Ultra Performans Sıvı Kromatografisi-Kütle Spektrometresi (UPLC-MS) ile Serum Büyük Ölçekli Sigara hedefli metabolomik Profilleme

Bu prosedürün genel amacı, büyük ölçekli bir deneyde serumun sağlam, hedeflenmemiş metabolit profillemesini gerçekleştirmektir. İlk olarak, metabolitleri bir plaka formatında çıkarın. Zaman içinde analitik stabiliteyi sağlamak için sağlam bir kalite kontrol numunesi ve yöntemi oluşturun.

Daha sonra QC ve randomize serum numuneleri üzerinde replika kütle spektral verileri elde edin, verilere, ön işlemeye, istatistiksel analize ve metabolit tanımlamasına devam edin. U-P-L-C-M-S ile hedeflenmemiş metabolit profillemesinin sonuçları, serumdaki küçük moleküllü biyobelirteçleri tanımlamak için kullanılabilir. Serum analizi için protokol burada sunulmuştur.

Bununla birlikte, idrar, doku ve hücre kültürü ekstraktları gibi diğer biyolojik sıvıların analizine kolayca genişletilebilir. Numune hazırlama için bir plaka haritası oluşturmak için bir elektronik tablo açın İlk sütuna, numune listesini yükleme sırasına göre girin. İkinci sütunda, otomatik örnekleyici yazılımınız için doğru terminolojiyi kullanarak 96 kuyulu plaka konumunu girin.

QC numunesi için her plakada bir kuyu ayırın. Lc otomatik örnekleyiciniz aynı anda iki plakayı işleyebiliyorsa, örnek listesini 190'lık gruplara ayırın ve bu bilgileri ikinci bir çalışma sayfasına kaydedin. Bu partilerin her birinde, enjeksiyon sırasını rastgele hale getirin.

Şimdi enjeksiyon Siparişinizi kopyalayıp LCMS örnek kuyruk yazılım sistemine yapıştırın. Örnek kuyruğunun ilk üç satırını sütun koşullandırma enjeksiyonları için ayırın. Deneyin kromatografik elüsyonunu kapsayan bilinen kütle ve alıkonma süresine sahip en az dört bileşik içeren 10 mililitrelik bir QC numunesi stoğu hazırlayın.

Serum örneklerini buz üzerinde çözdürün ve yaklaşık beş saniye boyunca hafifçe girdaplayın. Numune dağıtımı sırasında uç damlamasını önlemeye yardımcı olmak için 12 kanallı pipetleyicinin uçlarını metanol ile önceden ıslatın. Daha sonra, 96 Kuyulu plaka transferinin her bir kuyucuğuna 370 mikrolitre soğuk metanol ekleyin, her numuneden 100 mikrolitre plaka haritalarından ilgili plaka konumuna ekleyin.

Plakaları örtün ve eksi 80 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. Proteinleri çökeltmek için, plakaları 30 dakika boyunca 3, 200 G ve dört santigrat derecede santrifüjleyin. Daha sonra 250 mikrolitre süpernatanı yeni bir 96 oyuklu plakaya aktarın ve santrifüjleme adımını tekrarlayın.

Şimdi snat'ın 60 mikrolitrelik alikotlarını UPLC veya lc otomatik örnekleyici için uygun olan 3 96 oyuklu plakaya aktarın. Plaka üzerinde ayrılmış kuyucuk konumuna 100 mikrolitre QC numune karışımı ekleyin. Her plakayı yapışkan film ile kapatın.

Otomatik örnekleyiciyi dört santigrat dereceye ayarlayın. İlk iki plakayı otomatik örnekleyiciye yerleştirin. İki alternatif ters faz gradyanından birini kullanarak edinme yöntemini ayarlayın.

Gradyan A, polar olmayan moleküllere karşı önyargılıdır. Gradyan B, orta derecede polar moleküllerin daha iyi kapsama alanını sağlayacaktır. Kütle spektrometresini, 50 ila 1200 kütle şarj oranını tarayarak pozitif modda veri toplayacak şekilde ayarlayın.

Ek özel cihaz koşulları, her ikisinin başında kullanılan sisteme göre değişecektir. Numunelerin plaka yaması: QC numunelerini beş kez manuel olarak enjekte edin. Artı veya eksi 0,05 dakikalık %25'ten daha az RSD tutma süresi ve milyonda artı veya eksi üç parça kütle doğruluğu ile tepe alanını izlemek için üçüncü ila beşinci QC enjeksiyonlarını kullanın.

Bu parametrelerin, veri toplama için kullanılan cihazın özelliklerine uyacak şekilde ayarlanması gerekebilir. QC numuneleri geçerse, tüm veri setinin edinilmesi tamamlandığında bu iki plaka için serum numuneleri hakkında veri alın. Tüm veri kümesi için kütle spektrometresi verilerinin özellik algılamasını, hizalamasını ve normalizasyonunu gerçekleştirin.

Daha sonra biyolojik ilginin moleküler özelliklerini belirlemek için istatistiksel analiz yapın. Bu adımlar metin protokolünde açıklanmıştır. Aşağıdaki iş akışı, metabolit tanımlama sürecine kavramsal bir genel bakış içindedir.

Metin protokolünde alternatif bir strateji sağlanmıştır. Önemli moleküler özelliklerin doğru kütle ve izotopik dağılımından bir moleküler formülü tahmin etmek için yazılım kullanın. Ardından, kurum içi veya halka açık metabolitlere karşı doğru kütle ölçümlerini araştırın.

Veritabanları, aday metaboliti, kütle hatası tahmini moleküler formüle, alıkonma süresine, kaynak içi parçalanmaya ve deneysel tasarıma göre gözlemlenen eğilimlerdeki biyolojik alaka düzeyine göre tanımlamaları filtreler. Bu, varsayılan bir metabolit tanımlaması ile sonuçlanacaktır. Mutlak tanımlama, deneysel bileşik için doğru kütle tutma, zaman ve parçalanmanın varsayılan metabolitin otantik bir standardı ile eşleştirilmesini gerektirir.

Son olarak, metabolomik standartlar girişimi Önerilerine dayalı olarak rapor edilen tüm metabolit tanımlamalarına tanımlama güvenilirliği atayın. Bu iş akışı, U-P-L-C-M-S ile hedeflenmemiş bir metabolit profilleme deneyi gerçekleştirmenin temel analitik adımlarını gösterir. Ham veriler, bir temel tepe kromatogramı olarak görselleştirilebilir.

Bu örnek, istatistiksel analizden sonra gradyan a ile analiz edilen bir serum örneğini göstermektedir. Biyolojik olarak önemli ve istatistiksel olarak anlamlı tüm moleküler özellikler için metabolit tanımlaması yapılmaya çalışılır. Burada. Kafein, insan serumunda, deneysel moleküler özellik ile varsayılan metabolitin otantik bir standardı arasındaki kromatografik alıkonma süresi, doğru kütle ve parçalanma paterni eşleştirilerek tanımlandı.

Bu, birinci seviye metabolit tanımlamasına bir örnektir Bu videoyu izledikten sonra, UPLC ms kullanılarak serumun büyük ölçekli, hedeflenmemiş metabolit profillemesi sırasında analitik stabilitenin nasıl sağlanacağını iyi anlamalısınız. Bununla birlikte, analitik stabilite, başarılı bir metabolit profillemesinin, deneyinin yalnızca önemli bir yönüdür. Deneysel tasarım ve aşağı akış veri analizi ve yorumlaması da kritik öneme sahiptir.

Ancak bu video eğitiminin kapsamı dışında, bu konular metin protokolünde tanıtılır ve tartışılır.