İzolasyon, Kültür ve Yetişkin Fare Cardiomyoctyes Fonksiyonel Karakterizasyonu

Bu prosedürün genel amacı, kültürü izole etmek ve yetişkin aynalama kardiyomiyositlerinde kasılma ve kalsiyum kullanımını görselleştirmektir. Bu, önce müren kalbinin çıkarılması ve oda sıcaklığına yerleştirilmesiyle gerçekleştirilir. PBS, kalp çizgi filmde gösterildiği gibi çanak içinde kanüle edilebilir veya filmde olduğu gibi doğrudan perfüzyon sistemine bağlı iğne üzerinde olabilir.

Üçüncü adım, perfüzyon, tampon ve ardından enzim tamponunu sistemden pompalayarak kalbi yıkamak ve sindirmektir. Son adım, ventrikülleri bir transfer tamponu kabına kesmek ve dokuyu forseps ile nazikçe kıymaktır. Sonuç olarak, sonuçlar, bireysel kardiyomiyosit hücre kasılmasını ve kalsiyumun tüm hücre ve/veya sarkomer uzunluk ölçümleri ve oran metriği yoluyla işlenmesini gösterebilir.

İyon optik sistem ile RO 2:00 gibi kalsiyum göstergeleri. Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişiler mücadele edecektir çünkü damara veya kalbin kendisine zarar vermeden kalbi aorttan hızlı bir şekilde asmak zor olabilir. Yetişkin farelere yaklaşık 12 haftalıkken 150 USP heparin sodyum ile karın boşluğuna enjekte edin.

Fare susuz kalırsa, bir cc tuzlu su çözeltisi enjekte edin. Fareyi ketamin ksilazin karışımı enjeksiyonu ile uyuşturun Ağırlığa bağlı bir dozda, fareler, arka bacak ayak parmağı kıstırma refleksinin kaybı ve solunum hızının yavaşlaması yoluyla derinlemesine uyuşturulduklarından emin olmak için kontrol edilir. Sakinleştirici fareyi ameliyat pedine sabitleyin, ardından kalbi çıkarın ve bir fizyolojik salin kabına koyun.

Opti vision diseksiyon gözlüklerini kullanarak aortu tanımlayın ve açığa çıkarın. Hücre izolasyonu için aort damarı çevresindeki dokunun çıkarılmasına gerek yoktur. Aort kökü açıkça görülebildiği sürece, pompayı perfüzyon tamponu ile doldurun.

Hatları doldurmak için hızlı bir şekilde pompalamaya başlayın ve kabarcık olup olmadığını kontrol edin. Daha sonra kalp perfüzyonu için akış hızını ayarlamak için yavaş bir hızda pompalayın. Perfüzyon tamponunun sıcaklığını 37 santigrat derecede tutmak için sirkülasyonlu bir su banyosu kullanın.

Aortu iğneye çorap gibi yerleştirmek için mikro diseksiyon forseps kullanın. İğnenin ucunun çıkan aortta, ideal olarak aort kökü distalinde sağ innomatta durduğundan emin olun. Daha sonra, aortun üst kısmına 10 santimetre uzunluğunda bir dikiş ipeği bağlayarak kalbi iğneye sabitleyin.

Bağın sağ innominat arterin altındaki çıkan aort seviyesinde olduğundan emin olun, ancak aynı zamanda iğnenin ucunun üzerinde ve aort kapağının üzerinde olduğundan emin olun. Şimdi kalbi koninin iç kısmına indirin. Bu, ortam sıcaklığının korunmasına yardımcı olur.

Kalbi perfüzyon tamponu ile dakikada bir mililitre hızında beş dakika boyunca perfüze edin ve PERFU sekizinin konik camda toplanmasına ve kalbi sarmasına izin vermek için cam hazne çıkışını kapatın. Bu noktada, kalbin hacminin arttığını görmelisiniz. Ek olarak, kalp dokusundaki kan, PERFU sekiz'e neden olan doku ile değiştirilecektir. Solgun.

Boruyu perfüzyon tampon kabından enzim tampon kabına taşımak için pompayı durdurun. PERFU sekizini boşaltmak için çıkış kelepçesini serbest bırakın. Kalbi perfüze etmeye başlamak için pompayı yeniden başlatın.

Dakikada bir mililitre enzim tamponu ile, enzim tamponunun kalbi sarmasına izin vermek için çıkışı tekrar sıkıştırın. Burada. Enzim kalbe nüfuz ederken ve bağ dokusunu sindirirken, kalp soluklaşacak ve yapısal bütünlük azalacaktır. Acemi için, perfüzyon hattını bir manometre ile bağlamak yardımcı olur.

Manometre, iğnenin konumunun ventrikülde değil, aort kapağının üzerinde olmasını sağlamak için de kullanılabilir. Düşük basınç, iğnenin ventriküler odacıkta olduğunu gösterir ve yüksek basınç, iğnenin valfe temas ettiğini gösterir. Kalp sindirilirken, bağ dokusu direnci tutmadığı için basınç hızla azalacaktır.

Sindirilmiş kalpten ventriküllerin ne zaman kesileceğini belirlemek için, kalbi konik camdan kaldırın, kalbi forseps ile hafifçe sıkın ve kontrol etmek için küçük bir Petri kabında birkaç damla PERFU sekiz toplayın. Tek hücreler sekiz ila 10 dakika içinde düşüyorsa, ventriküler basınç düşmüş olacaktır ve tek hücrelerin Perfu'ya girdiğini görebilmeniz gerekir. Her ikisi de ilk görüldüğünde sekiz, kalpten gelen ventrikülleri transfer dolu bir tabağa kesin, daha homojen bir hazırlık için A tamponu

Sağ ventrikülü kesin ve çıkarın, sol ventrikülü kıymak ve çalışmak için geride bırakın. Sağ ventrikül ile ilgileniyorsa, ayrıldıktan sonra kıyılabilir. Mikro diseksiyon forsepsleri kullanarak her ventrikülü ayrı ayrı doğrayın, Başarılı bir sindirim, kıyma işleminden sonra neredeyse hiç katı doku parçası bırakmaz ve dokunun çoğu ayrışma üzerine amorf hale gelir.

Dokuyu daha fazla ayırmak için, ucun kesildiği plastik bir macun pipetinden geçirin. 45 derecelik bir açıyla, kelepçeler kullanarak küçük bir huniye bir parça kare ağ sabitleyin ve bu filtreleme cihazını 15 mililitrelik bir tüpe yerleştirin. Hücre çözeltisini tabaktan çıkarmak için modifiye edilmiş mera pipetini kullanın ve çözeltiyi 15 mililitrelik tüpe süzün.

Canlı hücrelerin tüpün dibine yerleşmesine izin verin, bu birkaç dakika sürecektir. Hacmi iki tüpe bölmek daha hızlı sonuç verir. Ali'den sonra peletleme.

Dört kalsiyum çözeltisinin her birinden 2,5 mililitreyi dört ayrı 15 mililitrelik tüpe koymak. Çökelmiş hücre peletini kalsiyum çözeltilerinin ilkine dikkatlice aktarmak için standart pipeti kullanın. Hücrelerin tüpün dibine çökmesine izin verin ve işlemi tekrarlayın.

Yerleşmiş hücrelerin kalsiyum çözeltilerinin her birinden aktarılması. Hücreler dördüncü kalsiyum çözeltisine aktarıldığında, tüpü kapatın ve yan çevirin. Önce ark lambasının başlatıldığından emin olarak MM SIS sistemine güç verin.

Ardından sistemi kalsiyum tamponu ile doldurun B. Tüpleri pompadan MM cis odasının uygun giriş ve çıkışlarına bağlayın. Haznede tipik olarak 20 x 25 milimetre olan uygun boyutta bir cam kapak kızağını sabitleyin. 500 mikrolitre hücre çözeltisini küçük bir eend orph tüpüne aktarın.

Hücrelere 0,5 mikrolitre PHE 2:00 ekleyin ve odayı kararttıktan sonra karanlıkta oda sıcaklığında beş ila yedi dakika inkübe etmelerine izin verin. Şimdi dikkatlice kalsiyum tamponu B'yi hazneden akıtmaya başlayın. Akış başlatıldıktan sonra ve daha erken olmamak üzere, oda sıcaklığını 37 santigrat dereceye çıkarmaya başlayın.

Hücre konsantrasyonuna bağlı olarak bir veya iki damla hücre solüsyonunu kapak fişine yüklemek için modifiye edilmiş bir pipet kullanın ve hücrelerin yerleşmesine izin verin. Odadaki hücrelerin yoğunluğu. Örtüşmeyen tek hücrelerin sys veri toplama platformunda kolayca bulunabileceği şekilde olmalıdır.

Haznenin bağlantı kabloları ile myo Pacer'a bağlı olduğundan emin olun ve deney için voltaj ve frekansı ayarlamaya başlayın. Doğru frekansta atan bir hücre seçin ve onu çerçeveleme açıklığına taşıyın. Kamera ve çerçeveleme açıklığı boyutlarını, tüm hücre pencerenin merkezinde, sarco aynaları görünecek şekilde yatay olarak yönlendirilecek şekilde ayarlayın.

Ardından, kutuyu hücrenin iyi tanımlanmış sarkomerler içeren bir alanına yerleştirin ve güç spektrumunun zirvesini optimize etmek için odağı ayarlayın. Ayrıca mavi yumuşatma penceresini ve siyah kontrast bilgilerini optimize etmek için mikroskobun parlaklığını ayarlayın. Fotoğraf çarpanını açın ve kaydetmeye başlayın.

Yeterli veri kaydedildikten sonra, kaydı geçici olarak durdurmak için duraklat'ı tıklayın. Durdur'u tıklatmayın. Bu, kaydı sonlandıracak ve o hücre için hiçbir arka plan kaydedilemeyecektir.

Şimdi, görüntüleme penceresinin odağını veya boyutlarını değiştirmeden, mikroskop aşamasını kapak kaymasının hiçbir hücrenin veya hücresel materyalin görülemeyeceğine bir alanına taşıyın. Ardından, bir arka plan ölçümü kaydetmek için devam ettir'i tıklayın. Yeterli arka plan kaydedildikten sonra, kaydı sonlandırmak için durdur'a tıklayın.

Ardından, o hücrenin tüm izlerini kaydetmek için dosya kaydet'e tıklayın Tek bir ZPT dosyasında, yetişkin kardiyomiyositlerin izolasyonu, ok ucunu kendiliğinden atmayan çubuk şeklinde çizgili ve hareketsiz hücrelerle sonuçlanır, çizgileri olmayan yuvarlak ölü hücreleri gösterir. Hareketsiz hücreler, gen ekspresyonunu manipüle etmek için adenovirüs ile kültürlenebilir ve transfekte edilebilir. 24 saatlik kültürden sonra, canlı hücrelerin morfolojisi değişmez.

Hala kalsiyuma toleranslıdırlar ve alan stimülasyonu ile hızlandırılabilirler. % 85 ila% 90 canlı hücre verimi mümkündür. MM SIS sistemi, vahşi bir tip C 57 siyah altı fareden alınan miyositlerin kasılmasını ve kalsiyum geçişini ölçmek için kullanıldı. Aynı anda.

Kasılma ve kalsiyum işleme ölçümü, fira 2:00 oranının bağlanmamış formlarına bağlanma oranı ölçülerek yapıldı, ölçümler kurulumlar arasında biraz değişebilir, ancak sağlıklı hücreler genellikle 1.5 ile 2.5 arasında puan alır. Kasılma ve kalsiyum izlerinden elde edilen verileri analiz etmek için, her hücre için karakteristik bir iz oluşturmak için izlerin ortalaması alındı. sys yazılımında bulunan mono geçici veri analizi algoritması kullanılarak, karakteristik izlerden sistolik ve diyastolik fonksiyon için parametreler oluşturuldu.

Bu videoyu izledikten sonra, bireysel yetişkin deniz kardiyomiyositlerini nasıl izole edeceğinizi iyi anlamış olmalısınız.