Name: Eşzamanlı Öncesi ve Sonrası-sinaptik Elektrofizyolojik Recording Xenopus Sinir-kas Co-kültürlerin (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-11T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 13 s
Description: Öğrenin Xenopus embriyolarından sinir-kas ko-kültürleri hazırlayarak eşzamanlı ön ve son sinaptik elektrofizyolojik kayıt yapmayı. Bu yöntem sinaptik fizyoloji ve nöromodülasyon çalışmaları için değerlidir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

NSF (0854551) tarafından finanse edilmiştir.

1. Ön-deneysel Hazırlama <ol><li> Aşağıdaki çözeltiler (kompozisyonlar için bakınız Tablo 1) hazırlanması: (a) 1 litre NFR (Normal Kurbağa Ringer), (b) ve 100 ml% 10 salin, (c) ve 100 ml CMF (Ca2 + / Mg2 +-serbest çözelti ), (d) 1 ml ITS (insülin transferin selenyum-, Sigma I1884), (e) ve 100 ml L-15 kültür ortamı, (f) 10 ml HCG (insan koryonik gonadotropin Sigma CG-10), (g) 100 ml K +-iç çözüm, çözüm 1 osmotik gücü bir buhar basıncı Osmometer (örn. Wescor model # 5100C) kullanarak yaklaşık 260 mOsm olduğundan emin olmak için kontrol edilmelidir Amfoterisin B (h) 100 ml K +-iç çözüm . </li><li> (B) çözümleri sterilize filtreleyin ve (c). Solutions (a) (b) ve (c) 4 ° C&#39;de üç aya kadar saklanabilir Bir 25 gauge iğne şırınga ve şırınga filtresi üzerinden liyofilize toz içeren şişe 1 ml deiyonize H2O ilave edilerek çözelti (d) hazırlayın. Bu nihai çözüm cBir 30 gün boyunca 4 ° C&#39;de saklanabilir. </li><li> Bir kabı veya şişesi tüm bileşenleri bir araya getirerek bir laminer akış kaputu çözeltisi (e) hazırlayın. Nihai çözüm sterilize ve steril santrifüj tüpleri içine 10 ml alikotları aktarmak filtreleyin. -20 ° C&#39;de saklayın </li><li> 25 gauge şırınga, iğne ve şırınga filtresi ile liyofilize toz içeren flakon H 2 0 deiyonize 10 ml ekleyerek HCG (çözüm (f)) hazırlayın. Bu, nihai çözelti 30 gün boyunca 4 ° C &#39;de muhafaza edilebilir. </li><li> Tutkallama siyanoakrilat yapıştırıcı ile cam bir Pasteur pipeti ucuna bir Minutien pim (26002-10, İnce Science araçları) ile en az iki mikrodisseksiyon araç imal. Pipet yaklaşık 0.5 cm sonunun uzatmak piminin sivri ucunu ver. </li><li> Hazırlama kültürleri İki gün önce, aşağıdaki prosedür ile üreme neden. Düzlemsel su üzerinde kadın ve koyu pigmentasyon göze çarpan, kırmızımsı kloaka gözlemleyerek Xenopus bir üreme hazır çifti tanımlayınerkek ön pençeleri rface. Kaçamayacağım böylece bir zaman, net her kurbağa Tek ve net bir lavabo üzerine ventral tarafında basılı tutun. Dorsal lenf keseler net ve deri altından içine biri ile çözeltinin 1 mL&#39;si (f) enjekte edilir. </li><li> Su ve bir kapalı on galon tank içinde bir arada üreme çifti yerleştirin. Hayvanların yeni koydu ve döllenmiş yumurta trample olmayacak emin olmak için, yaklaşık bir örgü boyutu ½ tankın alt (Şekil 1A) Yukarıdaki &quot;takılı yaklaşık 1-2 inç ekranlı bir zemin yüklemek. </li><li> Hayvanlar amplexus olan ve döllenmiş yumurta ekranının altındaki kat (Şekil 1B) gözlemlendi kadar 12-48 saat boyunca bozulmadan kurbağaları bırakın. </li><li> Tankından hayvanlar çıkarın, ama daha uzun en azından 24 saat için yumurta rahatsız bırakın. Kurbağa bu çifti altı hafta sonra yeniden yetiştirilen olabilir. </li><li> Tankın dibinden embriyolar gevşetin ve dört ya da beş 60X15 mm kült aktarabilirsiniz% 10 tuzlu su (çözüm b) içeren ure yemekleri. Niewkoop ve Faber (ref. 20) şemasına göre evre tarafından embriyolar sıralayın. Faydalı embriyo aşamasında 22-24 az olanlar olacaktır. Şekil 2B (yaklaşık aşamada 28) yararlı olduğu gelişme boyunca çok uzak bir embriyo gösterirken Şekil 2A yaklaşık aşamada 22 embriyo gösterir. Bu sağlıklı embriyolar seçmek önemlidir: açık kahverengi ve beyaz beneklenme ile görünüşte düzgün olanları idealdir. Büyük siyah ya da beyaz lekeler var Embriyolar genellikle sağlıksız ve kullanışsız. </li></ol> 2. Xenopus Embryolarının Mikrodisseksiyon <ol><li> Bir laminer akış kaputu, etiket içinde ve yaklaşık yarım üç 60X15 mm steril kültür% 10 tuzlu yemekleri ile doldurun ve CMF ile bir. </li><li> % 10 tuzlu su içeren yemekler birine steril, cam Pasteur pipeti transferi 09:55 aşamada 22-24 embriyo kullanma. Bir stereo zoom yardımıyla teşrih ilekaput içinde ing mikroskobu (10 x oküler ile 0.6-5x), steril # 5 forseps (11251-30, Güzel Bilim Araçları) iki çift kullanarak her embriyodan jöle ceket ve vitellin membran kaldırmak. (Şekil 3A ve 3B, bakınız.) </li><li> % 10 salin kalan iki yemekleri ile ve nihayet CMF içeren yemeğin içine, bir defada bir ileterek çıplak embriyolar yıkayın. Her transfer için yeni bir steril pipet kullanın ve çanak çanak transfer çözeltisinin hacmi en aza indirmek. </li><li> Buna karşılık, adım 1.5 sitemliyiz mikrodiseksiyon aracını kullanarak, forseps bir çift ile nazikçe ama sıkıca her embriyonun tutun ve nöral tüp ve hayvanın en dorsalinde yer almaktadır ilişkili Miyotom kaldırın. Üç dilim, nöral tüp konumu ve (Şekil 4A) için üçüncü sadece ventral iki ucundan birini yaparak bunu yapın. Uzaklıkta sarısı granül gelen çanak temiz bir parçası her disseke nöral tüp / myotome Taşıes ve diğer enkaz (Şekil 4B). Dorsal-ventral eksen, ve nöral tüp ve miyotomlarında ve konumları Şekil 4 içinde gösterilmektedir. </li><li> Bu çözüm yaklaşık on beş dakika sonra (CMF) kullanımı forseps disseke doku serbest pigmente deri kaldırın ve atmak. Birbirlerine (Şekil 4C) ayrışmış hale olarak bir ilave 30-60 dakika sonra, hücreler, bir &quot;kum yığını&quot; oluşturacak. </li></ol> 3. Sinir-kas Co-kültürlerin hazırlanması <ol><li> Kültür ortamı bir 10 ml tüp çözülme ve aseptik 70 ul ekleyin ITS ve 35 ng / ml &#39;BDNF (Sigma B3795). </li><li> Etiket ve steril 35 mm kültür kaplarına (FD35-100 Dünya Hassas Aletler) yaklaşık yarım L-15 kültür ortamı (çözüm (e)), disseke her bir embriyo için biri ile doldurun. </li><li> Bir alev üzerinde şevli kısım tutulurken, bir cam Pasteur pipeti her iki ucunda tutarak bir kaplama pipet imal. Yaklaşık 1 ila uçlarında ayrı çek0 cm ve daha sonra yaklaşık 0.2 &#39;lik bir uç elde etmek için son kopar. </li><li> Çizilmiş çözüm miktarını minimize tek embriyo &quot;kum yığını&quot; yalakalık kaplama pipet kullanın. Bir kültür çanağı alt üzerine hücreleri Expel. Birkaç satır içine Levha hücreleri. Kaplama farklılaşmamış hücreler (Şekil 5A ve 5B) uyun. </li><li> Hücreler zaman çanak takmak için izin vermek için en az on beş dakika boyunca rahatsız edilmeden kaplı hücreler bulaşık bırakın. </li></ol> 4. Patch Sıkma Sinir-kas Sinapslar <ol><li> Kas hücreleri iğ şeklinde olur ve spinal nöronlar uzun süreçler (Şekil 6) uzatmak: kültüründe 12-24 saat sonra, kaplama hücreleri belirgin morfolojik özellikleri üzerine alır. Nörit varisler ve kas hücreleri arasındaki fonksiyonel sinaptik iletişim simultane eşleştirilmiş elektrofizyolojik kayıtlar ile teyit edilebilir. &quot;M&quot;, &quot;S&quot; ve &quot;V&quot; nöronal, kas hücresi sırasıyla bakınsoma ve presinaptik varisler. </li><li> Presinaptik varisler için ve kas hücresi için bir: Kayıt için iki yama elektrot hazırlayın. </li><li> Presinaptik elektrot için, aşağıdaki gibi bir amfoterisin B içeren çözeltinin hazırlanması: 5 mg amfoterisin B (Sigma A4888) ihtiva eden 1.5 ml mikrosantrifüj tüpüne 100 ul DMSO ekleyin. 10 sn vorteksleyin bu çözüm. Sonraki, Amfoterisin B (çözüm (h)) için +-iç çözüm 625 ul K içeren ikinci bir mikrosantrifüj tüpüne bu çözeltinin 10 ul ekleyin. Yukarıdaki gibi Vortex. </li><li> Amfoterisin B ihtiva eden K basamak 4.3 &#39;de hazırlanmış +-iç çözelti ile K +-iç çözeltisi (çözeltisi (g)) ile birlikte post-sinaptik elektrot ile pre-sinaptik elektrot doldurun. </li><li> NFR ile kültür çanak medya değiştirin ve faz kontrast optik ile donatılmış bir inverted mikroskop gittiğinizde. </li><li> Sadece kendi hedeflerinin üzerinde her iki elektrot yerleştirin. Tüm-hücre eş edininvarisler elektrot ile delikli yama yapılandırma önce kas hücresi elektrot ile nfiguration. </li><li> Sinaps işlevselliğini doğrulamak için, yazılım denetimi altında (örn. Axopatch 200B, Moleküler Cihazlar) bir yama kelepçe amplifikatör ile varisler depolarize (pCLAMP 9, Molecular Devices örneğin) ve eşzamanlı presinaptik ve postsinaptik akımları gözlemlemek. Şekil 7 görülen akımlar gösterilir +40 mV&#39;ye -30 mV 10 mV artışlarla presinaptik varis verilen gerilimi adımlar depolarize yanıt olarak. Presinaptik hücre görülen içe akımları Na + ve Ca 2 + ve K + ile dış akımlar tarafından yürütülmektedir. Postsinaptik akımlar hücre içinde kaydedilmiş varis serbest nörotransmitter yanıtları vardır ve nikotinik asetilkolin reseptörü kanallar vasıtasıyla Na + tarafından çoğunlukla taşınmaktadır. </li></ol>

<ol><li>Augustine, G. J., Eckert, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Divalent+cations+differentially+support+transmitter+release+at+the+squid+giant+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Divalent cations differentially support transmitter release at the squid giant synapse.</a> J. Physiol. 346, 257-271 (1984).</li>
<li>Spitzer, N. C., Lamborghini, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+the+action+potential+mechanism+of+amphibian+neurons+isolated+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">The development of the action potential mechanism of amphibian neurons isolated in culture.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 73, 1641(1976).</li>
<li>Weldon, P. R., Cohen, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+synaptic+ultrastructure+at+neuromuscular+contacts+in+an+amphibian+cell+culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurocytol%22%5BJournal%5D)">Development of synaptic ultrastructure at neuromuscular contacts in an amphibian cell culture system.</a> J. Neurocytol. 8, 239-259 (1979).</li>
<li>Tabti, N., Poo, M. -M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTabti%2C+N+%22Culturing+Nerve+Cells%22">Culturing Nerve Cells</a>. Banker, G., Goslin, K. , MIT Press. Cambridge, Massachusetts. 137-153 (1991).</li>
<li>Yazejian, B., DiGregorio, D. A., Vergara, J. L., Poage, R. E., Meriney, S. D., Grinnell, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+measurements+of+presynaptic+calcium+and+calcium-activated+potassium+currents+regulating+neurotransmitter+release+at+cultured+Xenopus+nerve-muscle+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Direct measurements of presynaptic calcium and calcium-activated potassium currents regulating neurotransmitter release at cultured Xenopus nerve-muscle synapses.</a> J. Neurosci. 17, 2990(1997).</li>
<li>DiGregorio, D. A., Peskoff, A., Vergara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+action+potential-induced+presynaptic+calcium+domains+at+a+cultured+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Measurement of action potential-induced presynaptic calcium domains at a cultured neuromuscular junction.</a> J. Neurosci. 19, 7846(1999).</li>
<li>Yazejian, B., Sun, X. P., Grinnell, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+presynaptic+Ca2%2B+dynamics+during+neurotransmitter+release+with+Ca2%2B-activated+K%2B+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Tracking presynaptic Ca2+ dynamics during neurotransmitter release with Ca2+-activated K+ channels.</a> Nat. Neurosci. 3, 566(2000).</li>
<li>Sun, X. P., Chen, B. M., Sand, O., Kidokoro, Y., Grinnell, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depolarization-induced+Ca2%2B+entry+preferentially+evokes+release+of+large+quanta+in+the+developing+Xenopus+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Depolarization-induced Ca2+ entry preferentially evokes release of large quanta in the developing Xenopus neuromuscular junction.</a> J. Neurophysiol. 104 (5), 2730-2740 (2010).</li>
<li>Xie, S. P., Poo, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+events+in+the+formation+of+neuromuscular+synapse%3A+rapid+induction+of+acetylcholine+release+from+embryonic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Initial events in the formation of neuromuscular synapse: rapid induction of acetylcholine release from embryonic neurons.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 7069(1986).</li>
<li>Li, P. P., Chen, C., Lee, C. W., Madhavan, R., Peng, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+filopodial+asymmetry+induced+by+synaptic+target%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Axonal filopodial asymmetry induced by synaptic target.</a> Mol. Biol Cell. 22 (14), 2480-2490 (2011).</li>
<li>Feng, Z., Ko, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schwann+cells+promote+synaptogenesis+at+the+neuromuscular+junction+via+transforming+growth+factor-beta1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Schwann cells promote synaptogenesis at the neuromuscular junction via transforming growth factor-beta1.</a> J. Neurosci. 28 (39), 9599-9609 (2008).</li>
<li>Song, H. J., Ming, G. L., Poo, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cAMP-induced+switching+in+turning+direction+of+nerve+growth+cones%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">cAMP-induced switching in turning direction of nerve growth cones.</a> Nature. 17 (6639), 275-279 (1997).</li>
<li>Morimoto, T., Wang, X. H., Poo, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+synaptotagmin+modulates+short-term+synaptic+plasticity+at+developing+neuromuscular+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Overexpression of synaptotagmin modulates short-term synaptic plasticity at developing neuromuscular junctions.</a> Neuroscience. 82 (4), 969-978 (1998).</li>
<li>Lu, B., Czernik, A. J., Popov, S., Wang, T., Poo, M. M., Greengard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+synapsin+I+correlates+with+maturation+of+the+neuromuscular+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Expression of synapsin I correlates with maturation of the neuromuscular synapse.</a> Neuroscience. 74 (4), 1087-1097 (1996).</li>
<li>Schaeffer, E., Alder, J., Greengard, P., Poo, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synapsin+IIa+accelerates+functional+development+of+neuromuscular+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Synapsin IIa accelerates functional development of neuromuscular synapses.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 26 (9), 3882-3886 (1994).</li>
<li>Liou, J. C., Tsai, F. Z., Ho, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potentiation+of+quantal+secretion+by+insulin-like+growth+factor-1+at+developing+motoneurons+in+Xenopus+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Potentiation of quantal secretion by insulin-like growth factor-1 at developing motoneurons in Xenopus cell culture.</a> J. Physiol. 553 (Pt. 3), 719-7128 (2003).</li>
<li>Peng, H. B., Yang, J. F., Dai, Z., Lee, C. W., Hung, H. W., Feng, Z. H., Ko, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+neurotrophins+and+schwann+cell-derived+signals+on+neuronal+survival%2Fgrowth+and+synaptogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Differential effects of neurotrophins and schwann cell-derived signals on neuronal survival/growth and synaptogenesis.</a> J. Neurosci. 23 (12), 5050-5060 (2003).</li>
<li>Dan, Y., Poo, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hebbian+depression+of+isolated+neuromuscular+synapses+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Hebbian depression of isolated neuromuscular synapses in vitro.</a> Science. 12 (5063), 1570-1573 (1992).</li>
<li>Xiao, Q., Xu, L., Spitzer, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target-dependent+regulation+of+neurotransmitter+specification+and+embryonic+neuronal+calcium+spike+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Target-dependent regulation of neurotransmitter specification and embryonic neuronal calcium spike activity.</a> J. Neurosci. 30 (16), 5792-5801 (2010).</li>
<li>Niewkoop, P. D., Faber, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNiewkoop%2C+PD+%22Normal+table+of+Xenopus+laevis+%28Daudin%29%22">Normal table of Xenopus laevis (Daudin)</a>. , North-Holland, Amsterdam. (1967).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Motonöronlar ve kas hücrelerinin Başarılı co-kültür Key adımları uygun Xenopus kurbağaların indüklenen üreme üretilen embriyolar sahnelenen kullanımı ve farklılaşmamış spinal nöronlar ve iskelet hücreleri dikkatli aseptik diseksiyonu vardır. Er sık ​​onların gelişimi onları durdurur hareket gibi onlar yaklaşık 10 ya da öylesine aşamasına ulaşıncaya kadar Döllenen yumurtalar, bozulmamış bırakılmalıdır. Sağlıklı embriyoların pürüzsüz bir görünüm ve kahverengi ve beyaz benekli boyama ile tanımlanır. Bu miyositlerin önemli ölçüde farklılaştığını sadece nöral tüp kapanır sonra ve öncesinde geliştirme sırasında noktasıdır, çünkü Evre 22-24 embriyoların çok yararlıdır. Buna ek olarak, daha yaşlı edilen hücrelerden CMF iyi ayrıştırmak için başarısız. Bu embriyo kuvvetle yapışır gibi vitellin membran sökerken dikkat edilmelidir. Embriyonun bozulmadan ortaya böylece membran keskin forseps kullanarak parçalandı edilmelidir. Bir başka önemli precaution kültür çanak (yerine onları oraya yerleşmek icar fazla) alt üzerine hücreler dikkatle yerleştirmektir. Bu hücrelerin kültür çanak uyulması yönündeki olasılığını artırır gibi bu yöntem tercih edilir. Sinir ve kas arasındaki Fonksiyonel nörotransmisyonu sadece postsinaptik kaydı ile tespit edilebilir ve sık sık innervasyon sonra spontan kas kasılması gözlem tarafından tespit edilebilir. Un-innerve kas hücreleri kültür içinde seğirme yoktur. Yalnız postsinaptik kayıt minyatür son plak akımları ya da potansiyelleri ancak uyarılmış boşalma ölçümleri öncesi ve postsinaptik akımların presinaptik uyarımı ve korelasyon patch-klemp çift gerektirir gerektirir kayıt için yararlıdır. Burada açıklanan paired-yama kayıt yöntemi yanısıra, bu hazırlık Bu sayede nöronal soma 5 üçüncü bir pipet tanıtma fırsatı sunan bir aksiyon potansiyeli tha nesilt presinaptik varisler yaymak ve nörotransmitter salınımına yol açabilir. Buna ek olarak, arabuluculuk düşünce veya sinaptik iletimi modüle edilir olası ajanlar sinaps iki tarafına da tanıttı olabilir: kas hücresi pipet aracılığıyla veya soma yerleştirilmiş üçüncü bir pipetle difüzyon yoluyla.

<table border="1"><tbody><tr><td> Ekipman / Malzemeleri </td><td> Satıcı </td><td> Katalog / Model Numarası </td><td></td></tr><tr><td> İnsülin-Transferrin-Selenyum </td><td> Sigma </td><td> I1884 </td><td></td></tr><tr><td> İnsan koryonik gonadotropin </td><td> Sigma </td><td> CG-10 </td><td></td></tr><tr><td> Buhar Basıncı Ozmometre </td><td> Wescor </td><td> 5100C </td><td></td></tr><tr><td> Minutien Pins </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 26002-10 </td><td></td></tr><tr><td> Amfoterisin B </td><td> Sigma </td><td> A4888 </td><td></td></tr><tr><td> Forseps </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 11251-30 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1"><tbody><tr><td> Çözüm Adı </td><td> Yemek tarifi </td></tr><tr><td> (A) NFR (Normal Kurbağa Ringer (mM) </td><td> 116 NaCl, 2 KCl, 1.8 CaCl2, 5 Na-HEPES, pH 7.35. </td></tr><tr><td> (B)% 10 salin </td><td> 10 ml NFR +90 ml H2O deiyonize </td></tr><tr><td> (C) CMF (Ca2 + / Mg2 +-serbest çözelti) </td><td> 125 NaCl, 2 KCl, 1.2 EDTA, 5 Na +-HEPES, pH 7.35. </td></tr><tr><td> (E) L-15 Kültür ortamı </td><td> 50 ml L-15 ortamı (Sigma L1518) + 50 ml NFR. </td></tr><tr><td> (G) K +-iç solüsyonu (mM cinsinden) </td><td> 116 KCl, 1 NaCl, 1 MgCl2, 10 EGTA, 5 HEPES, pH 7.3 </td></tr><tr><td> Amfoterisin B (h) K +-iç solüsyonu (mM cinsinden) </td><td> 52 K 2 SO 4, 38 KCl, 1 EGTA, 5 HEPES, pH 7.3 </td></tr></tbody></table></td></tr></tbody></table> Table 1.

eşzamanlı Öncesi ve sonrası-sinaptik elektrofizyolojik recording<em&gt; xenopus</em&gt; sinir-kas co-kültürlerin

Simultaneous Pre- and Post-synaptic Electrophysiological Recording from Xenopus Nerve-muscle Co-cultures

Nörotransmitter serbest bırakılması ile presinaptik iyonik akımların kaplin hakkında çok bilgi en önemlisi omurgasız hazırlıkları, kalamar dev sinaps 1 elde edilmiştir. Bununla birlikte, hazırlama hariç burada açıklandığı gibi, az omurgalı preparatlar bu nörotransmitter serbest ve presinaptik iyonik akımlarının eşzamanlı ölçümler yapmak mümkündür ki içinde bulunmaktadır. (Dek 12-24 saat içinde işlevsel sinaps oluşturacak ve birkaç gün boyunca sinir ve kas hücre gelişimi ve sinaptik etkileşimleri çalışmak için de kullanılabilir; Embriyonik Xenopus motor nöronlar ve kas hücreleri oda sıcaklığında basit bir kültür ortamı içinde yetiştirilen bir arada büyümesi) oluşur. Diğer omurgalı preparatlar içinde bu ko-kültürler bazı avantajları hazırlama kolaylığı, oda sıcaklığında kültürleri ve çalışma muhafaza etme özelliğine sahiptir, ve 2 oluşturduğu sinaps hazır erişilebilirlik-4. Hazırlık presinaptik iyon kanalları ve verici sürümü 5-8 yönetmeliğin biyofiziksel özelliklerini incelemek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Buna ek olarak, hazırlık 9-12 akson uzantısı ve sinaptogenez çalışma, nörotransmitter salınımını 13-15, nöromodülasyon 16,17 içinde difüze haberciler rolünü moleküler mekanizmaları ve in vitro sinaptik plastisite 18 de dahil olmak üzere diğer kullanımlar için kendini vermiştir - 19.

Şekil 4B hemen 22 Xenopus embriyosunun. Şekil 4C olduğunu, Ca 2 +-Mg 2 + ücretsiz bir çözüm cilt kaldırma ve inkübasyon (CMF, çözümden sonra (gösteren bir sahne alanından çıkarılmasını sonrası kordon / myotome izole spinal dorsal görünümü gösterir c)), hücreleri bir &quot;kum yığını&quot; içine ayrışır ve kaplama için hazır. Kültür ortamı hücreleri içine kaplama biraz morfolojik değişkenliği (Şekil 5B) gösterirler ancak kültür yirmi dört saat sonra farklı şekiller almaktadırlar hemen sonra. Nöronlar uzanan neurites iken küresel kalırken kas hücreleri iğ şeklinde haline kas hücreleri ile sinaps (Şekil 6) de ayrıntılı variköz. Varis presinaptik ve postsinaptik kas hücresi (Şekil 7) aynı anda eşleştirilmiş yama kayıt nörotransmiterin salınışı ve resulta ile ilişkili presinaptik içe ve dışa doğru akımlar ortaya koymaktadırnt postsinaptik akımlar eksitatör. <img src="/files/ftp_upload/50253/50253fig1.jpg" alt="Şekil 1"/> Şekil 1 A:.. Ekranda tepesinde çiftleşme kova kurbağa Damızlık çifti B: döllenmiş yumurta ile amplexus kurbağalar. <img src="/files/ftp_upload/50253/50253fig2.jpg" alt="Şekil 2,"/> Şekil 2 A:.. &quot;Uygun&quot; aşaması 22 embriyo B: &quot;uygunsuz&quot; aşaması 28 embriyo. Ölçek çubuğu 1 mm temsil eder. <img src="/files/ftp_upload/50253/50253fig3.jpg" alt="Şekil 3"/> Şekil 3 A:. Aşama 22 embriyo vitellin membran ve jöle kat temizlenmeden önce. Ok jöle kat dış kenarına işaret. Vitellin membran embr yakından yapışıryo ve neredeyse görünmez B:. Bare embriyo. Ölçek çubuğu 1 mm temsil eder. <img src="/files/ftp_upload/50253/50253fig4.jpg" alt="Şekil 4,"/> Şekil 4 A: to-be disseke B kısmı gösteren kesikli çizgi ile Sahne 22 embriyo:.. Embriyonun Akut izole dorsal kısmı; &quot;d&quot; ve &quot;v&quot; embriyoların dorsal ve ventral yönlerini bakın, ise &quot;m&quot; ve &quot;n&quot; mytomes ve nöral tüp yaklaşık konumları belirtin C:. CMF 60 dk sonra hücrelerin &quot;Kum yığını&quot;. Ölçek çubuğu A için 1 mm ve B ve C için 0.5 mm temsil eder. <img src="/files/ftp_upload/50253/50253fig5.jpg" alt="Şekil 5,"/> Şekil 5 A:. Hemen sonra kaplama kültürdeki hücre 5x güç görünümü. B: 40x de aynı kültür. Ölçekçubuğu A için 40 mikron ve B için 5 mikron temsil <img src="/files/ftp_upload/50253/50253fig6.jpg" alt="Şekil 6"/> Şekil 6. Nöronal soma (S), presinaptik varisler (V) ve postsinaptik kas hücresi (M) kimlik ile kültür Nöromusküler kavşak. Ölçek çubuğu: 5 mm. <img src="/files/ftp_upload/50253/50253fig7.jpg" alt="Şekil 7" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50253/50253fig7highres.jpg"/> 10 mV artan voltaj uygulaması yanıt olarak görüldü Şekil 7. Presinaptik (üst) ve postsinaptik (alt) akımları -30 mV dan +40 mV presinaptik varisler sunulan adımları. Gerilim adımlar presinaptik izleri bazı yanında gösterilir. Hem hücreler için tutma potansiyeli -70 mV idi.

Bu video embriyonik primer kültürlerinde büyümek için kullanılan prosedürleri gösterir<em&gt; Xenopus</em&gt; Sinir ve kas hücreleri ve eşzamanlı öncesi ve post-sinaptik yama kelepçe kayıt yapmak için bu hazırlık kullanışlılığı.

Eşzamanlı Öncesi ve Sonrası-sinaptik Elektrofizyolojik Recording<em&gt; Xenopus</em&gt; Sinir-kas Co-kültürlerin

Much information about the coupling of  presynaptic ionic currents with the release of neurotransmitter has been obtained  from invertebrate preparations, ...

Bu prosedürün genel amacı, xenopus embriyolarından sinaptik olarak kenetlenmiş spinal nöronların ve kas hücrelerinin primer kültürlerini elde etmektir. Bu işlem, öncelikle hem erkek hem de dişi kurbağalara human chorionic gonadotropin enjekte edilerek xenopuslarda çiftleşmenin tetiklenmesi ve döllenmiş yumurtaların toplanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, evre 22 embriyolardan jöle tabakasının, vitellüs zarının ve membranların uzaklaştırılmasıdır.Ardından, embriyolardan spinal nöronlar ve kaslar izole edilir, deri ise çıkarılıp atılır. Son adım, izole edilen hücrelerin kültür kaplarına ekilmesi ve fonksiyonel nöromüsküler kavşakların oluşmasına izin verilmesidir. Nihayetinde, kültürdeki nöronlardan ve kas hücrelerinden eş zamanlı çift yama kenetleme (paired patch clamp) kayıtları alınarak fonksiyonel sinaptik bağlantılar gösterilebilir.Bu tekniğin güzelliği, kolayca erişilebilir bir omurgalı sinaptik preparat sağlamasıdır. Presinaptik iyon oluşumunu ölçerken aynı zamanda postsinaptik elektrofizyolojik kayıtlarla nörotransmitter salınımını izlemek için kullanılabilir. Ayrıca yöntemler açık ve yalındır; diseksiyon mikroskobu dışında özel bir ekipman gerektirmez ve böylece kültürler, basit bir kültür ortamında oda sıcaklığında saklanabilir.Bu hazırlık, presinaptik, biyokimyasal ve biyofiziksel olayların nörotransmitter salınımıyla nasıl eşleştiği dahil olmak üzere, sinaptik fizyoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasında yararlı olabilir. Ayrıca, nöromodülasyon, sinaptogenez ve sinaptik plastisite çalışmaları için de faydalıdır. Bu prosedüre başlamak için, beraberindeki makaleye göre gerekli çözeltileri hazırlayın. Ardından, bir minuchin pini bir cam pastier pipetinin ucuna yapıştırarak en az iki mikro diseksiyon aracı hazırlayın.Sano akrilik yapıştırıcı kullanarak, pimin sivri ucunun pipetin sonundan yaklaşık 0,5 santimetre dışarı çıkmasını sağlayın. Kültürleri hazırlamadan iki gün önce, dişide belirgin kırmızımsı bir pençe aika'sı ve erkeğin ön ayaklarının düz yüzeyinde koyu pigmentasyon gözlemleyerek üremeye hazır bir XUS çiftini belirleyin. Ardından, her bir kurbağayı ağ ile yakalayın ve kurbağanın kaçabilmesi için ağ ile birlikte bir evyenin içinde karın üstü gelecek şekilde tutun.Hayvanların yeni yumurtlanmış ve döllemiş yumurtaları ezmemesini sağlamak için, ağ üzerinden ve sırt lenf keselerinden birine deri altına bir mililitre HCG enjekte edin. Tankın tabanına, alttan bir ila iki inç mesafede yerleştirilmiş, yarım inç gözenek boyutuna sahip tel örgü bir taban kurun. Ardından, üretim çiftini beraberce kapalı, 10 galonluk bir su tankına yerleştirin.Döllenmiş yumurtalar süzgeç altındaki tabanda gözlemlenene kadar kurbağaları 12 ila 48 saat boyunca rahatsız etmeyin. Daha sonra hayvanları tanktan çıkarın ancak yumurtaları en az 24 saat daha rahatsız etmeden bırakın. Bu kurbağa çifti altı hafta sonra tekrar çiftleştirilebilir.Ardından, embriyoları tankın tabanından ayırın ve %10 tuzlu su içeren dört veya beş adet 60 x 15 milimetrelik kültür kabına aktarın. Embriyoları New Coupe ve Faber şemasına göre evrelerine ayırın; soldakiler gibi açık kahverengi ve beyaz tonlarda, pürüzsüz görünümlü embriyolar idealdir. Öte yandan, sağdakiler gibi büyük siyah veya beyaz lekeleri olan embriyolar genellikle sağlıksızdır ve kullanılamaz.Laminar akışlı kabin içerisinde, 360 x 15 mm'lik steril kültür kaplarının yaklaşık yarısını %10 tuzlu solüsyonla, bir tanesini ise CMF ile doldurup etiketleyin. Steril bir cam pastör pipeti kullanarak, 22 ile 24. evredeki beş ila 10 embriyoyu %10 tuzlu solüsyon içeren kaplardan birine aktarın. Kabin içindeki bir stereo zoom diseksiyon mikroskobunun yardımıyla, iki çift steril pens kullanarak her bir embriyonun jöle tabakasını ve vitellin membranını temizleyin. Çıplak embriyoları, kalan iki %10 tuzlu solüsyon kabından sırayla geçirerek yıkayın ve son olarak CMF içeren kaba aktarın.Ardından, her bir embriyoyu bir pensetle nazikçe ama sıkıca tutun ve hayvanın en dorsal kısmında yer alan nöral tüp ile ilgili miyotomları çıkarmak için mikro diseksiyon aracını kullanın. Bunu, nöral tüp konumunun her iki ucuna birer tane ve bir üçüncüsünü hemen ventraline gelecek şekilde üç kesik atarak yapın. Daha sonra, diseke edilen her bir nöral tüp miyotomunu, tabağın vitellus granülleri ve diğer kalıntılardan uzak, temiz bir bölümüne taşıyın.CMF içerisinde yaklaşık 15 dakika bekledikten sonra, pens yardımıyla pigmente deriyi diseke edilen dokudan ayırarak kaldırın ve deriyi atın. Ek 30 ila 60 dakika sonra, hücreler birbirinden ayrıldıkça kum yığını şeklinde bir yapı oluşturacaktır. Bu prosedürde, 10 mililitrelik bir kültür ortamı tüpünü çözün, ardından 35 nanogram/mL konsantrasyonunda 70 mikrolitre ITS ve BDNF etiketi ekleyin ve 35 milimetrelik steril kültür kaplarını yaklaşık yarıya kadar L 15 kültür ortamı ile doldurun.Diseke ettiğiniz her embriyo için bir kültür kabı kullanın. Bir ekim pipeti hazırlamak için, cam bir pastier pipetin her iki ucundan tutun ve konik kısmı alevin üzerine yerleştirin. Ardından, uçları yaklaşık 10 santimetre olacak şekilde birbirinden çekin.Ardından, yaklaşık 0,2 milimetrelik bir uç elde etmek için uç kısmını kırın. Daha sonra, ekim pipetini kullanarak bir embriyo üzerindeki kum yığınını çekin. Çekilen solüsyon miktarını minimumda tutmaya dikkat edin.Ardından, hücreleri bir kültür kabının tabanına boşaltın ve birkaç sıra halinde ekin. Daha sonra, hücrelerin kaba tutunabilmesi için ekili hücrelerin bulunduğu kapları en az 15 dakika boyunca rahatsız etmeden bekletin. Kültürde 12 ila 24 saat geçirdikten sonra, ekilen hücreler belirgin morfolojik özellikler geliştirecektir.Örneğin, kas hücreleri iğ şeklinde olur ve spinal nöronlar uzun uzantılar geliştirir. Urat, varikositeler ve kas hücreleri arasındaki fonksiyonel sinaptik temas, eş zamanlı çift elektrofizyolojik kayıtlar ile doğrulanabilir. Bunu yapmak için, biri presinaptik varikosite ve diğeri kas hücresi için olmak üzere, kayıt için iki patch elektrodu hazırlayın.Ardından, presinaptik elektrodu info terin içeren çözeltiyle ve postsinaptik elektrodu potasyum internal çözeltisiyle doldurun. Bundan sonra, kültür kabındaki ortamı NFR ile değiştirin. Daha sonra bunu faz kontrast optiklere sahip bir ters mikroskoba aktarın, sinapsın fonksiyonelliğini doğrulamak için presinaptik varikositeyi amfoterisin içeren elektrotla ve postsinaptik kas hücresini diğer elektrotla patch edin, patch clamp amplifikatörü ile varikositeyi depolarize edin ve eşzamanlı presinaptik ve postsinaptik akımları gözlemleyin.Bu şekil, ekimden hemen sonraki hücrelerin ve kültürün 5x büyütmedeki görünümünü ve aynı kültürün 40x büyütmedeki görünümünü göstermektedir. Burada kültürdeki nöromüsküler bileşke; nöronal soma, presinaptik varisite ve postsinaptik kas hücresi görülmektedir. Burada presinaptik ve postsinaptik akımlar gösterilmiştir.Presinaptik varikositeye -30 milivolttan +40 milivolta kadar 10 milivoltluk artımlı voltaj basamakları uygulandığında, her iki hücre için tutma potansiyeli -70 milivolt olarak belirlendi. Bu teknikte uzmanlaşıldığında, işlem yaklaşık iki saatte tamamlanabilir. Canlı hücre kültürleri 24 saat kadar kısa bir sürede elde edilebilir ve birkaç gün boyunca sürdürülebilir. Bu hazırlama yöntemi, nöromüsküler iletimin bazı temel özelliklerinin açıklanmasına yardımcı olmak amacıyla uzun yıllardır kullanılmaktadır.Bu videonun, araştırmacıların bu güçlü ve basit tekniğe daha aşina olmalarına yardımcı olarak keşiflerin devam etmesini sağlamasını umuyoruz.

simultaneous-pre-post-synaptic-electrophysiological-recording-from

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Burada Drosophila larva nöromüsküler kavşakta sinaptik iletim ölçmek için elektrofizyolojik yöntemler açıklanmaktadır. Uyarılmış serbest motor nöron aksonları uyararak yapay olarak başlatılan ve iletim yoluyla NMJ kas uyarılmış postsinaptik tepki ölçülebilir.

Drosophila Larva NMJ Synaptic Potansiyeller kayıt için Elektrofizyolojik Yöntemler

Erişilebilir sinaps elektrofizyoloji Uygulama sinaptik mutantlar analiz yararlı sinaptik aktivite ölçülebilir bir ölçü, sağlar. Bu makale, nöromüsküler kavşaklar (NMJ) ortaya çıkarmak için kullanılan bir diseksiyon yöntemi...

C. Elegans Nöromüsküler Kavşağı Diseksiyon ve kayıt

Elektrofizyolojik Kayıt Drosophila Embriyo

Kerevit bacak açıcı kas kas fenotip, sinaptik fizyolojisi ve plastisite tarihsel önemi ve deneysel çok yönlülük için sunulmuştur.

Kerevit Açıcı Kas NMJ Tarihsel ve Fizyolojisi gösteri

Bu makale, sinaptik yanıtları elektrofizyolojik kayıtlar yapmak bir kerevit yürüyüş bacak ekstansör kas ve sinir terminalleri, yüksek ve düşük çıkış sinir terminallerine brüt morfolojik farklılıklar göstermektedir görselleştirildiği nasıl gösteriyor.

Kerevit Bacak ekstansör kas Yüksek ve Düşük Çıkış NMJs Fizyolojik Kayıtlar

Bu yeni yöntem, tek bir yetişkin fare motonöron ve kas lifleri tarafından üretilen kuvvet ölçümü aynı anda hücre içi kaydını verir. Normal ve genetik olarak değiştirilmiş hayvanların motor birimlerin elektrik ve mekanik özelliklerinin kombine soruşturma nöromüsküler sistemin çalışması için bir atılımdır.

Erişkin Fare yılında Motor Ünite tarafından üretilen bir Lomber Motonöron ve Kuvvet Eşzamanlı intrasellüler Kaydı<em&gt; In vivo</em

Bu video, çok elektrotlu bir dizi veya MEA cihazı kullanılarak yakalanan, omurilik dilimlerinin organotipik ko-kültürlerinden alınan elektrofizyolojik kayıtları sunar. Bu kayıtlar, dilimler arasındaki nöronal rejenerasyonu değerlendirir. Gözlenen senkronize elektriksel aktivite, başarılı nöral rejenerasyonu doğrular.

Birlikte Kültürlenmiş Omurilik Dilimlerinde Nöronal Rejenerasyonları Değerlendirmek İçin Elektrofizyolojik Kayıtlar

Bu video, 3B kokültür kürelerinde sinaptik fizyolojiyi ölçmek için çoklu elektrot dizisinin (MEA) kullanılması prosedürünü göstermektedir. Bu yöntem, 3B küreler içindeki sinir ağı dinamiklerini ve sinaptik ağ patlama aktivitesini anlamayı sağlar.

3D Kokültür Kürelerinde Sinaptik Fizyolojiyi Ölçmek için Çoklu Elektrot Dizilerinin Kullanılması

Ekstraselüler bir kas Motor Pool için motor nöronlar belirlenmesi<em&gt; Aplysia&#39;nın californica</em

Sinaptik akımları, Drosophila Üçüncü INSTAR larva nöromüsküler kavşak görüntülenmeyecektir sinaptik boutons üzerinden focally kaydedilebilir. Bu teknik, tek bir sinaptik bouton etkinliğini izleme sağlar.

Drosophila larva nöromüsküler kavşak sinaptik akımlardan Fokal Macropatch kayıtları

Bu yazıda, Xenopus laevis Kurbağa yavrularını retinotectal devre eğitim için tüm cep telefonu yama kelepçe kaydetmek için kullanılan üç beyin hazırlıkları görüşmek. Kendi belirli avantajları ile her hazırlık Xenopus iribaş deneysel tractability nöral devre işlevi incelemek için bir model olarak katkıda bulunmaktadır.

Ürünleri ve tüm hücre yama kelepçe kayıt Xenopus laevis Tectal nöronlar için iletişim kuralları

Öğrenin Xenopus embriyolarından sinir-kas ko-kültürleri hazırlayarak eşzamanlı ön ve son sinaptik elektrofizyolojik kayıt yapmayı. Bu yöntem sinaptik fizyoloji ve nöromodülasyon çalışmaları için değerlidir.

Eşzamanlı Öncesi ve Sonrası-sinaptik Elektrofizyolojik Recording

Daha fazla video keşfet