Ultra Performans Sıvı Kromatografisi-Kütle Spektrometresi (UPLC-MS) ile Serum Büyük Ölçekli Sigara hedefli metabolomik Profilleme
14 Mart 2013
Kütle spektrometresi (UPLC-MS) ile birleştirilmiş ultra performanslı sıvı kromatografisi ile hedeflenmemiş metabolit profili, metabolizmayı araştırmak için güçlü bir tekniktir. Bu makale, numune organizasyonu ve hazırlama, veri toplama, veri analizi, kalite kontrol ve metabolit tanımlaması dahil olmak üzere serumun hedeflenmemiş metabolit profili için kullanılan tipik bir iş akışını özetlemektedir.
Bu prosedürün genel amacı, büyük ölçekli bir deneyde serumun sağlam, hedeflenmemiş metabolit profillemesini gerçekleştirmektir. İlk olarak, metabolitleri plaka formatında ekstrakte edin. Zaman içinde analitik stabiliteyi sağlamak için sağlam bir QC örneği ve yöntemi oluşturun.
Ardından QC ve randomize edilmiş serum örneklerinden tekrarlı olarak kütle spektral verileri elde edin; veri ön işleme, istatistiksel analiz ve metabolit tanımlama aşamalarına geçin. U-P-L-C-M-S ile yapılan hedeflenmemiş metabolit profilleme sonuçları, serumdaki küçük molekül biyobelirteçlerini tanımlamak için kullanılabilir. Bu protokol, serum analizi için burada sunulmuştur.
Bununla birlikte, yöntem kolaylıkla idrar, doku ve hücre kültürü ekstraktları gibi diğer biyolojik sıvıların analizine genişletilebilir. Numune hazırlama için bir plaka haritası oluşturmak üzere bir hesap tablosu açın. İlk sütuna, yükleme sırasına göre numune listesini girin. İkinci sütuna, otomatik örnekleyici yazılımınız için uygun isimlendirmeyi kullanarak 96 kuyucuklu plaka konumlarını girin.
Her plaka üzerinde QC örneği için bir kuyucuğu ayırın. Eğer lc otomatik örnekleyici aynı anda iki plakayı işleyebiliyorsa, örnek listesini 190'lık gruplara ayırın ve bu bilgileri ikinci bir çalışma sayfasına kaydedin. Bu grupların her birinde, enjeksiyon sırasını randomize edin.
Şimdi enjeksiyon sıranızı LCMS örnek kuyruğu yazılım sistemine kopyalayıp yapıştırın. Örnek kuyruğunun ilk üç satırını kolon koşullama enjeksiyonları için ayırın. Deneyin kromatografik elüsyonunu kapsayan, kütlesi ve tutulum süresi bilinen en az dört bileşik içeren 10 mililitrelik bir QC örneği stok çözeltisi hazırlayın.
Serum örneklerini buz üzerinde çözdürün ve yaklaşık beş saniye boyunca hafifçe vorteksleyin. Örnek dağıtımı sırasında uçtan damlamayı önlemek için 12 kanallı bir pipet ucunu metanol ile önceden ıslatın. Ardından, 96 kuyucuklu bir plaka transferinin her bir kuyucuğuna 370 µL soğuk metanol ekleyin ve plaka haritalarına göre her bir örneğin 100 µL'sini ilgili plaka konumuna aktarın.
Plakların üzerini kapatın ve -80 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin. Proteinleri çöktürmek için plakları 3.200 G'de ve 4 °C'de 30 dakika boyunca santrifüjleyin. Ardından, süpernatantın 250 µL'sini yeni bir 96 kuyucuklu plağa aktarın ve santrifüjleme adımını tekrarlayın.
Şimdi snat'tan 60 µL'lik alikotları, UPLC veya lc otomatik örnekleyiciye uygun 3 adet 96 kuyucuklu plakaya aktarın. Plakadaki ayrılmış kuyucuk konumuna 100 µL QC örnek karışımı ekleyin. Her bir plağı yapışkanlı film ile mühürleyin.
Otomatik örnekleyiciyi dört °C'ye ayarlayın. İlk iki plakayı otomatik örnekleyiciye yerleştirin. İki alternatif ters faz gradyanından birini kullanarak veri toplama yöntemini ayarlayın.
Gradyan A, apolar moleküllere yöneliktir. Gradyan B ise orta derecede polar moleküller için daha iyi bir kapsam sağlayacaktır. Kütle spektrometresini, 50 ile 1200 kütle yük oranı arasında tarama yaparak pozitif modda veri toplayacak şekilde ayarlayın.
Ek spesifik cihaz koşulları, her iki plaka örneği başlangıcında kullanılan sisteme göre değişiklik gösterecektir. QC örneklerini manuel olarak beş kez enjekte edin. Pik alanının %25 RSD'den küçük, alıkonma süresinin artı veya eksi 0,05 dakika ve kütle doğruluğunun artı veya eksi üç ppm olduğu durumları izlemek için üçüncü ile beşinci QC enjeksiyonlarını kullanın.
Bu parametrelerin, veri toplama işlemi için kullanılan cihazın özelliklerine uygun şekilde ayarlanması gerekebilir. KC örnekleri geçerse, tüm veri setinin toplama işlemi tamamlandığında bu iki plaktaki serum örnekleri için verileri toplayın. Tüm veri seti için kütle spektrometrisi verilerinin özellik tespitini, hizalamasını ve normalizasyonunu gerçekleştirin.
Ardından, biyolojik açıdan ilgi çekici moleküler özellikleri belirlemek için istatistiksel analiz gerçekleştirin. Bu adımlar metin protokolünde açıklanmıştır. Aşağıdaki iş akışı, metabolit tanımlama sürecinin kavramsal bir genel görünümündedir.
Metin protokolünde alternatif bir strateji sunulmuştur. Belirgin moleküler özelliklerin doğru kütlesi ve izotopik dağılımından bir moleküler formülle tahmin etmek için yazılım kullanın. Ardından, doğru kütle ölçümlerini kurum içi veya genel metabolit veritabanlarında aratın.
Veritabanları; kütle hatasıyla öngörülen moleküler formül, alıkonma süresi, kaynak içi fragmantasyon ve deneysel tasarıma göre gözlemlenen eğilimlerle ilgili biyolojik uygunluk kriterlerini kullanarak aday metabolitleri filtreler. Bu işlem, varsayımsal bir metabolit tanımlamasıyla sonuçlanır. Kesin tanımlama için, deneysel bileşiğin hassas kütlesi, alıkonma süresi ve fragmantasyonunun, varsayımsal metabolitin orijinal standardı ile eşleşmesi gerekir.
Son olarak, metabolomik standartlar girişimi Önerileri'ne dayanarak tüm raporlanan metabolit tanımlamalarına tanımlama güven derecesi atayın. Bu iş akışı, U-P-L-C-M-S ile hedeflenmemiş metabolit profilleme deneyinin gerçekleştirilmesindeki temel analitik adımları göstermektedir. Ham veriler, bir baz pik kromatogramı olarak görselleştirilebilir.
Bu örnek, istatistiksel analizin ardından gradyan ile analiz edilen bir serum örneğini göstermektedir. Biyolojik olarak önemli ve istatistiksel olarak anlamlı tüm moleküler özellikler için metabolit tanımlaması denenmiştir. Burada, deneysel moleküler özellik ile varsayılan metabolitin orijinal standardı arasındaki kromatografik alıkonma süresi, doğru kütle ve fragmantasyon deseni eşleştirilerek insan serumunda kafein tanımlanmıştır.
Bu, birinci seviye bir metabolit tanımlama örneğidir. Bu videoyu izledikten sonra, UPLC ms kullanılarak serumun geniş ölçekli, hedeflenmemiş metabolit profillemesi sırasında analitik stabilitenin nasıl sağlanacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Bununla birlikte, analitik stabilite, başarılı bir metabolit profilleme deneyinin yalnızca önemli bir yönüdür. Deneysel tasarım ile alt akış veri analizi ve yorumlaması da kritik öneme sahiptir.
Ancak bu video eğitimin kapsamı dışında kalan bu konular, metin protokolünde tanıtılmış ve tartışılmıştır.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, ultra performans sıvı kromatografisi ile kütle spektrometrisi (UPLC-MS) kullanılarak serumun hedef dışı metabolit profillemesi için bir protokol sunmaktadır. Örnek hazırlamadan veri analizine ve metabolit tanımlamaya kadar olan iş akışı ayrıntılı olarak açıklanmaktadır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Metabolomik
- Kütle Spektrometrisi
- Biyokimya
Arka Plan
- Hedeflenmemiş metabolit profilleme, metabolik süreçlerin anlaşılması için kritik öneme sahiptir.
- UPLC-MS, karmaşık biyolojik örneklerin analizi için yaygın olarak kullanılan bir tekniktir.
- Kalite kontrol, analitik sonuçların güvenilirliğinin sağlanması için gereklidir.
- Küçük moleküllü biyobelirteçlerin tanımlanması, çeşitli biyomedikal araştırma uygulamalarına yardımcı olabilir.
Çalışmanın Amacı
- Metabolit ekstraksiyonu ve analizi için sağlam bir yöntem oluşturmak.
- Kalite kontrol önlemleri aracılığıyla analitik stabiliteyi sağlamak.
- Serum örneklerindeki biyobelirteçlerin tanımlanmasını kolaylaştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Plaka formatında metabolitlerin ekstraksiyonu.
- Bir kalite kontrol örneğinin oluşturulması.
- QC ve randomize serum örnekleri üzerinde kütle spektral veri kazanımı.
- Metabolit tanımlama için veri ön işleme ve istatistiksel analiz.
Ana Sonuçlar
- Serum örneklerindeki metabolitlerin başarılı bir şekilde profillenmesi.
- Potansiyel küçük molekül biyobelirteçlerin tanımlanması.
- UPLC-MS yönteminin dayanıklılığının kanıtlanması.
- Serumdaki metabolik varyasyonlara dair içgörüler.
Sonuçlar
- Protokol, hedeflenmemiş metabolit profilleme için güvenilir bir çerçeve sunmaktadır.
- Kalite kontrol önlemleri, sonuçların tekrarlanabilirliğini artırır.
- UPLC-MS, serumdaki biyobelirteçlerin tanımlanmasında etkilidir.
Sıkça Sorulan Sorular
Endüstriyel Uygulama Alanları
Serumun UPLC-MS ile hedeflenmemiş metabolomik profillemesi, küçük molekül biyobelirteçlerinin tarafsız bir şekilde tespit edilmesini sağlayarak ilaç keşfinde erken evre hedef doğrulama ve mekanistik risk azaltma süreçlerini destekler. Bu yöntem, geniş ölçekli çalışmalarda istatistiksel güç için gerekli olan kantitatif ve tekrarlanabilir veriler sunarak metabolik yolak modülasyonuna dayalı devam/dur kararlarını kolaylaştırır. Bu yaklaşım, fenotipik sonuçları metabolik imzalarla ilişkilendirerek preklinik modellerdeki öngörü güvenilirliğini artırır.
Biyofarma Ar-Ge'de Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Serumdaki tarafsız metabolit tespiti aracılığıyla terapötik hipotezlerin sorgulanmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Hedef modülasyonu ile ilişkili metabolik pertürbasyonların belirlenmesi yoluyla biyolojik risk azaltma sürecini destekler.
- Öngörücü Değer: Etki mekanizmasının doğrulanması için metabolit tabanlı biyobelirteçler sağlayarak portföy önceliklendirmesini kolaylaştırır.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Bilimsel Değer: Metabolit bazal profillerini oluşturarak, onaylanmış biyolojik sistemleri sonraki tarama aşamaları için hazırlar.
- Operasyonel Değer: Titiz kalite kontrol (QC) örnek izlemesi ve rastgele örnek alımı yoluyla analiz standardizasyonunu ve tekrarlanabilirliğini sağlar.
- Ölçeklenebilirlik: Büyük örnek setleri genelinde MS verilerinin özellik tespiti, hizalanması ve normalizasyonu aracılığıyla güvenilir bileşik değerlendirmesine olanak tanır.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Translasyonel Süreklilik: Biyobelirteç tanımlama iş akışları aracılığıyla keşif aşamasındaki metabolit bulgularını preklinik doğrulamaya bağlar.
- Riski Ayarlanmış İlerleme: Metabolit değişikliklerini fenotipik sonuçlarla ilişkilendirerek bileşik ilerleme kararlarını destekler.
- Mekanistik Risk Azaltma: Raporlanan metabolitler için MSI önerileri doğrultusunda tanımlama güven derecesi atamasını zorunlu kılarak öngörücü değere odaklanır.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu yöntem, hedef etkileşimi ve yolak analizine ışık tutan metabolit verileri sağlayarak, hipotez testinden öncü bileşik tanımlamaya ve preklinik doğrulamaya kadar uzanan keşif sürecine entegre olur.
- Keşif Biyolojisi: Serumdaki istatistiksel olarak anlamlı moleküler özelliklerin saptanması yoluyla hipotez testlerini ve yolak aydınlatmasını destekler.
- Tarama: QC ve randomize serum örneklerinin tekrarlı alımları aracılığıyla assay hazır bulunuşluğu ve kantitatif çıktılar sağlar.
- Analitik: Biyolojik açıdan ilgi çekici moleküler özellikleri belirlemek için istatistiksel analiz yoluyla koşul karşılaştırmasına olanak tanır.
- Translasyonel Araştırma: Doğru kütle, tutunma süresi ve fragmantasyona dayalı metabolit tanımlama ve güven ataması aracılığıyla preklinik süreklilikle bağlantı kurar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: İş akışını, farklı terapötik alanlarda geniş ölçekli biyobelirteç keşfi için yeniden kullanılabilir bir yetkinlik olarak çerçeveler.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Tarafsız metabolit profilleme ve biyobelirteç tanımlama yoluyla öngörücü güvenilirlik.
- Operasyonel Değer: Plaka tabanlı örnek hazırlama ve QC izleme aracılığıyla standardizasyon, tekrarlanabilirlik ve ölçeklenebilirlik.
- Stratejik Değer: Erken metabolik içgörü yoluyla daha iyi devam/durdurma kararları, sermaye verimliliği ve azaltılmış geç evre biyolojik risk.
- Portföy Etkisi: Metabolit biyobelirteç panellerine dayalı, riske göre ayarlanmış önceliklendirme ve ilerletme kararları.
Uygulama Hususları
- Metabolit tanımlama için metabolomik, kütle spektrometrisi ve veri analizi konularında uzmanlık gerektirir.
- Büyük ölçekli analiz serileri ve otomatik numune işleme kapasitesine sahip UPLC-MS cihazı gereklidir.
- Tekrarlanabilirlik için numune hazırlama, randomizasyon ve QC protokollerinin ekipler arası standardizasyonunu gerektirir.
- Protokolde belirtildiği üzere, yöntemin idrar, doku veya hücre kültürü ekstraktlarına genişletilmesine yönelik adaptasyon değerlendirmelerini içerir.
- Biyolojik ve çevresel metabolik varyasyonlar nedeniyle istatistiksel güce ulaşmak için gereken yüksek numune sayıları gibi pratik sınırlamaları kapsar.
