Eski utero Elektroporasyon ve Tüm Yarımküre Eksplantlarından: Erken Kortikal Kalkınma Çalışmaları İçin Basit Bir Deney Yöntemi

Bu prosedürün genel amacı, erken kortikal gelişimin incelenmesi için tüm serebral hemisfer eksplantı hazırlamaktır. Bu işlem, öncelikle embriyonik 13. günde fare embriyolarının toplanmasıyla gerçekleştirilir. Ardından, plazmid DNA karışımı serebral ventriküle enjekte edilir ve utero dışı elektroporasyon uygulanır.

Ardından, elektropore edilmiş embriyodan bütün bir hemisfer explanı hazırlayın. Son adım, histolojik analizler için bütün hemisfer explanının fikse edilmesi ve kesitlenmesidir. Nihayetinde, mutasyonun veya toksin maruziyetinin kortikal nöron gelişimi üzerindeki etkisi, GFP eksprese eden nöronların immünohistokimyasal analizleri ile değerlendirilebilir.

Benim adım Eric Olson. Syracuse'daki SUNY Upstate Medical University bünyesindeki Nörobilim ve Fizyoloji Bölümü'ndeyim ve bugün size "tüm hemisfer eksplantı" adını verdiğimiz, geliştirdiğimiz bir yöntemi göstereceğiz. Bu tekniğin dilim eksplantı gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, tüm hemisfer eksplantlarının hazırlanmasının basit olması ve iki günlük organotipik büyüme sağlamasıdır.

Bu yöntem, belirli bir mutasyonun veya toksinin erken kortikal gelişimi nasıl bozduğu gibi nörogelişim alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Genel olarak, bu yöntemi ilk kez kullanacak kişiler, meningeslere zarar vermeden tüm hemisferin eksplantını hazırlamanın biraz pratik gerektirmesi nedeniyle zorluk yaşayabilirler. Dokunun mekanik hasara karşı hassasiyeti nedeniyle diseksiyon ve eksplant transfer adımlarının öğrenilmesi zor olduğundan, bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritik öneme sahiptir.

Prosedür, laboratuvarımdaki doktora sonrası araştırmacı Dr. Theresa Ozzi tarafından gösterilecektir. Bu protokol için, plazmitleri saflaştırmak amacıyla ticari olarak mevcut bir kit kullanın. Plazmit DNA'sını su içerisinde 0,33 mg/mL konsantrasyonunda hazırlayın ve enjeksiyon izleyicisi olarak yaklaşık %0,02 (ağırlık/hacim) oranında fast green boyası ekleyin; cerrahi aletleri, çalışma alanını ve mikroskobu her zaman dezenfekte edin.

%70 etanol ile temizledikten sonra, E 13 günündeki gerekli sayıda Swiss Webster diş fareyi karbondioksit inhalasyonu ile sakrifiye edin. Embriyolar çıkarıldığında, onları buz gibi soğuk HBSS içeren ve soğuk tutulan 10 santimetrelik bir kaba yerleştirin. Her bir embriyoyu çevreleyen ekstra embriyonik membranlardan dikkatlice ayırın.

Şimdi her bir embriyoyu tek tek, buz gibi soğuk HBSS içeren temiz bir kaba aktarın. Bir Hamilton şırıngası kullanarak, hazırlanan DNA'dan iki ila üç mikrolitre sol serebral hemisferin ventrikülüne enjekte edin. Gelecekteki analizler için planlanan kortikal alana veya bu alanın yakınına enjeksiyon yapmayın.

DNA'yı elektroporasyonla aktarmak için, embriyoyu pensle nazikçe tutun ve cımbız elektrodun pozitif pedini başın dorsal orta hattına hafifçe yerleştirin. Negatif pedi embriyonun çenesinin altına hafifçe yerleştirin. BTX 830 model bir cihaz kullanarak, her biri 50 milisaniye süren, bir saniyelik aralıklarla uygulanan 30 voltluk beş palslik bir program çalıştırın; diğer sistemler üretici talimatlarına göre ayarlanabilir.

Her bir embriyoyu buz gibi soğuk HBSS'ye geri koyun ve iki adet 5 numara kuyumcu pensi kullanarak bir diseksiyon mikroskobu altında tüm hemisfer Explan hazırlığına geçin. Embriyo başından deriyi ve kıkırdaksı kafatasını çıkarın. Ardından, penslerden birini beynin altına kaydırın.

Sağlam beyni kafatasından çıkarmak için, ekli orta beyin dokusu da dahil olmak üzere elektropore edilmiş hemisferi diseke ederek ayırın. Diseke edilen kortikal hemisferin üzerindeki meningeslere zarar vermemeye dikkat edin. En zor öğrenilen adımın, meningeslere zarar vermeden elektropore edilmiş hemisferin diseksiyonu ve çıkarılması olduğunu tespit ettik.

Diseksiyon işlemi tamamlandıktan sonra, genişletilmiş bir mililitrelik pipet ucu kullanarak her bir hemisferi beş mililitre buz gibi soğuk HBSS içerisine aktarın. Gerekirse embriyolar, 12 kuyucuklu bir doku kültürü kabının ayrı kuyucuklarında tutulabilir. Ardından, altı adede kadar hemisferi nazikçe 24 milimetrelik kolajen kaplı bir kültüre aktarın.

İnserti medial tarafı aşağı gelecek şekilde yerleştirin ve düzenleyin. Şimdi, altı kuyucuklu bir plağın 35 milimetrelik bir kuyucuğunu 2,7 mililitre desteklenmiş besiyeri ile doldurun. İnsertteki fazla HBSS'yi uzaklaştırın ve inserti besiyeri bulunan kuyucuğun içine yerleştirin; kuyucuktaki besiyerinden birkaç damlayı her bir eksplanın üzerine pipetleyin.

Besiyeri hacmini artırmayın. X eksplantlarının üzerine birkaç damla kültür besiyeri yerleştirmenin ve böylece X eksplantlarının besiyeri ile tamamen örtülmemesinin kritik olduğunu saptadık. Bu, x eksplantı üzerindeki 2,7 ml besiyerine 400 µL kadar ekleme yapmak anlamına gelebilir.

Kabı, içinde nemlendirme amacıyla su bulunan bir kap yerleştirilmiş ve en az bir dakika boyunca %95 oxygen ile doyurulmuş bir Billups Rothenberg haznesine yerleştirin. Hazneyi sızdırmaz şekilde kapatın ve gaz besleme tüpünü ayırın. Hazneyi, prepl bölünmesinin gerçekleşeceği süre boyunca iki gün boyunca 37 degree Celsius'lik bir inkübatöre yerleştirin.

Hazırlık aşaması. Explan gömme işlemi için pedler hazırlayın. 60 °C'de %10'luk dana derisi jelatin çözeltisi hazırlayın.

Çözündükten sonra, çözeltinin yaklaşık 10 mililitresini 10 santimetrelik bir kaba dökün. Kalan çözeltiyi daha sonra kullanmak üzere 60 °C'de tutun. Gerekiyorsa, pedlerin katılaşması için yarım saat bekleyin.

Dört °C'de birkaç gün boyunca saklanabilirler, ancak kullanımdan önce oda sıcaklığına getirilmelidirler. Tespit işleminin yapılacağı gün, bir çeker ocak altında Pagano, tespit çözeltisi ve tespit çözeltisi içermeyen Pagano çözeltisini hazırlayın. Tespit çözeltisini 37 °C'ye ısıtın.

Eksplantları, dokuları rahatsız etmeden dikkatlice ve hızlı bir şekilde inkübatörden çıkarın. Besiyerinin büyük kısmını uzaklaştırın ve yerine beş mililitre ısıtılmış tespit çözeltisi ekleyin. Her bir eksplantın tamamen daldırıldığından emin olun.

Dokuları oda sıcaklığında bir saat boyunca sabitleyin. Ardından fiksatifle uzaklaştırın ve yerine Pagano solüsyonu ekleyin. Fiksatif kullanmayın.

Her bir kuyuya birkaç damla %10 sodyum azid ekleyin. Dokular, gömme pedine gömülene kadar dört derece Celsius'ta saklanabilir. Bir cetvel yardımıyla kabın tabanına bir ızgara çizin.

İki ila üç santimetrelik kareler oluşturun. Münferit eksplantları gömme pedine aktarın. Kalan solüsyonu pipetle çekin ve her bir eksplantın üzerini sıcak %10'luk jelatin solüsyonu ile kaplayın.

Katılaşmasını bekleyin. Yavaşça katılaştıktan sonra, her bir eksplant tamamen çevrelenene kadar daha fazla jelatin çözeltisi ekleyin. Bir kerede çok fazla jelatin eklenmesi durumunda meydana gelebilen pedin erimesinden kaçının.

Şimdi, jelatinin yaklaşık bir saat boyunca sertleşmesini bekleyin. Sertleşme tamamlandığında, kesit alma işleminden önce tekil explanlar küçük jelatin bloklar halinde kesilebilir. Blokların bir veya iki gün boyunca Pagano fiksatifinde son fiksasyona tabi tutulması önemlidir.

Kesit alma işlemi sırasında, eksplantları olfaktör bulb yukarı gelecek şekilde konumlandırın ve koronal düzlemde 100 µm kalınlığında kesitler alın. Kesitleri %0,1 sodyum azid içeren soğutulmuş PBS içerisinde toplayın.

Kesitleri, belirtilen teknik kullanılarak boyanana kadar dört °C'de saklayın. Tüm hemisfer eksplantları, prelate bölünmesi öncesinde E 13 evresinde hazırlandı. Dorsal neokortekste.

Doku, eksitatör kortikal soyuna ait immatür nöronları raporlayan bir transgen taşıyordu. Aynı batımdan alınan kortikal eksplantlar, in vitro ortamda iki günlük bir süre boyunca sırasıyla damla sabitleme yöntemine tabi tutuldu ve sonraki histolojik analizler için işlendi. Başlangıç analiz zaman noktası olan DIV sıfırda, alan bir bir boyunca prepl bölünmesi henüz gerçekleşmemiştir.DIV.

CP belirginleşti ve 2D IV'e kadar büyümeye devam etti. Böylece, başlangıçta E 13'te kültüre edilen tüm hemisfer eksplantları, serebral korteksin olgunlaşmasını iki gün boyunca destekledi ve dorsal neokorteksteki normal histolojik gelişimi doğrulamak için dorsal neokorteksteki öncül bölünmeyi yakaladı. 2D IV eksplantları kondroitin sülfat, proteoglikanlar ve hücre dışı matris bileşenleri için immün boyandı. Dorsal korteksteki iki immünreaktivite bandı, in vitro kültür süresi boyunca PPP'nin MZ ve SP'ye uygun şekilde bölündüğünü gösterdi.

PP, CTIP2 ve TBR1 eksprese eden altı kortikal nöron tarafından L şeklinde bölünmüştü. Bu markörlerin immün boyama örüntüsü, yeni oluşan cp'de bu transkripsiyon faktörlerinin uygun ekspresyonunu doğrulamaktadır. Bu analizler hep birlikte, tanımlanan protokolün tamamı kullanılarak sağlam E13 embriyolarının sol ventrikülüne enjeksiyon yapılan tüm hemisfer preparatında ORGANOTİPİK erken kortikal gelişimi doğrulamaktadır.

Vz'deki nöronal öncüllerde elektropore edilmiş ve işlenmiş GFP ekspresyonu gözlemlenebilmiştir. IZ ve cp'de yoğun GFP eksprese eden hücreler görülürken, önemle, gelişen dendrit ve aksonlara sahip, ok uçlarıyla işaretlenmiş çok sayıda GFP pozitif nöron, oluşmakta olan CP'nin üst kısmında gözlemlenmiştir. CP ve MZ arasındaki arayüzde bulunan belirgin tabaka; uygun migrasyon, duraklama ve laminasyonun gerçekleştiğini göstermektedir.

Dendritler MZ'ye doğru uzanırken, kortiko-ugal aksonlar CP'nin altına ve iz'ye doğru uzanmıştır. Farklaşan hücreler, radyal glial liflerin yanındaki bipolar morfolojiye sahip nöronlar ve bunların altında iz'deki multipolar nöronlar dahil olmak üzere, farklı olgunluk durumlarındaki GFP pozitif hücrelerdi. Dendritler ayrıca, ECM proteini reelin'in uygun şekilde immünolokalize olduğu MZ'ye de uzanmıştır.

Böylece, elektroporasyon ve eksplant koşulları kortikal nöronların normal gelişimine olanak sağlar. Beklendiği gibi, post-mitotik GFP pozitif nöronlar oluşan cp'yi doldurmuştur. Dolayısıyla, bu protokol, göç ve olgunlaşma çalışmalarında L altı kortikal nöronları güvenilir bir şekilde hedefleyebilir.

Bu prosedürün kapsamlı kullanımı %79 başarı oranıyla sonuçlanmıştır. 248 denemenin 195'i görüntüleme ve analiz için uygun bulunmuştur. Başarısızlıkların yarısı, GFP ekspresyonunun gerçekleşmemesinden veya hedeflenen GFP'nin kaçırılmasından kaynaklanmıştır. Yöntem ustalıkla uygulandığında.

Bu teknik, doğru şekilde uygulandığında 90 dakika içinde tamamlanabilir. Bu prosedürü gerçekleştirirken, elektropore edilmiş hemisferlerin prosedür sonrasında sağlam meningesler ile kültüre edilebilmesi için diseksiyonların pratikle pekiştirilmesinin önemli olduğunu unutmamak gerekir. İlgilenilen mutasyonların nöronal migrasyonu veya dendritogenezi nasıl bozduğu gibi ek soruları yanıtlamak için time-lapse mikroskopi gibi diğer yöntemler uygulanabilir.