Canlı Hücre Döngüsü Analizi

Bu prosedürün genel amacı, Drosophila'da genetik olarak manipüle edilmiş ve GFP veya RFP ile etiketlenmiş hücre popülasyonlarına sahip dokuların nispi hücre döngüsü fazını ve hücre boyutunu ölçmektir. İlk olarak, belirli bir doku veya hücre popülasyonunda istenen floresan proteinleri ve istenen genetik manipülasyonlarla etiketlenmiş döl içeren hücreler oluşturmak için genetik çaprazlamalar oluşturun. İncelenen, istenen dokuyu uygun gelişim aşamasının döllerinden temiz bir şekilde izole edin, daha sonra dokuyu tek bir hücre süspansiyonuna ayırın ve DNA içeriğini ölçmek için canlı bir DNA boyası ile boyayın.

Lekeli ayrışmış örnekleri akış sitometrisi ile analiz edin. Sonuç olarak, in vivo sonuçlar, incelenen genetik manipülasyonların neden olduğu hücre boyutu ve hücre döngüsü fazındaki değişiklikleri ölçer. Bu tekniğin, ultraviyole boyalar kullanan canlı drosophila dokuları üzerindeki mevcut akış sitometrisi yöntemine göre ana avantajı, boya döngüsü menekşe boyasının, küçük bir bütçeyle satın alınabilen ve tek bir laboratuvar ölçeğinde bakımı yapılabilen bir menekşe 4 0 5 lazer içeren daha ucuz tezgah üstü sitometrelerle uyumlu olmasıdır.

Bu yöntem, hücre döngüsü aşaması ve hücre boyutu hakkında yalnızca genel doku boyutunu ve çoğalma hızını ölçmekten daha ayrıntılı bilgi sağlayarak hücre döngüsü alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Prosedürü göstermek, laboratuvarımdan yüksek lisans öğrencileri Kagel ve Dan Sun ve Olga Guko olacak. Teknisyenimiz, larva diseksiyonları için yumurtlamadan yaklaşık 110 ila 120 saat sonra üçüncü larva Instar'da olgun larvaları toplar.

Bu hasat için metamorfoz sırasındaki çalışmalar için doğru öğrenci evrelemesi şarttır metamorfozun başlangıcında beyaz pre pupa gerekirse, 37 santigrat derece su banyosunda pupi Petri kabı veya bir larva şişesi ısıyı aktive etmek için mühürlü bir petri kabı Isıyı aktive etmek için. Soy izleme klonları için Chuck çevirme tabanı. Petri kabının mührünü açtıktan sonra, öğrenci diseksiyonu için istenen gelişim aşamasına yaşlanmak üzere bir inkübatöre yerleştirin.

İçerideki pupaya zarar vermemek için hava kabarcığı bulunan göz bebeği kutusunun ön ucundan bir pupayı nazikçe kavrayın, yüzen pupayı uygun şekilde kavrayacak şekilde konumlandırın. Daha sonra mikro makasla, pupa'nın arka ucundan hayvanın sırt kısmına doğru hafif bir açıyla temiz bir şekilde kesin, böylece hist yağını torakstaki istenen dokulara zorlamadan iç basıncı serbest bırakın ve kafa, sırt medyanı boyunca dikkatlice kesin, kanatlara zarar vermekten kaçının ve ön göz beyin kompleksi yağını çıkarmak için yıkayın. Ardından, göz bebeği epidermisinin arka kenarını forseps ile kavrayarak ve göz bebeği kılıfından dışarı çekerek göz bebeğini göz bebeği kılıfından çıkarın.

Diseke edilmiş pupayı temiz bir diseksiyon kabına aktarın. Forseps ile gözün beyin kompleksinin önündeki kütikülde küçük bir delik açın. Lastik ampullü bir cam macun pipeti kullanarak.

Kalan yağ ve bağırsak dokusunu çıkarmak için PBS diseksiyon solüsyonunu kısmen disseke edilmiş pupadan nazikçe yıkayın. Göz bebeği kanatlarını elde etmek için, ikinci bir forseps kullanarak pupayı bir forsep ile başından aşağı doğru tutun. Kanat kütikülünün en arka ucunu kavrayın, karkasın yanından çekin ve çıkarın.

Daha sonra kanadı gövdeden çıkarmak için menteşeden kesin veya çekin ve göz bebeğini, gözlerini veya beynini elde etmek için karkaslardan ve diğer malzemelerden uzakta bir yığına koyun. Göz beyin kompleksi yerinden çıkana ve pupadan kurtulana kadar pupayı yıkayın. Bir forsep kullanarak, göz bebeği gözünü nazikçe beyinden uzaklaştırın ve istenen dokuyu koruyun Yağlanmış bir geçmiş pipet kullanarak, diseke edilen dokuları dikkatlice aktarın.

Tüpleri 23 santigrat derecede 500 RPM'de 70 dakika çalkalayarak inkübe edin. Daha sonra orta hızda beş saniye boyunca hafifçe girdap yapın ve numuneleri 15 ila 20 dakika daha çalkalayıcıya geri koyun. Vorteks, beyinler ve göz bebeği gözleri için orta hızda beş saniye boyunca bir kez daha örnekler verir.

36 saatten eski. Bir PF, DNA boyama çözeltisindeki dokuları, 45 ila 60 dakika boyunca 500 RPM'de 23 santigrat derecede ayırır. Daha sonra, yaklaşık 50 mikrolitre DNA leke çözeltisi ile birlikte bir diseksiyon kabına aktararak büyük doku parçalarını tek tek manuel olarak ayırın.

Yaklaşık 100 ila 150 mikrometre açıklığa sahip pipetinizi manuel olarak çizerek hızla yukarı ve aşağı pipetleyin. Ayrışmış örnekleri beş mililitrelik bir tüpte toplayın. 500 RPM'de çalkalayarak 23 santigrat derecede 30 dakika daha inkübe edin.

Örneklerin tamamen ayrıştığını görsel olarak doğrulayın. Hücresel şeffaf göz bebeği kanadı kütikülünün birleşmeyeceğine dikkat edin. Numuneyi sitometreye yükleyerek faks analizine başlayın.

Ardından, hücre boyutunu ve zar karmaşıklığını gösteren ileri saçılma ve yan saçılmayı algılamak için kanalları seçin. DNA'nın D döngüsü menekşe boyamasını tespit etmek için, mor lazer uyarımından VL'nin bir yüksekliğini, genişliğini ve alanını ölçmeniz gerekecektir. Ayrıca GFP floresansını ölçmek için mavi lazer kanalını bir alan seçin.

RFP analizi için mavi lazer kanalı üçünü kullanıyoruz. Attune'daki bu kanal, RFP algılaması için optimize edilmiştir. Analizi seçilen popülasyonla sınırlamak ve birinci kapı ile durdurma grafikleri oluşturan analizden enkaz ve satış kümelerini sınırlamak için kapıları ayarlayın, SSC'ye karşı FSC grafiğindeki enkaz ve kümeleri VL grafiğinde bir alana karşı VL bir alana karşı GA iki ile boyanmamış hücreleri dışlamak için G bir apoptotik hücreleri ve singletlerin tanımlanmasına dayalı hücre kümelerini hariç tutun.

GA üç, VE L'nin bir yüksekliğine dayalı olarak floresan ve DNA içeriğine karşı floresan grafiğinde GFP negatif olan birinci ve ikinci kapılardaki hücreleri kapsar. Sonraki yürüyüş dördüncü, floresan ve DNA içeriği grafiğinde GFP pozitif olan birinci ve ikinci kapılardaki hücreleri kapsar. Ayrıca, ileri saçılmaya karşı GFP ile ölçülen hücre boyutunun nokta çizimlerinden beşinci ve altıncı kapılar da oluşturulabilir.

Hücre döngüsü fazını incelemek için, üçüncü ve dördüncü geçit tarafından tanımlanan popülasyonlar için x ekseninde DNA içeriğini ve Y ais üzerinde hücre sayısını çizen iki histogramı kullanın. Hücre boyutu için, histogramlar popülasyonları beş ve altıncı kapılara ayarlar ve FSC'yi x ekseninde çizer ve örnekleri çalıştırırken Y ekseninde sayılır, kaydı 10.000'de duracak şekilde ayarlar. GFP pozitif olayları ayrıca 300 mikrolitre için satın alma hacmini de belirledi.

Uygun eşik ve voltaj ayarları, sağlanan şablonlarda yer almaktadır. Numuneleri dakikada 100 mikrolitre standart veya yüksek hassasiyette çalıştırın ve kaydedin. Attune yazılımı tarafından oluşturulan kayıtlı veri dosyaları, çoğu hücre döngüsü modelleme yazılımıyla uyumlu olan FCS biçimindedir.

Dört nokta grafiği ve iki histogram içeren bu temsili çalışma alanı, bir Grailed gal dört transgeni tarafından sürülen, arka kanatta GFP ve Cyclin D'yi ifade eden bir larva kanadı örneğini gösterir. Yürüyüşlü hücre boyutunun ilk nokta grafiği, döküntüleri ve kümeleri hariç tutar. İkinci nokta grafiği, GFP'ye karşı DNA içeriğine karşı çizimdeki lekelenmemiş hücreleri, G 1D NA içeriğini ve kümeleri dışlamak için yürüyüşlü ikinci tekilleri ayırt eder.

GFP negatif ve pozitif hücreler ayırt edilebilir ve x ekseni boyunca konuma bağlı olarak iki N ve dört NDNA içeriği belirgindir. İleri saçılmaya karşı GFP ile ölçülen bu hücre boyutu grafiği, beşinci ve altıncı kapıları oluşturmak için kullanılır. Elde edilen analizler, GFP veya RFP negatif popülasyonun yanı sıra GFP veya RFP pozitif hücreler için sayımlara karşı DNA içeriğinin histogramlarına yol açar.

Sağlanan RFP şablonunu kullanma. Aynı doku tipi ve ekspresyon paterni ile benzer sonuçlar elde edilir. RFP için sağlanan şablonlar ve voltajlar, larva gözleri, beyinleri ve kanatlarının yanı sıra göz bebeği gözleri, beyinleri ve kanatlarının analizi için uygundur.

Uyumlu yazılımda. Hücre döngüsü veya hücre boyutu histogramları için otomatik ölçeklendirme özelliğinin kullanılması, her popülasyon için genel maksimumun belirlenmesine olanak tanır. Bu hücre döngüsü profilleri, posteriorda GFP'yi eksprese eden larva gözlerindeki GFP pozitif ve negatif hücreleri temsil eder.

GMR GAL dört U-A-S-G-F-P Transgenlerini kullanarak, kaplama, posterior GFP eksprese eden hücrelerin hücre döngüsü fazındaki farklılıkları ortaya çıkarır. GFP pozitif ve negatif hücreler arasındaki hücre boyutundaki göreceli değişim de çizilebilir. Bu hücre döngüsü profili, 46 saatlik A PF'de öğrenci beyinlerinden türetilmiştir. GFP pozitif hücreler, sessizliği bozan ve S-fazı girişine yol açan G bir S regülatörü, siklin D ve E iki F'yi ifade eden soy izleme klonlarıdır.

Bu, bu aşamada normalde tutuklanan eksprese etmeyen GFP negatif hücrelerin aksine. G one'da, attune yazılımı histogramlarda kullanıcı tanımlı bölgeler oluşturarak G one s ve G iki fazını tanımlar. Her çalıştırma için bir istatistik tablosu, kullanıcı tanımlı bölgeler ve yüzdeler içindeki hücrelerin mutlak sayısını belirler.

Alternatif olarak, mod fit gibi modelleme yazılımları, apoptotik hücrelerin yanı sıra her fazdaki yüzdeleri tahmin etmek için kullanılabilir. Bu videoyu izledikten sonra, hücre döngüsü analizi için Drosophila'dan birkaç dokuyu nasıl izole edeceğinizi ve etiketleyeceğinizi iyi anlamış olmalısınız.