belirtileridir.Atriyal fibrilasyon hastalarında eş zamanlı olarak kaydedilen hücre içi kalsiyum geçişleri, atriyal fibrilasyon hastalarından alınan miyositlerde artmış diyastolik kalsiyum seviyeleri ve azalmış kalsiyum geçiş genliği ortaya koymuştur; L tipi kalsiyum akımları kaydedilmiştir. Potasyum akımları, dört amino paridin ve baryum klorür kullanılarak bloke edilmiştir. Hücreler, voltaj klemp konfigürasyonunda, -80 mV tutma potansiyeli ile -40 mV'ye 100 ms'lik bir rampa ve 10 mV'ye 100 ms'lik bir test darbesi uygulanarak 0,5 Hz frekansında stimüle edilmiştir.Temsili kayıtlar, atriyal fibrilasyonun azalmış L tipi kalsiyum akımı ile ilişkili olduğunu göstermektedir. Benzer şekilde, diastolik kalsiyum seviyesi artarken, kalsiyum transiyent genliği daha düşük bulunmuştur. Atriyal fibrilasyonda.Selektif olmayan beta adrenal reseptör agonisti izoprenin uygulanması, L tipi kalsiyum akımlarının ve sitozolik kalsiyum geçişlerinin genliğini artırmıştır. Her iki grupta da bu durum, hücrelerin sağlam bir beta adrenerjik sinyal iletim kaskadına sahip olduğunu göstermektedir. Sonuçlar, bu yöntemin, eş zamanlı patch clamp ve kalsiyum geçişi ölçümleri için uygun, yüksek kaliteli kalsiyum toleranslı miyositler sağladığını ortaya koymaktadır.Ayrıca, elde edilen miyositler hücre kısalma ölçümleri, immün boyama veya TTU boyama için yararlı olabilir.

isolation-human-atrial-myocytes-for-simultaneous-measurements-ca2

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Kv kanal disfonksiyonu kardiyak aritmiler ile ilişkilidir. Biz Kv kanal yan altbirim knockout farelerde atriyal ve ventriküler kardiyomiyositlerde izolasyonu için sistematik bir protokol kullanmak gibi aritmiler neden moleküler mekanizmaları incelemek için. İzole kardiyomiyositlerde hemen sonra hücresel elektrofizyolojik çalışmalar, biyokimyasal ya da immunofloresan (IF) deneyleri için de kullanılabilir.

Mürin Atriyal ve Ventriküler kardiyomiyositlerde izolasyonu ve Kv Kanal Kayıtları

Kalp hastalıklarının hücre temelinde Mevcut bilgi çok hayvan modelleri üzerinde yapılan çalışmalara dayanmaktadır. Burada açıklamak ve insan ventrikülün küçük cerrahi örneklerinden tek bir canlı kardiyomiyositlerin elde etmek için yeni bir yöntem doğrulamak. İnsan ventriküler miyositler elektrofizyolojik çalışmalar ve uyuşturucu testi için kullanılabilir.

Taze Cerrahi Örneklerden İzolasyon ve İnsan Ventriküler kardiyomiyositlerin Fonksiyonel Karakterizasyonu

Yöntemler yama kelepçe elektrofizyoloji veya görüntüleme çalışmaları için yetişkin farelerin sinoatriyal düğüm miyosit (SAMs) izolasyonu için gösterilmiştir. İzole edilmiş hücreler, doğrudan kullanılabilir ya da bu tür genetik olarak kodlanmış muhabir olarak ilgi proteinlerin ekspresyonuna izin vermek için kültür içinde muhafaza edilebilir.

Yetişkin fareler ile Sinoatriyal Düğüm miyositlerin İzolasyonu, Kültür ve Fonksiyonel Karakterizasyonu Yöntemleri

Bu iletişim kuralı ile yüksek zamansal ve mekansal çözünürlüklü, membran gerilim çift kayıtları da dahil olmak üzere bir optik haritalama sistemi kullanan fare Kulakçık Elektrofizyolojik değerlendirme açıklar ve Ca2 + geçici altında programlanmış stimülasyon özel elektrot kateter aracılığıyla.

Yüksek çözünürlüklü optik eşleştirmenin fare Atria Elektrofizyolojik değerlendirme

Burada, biz bir en iyi duruma getirilmiş, Langendorff tabanlı bir fare modeli Metabolik sendromu ile ilgili kalp yetmezliği ile korunmuş ejeksiyon fraksiyonu tek hücreli atriyal cardiomyocytes yalıtım için açıklayınız. El ile düzenleme intraluminal basınç kalp boşlukları, işlevsel olarak sağlam miyositler uyarma-kasılma-kaplin çalışmaları için uygun verim için uygulanır.

Bir fare modeli Metabolik sendromu ile ilgili kalp yetmezliği ile korunmuş ejeksiyon fraksiyonu atriyal Cardiomyocytes izolasyonu

Bu protokol, bir öbek sindirim yaklaşımı kullanarak yetişkin fare kalbi tek atriyal kardiyomiyositler izole etmek için kullanılır. Bu yaklaşım, yama kelepçe çalışmalarında atriyal miyosit elektrofizyolojisini karakterize etmek için kullanılabilecek sağ veya sol atriyal miyositleri izole etmek için kullanılır.

Yetişkin fareler atriyal Miyoksit izolasyonu

Sunulan vibratome kesilmiş miyokardiyal dilimlerden insan ve hayvan ventriküler kardiyomiyosit izolasyon için bir protokoldür. Kalsiyuma dayanıklı hücrelerin yüksek verimi (200 hücre/mg'a kadar) az miktarda dokudan (&lt;50 mg) elde edilebilir. Protokol soğuk iskemiye maruz kalan miyokardiyum için 36 saate kadar geçerlidir.

Vibratome-Cut Miyokardiyal Dilimlerden İnsan Ventriküler Kardiyomiyositlerin İzolasyon

Miyositlerin ve miyosit olmayanların tek bir yetişkin fare kalbinin hem atria hem de ventriküllerinden eşzamanlı izolasyonu için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu protokol, yüksek oranda uygulanabilir kardiyak miyositlerin ve miyosit olmayanların tutarlı verimini sağlar ve fenotipleme ve in vitro analiz için en uygun hücreye özgü kültür koşullarını detaylandırmaz.

Yetişkin Fare Kalbinden Atriyal Miyositler, Ventrikül Miyositleri ve Miyosit Olmayanların Eşzamanlı İzolasyonu ve Kültürü

Fare modelleri, aritmogenezin temel mekanizmalarının incelenmesine izin verir. Bu amaçla, yama-kelepçe ölçümleri yapmak için yüksek kaliteli kardiyomiyositler gereklidir. Burada, kalsiyum geçicilerinin ve L-tipi kalsiyum akımının eşzamanlı ölçümlerine izin veren retrograd enzim bazlı Langendorff perfüzyonu yoluyla murin atriyal ve ventriküler miyositleri izole etmek için bir yöntem tanımlanmıştır.

Ca2+ geçici ve L-tipi kalsiyum akımının eşzamanlı ölçümleri için yüksek kaliteli murin atriyal ve ventriküler miyositlerin izolasyonu

Bu protokol, yetişkin farelerden atriyal ve ventrikül miyositlerinin eşzamanlı izolasyonu için aort kanülasyonunun derinliğini de içeren Langendorff yönteminin modifikasyonlarını açıklar.

Yetişkin Farelerden Atriyal ve Ventrikül Miyositlerinin Eşzamanlı İzolasyonu için Langendorff Yönteminin Modifikasyonları

Öğrenin insan atriyal miyositlerinin izolasyonunu ve Ca²⁺ geçişleri ile membran akımlarının eşzamanlı ölçümünü. Bu yöntem, kardiyak hastalıkların moleküler temelini anlamak için kullanılır.

Ca aynı anda Ölçümler İnsan Atriyal miyositlerin izolasyonu

Daha fazla video keşfet