Ca aynı anda Ölçümler İnsan Atriyal miyositlerin izolasyonu

Bu prosedürün genel amacı, kalsiyum geçişlerinin ve membran akımlarının eş zamanlı ölçümleri için uygun insan atriyal miyositlerini izole etmektir. Sağ atriyal örnek, açık kalp ameliyatı geçiren hastalardan alınır ve prosedüre başlamak üzere hızla nakledilir. Prosedürün ilk adımı, dokuyu temizlemek ve küçük doku parçaları halinde kesmektir.

İkinci adım, izole atriyal miyositlerin elde edilmesi için dokunun proteolitik enzimlerle iki aşamalı enzimatik sindirim işlemidir. Son adım, miyositlerin kalsiyuma duyarlı floresan bir boya ile yüklenmesini kapsar. Nihayetinde, epi-floresan mikroskopi ve patch-clamp tekniğinin birlikte kullanımı, kalsiyum geçişlerinin membran akımları veya aksiyon potansiyelleri ile eş zamanlı kayıtlarının alınmasını sağlar.

Bu yöntem, atriyal fibrilasyon gibi kardiyak hastalıkların temelinde yatan hücresel kalsiyum yönetimi anomalilerinin moleküler temelini anlamaya yardımcı olabilir; yöntemi laboratuvarımızın kıdemli teknisyeni Claudia Lira uygulamaktadır. Koroner bypass grefti veya mitral kapak değişimi için açık kalp ameliyatı geçiren hastalardan alınan insan atriyal dokusu, taşıma solüsyonu içerisinde hızla laboratuvara nakledilmelidir. Laboratuvara ulaşıldığında, doku örneği ve solüsyon 10 santimetrelik bir kaba aktarılır. Ardından, yağ dokusu makas yardımıyla kaba bir şekilde temizlenir.

Ardından, doku örneğini tartın. Hücre izolasyonu için 200 ile 600 miligram arasını ayırın ve geri kalanını biyokimyasal analiz için sıvı azot içinde dondurun. Hücre izolasyonu için ayrılan dokuyu soğuk kalsiyumsuz çözelti içeren bir kaba aktarın ve dokuyu yıkamak için bir kübik milimetrelik parçalar halinde doğrayın.

Kalsiyumsuz çözelti ile birlikte ceketli behere aktarın. 37 °C'ye ısıtın. Güçlü kabarcıklanmayı önlemek için pipet ucuyla kapatılmış bir hat üzerinden oksijen sağlayın.

Dokuyu manyetik bir karıştırma çubuğu ile yaklaşık üç dakika boyunca dikkatlice karıştırın. Ardından dokunun çökmesini bekleyin. Şimdi süpernatanı 200 mikronluk bir naylon süzgeçten dikkatlice süzün.

Dokunun çoğu beherde kalmalıdır. Beheri 37 dereceye ısıtılmış kalsiyumsuz çözelti ile yeniden doldurun. Ardından, süzgeçteki doku parçalarını pens kullanarak behere geri aktarın ve yıkama işlemini iki kez tekrarlayın.

Prosedürün bu bölümüne, kollajenaz ve proteaz içeren 37 °C'ye ısıtılmış 20 mililitre E bir enzim çözeltisi hazırlayarak başlayın. Son yıkama adımından sonra kalsiyum içermeyen çözeltiyi dikkatlice süzün ve yıkanmış dokuyu E bir çözeltisi içinde yeniden süspande edin. Elek üzerinde toplanan dokuyu behere geri aktarın.

Süspansiyonu 10 dakika boyunca dikkatlice karıştırın. Ardından 40 µL 10 mM kalsiyum klorür ekleyin ve karıştırma işlemine 35 dakika daha devam edin. Son olarak, süpernatantı bir naylon süzgeçten dikkatlice süzün.

Dokunun çoğu beherde kalmalıdır. Sadece kollajenaz bir içeren 20 mililitre enzim çözeltisi E iki hazırlayın ve beheri yeniden doldurmak için bunu kullanın. Elek üzerinde toplanan dokuyu behere geri aktarın.

Ardından, ikinci sindirim sırasında hemen 40 µL 10 mM kalsiyum klorür çözeltisi ekleyin ve doku pıhtılarını parçalamak için ara ara makas kullanın. Beş dakika sonra, hücrelerin disosiyasyonunu mikroskop altında kontrol etmek için süspansiyondan bir örnek alın. Çubuk şeklinde çizgili kardiyomiyositler net bir şekilde görülene kadar her iki ila üç dakikada bir örnek almaya devam edin.

Ardından karıştırmayı durdurun ve dokunun çökmesini bekleyin. Çökme gerçekleştikten sonra, süpernatantı bir naylon süzgeç yardımıyla dikkatlice süzerek 50 mililitrelik plastik bir tüpe aktarın. Sonrasında, dokuyu 20 mililitre saklama çözeltisi içinde süspande edin ve süzgeçteki doku parçalarını tekrar behere geri koyun.

Hücreleri hafif mekanik agitasyonla daha fazla ayrıştırın. 20 mililitrelik bir pipet kullanarak kabarcık oluşumundan kaçınmaya çalışın. Ardından, süpernatantı dikkatlice bir naylon süzgeçten geçirin ve süzme işlemi sonrası, her iki süpernatant koleksiyonunu da 90 5G'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin.

Hücreleri peletlemek için, peleti bozmadan süpernatanları aspirasyon yoluyla uzaklaştırın. Her bir peleti oda sıcaklığında 1,5 milliliters saklama çözeltisi içinde süspande edin. Ardından, her tüpe 7,5 microliters 10 millimolar kalsiyum klorür çözeltisi ekleyin ve 10 dakika bekleyin.

Ardından 7,5 µL daha kalsiyum klorür ekleyin ve 10 dakika daha bekleyin. Bekleme süresinin ardından, çözeltideki kalsiyum klorürün nihai konsantrasyonunu 0,2 mM'ye getirmek için 10 mM kalsiyum klorürden üçüncü bir 15 µL hacim ekleyin. Bu izolasyonun amacı, hücre içi kalsiyum ölçümleri için uygun hücreler elde etmektir.

Bu nedenle, saklama solüsyonundan EGGA gibi kalsiyum tamponlarının çıkarılması kritik bir gerekliliktir. Hücre süspansiyonunun 1.5 mililitresini iki mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne aktarın. Sonraki adımlar, floresan kalsiyum indikatörünün ışığa duyarlılığı göz önünde bulundurularak uygulanmalıdır.

Flu O three. Öncelikle, 1 mM Flu O three stok çözeltisi hazırlayın. Bu çözelti, -20 °C'de bir haftaya kadar saklanabilir.

Ardından, 1,5 mililitrelik hücre süspansiyonuna 15 µL flu oh 3:00 AM stok çözeltisi ekleyin. Karışımı dikkatlice çalkalayın ve süspansiyonu oda sıcaklığında, opak bir kutu içerisinde 10 dakika boyunca inkübe edin. İnkübasyonun ardından, dokuyu yaklaşık 6.000 RPM hızında kısa süre santrifüjleyin.

Ardından süpernatanı atın ve peleti 1,5 milliliters banyo çözeltisi içinde yeniden süspanse edin. Deneylere başlamadan önce, deesterifikasyon için hücre süspansiyonunu yaklaşık 30 dakika bekletin. Sonrasında, belirtilen protokolü kullanarak eş zamanlı patch clamp ve epi-floresan kalsiyum ölçümleriyle devam edin.

Miyositler atriyal dokudan izole edildi ve bir hücre bulucu mikroskop lamı üzerinde sayıldı. Ortalama hücre verimleri, kronik atriyal fibrilasyonu olan hastalardan alınan örneklerde hücre veriminin daha düşük olma eğiliminde olduğunu açıkça göstermektedir. Fluo-3 yüklü miyositler, aksiyon potansiyellerini ortaya çıkarmak için akım kenetleme konfigürasyonunda 0,5 hertz frekansında stimüle edildi ve incelenen hücrelerin yaklaşık %90'ı düzenli kasılmalar gösterdi.

Bu stimülasyona yanıt olarak, floresans mikroskobuna geçiş, sarkoplazmik retikulumdan tetiklenen ve hücresel kontraksiyonu başlatan aksiyon potansiyeli kaynaklı kalsiyum salınımını görselleştirir. Sinüs ritmine ve atriyal fibrilasyona sahip hastalardan alınan temsili kayıtlar şunu göstermektedir: Hastaların aksiyon potansiyelleri tipik olarak bir spike ve dome (kubbe) şekline sahipken, aksiyon potansiyeli triyangülasyonu ve kısalması atriyal remodeling'in tipik belirtileridir.

Atriyal fibrilasyon hastalarında eş zamanlı olarak kaydedilen hücre içi kalsiyum geçişleri, atriyal fibrilasyon hastalarından alınan miyositlerde artmış diyastolik kalsiyum seviyeleri ve azalmış kalsiyum geçiş genliği ortaya koymuştur; L tipi kalsiyum akımları kaydedilmiştir. Potasyum akımları, dört amino paridin ve baryum klorür kullanılarak bloke edilmiştir. Hücreler, voltaj klemp konfigürasyonunda, -80 mV tutma potansiyeli ile -40 mV'ye 100 ms'lik bir rampa ve 10 mV'ye 100 ms'lik bir test darbesi uygulanarak 0,5 Hz frekansında stimüle edilmiştir.

Temsili kayıtlar, atriyal fibrilasyonun azalmış L tipi kalsiyum akımı ile ilişkili olduğunu göstermektedir. Benzer şekilde, diastolik kalsiyum seviyesi artarken, kalsiyum transiyent genliği daha düşük bulunmuştur. Atriyal fibrilasyonda.

Selektif olmayan beta adrenal reseptör agonisti izoprenin uygulanması, L tipi kalsiyum akımlarının ve sitozolik kalsiyum geçişlerinin genliğini artırmıştır. Her iki grupta da bu durum, hücrelerin sağlam bir beta adrenerjik sinyal iletim kaskadına sahip olduğunu göstermektedir. Sonuçlar, bu yöntemin, eş zamanlı patch clamp ve kalsiyum geçişi ölçümleri için uygun, yüksek kaliteli kalsiyum toleranslı miyositler sağladığını ortaya koymaktadır.

Ayrıca, elde edilen miyositler hücre kısalma ölçümleri, immün boyama veya TTU boyama için yararlı olabilir.