Eşzamanlı Öncesi ve Sonrası-sinaptik Elektrofizyolojik Recording Xenopus Sinir-kas Co-kültürlerin

Bu prosedürün genel amacı, ksenopus embriyolarından sinaptik olarak eşleşmiş spinal nöronların ve kas hücrelerinin birincil kültürlerini elde etmektir. Bu, ilk olarak hem erkek hem de dişi kurbağalara atropin içinde insan koryonik enjeksiyonu ve döllenmiş yumurtaların toplanması yoluyla ksenopusta üremeyi indükleyerek gerçekleştirilir. İkinci adım, 22. evre embriyolardan jöle ceket ve fatel ve zarları çıkarmaktır.

Daha sonra, omurga nöronları ve kasları embriyolardan izole edilir ve cilt çıkarılır ve atılır. Son adım, izole edilen hücreleri kültür kaplarına yerleştirmek ve fonksiyonel nöromüsküler kavşakların oluşumuna izin vermektir. Sonuç olarak, fonksiyonel sinaptik bağlantılar, kültürdeki nöronlardan ve kas hücrelerinden eşzamanlı eşleştirilmiş yama kelepçe kayıtları ile gösterilebilir.

Bu tekniğin güzelliği, kolayca erişilebilir bir omurgalı sinaptik preparasyonu sağlamasıdır. Presinaptik iyon oluşumunu ölçerken aynı anda postsinaptik elektrofizyolojik kayıtlarla nörotransmitter salınımını izlemek için kullanılabilir. Ayrıca, yöntemler açık ve anlaşılırdır, diseksiyon mikroskobunun ötesinde özel bir ekipman gerektirmez ve bu nedenle kültürler daha sonra basit bir kültür ortamında oda sıcaklığında saklanabilir.

Bu hazırlık, sinaptik fizyoloji alanında, pre-sinaptik, biyokimyasal ve biyofiziksel olayların nörotransmitter salınımı ile nasıl birleştirildiği de dahil olmak üzere temel soruları yanıtlamada yararlı olabilir. Ek olarak, nöromodülasyon sinaptogenezi ve sinaptik plastisite çalışmaları için de yararlıdır Bu işleme başlamak için, ekteki el yazmasına göre gerekli çözeltileri hazırlayın. Ardından, bir cam hamur işi pipetinin ucuna bir minuchin pimi yapıştırarak en az iki mikro diseksiyon aleti üretin.

Sano akrilik yapıştırıcı ile, pimin keskin ucunun pipetin ucunu yaklaşık 0,5 santimetre geçmesine izin verin. Kültürleri hazırlamadan iki gün önce, dişide belirgin kırmızımsı bir pençe aika ve erkeğin ön pençelerinin düzlemsel yüzeyinde koyu pigmentasyon gözlemleyerek üremeye hazır bir XUS çiftini tanımlayın. Daha sonra her bir kurbağayı ağa bağlayın ve kaçabilmesi için ağ ile birlikte bir lavaboda ventral tarafı aşağı bakacak şekilde tutun.

Hayvanların yeni bırakılan ve döllenmiş yumurtaları çiğnememesini sağlamak için ağdan ve deri altından dorsal lenf torbalarından birine enjekte edin. Tankın altına bir ila iki inç takılı, yarım inç ağ boyutuna sahip ekranlı bir zemin döşeyin. Daha sonra üreme çiftini 10 galonluk kapalı bir su tankına yerleştirin.

Kurbağaları, ekranın altındaki zeminde döllenmiş yumurtalar görülene kadar 12 ila 48 saat boyunca rahatsız etmeyin. Daha sonra hayvanları tanktan çıkarın, ancak yumurtaları en az 24 saat daha rahatsız edilmeden bırakın. Bu kurbağa çifti altı hafta sonra yeniden yetiştirilebilir.

Daha sonra, embriyoları tankın dibinden gevşetin ve% 10 salin içeren dört veya beş adet 60 x 15 milimetre kültür kabına aktarın. Embriyoları yeni coupe şemasına göre aşama aşama sıralayın ve soldakiler gibi açık, kahverengi ve beyaz modelleme ile görünüşte pürüzsüz olan Faber embriyoları idealdir. Öte yandan, sağdaki gibi büyük siyah veya beyaz lekelere sahip embriyolar genellikle sağlıksız ve kullanılamaz durumdadır.

Laminer akışlı bir başlık etiketinin içinde ve yaklaşık yarısına kadar 360 x 15 milimetre steril kültür kabını% 10 tuzlu su ve birini CMF ile doldurun. Steril bir cam pastier pipet kullanarak, beş ila 10, evre 22 ila 24 embriyoyu, başlığın içinde bir stereo zoom diseksiyon mikroskobunun sekizi ile% 10 salin içeren tabaklardan birine aktarın, iki çift steril forseps kullanarak her embriyodan jöle kaplamayı ve viel zarını çıkarın. Çıplak embriyoları teker teker %10 tuzlu suyun kalan iki kabından geçirerek ve son olarak CMF içeren kabın içine geçirerek yıkayın.

Daha sonra, her embriyoyu bir çift forseps ile nazikçe ama sıkıca tutun ve hayvanın en dorsal tarafında bulunan nöral tüpü ve ilgili miyotomları çıkarmak için mikro diseksiyon aletini kullanın. Bunu, biri nöral tüpün bulunduğu yerin her iki ucunda ve üçüncüsü sadece ventral olmak üzere üç dilim yaparak yapın. Daha sonra, disseke edilmiş her bir nöral tüp miyotomu, yumurta sarısı granüllerinden ve diğer kalıntılardan uzakta, yemeğin temiz bir kısmına taşıyın.

CMF'de yaklaşık 15 dakika sonra, pigmentli cildi diseke edilmiş dokudan çıkarmak için forseps kullanın ve cildi atın. 30 ila 60 dakika daha sonra, hücreler birbirlerinden ayrıldıkça bir kum yığını oluşturacaktır. Bu prosedürde, 10 mililitrelik bir kültür ortamı tüpünü, ardından mililitre başına 35 nanogramda 70 mikrolitre ITS'de, BDNF etiketini çözün ve 35 milimetre steril kültür kaplarını yaklaşık yarısına kadar L 15 kültür ortamı ile doldurun.

Diseke ettiğiniz her embriyo için bir kültür kabı kullanın. Bir kaplama pipeti imal etmek için, bir cam macun pipetinin her iki ucunu tutun ve konik kısmı bir alevin üzerine yerleştirin. Ardından uçları yaklaşık 10 santimetreye kadar ayırın.

Daha sonra, yaklaşık 0,2 milimetrelik bir uca ulaşmak için ucu kırın. Daha sonra, bir embriyodan kum yığınını emmek için kaplama pipetini kullanın. Çekilen çözelti miktarını en aza indirmeye dikkat edin.

Daha sonra, hücreleri bir kültür kabının dibine boşaltın ve birkaç satır halinde kaplayın. Daha sonra, hücrelerin tabağa yapışması için zaman tanımak için kaplanmış hücrelerin tabaklarını en az 15 dakika boyunca rahatsız edilmeden bırakın. Kültürde 12 ila 24 saat sonra, kaplanmış hücreler farklı morfolojik özellikler geliştirecektir.

Örneğin, kas hücreleri iğ şeklinde olur ve omurga nöronları uzun süreçler geliştirir. Ürat, varisler ve kas hücreleri arasındaki fonksiyonel sinaptik temas, eş zamanlı eşleştirilmiş elektrofizyolojik kayıtlarla doğrulanabilir. Bunu yapmak için, kayıt için iki yama elektrotu hazırlayın, biri presinaptik varisite için ve diğeri kas hücresi için.

Daha sonra presinaptik elektrodu info terin içeren çözelti ve post-sinaptik elektrodu potasyum iç çözeltisi ile doldurun. Bundan sonra, kültür kabındaki ortamı NFR ile değiştirin. Daha sonra, yüz kontrast optiklerle donatılmış ters çevrilmiş bir mikroskoba aktarın, sinapsın işlevselliğini doğrulamak için presinaptik varissiteyi amfoterisin içeren elektrotla ve post-sinaptik kas hücresini diğer elektrotla yamalayın, varisliği bir yama kelepçe amplifikatörü ile depolarize edin ve eşzamanlı presinaptik ve postsinaptik akımları gözlemleyin.

Bu şekil, kaplamadan hemen sonra hücrelerin ve kültürün beş x güç görünümünü göstermektedir ve bu, 40 x'te aynı kültürdür. İşte kültürdeki nöromüsküler kavşak, nöronal soma, presinaptik, varis ve postsinaptik kas hücresini gösterir. Burada presinaptik ve postsinaptik akımlar gösterilmiştir.

Eksi 30 milivolttan artı 40 milivolta kadar presinaptik varissiteye sunulan 10 milivoltluk artımlı voltaj adımlarının uygulanmasına yanıt olarak, her iki hücre için tutma potansiyeli eksi 70 milivolt idi. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik yaklaşık iki saat içinde tamamlanabilir. Canlı hücre kültürleri daha sonra 24 saat gibi kısa bir sürede elde edilebilir ve birkaç gün boyunca korunabilir. Bu preparat zaten birkaç yıldır kullanılmaktadır ve nöromüsküler iletimin bazı temel özelliklerini açıklamaya yardımcı olmaktadır.

Bu videonun, araştırmacıların bu güçlü ve basit tekniğe daha aşina olmalarına yardımcı olarak keşfin devamına izin vereceğini umuyoruz.