Name: Ultra Performans Sıvı Kromatografisi-Kütle Spektrometresi (UPLC-MS) ile Serum Büyük Ölçekli Sigara hedefli metabolomik Profilleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 34 s
Description: Öğrenin, serum metabolitlerini UPLC-MS ile büyük ölçekli hedefsiz metabolomik profilleme için nasıl analiz edeceğinizi. Bu yöntem, küçük moleküllü biyobelirteçleri güvenilir şekilde tanımlamayı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Sunulan eğitim, kısmen CSU Araştırma İdaresi Bilimsel Projeler için Kaynaklar tarafından finanse edilen Colorado Eyalet Üniversitesi'ndeki Proteomik ve Metabolomik Tesisi içinde gerçekleştirilmiş ve geliştirilmiştir.

1. Örnek Organizasyon
<ol>
	<li>Bir elektronik tabloda numune hazırlama için bir plaka haritası oluşturmak için, ilk sütuna yükleme sırasına göre bir numune listesi girin. İkinci bir sütunda, otomatik numune alma yazılımınız için doğru terminolojiyi kullanarak 96 kuyulu plaka konumunu girin.</li>
	<li>QC numuneleri için her plakada bir kuyu ayırın.</li>
	<li>LC otomatik numune alma cihazınız aynı anda iki plakayı işleyebiliyorsa, numune listesini 190'lık gruplara ayırın ve bu bilgileri ikinci bir çalışma sayfasına kaydedin.</li>
	<li>Bu partilerin her birinde, enjeksiyon sırasını rastgele hale getirmek için rastgele hale getirme işlevini [not: Excel'de "=rand()"] kullanın. Şimdi enjeksiyon siparişinizi kopyalayıp LC-MS numune kuyruğu yazılım sistemine yapıştırın. Randomizasyon, partiler arasında, partiler içinde gerçekleşmeli ve enjeksiyon kopyaları arasında benzersiz olmalıdır.</li>
</ol>
2. Serum ve Kalite Kontrol (QC) Numune Hazırlama İşlemleri
<ol>
	<li>Deneyin kromatografik elüsyonunu kapsayan bilinen kütle ve alıkonma süresine sahip en az dört bileşik içeren 10 ml'lik bir QC numunesi stoğu hazırlayın. (not: kafein, reserpin, sülfadimetoksin ve terfenadin her biri 2 μg/ml konsantrasyonda).</li>
	<li>Serum örneklerini buz üzerinde çözdürün ve ~ 5 saniye boyunca hafifçe girdaplayın.</li>
	<li>Numune dağıtımı sırasında uç damlamasını önlemeye yardımcı olmak için 12 kanallı pipetleyicinin uçlarını metanol ile önceden ıslatın. Daha sonra 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 370 μl soğuk metanol ekleyin.</li>
	<li>Her numunenin 100 μl'sini plaka haritalarından ilgili plaka konumuna aktarın. Plakaları örtün ve proteinleri çökeltmek için -80 ° C'de 30 dakika inkübe edin.</li>
	<li>Plakaları 4 ° C'lik bir santrifüjde 3.200 x g'da 30 dakika boyunca döndürün. 250 μl süpernatanı yeni bir 96 oyuğuna aktarın ve santrifüjlemeyi tekrarlayın.</li>
	<li>Şimdi süpernatantın 60 μl'lik alikotunu UPLC veya LC otomatik örnekleyici için uygun üç adet 96 oyuklu plakaya aktarın.</li>
	<li>Plaka üzerinde ayrılmış kuyu konumuna 100 μl QC numune karışımı ekleyin.</li>
	<li>Her plakayı yapışkan film ile kapatın. Kuyu delindikten sonra solvent hızlı bir şekilde buharlaşabilir ve bu nedenle enjeksiyonlar her plakadan sadece bir kez yapılmalıdır. Numune kuyruğundaki plakalar kısa süreli olarak -20 °C'de saklanabilir.</li>
</ol>
3. UPLC-MS Veri Toplama
<ol>
	<li>Otomatik numune alma cihazını 4 °C'ye ayarlayın ve ilk iki plakayı otomatik numune alma cihazına yerleştirin.</li>
	<li>İki alternatif ters faz gradyanından birini kullanarak edinme yöntemini ayarlayın. Gradyan A, polar olmayan moleküllere karşı önyargılıdır, gradyan B ise orta derecede polar moleküllerin daha iyi kapsama alanını sağlayacaktır.
	<ol>
		<li>Gradyan A: 
		<tablo kenarlığı="1">
			<tbody>
				<tr>
					<td>Zaman (dk)</td>
					<td>%A</td>
					<td>%B</td>
					<td>eğri</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>0,0</td>
					<td>100</td>
					<td>0</td>
					<td> </td>
				</tr>
				<tr>
					<td>0,1</td>
					<td>100</td>
					<td>0</td>
					<td>6</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>1,0</td>
					<td>60</td>
					<td>40</td>
					<td>6</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>3,0</td>
					<td>30</td>
					<td>70</td>
					<td>6</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>11,0</td>
					<td>0</td>
					<td>100</td>
					<td>6</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>17,0</td>
					<td>0</td>
					<td>100</td>
					<td>6</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>17,1</td>
					<td>100</td>
					<td>0</td>
					<td>6</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>23,0</td>
					<td>100</td>
					<td>0</td>
					<td>6</td>
				</tr>
			</tbody>
		</table>
		</li>
		<li>Gradyan B 
		<tablo kenarlığı="1">
			<tbody>
				<tr>
					<td>Zaman (dk)</td>
					<td>%A</td>
					<td>%B</td>
					<td>eğri</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>0,0</td>
					<td>100</td>
					<td>0</td>
					<td> </td>
				</tr>
				<tr>
					<td>1</td>
					<td>100</td>
					<td>0</td>
					<td>6</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>13</td>
					<td>5</td>
					<td>95</td>
					<td>6</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>16</td>
					<td>5</td>
					<td>95</td>
					<td>6</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>Saat 16.05</td>
					<td>100</td>
					<td>0</td>
					<td>6</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>20</td>
					<td>100</td>
					<td>0</td>
					<td>6</td>
				</tr>
			</tbody>
		</table>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kütle spektrometresini 50-1.200 m/z arasında pozitif modda taramada veri toplayacak şekilde ayarlayın. Ek özel cihaz koşulları, kullanılan sisteme göre değişecektir. Aşağıdakiler, Waters Xevo G2 Q-TOF kütle spektrometremizde kullanılan koşulları temsil eder: Çarpışma Enerjisi = 6V; Tarama Süresi = tarama başına 0,2 saniye; Kılcal gerilim =2.200 V; Kaynak Sıcaklığı =150 °C Çözünme Sıcaklığı =350 °C Çözünme Gaz Akışı (N2) = 800 L/saat).</li>
	<li>QC numunelerini her 2 plakalı numune partisinin başında beş kez enjekte edin. UPLC-MS sistemini ilk iki enjeksiyonla koşullandırdıktan sonra, üçüncü ila beşinci enjeksiyonların tepe alanını (% <25 RSD), alıkonma süresini (+/- 0.05 dakika) ve kütle doğruluğunu (+/- 3 ppm) izleyin. Bu parametrelerin, veri toplama için kullanılan cihazın özelliklerine uyacak şekilde ayarlanması gerekebilir.</li>
	<li>QC numuneleri geçerse, bu iki plaka için serum numuneleri hakkında veri edinin. KK örnekleri başarısız olursa, sorun çözülene ve KK örnekleri geçene kadar örnek verileri toplanmaz. Laboratuvarımızda, bu parametrelerin üç günlük enjeksiyonlar boyunca (yani 2.96 kuyucuklu plakanın enjeksiyonu) tutarlı bir şekilde stabil olduğunu bulduk. Sisteminizin bu süre zarfında kararsız olduğu tespit edilirse, daha sık QC enjeksiyonları uygun olabilir. Kalite kontrol örneği, düşük kaliteli verileri düzeltmek için değil, düşük kaliteli verilerin toplanmasını önlemek için kullanılır.</li>
</ol>
4. Tepe Algılama, Entegrasyon, Hizalama ve Normalleştirme
Bu adımları gerçekleştirmek için ücretsiz yazılım ve satıcıya özel araçlar da dahil olmak üzere çeşitli seçenekler vardır. Bu adım video eğitiminde atlanmıştır, ancak yaklaşımımız aşağıda bir örnek olarak açıklanmıştır.
Her örnek için, bu tür bir deneyden üretilen analitik veriler, bir tutma süresi, m/z değeri ve bir spektral yoğunluk ile tanımlanan bir iyon profilidir. Hedeflenmemiş bir metabolit profilleme deneyi birçok örnekten oluşacaktır ve bu nedenle veri kümesinin müteakip istatistiksel analizini sağlamak için tepe tespiti, tutma süresi hizalaması ve normalleştirme gerçekleştirilmelidir.
<ol>
	<li>Waters DataBridge yazılımını kullanarak ham verileri .cdf formatına aktarın. XCMS yazılım paketini 10 (<a href="http://metlin.scripps.edu/xcms/" target="_blank">http://metlin.scripps.edu/xcms/) adresinde bulunan ücretsiz yazılım) kullanarak tepe algılama ve saklama süresi hizalaması gerçekleştirin</a> ve R istatistiksel ortamında11 yürütülür. Web sitesi, yazılımın nasıl indirileceği ve çalıştırılacağı ile ilgili belgeler içerir.</li>
	<li>XCMS içinde aşağıdaki parametrelerle "matchedfilter" yöntemini kullanın: yarım maksimumda tam genişlik = 8 saniye, S/N oranı = 3, ekstrakte edilen her iyon kromatogramı için maksimum 100 tepe. Özellik gruplandırma, bekletme süresi düzeltmesi, yeniden gruplandırma ve fillPeaks adımlarını gerçekleştirin. XCMS yazılımının çıktısı, tüm algılanabilir özelliklerin satırlar olarak listelendiği, her deneysel örneğin bir sütun olarak listelendiği ve hücrelerin her örnekteki her özelliğin tepe alanı ile doldurulduğu bir veri matrisidir. Bu veri kümesinin transpozisyonu, aşağı akış istatistiksel iş akışlarına dahil etmek için gerekli olabilir.</li>
	<li>Belirli bir numunedeki her bir özelliğin tepe alanını, ekstrakte edilen iyon tepe alanının toplamına bölerek (toplam iyon akımı veya o numune için TIC olarak adlandırılır (sayıları görsel veri yorumlaması için daha uygun hale getirmek için 100.000 ile çarpılır) R'deki veri matrisini normalleştirin.</li>
	<li>Aykırı değerleri kaldırın. Verilerdeki aykırı değerler, iyi bir numunenin kötü bir enjeksiyonundan veya kötü bir numunenin iyi bir enjeksiyonundan kaynaklanabilir.
	<ol>
		<li>Aşağıdaki parametrelere sahip aykırı değer paketini kullanarak R'de aykırı değer algılaması gerçekleştirin: (1) TIC değerleri ve (2) %99,9 güvenle PC puanları.</li>
		<li>Aykırı değerler varsa, ilgili veri dosyaları kaldırılır ve tepe algılama, hizalama ve normalleştirme prosedürleri yeniden gerçekleştirilir.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Numune tanımlayıcısına göre normalleştirilmiş tepe alanlarının ortalamasını alın (çoklu enjeksiyonların ortalamasını almak için). Bu, istatistiksel analiz yapılmadan önce yapılmalıdır (not: enjeksiyon kopyaları analitik varyasyonu hesaba katar, ancak gerçek biyolojik kopyalar olarak kullanılamaz).</li>
</ol>
5. İstatistiksel Analiz
Metabolomik deneyler için, verilerin yorumlanması için hem çok değişkenli hem de tek değişkenli istatistiksel teknikler gereklidir. Yaygın olarak kullanılan iki teknik, Temel Bileşen Analizi ve Varyans Analizi'ni (ANOVA) içerir. Verilerin istatistiksel analizine yaklaşmanın birden fazla yolu vardır ve hem açık kaynaklı hem de ticari yazılım araçları mevcuttur. Bu adım video eğitiminde atlanmıştır, ancak yaklaşımımız aşağıda bir örnek olarak açıklanmıştır.
<ol>
	<li>R'deki veri kümesine bir aov işlevi uygulayarak ANOVA gerçekleştirin.</li>
	<li>Benjamini-Hochberg ayarlaması kullanarak yanlış pozitifleri hesaba katın (R'de p.adjust fonksiyonu).</li>
	<li>Pareto ölçekli (birim varyans da uygulanabilir) ve ortalama merkezli veri seti ile PCA yürütün. Hem PC puanları hem de yüklemeler, R'deki pcaMethods paketi kullanılarak hesaplanır.</li>
	<li>Deneysel tedaviyle ilişkili varyasyonu en iyi tanımlayan moleküler özellikleri belirlemek için ANOVA p değerlerini, yükleme skorlarını ve kat değişim parametrelerini kullanın.</li>
	<li>Bir moleküler iyona, eklentiye (örneğin sodyum, potasyum veya dimer) veya nötr kayba karşılık gelip gelmediğini belirlemek için ilgilenilen her bir moleküler özelliği manuel olarak sorgulayın.</li>
</ol>
6. Metabolit Tanımlama
Burada sunulan iş akışı çok geneldir ve herhangi bir cihaz platformundan elde edilen sonuçlara uygulanabilir. Tartışma bölümünde alternatif bir strateji sunulmaktadır.
<ol>
	<li>İstatistiksel olarak anlamlı tüm özellikler için (Adım 6'daki analizden belirlendiği gibi) ham verileri gözden geçirin ve ana iyonların, sodyum eklentilerinin, izotopların ve fragmanların veri kümesi boyunca benzer eğilimleri izlediğini onaylayın. Örneğin, bir ana iyon için ANOVA'dan türetilen p değeri, izotopuna benzer olmalıdır. Bu, her iki moleküler özelliğin de aynı metabolite karşılık geldiğini gösterir.</li>
	<li>İstatistiksel olarak anlamlı moleküler özelliklerin doğru kütle ölçümlerini ve/veya nötr kayıplarını (birden fazla izotop önemliyse C12 izotopunu seçin) kurum içi (varsa) veya kamuya açık metabolit veritabanlarına karşı arayın:
	<ol class="lroman">
		<li>İnsan Metabolom Veritabanı (<a href="http://www.hmdb.ca/" target="_blank">http://www.hmdb.ca/</a>)</li>
		<li>Metlin (<a href="http://metlin.scripps.edu/metabo_search_alt2.php" target="_blank">http://metlin.scripps.edu/metabo_search_alt2.php</a>)</li>
		<li>Kitle Bankası (<a href="http://www.massbank.jp/?lang=en" target="_blank">http://www.massbank.jp/?lang=en</a>)</li>
		<li>Lipid Haritaları (<a href="http://www.lipidmaps.org/data/standards/index.html" target="_blank">http://www.lipidmaps.org/data/standards/index.html</a>)</li>
		<li>Ulusal Standartlar ve Teknoloji Enstitüsü MS Arama (<a href="http://chemdata.nist.gov/mass-spc/ms-search/" target="_blank">http://chemdata.nist.gov/mass-spc/ms-search/</a>)</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Önemli moleküler özelliklerinizin doğru kütle ve izotopik dağılımından bir moleküler formülü tahmin etmek için yazılımı kullanın. Waters yazılımında bu, MassLynx paketindeki Elemental Comp aracı kullanılarak gerçekleştirilir.</li>
	<li>Aday metabolit tanımlamalarını şu kriterlere göre filtreleyin: kütle hatası (cihaz platformunuz için uygun olduğu şekilde), tahmin edilen moleküler formül, deneysel tasarıma göre gözlemlenen eğilimlerdeki biyolojik alaka düzeyi ve alıkonma süresi (örneğin, lipitler ve diğer polar olmayan bileşikler, ters faz kromatografisi kullanıldığında daha uzun alıkonma sürelerine sahip olacaktır).</li>
	<li>İstatistiksel olarak anlamlı moleküler özellikler için MS / MS parçalanmasını elde etmek için sonraki deneyleri gerçekleştirin. Mümkün olduğunda, metabolit tanımlaması, deneysel parçalanma zirvelerinin ve alıkonma süresinin aynı cihazda elde edilen otantik bir standardınkiyle eşleştirilmesine dayanmalıdır. Alternatif olarak, deneysel parçalanma spektral bir veritabanıyla eşleştirilebilir.</li>
	<li>Tanımlama güvenilirliği, metabolomik standartlar girişimi önerileri12. dayalı olarak rapor edilen tüm metabolit tanımlamalarına atanmalıdır
	Seviye 1: otantik bir bileşiğe göre ortogonal analitik parametrelere (doğru kütle, alıkonma süresi ve MS/MS parçalanması) dayalı güvenli moleküler tanımlama. 
	Seviye 2, fizikokimyasal özelliklere ve/veya literatür veya spektral kütüphanelerle spektral benzerliğe dayalı varsayılan bir tanımlama tabanını ifade eder. 
	Seviye 3, fizikokimyasal özelliklere veya spektral benzerliğe dayalı olarak bir bileşik sınıfının varsayılan tanımlamasını ifade eder. 
	Seviye 4, bilinmeyen bir bileşiği ifade eder.</li>
</ol>

<ol><li>Theodoridis, G., Gika, H. G., Wilson, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+Spectrometry-Based+Holistic+Analytical+Approaches+for+Metabolite+Profiling+in+Systems+Biology+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrom.+Rev%22%5BJournal%5D)">Mass Spectrometry-Based Holistic Analytical Approaches for Metabolite Profiling in Systems Biology Studies.</a> Mass Spectrom. Rev. 30, 884-906 (2011).</li>
<li>Zelena, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+robust+and+repeatable+UPLC-MS+method+for+the+long-term+metabolomic+study+of+human+serum%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Development of a robust and repeatable UPLC-MS method for the long-term metabolomic study of human serum.</a> Analytical Chemistry. 81, 1357-1364 (2009).</li>
<li>Michopoulos, F., Lai, L., Gika, H., Theodoridis, G., Wilson, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UPLC-MS-based+analysis+of+human+plasma+for+metabonomics+using+solvent+precipitation+or+solid+phase+extraction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">UPLC-MS-based analysis of human plasma for metabonomics using solvent precipitation or solid phase extraction.</a> Journal of Proteome Research. 8, 2114-2121 (2009).</li>
<li>Kamburov, A., Cavill, R., Ebbels, T. M., Herwig, R., Keun, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+pathway-level+analysis+of+transcriptomics+and+metabolomics+data+with+IMPaLA%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Integrated pathway-level analysis of transcriptomics and metabolomics data with IMPaLA.</a> Bioinformatics. 27, 2917-2918 (2011).</li>
<li>Xia, J., Wishart, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MetPA%3A+a+web-based+metabolomics+tool+for+pathway+analysis+and+visualization%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">MetPA: a web-based metabolomics tool for pathway analysis and visualization.</a> Bioinformatics. 26, 2342-2344 (2010).</li>
<li>Johnson, C. H., Gonzalez, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+and+opportunities+of+metabolomics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Challenges and opportunities of metabolomics.</a> J. Cell. Physiol. 227, 2975-2981 (2012).</li>
<li>Issaq, H. J., Waybright, T. J., Veenstra, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+biomarker+discovery%3A+Opportunities+and+pitfalls+in+analytical+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Cancer biomarker discovery: Opportunities and pitfalls in analytical methods.</a> Electrophoresis. 32, 967-975 (2011).</li>
<li>Zhou, B., Xiao, J. F., Tuli, L., Ressom, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LC-MS-based+metabolomics%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biosyst%22%5BJournal%5D)">LC-MS-based metabolomics.</a> Mol. Biosyst. 8, 470-481 (2012).</li>
<li>Weckwerth, W., Morgenthal, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolomics%3A+from+pattern+recognition+to+biological+interpretation%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov.+Today%22%5BJournal%5D)">Metabolomics: from pattern recognition to biological interpretation.</a> Drug Discov. Today. 10, 1551-1558 (2005).</li>
<li>Smith, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((METLIN+-+A+metabolite+mass+spectral+database%5BTitle%5D)+AND+%22Ther.+Drug+Monit%22%5BJournal%5D)">METLIN - A metabolite mass spectral database.</a> Ther. Drug Monit. 27, 747-751 (2005).</li>
<li>Culpepper, S. A., Aguinis, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((R+is+for+Revolution%3A+A+Cutting-Edge%2C+Free%2C+Open+Source+Statistical+Package%5BTitle%5D)+AND+%22Organ+Res.+Methods%22%5BJournal%5D)">R is for Revolution: A Cutting-Edge, Free, Open Source Statistical Package.</a> Organ Res. Methods. 14, 735-740 (2011).</li>
<li>Sumner, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proposed+minimum+reporting+standards+for+chemical+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolomics%22%5BJournal%5D)">Proposed minimum reporting standards for chemical analysis.</a> Metabolomics. 3, 211-221 (2007).</li>
<li>Vuckovic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+trends+and+challenges+in+sample+preparation+for+global+metabolomics+using+liquid+chromatography-mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Bioanal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Current trends and challenges in sample preparation for global metabolomics using liquid chromatography-mass spectrometry.</a> Anal. Bioanal. Chem. 403, 1523-1548 (2012).</li>
<li>Garcia-Canaveras, J. C., Donato, M. T., Castell, J. V., Lahoz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+untargeted+metabonomic+analysis+of+human+steatotic+liver+tissue+by+RP+and+HILIC+chromatography+coupled+to+mass+spectrometry+reveals+important+metabolic+alterations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">A comprehensive untargeted metabonomic analysis of human steatotic liver tissue by RP and HILIC chromatography coupled to mass spectrometry reveals important metabolic alterations.</a> Journal of Proteome Research. 10, 4825-4834 (2011).</li>
<li>Nordstrom, A., Want, E., Northen, T., Lehtio, J., Siuzdak, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+ionization+mass+spectrometry+strategy+used+to+reveal+the+complexity+of+metabolomics%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Multiple ionization mass spectrometry strategy used to reveal the complexity of metabolomics.</a> Analytical Chemistry. 80, 421-429 (2008).</li>
<li>Horai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MassBank%3A+a+public+repository+for+sharing+mass+spectral+data+for+life+sciences%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">MassBank: a public repository for sharing mass spectral data for life sciences.</a> J. Mass Spectrom. 45, 703-714 (2010).</li>
<li>Wishart, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+metabolite+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Bioanalysis%22%5BJournal%5D)">Advances in metabolite identification.</a> Bioanalysis. 3, 1769-1782 (2011).</li>
<li>Broeckling, C., Heuberger, A., Prince, J., Ingelsson, E., Prenni, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assigning+precursor-product+ion+relationships+in+indiscriminant+MS%2FMS+data+from+non-targeted+metabolite+profiling+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolomics%22%5BJournal%5D)">Assigning precursor-product ion relationships in indiscriminant MS/MS data from non-targeted metabolite profiling studies.</a> Metabolomics. , 1-11 (2012).</li>
<li>Kangas, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+silico+identification+software+%28ISIS%29%3A+a+machine+learning+approach+to+tandem+mass+spectral+identification+of+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">In silico identification software (ISIS): a machine learning approach to tandem mass spectral identification of lipids.</a> Bioinformatics. 28, 1705-1713 (2012).</li>
</ol>

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Bu eğitim, UPLC-MS ile büyük ölçekli hedeflenmemiş metabolit profili oluşturmak için bir başlangıç noktası olarak hizmet etmeyi amaçlamaktadır. İş akışı, sulu bir metanol çözücü ile ekstrakte edilebilen, bir C8 veya C18 UPLC kolonunda tutulabilen ve pozitif iyonlar olarak tespit edilebilen metabolitlere odaklanmıştır. Belirli bir metabolit sınıfına karşı önceden belirlenmiş bir önyargının olmadığı ve küresel profil oluşturan bir hipotezin istendiği durumda, bu protokol, çeşitli kimyasal sınıflardan (yani orta de...

Metabolomik" terimi birçok şeyi kapsayabilir. Örneğin, bir metabolomik deney, NMR ve kütle spektrometresi ile birleştirilmiş hem gaz hem de / veya sıvı kromatografisi gibi çeşitli analitik platformlar kullanılarak gerçekleştirilebilir. Ayrıca, metabolomik deneyler hedefli veya hedefsiz bir şekilde veya her ikisinin bir kombinasyonu olarak gerçekleştirilebilir. Hedefli bir metabolomik deney, eldeki biyolojik soru için önemli olan bir molekül panelinin yönlendirilmiş analizini içerecektir (örneğin, TCA döngüsüne dahil olan küçük moleküller, bu yolun doğru bir şekilde ölçülmesine izin verecektir). Bu durumda, biyolojik hipotez, analizde hedeflenecek metabolitlerin seçimini belirler ve analitik adımlar bu moleküllerin tespiti için optimize edilir. Alternatif olarak, hedeflenmemiş bir metabolomik deney hipotez üretmektedir. Bu durumda, deney mümkün olduğu kadar çok metabolitin tespit edilmesini sağlamak için geniş ve tarafsız bir şekilde gerçekleştirilir. Hedeflenmemiş bir deneyden elde edilen sonuçlar, araştırmanın bir sonraki adımını yönlendirecektir (çoğu durumda hedefli bir metabolomik iş akışını içerebilir). İki yaklaşımı birleştirmek de mümkündür, bu durumda bir deney hedeflenmemiş bir şekilde gerçekleştirilirken, aynı anda veriler içinde bilinen moleküllerden oluşan bir panel izlenir. 
Burada sunulan eğitim, özellikle serumun hedeflenmemiş metabolit profillemesine odaklanmıştır. Yukarıda açıklandığı gibi, hedefsiz yaklaşım, tespit edilebilir metabolitlerin tarafsız bir görünümünü sağlar, büyük miktarda bilgi üretebilir ve nihayetinde yeni keşiflere izin verebilir. Özellikle kütle spektrometresi (UPLC-MS) ile birleştirilmiş ultra performanslı sıvı kromatografisini kullanan bu yaklaşımın kullanımı yaygınlaşmaktadır 1, 2, 3 ve aşağıdaki adımları içermektedir: (1) deneysel tasarım (2) numune toplama (3) numune hazırlama (4) UPLC-MS ile veri toplama (5) veri ön işleme (tepe algılama, entegrasyon, hizalama ve normalleştirme) (6) istatistiksel veri analizi (hem tek hem de çok değişkenli) (7) metabolit tanımlama ve (8) biyolojik Yorumu. 
Şu anda, UPLC-MS tabanlı hedeflenmemiş metabolit profili oluşturma ve sonraki veri ön işleme adımları için belirlenmiş standart yöntemler yoktur. Bu standardizasyon eksikliği, kısmen metabolit profillemesinin birincil analitik zorluklarından birinden kaynaklanmaktadır; Metabolomun kimyasal çeşitliliği. Bu çeşitlilik nedeniyle, tek bir ekstraksiyon yönteminin veya kütle spektrometresi elde etme yönteminin tek bir analizde tüm metabolitlerin kapsamlı bir şekilde kapsanmasını sağlamak imkansızdır. Kavram olarak, metabolit kapsamı, çeşitli kromatografik koşullar (örneğin ters faz, HILIC, vb.) ve çeşitli iyonizasyon modları (örneğin pozitif iyon, negatif iyon, kimyasal iyonizasyon, vb.) ile birleştirilmiş çoklu ekstraksiyonlar (örn. sulu, metanol, kloroform: metanol, vb.) kullanılarak maksimize edilebilir.). Bununla birlikte, çoğu zaman, araştırmacılar belirli bir kimyasal sınıf için önceden belirlenmiş bir önyargıya sahip değildir ve bu nedenle, özellikle büyük ölçekli deneyler için çoklu ekstraksiyon ve cihaz edinimi gerçekleştirme masrafı garanti edilmez. Bu nedenle, burada sunulan video eğitimi, UPLC-MS ile serumun büyük ölçekli hedeflenmemiş metabolit profillemesi için genel bir prosedür sağlamak üzere tasarlanmıştır. Yeni ve yerleşik laboratuvarların bu tür deneyleri gerçekleştirmelerini ve çeşitli numune türleri, belirli kimyasal sınıflar veya hedefli analizler için yaklaşımı genişletebilecekleri yapı taşlarını sağlayacaktır. Spesifik olarak, bu protokol şu adımları içerecektir: serum numunesi hazırlama, büyük ölçekli çalışmalar için numune organizasyonu, UPLC-MS veri toplama, kalite kontrol (QC) prosedürleri ve metabolit tanımlama. Veri ön işleme ve istatistiksel analiz için stratejiler de sunulmaktadır.
Protokol, bu eğitimin kapsamı dışında olduğu için deneysel tasarım, örnek toplama veya biyolojik veri yorumlama adımlarına odaklanmayacaktır. Bununla birlikte, literatürde bu konular için birçok kaynak bulunmaktadır ve yazarlar metabolomiklere yeni başlayan araştırmacıları bunları derinlemesine araştırmaya teşvik etmektedir 4, 5, 6, 7, 8, 9. Özellikle, deneysel tasarım son derece önemlidir ve hedeflenmemiş bir metabolomik deneyin başarısı için kritik öneme sahiptir. Uygulanabilir bir çalışma sağlamak ve verilerin uygun biyolojik yorumlamasını kolaylaştırmak için uygun biyolojik replikasyon ve numune toplama prosedüründe tutarlılık gibi faktörler (örn. tezgahta geçirilen süre, saklama sıcaklığı, saklama süresi, donma-çözülme vb.) dikkate alınmalıdır.

<table><tbody><tr><td>96 kuyu plakası - 500 &mu; l kuyular</td><td>VWR</td><td>40002-020</td><td>Bunlar numune hazırlama için kullanılır</td></tr><tr><td>96 kuyulu plaka paspasları</td><td>VWR</td><td>89026-514</td><td>Bunlar numune hazırlama için kullanılır</td></tr><tr><td>96 kuyulu plakalar - 350 &mu; l kuyular</td><td>Waters Corporation</td><td>WAT058943</td><td>Bunlar numune enjeksiyonu için kullanılır</td></tr><tr><td>96 kuyulu plaka paspasları</td><td>Waters Corporation</td><td>186000857</td><td>Bunlar numune enjeksiyonu için kullanılır</td></tr><tr><td>96 kuyu plakalı ısı contaları</td><td>Waters Corporation</td><td>186002789</td><td>Bunlar numune enjeksiyonu veya uzun süreli depolama için kullanılabilir</td></tr><tr><td>96 kuyulu plakalı ısı mühürleyen </td><td>Waters Corporation</td><td>186002786</td><td></td></tr><tr><td>LC-MS sınıfı metanol</td><td>Fluka</td><td>34966</td><td></td></tr><tr><td>LC-MS sınıfı asetonitril</td><td>Fluka</td><td>34967</td><td></td></tr><tr><td>LC-MS sınıfı aater</td><td>Fluka</td><td>39253</td><td></td></tr><tr><td>LC-MS sınıfı formik asit</td><td>Fluka</td><td>56302</td><td></td></tr><tr><td>Çok kanallı elektronik pipetleyici</td><td>VWR</td><td>89000-674</td><td></td></tr><tr><td>Pipet uçları</td><td>Eclipse (Light Labs aracılığıyla satın alınır)</td><td>B-5061/B-4061</td><td></td></tr><tr><td>Soğutulmuş santrifüj - Allegra X-12R</td><td>Beckman Coulter</td><td>N/A - iletişim Beckman Coulter</td><td></td></tr><tr><td>Acquity Ultra performanslı Sıvı Kromatografisi (UPLC) Sistemi</td><td>Waters Corporation</td><td>N/A - Waters Corporation</td><td></td>ile iletişim</tr> kurun <tr><td>UPLC C8 sütunu (gradyan seçeneği a)</td><td>Waters Corporation</td><td>186002876</td><td></td></tr><tr><td>UplC T3 sütunu (gradyan seçeneği b) </td><td>Sular Corporation</td><td>186003536</td><td></td></tr><tr><td>Xevo G2 Q-TOF Kütle spektrometresi</td><td>Waters Corporation</td><td>N/A - Waters Corporation</td><td></td> ile iletişim</tr></tbody></table> kurun

ultra performans sıvı kromatografisi-kütle spektrometresi (uplc-ms) ile serum büyük Ölçekli sigara hedefli metabolomik profilleme

Large Scale Non-targeted Metabolomic Profiling of Serum by Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (UPLC-MS)

Kütle spektrometresi (UPLC-MS) ile birleştirilmiş ultra performanslı sıvı kromatografisi ile hedeflenmemiş metabolit profili, metabolizmayı araştırmak için güçlü bir tekniktir. Yaklaşım, tanı testlerinin, yeni tedavilerin geliştirilmesini ve hastalık süreçlerini daha iyi anlamamızı sağlayabilecek tarafsız ve derinlemesine bir analiz sunar. Metabolomun doğal kimyasal çeşitliliği önemli analitik zorluklar yaratır ve tüm metabolitleri tespit edebilecek tek bir deneysel yaklaşım yoktur. Ek olarak, bireysel metabolizmadaki biyolojik çeşitlilik ve metabolizmanın çevresel faktörlere bağımlılığı, anlamlı biyolojik yorumlama için gereken uygun istatistiksel gücü elde etmek için büyük örneklem sayılarını gerektirir. Bu zorlukların üstesinden gelmek için bu eğitim, UPLC-MS ile serumun büyük ölçekli hedeflenmemiş metabolit profillemesi için analitik bir iş akışını özetlemektedir. Prosedür, numune organizasyonu ve hazırlama, veri toplama, kalite kontrol ve metabolit tanımlaması için yönergeleri içerir ve büyük deneyler için güvenilir veri elde edilmesini sağlayacak ve UPLC-MS ile hedeflenmemiş metabolit profillemesi konusunda yeni olan laboratuvarlar için bir başlangıç noktası sağlayacaktır.

UPLC-MS ile gerçekleştirilen hedef dışı metabolit profilleme deneyinin temel analitik adımları Şekil 1'de özetlenmiştir. Her örnek için elde edilen ham veriler, baz pik kromatogramı olarak görselleştirilebilir. Şekil 2, eğitimdeki (a) gradyan seçeneği ile analiz edilen bir serum örneğine ait örnek bir baz pik kromatogramını göstermektedir. Yukarıda açıklanan istatistiksel analizlerin ardından, istatistiksel olarak anlamlı olan tüm moleküler özellikler için metabolit tanımlaması yapılmaya...

Kütle spektrometresi (UPLC-MS) ile birleştirilmiş ultra performanslı sıvı kromatografisi ile hedeflenmemiş metabolit profili, metabolizmayı araştırmak için güçlü bir tekniktir. Bu makale, numune organizasyonu ve hazırlama, veri toplama, veri analizi, kalite kontrol ve metabolit tanımlaması dahil olmak üzere serumun hedeflenmemiş metabolit profili için kullanılan tipik bir iş akışını özetlemektedir.

Ultra Performans Sıvı Kromatografisi-Kütle Spektrometresi (UPLC-MS) ile Serum Büyük Ölçekli Sigara hedefli metabolomik Profilleme

Non-targeted metabolite profiling by ultra performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry (UPLC-MS) is a powerful technique to ...

Bu prosedürün genel amacı, büyük ölçekli bir deneyde serumun sağlam, hedeflenmemiş metabolit profillemesini gerçekleştirmektir. İlk olarak, metabolitleri plaka formatında ekstrakte edin. Zaman içinde analitik stabiliteyi sağlamak için sağlam bir QC örneği ve yöntemi oluşturun.Ardından QC ve randomize edilmiş serum örneklerinden tekrarlı olarak kütle spektral verileri elde edin; veri ön işleme, istatistiksel analiz ve metabolit tanımlama aşamalarına geçin. U-P-L-C-M-S ile yapılan hedeflenmemiş metabolit profilleme sonuçları, serumdaki küçük molekül biyobelirteçlerini tanımlamak için kullanılabilir. Bu protokol, serum analizi için burada sunulmuştur.Bununla birlikte, yöntem kolaylıkla idrar, doku ve hücre kültürü ekstraktları gibi diğer biyolojik sıvıların analizine genişletilebilir. Numune hazırlama için bir plaka haritası oluşturmak üzere bir hesap tablosu açın. İlk sütuna, yükleme sırasına göre numune listesini girin. İkinci sütuna, otomatik örnekleyici yazılımınız için uygun isimlendirmeyi kullanarak 96 kuyucuklu plaka konumlarını girin.Her plaka üzerinde QC örneği için bir kuyucuğu ayırın. Eğer lc otomatik örnekleyici aynı anda iki plakayı işleyebiliyorsa, örnek listesini 190'lı

large-scale-non-targeted-metabolomic-profiling-serum-ultra

Research

JoVE Journal

Chemistry

Kimya

Hedefsiz metabolomik bir metabolik profili anlık üreten bir hipotez sağlar. Bu protokol, serum hücreler veya doku metabolitlerinin çıkarma ve analiz gösterecektir. Metabolitleri bir dizi sıvı-sıvı faz ekstraksiyon kullanılarak anket vardır, Mikrosirkülasyon Ultra Performanslı sıvı kromatografisi / diferansiyel analiz yazılımı için birleştiğinde yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi (UPLC-HRMS).

Ultra Performanslı Sıvı Kromatografi-Yüksek Çözünürlüklü Kütle Spektrometre (UPLC-HRMS) kullanarak Biyolojik Kaynaklar gelen hedefsiz Metabolomik

Metabolit profil sağlık ve hastalık metabolizmanın çalışmasında değerli bir varlık olmuştur. Polarizasyon değiştirmesi ve hızlı görev döngüsü ile yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi birleştiğinde normal aşamalı sıvı kromatografisi kullanarak, yüksek hassasiyet, doğruluk ve çözünürlük ile biyolojik madde polar metabolik bileşimini analiz etmek için bir protokol açıklar.

Hassas, Büyük Ölçekli Kantitatif metabolomik için bir strateji

Metabolomiks deneylerde sonuçların güvenilirliği numune hazırlama etkinliği ve yeniden üretilebilirlik bağlıdır. Daha sonra bileşikler bin kadar analiz, ya da ilgi sadece bileşik sınıfları seçeneği ile biyolojik sıvılardan metabolitlerin çıkarma sağlayan bir sıkı ve derinlemesine bir yöntem tarif edilmektedir.

Derinlemesine ve Bilgilendirici metabolomic Analizi Çoklu Metaboliti&#39;nin Bileşik Sınıfları Kurtar Multi-step Hazırlama Tekniği

Bir sheathless gözenekli ucu arayüz tasarımı kullanılarak kapiler elektroforez-kütle spektrometrisi ile biyolojik numunelerin metabolik profil için bir protokol verilmektedir.

Biyolojik Numune metabolik profil için Sheathless Kapiler Elektroforez-Kütle Spektrometre

Biz doğru bir şekilde sıvı Kromatografi yüksek çözünürlüklü bir Kütle Spektrometre için arabirim ile proteinler ile izobarik etiketleme, geniş ayırma, Biyoinformatik araçlarını ve kalite kontrol adımları birlikte quantitate için bir protokol mevcut.

Derin Proteom izobarik etiketleme, kapsamlı sıvı Kromatografi, kütle spektrometresi ve yazılım destekli miktar tarafından profil oluşturma

Detaylı bir protokol ayırma, kimlik ve kapiller bölge Elektroforez-electrospray iyonlaşma-tandem kütle spektrometresi (CZE-ESI-MS/MS) kullanarak protein örnekleri proteoforms karakterizasyonu için tanımlanır. Protokol proteoforms basit protein örneklerinde yüksek çözünürlüklü karakterizasyonu ve proteoforms karmaşık Proteom örneklerinde büyük ölçekli tanımlaması için kullanılabilir.

Büyük ölçekli tepeden proteomik kılcal bölge Elektroforez Tandem kütle spektrometresi kullanılarak

Burada biz bir yüksek-den geçerek yöntemi ile kalite kontrol multisegment enjeksiyon-kılcal göre geliştirilmiş çözünürlük ve ilaç kötüye kullanımı ve bunların metabolitleri büyük paneller tespiti için sağlar kapsamlı uyuşturucu gözetimi için tarif Elektroforez-kütle spektrometresi.

Multisegment enjeksiyon-kılcal Elektroforez kütle spektrometresi kullanılarak yüksek üretilen iş ve kapsamlı uyuşturucu gözetim

Buğday tanemetabolitleri ve lipitlerinin hedeflenmemiş analizi için bir yöntem sunulmuştur. Protokol, pozitif ve negatif elektrosprey iyonizasyon modlarında edinim ile bir asetonnril metabolit çıkarma yöntemi ve ters faz sıvı kromatografi-kütle spektrometresi metodolojisi içerir.

Hedefsiz Sıvı Kromatografisi-Kütle Spektrometresi Tabanlı Metabolomik Buğday Tanesi Analizi

Protokoller, karmaşık lisat bazlı hücre içermeyen sistemlerde metabolik reaksiyonları incelemek için kırma indeksi veya kütle spektrometrik tespiti ile birleştiğinde yüksek performanslı sıvı kromatografi yöntemlerini açıklar.

Sıvı Kromatografisi, Lysate Tabanlı Hücre içermeyen Sistemlerde Metabolit Profilleme için Kırılma İndeksi veya Kütle Spektrometrik Algılaması ile Birleştirilmiştir

Bu protokolün amacı, yarı hedefli kromatografi-kütle spektrometrisi yöntemi kullanarak plazmadaki fenolik metabolitleri tespit etmektir.

Yaşlı Yetişkinlerin Plazmasındaki Fenolik Metabolitlerin Kütle Spektrometri Analizine Bağlanan Yarı Hedefli Ultra Yüksek Performanslı Kromatografi

Öğrenin, serum metabolitlerini UPLC-MS ile büyük ölçekli hedefsiz metabolomik profilleme için nasıl analiz edeceğinizi. Bu yöntem, küçük moleküllü biyobelirteçleri güvenilir şekilde tanımlamayı sağlar.

Ultra Performans Sıvı Kromatografisi-Kütle Spektrometresi (UPLC-MS) ile Serum Büyük Ölçekli Sigara hedefli metabolomik Profilleme (Video) | JoVE Journal

Ultra Performans Sıvı Kromatografisi-Kütle Spektrometresi (UPLC-MS) ile Serum Büyük Ölçekli Sigara hedefli metabolomik Profilleme

Daha fazla video keşfet