Name: İzolasyon, Kültür ve Yetişkin Fare Cardiomyoctyes Fonksiyonel Karakterizasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-24T18:10:00.000+00:00
Duration: 12 min 49 s
Description: Keşfedin yetişkin fare kardiyomiyositlerinin Langendorff perfüzyon sistemiyle izolasyonunu ve fonksiyonel karakterizasyonunu. Bu yöntem, kalp fonksiyonu ve gen ekspresyonu araştırmaları için Ca2+ toleranslı hücreler sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1.. Kardiyomyosit İzolasyon Malzeme (Şekil 1) Forseps Microdissecting Doku forseps Narin hemostatik forseps Hemostatik forseps Microdissecting, tırtıklı, kavisli forseps Çalışma makas, düz Çalışma makas, kavisli 15 ml Falcon tüpleri (5) 60 mm Petri Fosfat Tamponlu Salin (PBS) Naylon Mesh - 400 mikron gözenek boyutu Küçük huni Balmumu kaplı, örgülü ipek 4-0, 19 mm uzun, 7-10 cm Non-derialtı iğne, küt uç, 24 G veya ticari hayvan besleme iğne (W/1-1/4, 24 x 1) Heparin sodyum Ketamin / ksilazin karışımı Pasteur Pipetler OptiVision Diseksiyon Goggles IonOptix MMSYS sistemi Not: hücreleri kültür ise, bu protokolü başlamadan önce hücre kültüründe 2. kısmına bakınız. Not: Tüm fareleri için bakımonaylanmış IACUC düzenlemeleri, uygulamaları ve prosedürlerine göre bir bariyer tesisi ve kurban. Not: Ön işleme başlamadan için, tüm sistemin Langendorff sistemine (Şekil 2A, Şekil 3) tüm öğeleri uygun ve eksiksiz kolajenaz aktivitesi sağlamak için 37 ° C&#39;ye ısıtıldı sağlamak için önceden ısıtılmış olmalıdır. <ol><li> 150 USP birimleri karın boşluğu içine heparin sodyum erişkin fareler (~ 12 hafta) enjekte edilir. </li><li> Bir kilo bağımlı doz (Tablo 1), bir ketamin / ksilazin karışımı bir enjeksiyon ile anestezi. <ol><li> 80:12 mg / kg ketamin: ksilazin tarifi: 2.6 ml ketamin (100 mg / ml) + 0.4 ml ksilazin (100 mg / ml) + 37 ml PBS. Nihai: ketamin = 6.5 mg / ml; xylazine = 1 mg / ml </li></ol></li><li> , Işletme ped sedasyon fareyi Güvenli kalp kesip, ve bir oda sıcaklığı PBS tabak veya% 0,9 tuz (Şekil 1J) içine yerleştirin. Physiologic tuzlu dokunulmamış kalp odası içinde kan daha iyi ekstrüzyon ve 1,6 aşamasından önce aort kolay tanımlama için sözleşme sağlar. Fareler onlar derinden arka bacak ayak tutam refleksi ve önceki torakotomi başlangıcından solunum hızının yavaşlaması kaybı ile anestezi sağlamak için kontrol edildi. </li><li> Aorta belirlemek ve maruz OptiVision diseksiyon gözlük (Şekil 1A) kullanın. Aort kökü açıkça görülebilir olup olmadığını kabın vizüalizasyon yapar, ancak, aort etrafındaki doku çıkarma hücre izolasyonu optimizasyonu için gerekli değildir. </li><li> Prime perfüzyon tamponu ile pompa (Tablo 2). Sıcaklık kullanılarak prosedür uzunluğu boyunca 37 ° C ısıda tutulur gereken bir su banyosu (Şekil 2B) dolaşan, kontrol edilir. </li><li> Langendorff cihazına (Şekil 2A) üzerine kalp monte edin. İki mikro diseksiyon forseps (Şekil 1D-E) kullanılarak, pruzak ucunda silikon tüp ile non-derialtı, künt uç iğne (24 G) etrafında aort ime. Alternatif olarak (W/1-1/4, 24 x 1), ticari hayvan besleme iğne kullanılabilir. 24 G iğne ya da hayvan besleme iğnesi üzerindeki silikon tüp oluk üzerinde dikiş güvenliğini sağlayacaktır. Bir çorap gibi iğne aorta yerleştirin. (Şekil 2C). <ol><li> Not: Bu ciddi olacak gibi, sol ventrikül içine aort kapağı boyunca uzanan olmadığı iğnenin ucu ideal doğru innominat için aort kökü distalinde, aortta aittir emin olmak önemlidir, ancak etkin bir şekilde koroner arter üzerinden kalbinden serpmek için tampon yeteneğini sınırlar. </li></ol></li><li> Kravat doğru innominat arter altında, çıkan aorta düzeyinde olduğunu sağlanması, aortun üst etrafında (7-10 cm uzunluğunda) sütür ipek küçük bir uzunluğu (Şekil 1K) bağlayarak iğneye kalp Securey, ancak iğnenin ucu üzerindedir. </li><li> Uygun bir ortam sıcaklığını korumak için konik camın iç (Şekil 2B) içine kalp indirin. </li><li> 1 ml / dk &#39;lık bir hızda 5 dakika boyunca perfüzyon tamponu ile kalp serpmek ve perfüzyon konik cam toplamak ve kalp zarf izin vermek için cam odacık çıkış kelepçe. Kalp sindirim için, Şekil 3&#39;te şematik olarak gösterilmiştir. <ol><li> Bu noktada kalp artışın hacmi görmelisiniz. Buna ek olarak, kalp dokusundaki kan doku solgunluk neden perfüzat ile değiştirilecektir. </li></ol></li><li> Perfüzat drenaj çıkış kelepçeyi çözün. Enzim tampon kabın (Şekil 2E) perfüzyon tampon haznesinden boru taşımak için bir pompa durdurun. 1 ml / dk da enzim tamponu (Tablo 2) ile kalp serpmek başlamak için pompayı yeniden başlatın. Enzim tampon zarf izin vermek için tekrar çıkış kelepçekalp. <ol><li> Burada, enzim, perfüze kalp ve bağ dokusu sindirerek olduğu gibi, kalp soluk olur ve yapısal bütünlük azalacaktır. </li><li> , Sindirilmiş kalpten ventrikülleri kesilmiş konik camdan kalbi kaldırın, forseps ile yavaşça kalp sıkmak ve küçük bir Petri kabındaki Perfüzatın birkaç damla toplamak ve tek bir hücre bırakarak olup olmadığını görmek için kontrol etmek için zaman belirlemek için . </li><li> Acemi için bir manometre ile perfüzyon hattı bağlamak için yararlı olduğunu. Kalp sindirilir oluyor zaman bağ dokusu direncini tutmaz gibi basınç hızla azalacak. Manometre iğnenin konumunu aort kapağının olup ventrikülde olduğundan emin olmak için, aynı zamanda acemi için yararlıdır. Düşük basınç iğne ventriküler odası olan ve yüksek basınç iğne valfı temas olduğunu göstermiştir olduğunu gösterir. </li></ol></li><li> Bir çanak içine kalpten ventriküller Cutventrikül basınç size perfüzeye tek hücreleri görmek mümkün olduğunda önemli ölçüde düşmesi veya başladığında transfer tampon (A) (Tablo 2) dolu. Bu genellikle ~ 7-10 dakika sürer. </li><li> Yine (Şekil 1C) mikro diseksiyon forseps kullanarak, ayırmak için küçük parçalar halinde ventrikülleri kıyma. Başarılı bir sindirim dokusunun en ayrışma üzerine amorf olmasıyla birlikte, kıyma sonra doku neredeyse hiç katı topakları bırakacaktır. <ol><li> Ayrıca, doku ayırmak ucu bir ~ 45 ° açıyla kesilmiş olmuştu hangi bir plastik Pasteur pipet (Şekil 4) kullanılarak in / out çözüm pipetle için. Bu modifikasyon, doku ezilir olarak pipet böylece hücrelerde kesme stresi miktarını azaltarak iç çap alanı artırmak için hizmet eder. </li><li> Forseps ile doku diseksiyon önce bireysel odaları ayırmak ve ayrı ayrı atriyal, sol ventrikül veya righ ayırmak mümkündürt ventriküler hücreler. </li></ol></li><li> Kelepçeler kullanarak küçük bir huni (Şekil 1L) için kareli örgü (Şekil 1M) Güvenli ve bir 15ml Falcon tüp (Şekil 1i) içine bu filtreleme cihazı yerleştirin. </li><li> Çanak hücre çözümü kaldırmak ve Falcon tüpüne çözelti filtre değiştirilmiş Pasteur pipet kullanın. </li><li> (Canlı hücre sedimantasyon 2-4 dakika sürer) canlı hücrelerin tüp dibe çökmesine izin verin. </li><li> 4 ayrı 15 ml Falcon tüpleri içine dört kalsiyum çözeltiler (Tablo 3) her birinin kısım 2.5 ml. </li><li> Yine, standart bir Pasteur pipeti kullanılarak, dikkatli bir şekilde borunun altından hücre pelletini kaldırmak ve kalsiyum çözeltiler ilk hücreleri aktarın. </li><li> Hücreler son çözelti haline gelene kadar hücreler tüp dibe ve sonraki kalsiyum Çözeltilerin adımı 1.17 tekrar izin verin. </li><li> Hücreler FOURT yerleşmek izin vermeyinh kalsiyum çözeltisi. Tüp kap ve yan çevirin. </li></ol> 2. Hücre Kültürü <ol><li> Izolasyon, levha 1 ug / ml fare doğal cam kapak slipleri üzerine laminin ve 37 ° C&#39;de en az 1 saat boyunca inkübe edilir ve% 2 CO2 önce. Ayrıca, kaplama ve kültür ortamı (Tablo 4), 37 ° C&#39;de inkübatör içinde sıcak ve% 2 CO2 izin verir. Bu ortam içerisinde çözünmüş CO2 dengelenmeye olanak vermektedir. <ol><li> Medyadan üst çıkarmayın. Basitçe kontaminasyonu önlemek için üst gevşetin. </li></ol></li><li> Izole edilmiş hücreler Falcon tüpün altındaki pelet izin verin. </li><li> Ortam kaplama en uygun miktarda bir standart plastik Pasteur pipet kullanılarak ve tekrar süspansiyon pelet çıkarın. </li><li> Uygun boyutlu bir yemek laminin kaplanmış lamelleri hücreleri Plate ve 37 ° C de inkübe edilir ve% 2, en az 30-60 dakika boyunca CO2 hücreler lamelleri uymak için izin vermek. </li><li> ** Adenovirüs ile transfekte ise, kaplama ortamın uygun bir miktarda virüs sulandırmak ve virüs ihtiva eden ortam ile tabak içinde kaplama ortamı değiştirin. Virüs, 37 ° C 2 saat ve% 2 CO2 için hücreler üzerinde inkübe olsun. ** </li><li> Çanak kaplama ortamı çıkarın ve kültür ortamı ile değiştirin. </li><li> Lamelleri hücrelerin rahatsız etmeyecek şekilde dikkatlice her gün kültür ortamı değiştirin. </li></ol> Bu prosedür kullanılarak, hücreler, başarılı bir şekilde 72 saat boyunca kültürlenmiştir. Transfekte edilmiş kültürlenmiş hücreler ve GFP görüntüleri, Şekil 5&#39;te bulunabilir. 3. MMSYS Sistemi <ol><li> Ark lambası ilk başlatıldığı sağlamak MMSYS sistemini güçlendirin. </li><li> Pompadan MMSYS odasının uygun giriş ve çıkışları (Şekil 6) için tüpler bağlayın. </li><li> Prime kalsiyum tampon maddesi (B) ile, sistem (Tablo 2). </li><li> Bir yak yerleştirinodasına ve vidalarını sıkın (Şekil 6E) içine opriately ölçekli cam lamel. En MMSYS odaları 22 mm veya 25 mm kare lamelleri kullanabilirsiniz. Lütfen odası için uygun lamel belirlemek için MMSYS kullanım kılavuzuna başvurun. </li><li> Küçük bir Eppendorf tüpüne, hücre çözeltisinin 500 ul aktarın. </li><li> Hücrelerin küçük tüpe 0.5 ul Fura2-AM (1 ug / ul stok çözeltisi) ekleyin ve bunları 5-7 dakika boyunca oda sıcaklığında karanlıkta inkübe izin verir. Bu Fura2-AM hücre zarı boyunca hızlı pasif difüzyon yoluyla hücre içine &quot;yük&quot; olanak sağlar. <ol><li> Fura-2 yüklü hücreler, tüpün dibine pelet olsun ve kalsiyum tamponu B, 500 ul ile aşırı yıkama Fura </li></ol></li><li> Oda ışıkları kapatın. </li><li> Standart bir Pasteur pipeti kullanılarak, bölmenin (Şekil 6C) merkezine &quot;yüklü&quot; hücre çözeltisinin (hücre konsantrasyonuna bağlı olarak) 1-2 damla damla ve hücreler, t izino 5 dakika boyunca lamel üzerine yerleşmek. <ol><li> Oda içindeki hücre yoğunluğu, bir örtüşmeyen hücreler kolayca MMSYS veri toplama platformunda izlenebilir şekilde olmalıdır. </li></ol></li><li> Dikkatlice bölmesi boyunca kalsiyum tamponu (B) akmaya başlar. </li><li> 37 ° C oda sıcaklığı artırmak <ol><li> ÖNEMLİ: akış başlatılmıştır kadar ısıtma cihazları açmayın. Bu ciddi geribildirim thermocoupler (Şekil 6A) zarar verebilir. </li></ol></li><li> Bağlantı telleri (Şekil 6B) üzerinden odası MyoPacer bağlı olduğundan emin olun ve 1.5x hücreler için pacing eşiği de hücreleri 5 Hz hızlanmaya başlar. </li><li> Doğru frekansta yenerek bir hücreyi seçin ve çerçeveleme boşluğuna taşıyın. </li><li> Tüm hücre yatay olarak yönlendirilmiş, pencerenin merkezinde böylece sarkomerlerin ap ile, kamera ve çerçeveleme açıklık ölçüleri ayarlayınebeveyn. <ol><li> Hücre uzunluğu için hücrenin kenarına (sağ ve sol) fotodiyot göstergeleri kırmızı ve yeşil ayarlayın. Hücrenin kenarlarında beyaz / siyah kontrast optimize etmek için kontrastı ayarlayın. Daha fazla ayrıntı için Ionoptix kılavuzuna başvurun. </li></ol></li><li> Iyi tanımlanmış sarkomerlerin ihtiva eden hücrenin bir alanda Kutuyu ve güç spektrumu (kırmızı) ve tepe optimize etmek için odak ayarlayın. Ayrıca mavi yumuşatma pencere ve siyah kontrast bilgilerini optimize etmek için mikroskop parlaklığını ayarlayın. </li><li> Kırmızı güç spektrumu (tepe noktası) ve mümkün olan en az arka planın kadar yakalamak için yeşil eşik çubukları ayarlayın. </li><li> Kayda başlamak. </li><li> Yeterli veri kaydedildikten sonra, geçici kaydı durdurmak için &quot;Pause&quot; a tıklayın ve izleme penceresinin odak ne boyutları ne değişmiş olmasını sağlamak, hiçbir hücre veya hücresel materyal olabilir hangi lamel bir alana mikroskop sahne taşımak görüldü. Lenkayıt gth araştırmacının deney protokolüne bağlı olarak değişir. <ol><li> Not: &quot;Dur&quot; tıklandığında Kaydı sonlandırmak ve hiçbir arka plan o hücre için kayıtlı olmak mümkün olacak. </li></ol></li><li> Bir arka plan ölçüm kaydetmek için &quot;Devam&quot; düğmesine tıklayın. </li><li> Yeterli arka plan Kaydı sonlandırmak için &quot;Durdur&quot; butonuna tıklayınız kaydedildikten sonra. </li><li> Tek bir. ZPT dosyasında bu hücre için tüm izlerini kaydetmek için &quot;Dosya &gt;&gt; Kaydet&quot; i tıklayın. </li><li> Yeterli hücre kaydedildi kadar 3.20 - 3.12 tekrarlayın adımları. </li><li> Kaydedilen verilerin analizi ile ilgili talimatlar için IonOptix-MMSYS Kullanım Kılavuzu 12 danışın. Vahşi tip kardiyomiyositlerin karakteristik kaydedilen veriler, Şekil 7&#39;de gösterilmiştir. </li></ol> 4. Patch Kelepçe Farklı hücre tipleri Patch sıkıştırma de bu dergide 25-28 daha önce tarif edilmiştir. Bu nedenle bazı eleştirmen odaklanmakyetişkin kardiyomiyositlerin başarılı yama sıkma için al parametreler bizim protokol tarif kullanılarak izole edilmiştir. <ol><li> Bir pipet çektirmenin ve borosilikat cam (filamanla: OD 1,5 mm, ID 0.86 mm - 10 cm uzunluğunda) kullanarak pipet çözüm (Tablo 5) ile doldurulduğunda ~ 2.0-3.0 MQ sergileyen bir pipet çekin. </li><li> Yangın lehçe hafifçe Narishige veya diğer düşey yangın parlatıcı kullanarak pipet ucu. Yama pipet direnci alev parlatma sonra 2-4 MO olmalıdır. </li><li> Bilgisayara, amplifikatör (Axopatch 200B), AD çevirici (Digidata 1440A, Axon Instruments) ve Mikromanipülatör (MP-285) açın. Tam hücre yama kenetleme için, daha önce tarif edildiği gibi standart parametreler ile başlar. </li><li> Kültürlü yetişkin CMS için, inkübatör bunları kaldırmak ve yavaşça CMs oda sıcaklığında PBS ile kaplanmıştır hangi lamel yıkayın. </li><li> Yavaşça lamel kaldırmak ve ters mikroskop (Nikon TE 2 perfüzyon odasında yerleştirin000). <ol><li> (Emme) perfüzyon sistemine ve çıkış için giriş sadece lamel yüzeyi üzerinde olduğundan emin olun. </li></ol></li><li> Uygun hücre dışı çözeltisi (Tablo 5) ile perfüze başlayın. </li><li> Taze ayrışmış yetişkin CMS için, yukarıdaki gibi perfüzyon sisteminde bir kollajen kaplı lamel yerleştirin. <ol><li> Hücreleri, sıvı içerisinde olacağından, yavaşça hücre tamponu ile çözüm değiştirin. </li></ol></li><li> Modifiye Pasteur pipet (Şekil 4) kullanılarak, yavaşça, hücre dışı tampon hücreleri tekrar süspansiyon bir kısım almak ve lamel üzerine yerleştirin. </li><li> Hücrelerin 4.4 olarak perfüzyon başlamadan önce 10-15 dakika boyunca birleşmeye izin verin. </li><li> Geri dolgu bir Microfil (Dünya Hassas Aletler, 28 G) iğne kullanılarak hücre içi tampon ile tüm hücre yama pipet. Hava kabarcığı pipet ucu vardır emin olun, hafifçe hava kabarcıkları $ tirilmi $ yüzey için yüzmesine izin dokununÇözeltinin ce. </li><li> Mikroelektrot ve iç çözümü arasında temas sağlamak, pipet-tutucuya dolu yama pipet takın. <ol><li> Biz gümüş klorür elektrotları kullanır, ancak çamaşır suyu gecede daldırarak gümüş teller en az haftada bir kez &#39;klorid edilmesine&#39; ilgileneceğim. </li></ol></li><li> Yavaşça banyo elektrot banyo / hücre dışı çözelti içinde her zaman batırılır sağlamak, banyo içine pipet indirin. Şu anda herhangi bir sıvı değme potansiyelleri ofset. Büyük kavşak potansiyeller elektrotlar üzerinde gümüş klorür bozulan bir belirtisi olabilir. </li><li> Sağlıklı silindirik yetişkin CMs mikroskop tespit ve görüş alanında ortalanır. Daha önce tarif edildiği gibi, mikromanipülatör hareket eden ve odak ayarlama bir arada yakın bir yama pipet yakınlık ve CM yüzeyi sağlar. <ol><li> Onlar aynı odak düzlemi kere, biz görsel bir arada kullanınhücre ve (Axopatch 200B mevcut) test darbesinin zasyon. </li><li> Pipet direnci (pipet hücrenin yüzeyi ile temas halinde olduğunu düşündüren) ve hücre silindirik bakmaya devam yarısında azalır sonra, hafif bir emme kullanılarak gigaohm sızdırmazlık tesis. </li><li> CMS için, negatif baskı kurmak için ağız emme tercih. Bir gigaseal başarıyla elde edilirse, biz yine bütün hücre yama modunu kurmak için hücreye &#39;break-in&#39; nazik ritmik ağız emme kullanmak. </li></ol></li><li> Sağlıklı CMS Tipik istirahat potansiyelleri -85 -90 mV sıralanmıştır. Bir gigaseal elde edildikten sonra, I = 0 Pa şimdiki kelepçe kullanarak istirahat membran potansiyelini ölçmek. <ol><li> Dinlenme membran potansiyeli depolarize olması durumunda bu, bozuk bir hücre ya da bir zayıf mühür gösterebilir. </li></ol></li><li> CMs yüzey alanının çok büyük hücreler olduğundan, dikkatli dikkat özellikle w, tazminat kapasitans için ödenmesi gerekiyorörneğin, sodyum kanalı olarak tavuk hızlı bir şekilde aktif hale akımları üzerinde çalışılacak gerekmektedir. Yeterli kapasite tazminat kullanılarak elde edilemezse çarkı üzerindeki tazminat ayarları yerleşik, alt eşik geriliminde prepulses ve zıt kutuplu uygulanmış ve kaydedilen sinyal çıkarılır çıkan cari gerekebilir. Böyle bir protokol kolayca Axopatch programlanmıştır. </li><li> Tam hücre yama modu bir kez kurulduktan sonra, dengeyi sağlamak için 15 dakika beklemek ve önceki başlangıç ​​voltaj ya da akım kelepçe protokolleri için, contanın istikrarı sağlamak için. Bu daha önce tarif edilmiştir, standart protokoller ve diğer dergi kullanımı ve bir değerlendirmeye olmayacaktır. </li></ol>

<ol><li>Chlopcikova, S., Psotová, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+rat+cardiomyocytes-a+model+for+the+study+of+morphological%2C+biochemical+and+electrophysiological+characteristics+of+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Papers%22%5BJournal%5D)">Neonatal rat cardiomyocytes-a model for the study of morphological, biochemical and electrophysiological characteristics of the heart.</a> Biomedical Papers. , (2001).</li>
<li>Rosenthal, N., Brown, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+ascending%3A+perspectives+for+human-disease+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The mouse ascending: perspectives for human-disease models.</a> Nat. Cell Biol. 9, 993-999 (2007).</li>
<li>Ballou, L. M., Lin, R. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapamycin+and+mTOR+kinase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Rapamycin and mTOR kinase inhibitors.</a> J. Chem. Biol. 1, 27-36 (2008).</li>
<li>Brette, F., Orchard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-Tubule+Function+in+Mammalian+Cardiac+Myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">T-Tubule Function in Mammalian Cardiac Myocytes.</a> Circ Res. , (2003).</li>
<li>Sakata, Y., Hoit, B., Liggett, S., Walsh, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decompensation+of+pressure-overload+hypertrophy+in+G%3Fq-overexpressing+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Decompensation of pressure-overload hypertrophy in G?q-overexpressing mice.</a> Circulation. , (1998).</li>
<li>Lieu, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absence+of+Transverse+Tubules+Contributes+to+Non-Uniform+Ca+2%2BWavefronts+in+Mouse+and+Human+Embryonic+Stem+Cell-Derived+Cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">Absence of Transverse Tubules Contributes to Non-Uniform Ca 2+Wavefronts in Mouse and Human Embryonic Stem Cell-Derived Cardiomyocytes.</a> Stem Cells and Development. 18, 1493-1500 (2009).</li>
<li>Lim, H., De Windt, L., Mante, J., Kimball, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversal+of+cardiac+hypertrophy+in+transgenic+disease+models+by+calcineurin+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Reversal of cardiac hypertrophy in transgenic disease models by calcineurin inhibition.</a> J. Mol. Cell Cardiol. 32 (4), 697-709 (2000).</li>
<li>Muthuchamy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+model+of+a+familial+hypertrophic+cardiomyopathy+mutation+in+alpha-tropomyosin+manifests+cardiac+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Mouse model of a familial hypertrophic cardiomyopathy mutation in alpha-tropomyosin manifests cardiac dysfunction.</a> Circ. Res. 85, 47-56 (1999).</li>
<li>Müller, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+of+the+cardiac+sodium+calcium+exchanger+promoter+in+adult+and+neonatal+cardiomyocytes+by+Nkx2.5+and+serum+response+factor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Cell.+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Differential regulation of the cardiac sodium calcium exchanger promoter in adult and neonatal cardiomyocytes by Nkx2.5 and serum response factor.</a> J. Mol. Cell. Cardiol. 34, 807-821 (2002).</li>
<li>Epstein, F., Hunter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+pathways+for+cardiac+hypertrophy+and+failure%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Signaling pathways for cardiac hypertrophy and failure.</a> New England Journal of Medicine. 341 (17), 1276-1283 (1999).</li>
<li>Snopko, R., Aromolaran, A., Karko, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+culture+modifies+Ca+2%2B+signaling+during+excitation-contraction+coupling+in+neonate+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Cell culture modifies Ca 2+ signaling during excitation-contraction coupling in neonate cardiac myocytes.</a> Cell Calcium. , (2007).</li>
<li>Ranu, H., Terracciano, C., Davia, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Na%2B%2FCa2%2B-exchanger+overexpression+on+excitation-contraction+coupling+in+adult+rabbit+ventricular+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Effects of Na+/Ca2+-exchanger overexpression on excitation-contraction coupling in adult rabbit ventricular myocytes.</a> J. Mol. Cell Cardiol. 34 (4), 389-400 (2002).</li>
<li>Kaab, S., Nuss, H. B., Chiamvimonvat, N., O'Rourke, B., Pak, P. H., Kass, D. A., Marban, E., Tomaselli, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ionic+mechanism+of+action+potential+prolongation+in+ventricular+myocytes+from+dogs+with+pacing-induced+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Ionic mechanism of action potential prolongation in ventricular myocytes from dogs with pacing-induced heart failure.</a> Circ. Res. 78 (2), (1996).</li>
<li>Splawski, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variant+of+SCN5A+sodium+channel+implicated+in+risk+of+cardiac+arrhythmia%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Variant of SCN5A sodium channel implicated in risk of cardiac arrhythmia.</a> Science. 297, 1333-1336 (2002).</li>
<li>Zhou, Y., Wang, S., Zhu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+and+adenoviral+infection+of+adult+mouse+cardiac+myocytes%3A+methods+for+cellular+genetic+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Culture and adenoviral infection of adult mouse cardiac myocytes: methods for cellular genetic physiology.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 279 (1), 429-436 (2000).</li>
<li>Sussman, M., Lim, H., Gude, N., Taigen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevention+of+cardiac+hypertrophy+in+mice+by+calcineurin+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Prevention of cardiac hypertrophy in mice by calcineurin inhibition.</a> Science. , (1998).</li>
<li>Heinzel, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impairment+of+diazoxide-induced+formation+of+reactive+oxygen+species+and+loss+of+cardioprotection+in+connexin+43+deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Impairment of diazoxide-induced formation of reactive oxygen species and loss of cardioprotection in connexin 43 deficient mice.</a> Circ. Res. 97, 583-586 (2005).</li>
<li>Li, X., Heinzel, F. R., Boengler, K., Schulz, R., Heusch, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+connexin+43+in+ischemic+preconditioning+does+not+involve+intercellular+communication+through+gap+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Cell.+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Role of connexin 43 in ischemic preconditioning does not involve intercellular communication through gap junctions.</a> J. Mol. Cell. Cardiol. 36, 161-163 (2004).</li>
<li>Rockman, H. A., Ross, R. S., Harris, A. N., Knowlton, K. U., Steinhelper, M. E., Field, L. J., Ross, J., Chein, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Segregation+of+atrial-specific+and+inducible+expression+of+an+atrial+natriuretic+factor+transgene+in+an+in+vivo+murine+model+of+cardiac+hypertrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Segregation of atrial-specific and inducible expression of an atrial natriuretic factor transgene in an in vivo murine model of cardiac hypertrophy.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88, 8277-8281 (1991).</li>
<li>Nakamura, A., Rokosh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LV+systolic+performance+improves+with+development+of+hypertrophy+after+transverse+aortic+constriction+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">LV systolic performance improves with development of hypertrophy after transverse aortic constriction in mice.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 281 (3), 1104-1112 (2001).</li>
<li>Boström, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+PGC1-%3F-dependent+myokine+that+drives+brown-fat-like+development+of+white+fat+and+thermogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A PGC1-?-dependent myokine that drives brown-fat-like development of white fat and thermogenesis.</a> Nature. 481, 463-468 (2012).</li>
<li>Liao, R., Jain, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+culture%2C+and+functional+analysis+of+adult+mouse+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Isolation, culture, and functional analysis of adult mouse cardiomyocytes.</a> Methods Mol. Med. 139, 251-262 (2007).</li>
<li>Volz, A., Piper, H. M., Siegmund, B., Schwartz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longevity+of+adult+ventricular+rat+heart+muscle+cells+in+serum-free+primary+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Cell.+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Longevity of adult ventricular rat heart muscle cells in serum-free primary culture.</a> J. Mol. Cell. Cardiol. 23, 161-173 (1991).</li>
<li>Guatimosim, S., Guatimosim, C., Song, L. -S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGuatimosim%2C+S+%22Methods+in+Molecular+Biology%22">Methods in Molecular Biology</a>. 689, Humana Press. 205-214 (2010).</li>
<li>Yang, J., Delaloye, K., Lee, U. S., Cui, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch+Clamp+and+Perfusion+Techniques+for+Studying+Ion+Channels+Expressed+in+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes.</a> J. Vis. Exp. (47), e2269(2011).</li>
<li>Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch+Clamp+Recording+of+Ion+Channels+Expressed+in+Xenopus+Oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in Xenopus Oocytes.</a> J. Vis. Exp. (20), e936(2008).</li>
<li>Arman, A. C., Sampath, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch+Clamp+Recordings+from+Mouse+Retinal+Neurons+in+a+Dark-adapted+Slice+Preparation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation.</a> J. Vis. Exp. (43), e2107(2010).</li>
<li>Wen, H., Brehm, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paired+patch+clamp+recordings+from+motor-neuron+and+target+skeletal+muscle+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Paired patch clamp recordings from motor-neuron and target skeletal muscle in zebrafish.</a> J. Vis. Exp. (45), e2351(2010).</li>
<li>Maier, S., Westenbroek, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+unexpected+role+for+brain-type+sodium+channels+in+coupling+of+cell+surface+depolarization+to+contraction+in+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">An unexpected role for brain-type sodium channels in coupling of cell surface depolarization to contraction in the heart.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (6), 4073-4078 (2002).</li>
<li>Shroff, S. G., Saner, D. R., Lal, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+micromechanical+properties+of+cultured+rat+atrial+myocytes+measured+by+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Dynamic micromechanical properties of cultured rat atrial myocytes measured by atomic force microscopy.</a> Am. J. Physiol. 269, 286-292 (1995).</li>
<li>Domke, J., Parak, W. J., George, M., Gaub, H. E., Radmacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+the+mechanical+pulse+of+single+cardiomyocytes+with+the+atomic+force+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22European+Biophysics+Journal%22%5BJournal%5D)">Mapping the mechanical pulse of single cardiomyocytes with the atomic force microscope.</a> European Biophysics Journal. 28, 179-186 (1999).</li>
<li>Smith, B. A., Tolloczko, B., Martin, J. G., Grütter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+Viscoelastic+Behavior+of+Cultured+Airway+Smooth+Muscle+Cells+with+Atomic+Force+Microscopy%3A+Stiffening+Induced+by+Contractile+Agonist%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Probing the Viscoelastic Behavior of Cultured Airway Smooth Muscle Cells with Atomic Force Microscopy: Stiffening Induced by Contractile Agonist.</a> Biophysical Journal. 88, 2994-3007 (2005).</li>
</ol>

Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.

Bu yazıda, fare kalp başarılı izolasyonu ve yetişkin CMS kültürü için gerekli teknikleri tarif var. Bizim teknik, yukarıda tarif edilen metotlar kullanılarak CM fonksiyon uyarılma ve daha sonra çalışma için izin verir. Yetişkin CMS işlevselliğini eğitim için kritik parametre izole CMS sağlık ve kalitesidir. Yukarıda tarif edildiği gibi, teknik adenoviral / lentiviral kültüründe enfeksiyonları ve hücresel uyarılımın ve kontraktil fonksiyon analizi kullanılarak gen ekspresyonunun manipülasyon için uygun olan fonksiyonel b...

Kalp-damar hastalığı olan kemirgen modellerinde potansiyel terapötik hedefler 1,3 belirlenmesi için temel bir hastalık mekanizmalarının 1,2 açıklık yanı sıra için etkili araçlar olarak hizmet etmişlerdir. Özellikle, (örneğin basınç aşırı olarak) edinilmiş kalp hastalıklarının hem kemirgen modellerinde 4,5 ve transgenik fare modellerinin kullanımının kalp hastalığı 6-8 anlayışımızı gelişmiş var. Tek hücre düzeyinde kalp 11-13 hücre uyarılabilirliğini ve uyanlma-kasılma kaplin altında yatan tek tek proteinler de sinyal iletim 3,9,10 ve değişiklikler çalışma hücre kültürü tekniklerinin kullanımı in vivo fare modelleri tamamlayıcı var. Bununla birlikte, yetişkin CM yapısı ve fonksiyonu yansıtır yeterli hücre çizgilerinin olmaması önemli bir sınırlama olmuştur. Araştırmacılar, heterolog sentezleme sistemlerinde, örneğin iyon kanalları gibi tek tek proteinler, inceleyerek bu üstesinden gelmek çalışmışlardır <sup&gt; 14, ve bu çalışmalar iyon kanal biyofizik veya protein kaçakçılığı, CMS yerli mikro yetersiz temsili açısından yararlı bilgiler bize vermiş ise önemli bir kısıtlamadır. İkinci olarak, bu heterolog hücrelerin çoğu olgun bir kasılma aparatı yok çünkü, bu kasılma fonksiyonunu ve hücresel uyarılmayı ve daralma arasındaki karmaşık etkileşimi incelemek mümkün olmamıştır. Bu nedenle araştırmacılar, in vitro fonksiyonel çalışmaların çoğu için temel kardiyak hücre kültürlerine döndü. Son olarak, izole kardiyomyosit çalışmalar skar veya fibrozis ve fiber yönlendirme etkisi dahil çok hücreli hazırlık faktörlerin olmayan kasılma fonksiyonu değerlendirmesini sağlar. İlköğretim yenidoğan sıçan ventrikül kardiyomiyositler (NRVMs) kültür nispeten kolay, gen ifadesini 15 işlemek için adenovirüslerden ve lentivirüsler ile enfekte olabilir olduğu birnd nedenle başarıyla 1 kullanılır, ancak kendi sınırlamaları var olmuştur. Bir fizyolojik mikroortam 1 ​​sağlamak ve sinyal alanın beygir olmasına rağmen, morfoloji ve NRVMs ve yetişkin cardiomyoctyes subselüler örgüt arasındaki önemli farklar onları erişkin kalp iyonik eritici ve uyarılma-kasılma kenet soruşturma için yetersiz bir model yapmak . En önemlisi NRVMs kesin bir t-tüp şeklindeki alt sistem 4 yoksundur. Ca 2 + akı ve dinamikleri olgun t-boru ve sarkoplazmik retikulum (SR) yapısı 6, Ca 2 + dinamikleri ve NRVMs yılında kalp kasılmasında fonksiyonel çalışmalarda kritik bağımlı olduğundan erişkin kardiomyositlerindeki bu kritik süreçlerin doğru bir yansıması değildir. Ayrıca, sinyal yollarının bazı bileşenler, böylece başka bir hastalık süreçlerini incelemek için sınırlama ve i sağlayarak, yenidoğan ve yetişkin farelerin 9 arasında farklılıkNRVMs hücresel uyarılmayı ve kasılma Mpact. Son olarak, kasılma makine dağıtım kontraktil ölçümlerin doğruluğunu sınırlayan çok yönlü ve düzgün olmayan hücre kısalmasına yol açar. Izole edilmiş yetişkin kardiyomiyositlerde kullanılması bu nedenle, daha doğru bir in vitro model sistemi sağlar. Farelerin genetik manipülasyonu ile mümkün bilginin olağanüstü büyüme farelerden izole edilmiş fonksiyonel kardiyomiyositlerde elde önemini vurgulamaktadır. Aslında, fare modellerinde izole yetişkin CMS karakterizasyonu birçok biyolojik ve patolojik olaylara ışık tutmuştur. Transgenik fare modellerinde izole CMs ve böylece de elde edilen bilgiler tamamlayıcı, iskemi / reperfüzyon 17,18 gibi hastalık modellerinde kazanç ya da proteinlerin fonksiyon kaybı tek hücre 2,16 kasılma özelliklerini ve canlılığı çalışmaları için izin in vivo çalışmalardase fareler. Ya da (fizyolojik hipertrofisi modelleme için) egzersiz 5,21 incelenmesi için izin verir (mimikler hipertansiyon veya aort kapak darlığı böyle enine aort daralma kaynaklı basınç yüklenmesi gibi) edinilmiş kalp hastalığı 3,19,20 sıçan modellerinde izole erişkin CMS Kullanımı tek hücre düzeyinde hücresel uyarılımın ve uyanlma-kasılma kaplin ile bu işlemlerde rol sinyal iletim etkileşimi. Ayrıca, yetişkin CMS adenoviral odaklı gen ifadesi kullanılarak gen ifadesini işlemek için yeteneği bize karmaşık sinyal yollarının bileşenlerini incelemek için fırsat tanıyor. Elektrofizyolojik bir perspektiften bakıldığında, tüm hücre voltaj ve izole yetişkin CMS güncel kelepçe deneyler Başlangıçta iyonik akılarının doğasını durulaştırmada ve çeşitli hastalık durumlarında kritik olmuştur. Nedeniyle hücre zarının karmaşık yapısı ve diferansiyel proteYetişkin Cms ve NRVMs ya da heterolog hücre hatları arasında iskele yapılarda, yetişkin hücrelerin yama yeteneği belirli zar proteinleri, yapısal proteinler, ve yetişkin kalp elektrofizyolojik parçaları üzerinde iyon kanalı etkileşim ortaklarının etkileri çok daha iyi bir temsilini verir. , Yetişkin kemirgen kardiyomiyositlerin okuyan tecrit ve yetişkin fareler kardiyomiyositler zorlu olmuştur kültüre, canlı fare kardiyomiyositlerin izole etmek ve viral kullanarak daha fazla genetik manipülasyon izin kültür onları korumak için metodoloji sistematik ve doğru açıklama için ihtiyaç çağıran böyle önemli avantajlara rağmen vektörleri. Önceki çalışmalar akut izole fare yetişkin CMS veya kültür sıçan yetişkin CMS ya kullandık. İkincisi yetişkin fare cm daha kültüre kolaydır ve in vitro olarak gen ifadesini manipüle en deneyleri sıçan yetişkin cm kullandık. Birkaç çalışmaları başarıyla değişmiş ve functi araştırdıkdeneyler kapsamında büyük bir sınırlama sunulması yetişkin fare CMS onal gen ifadesi. Bu nedenle, burada detaylı olarak izolasyon 7,8,22, kültür 3,10,15,23, adenoviral enfeksiyon 11-13,15 ve yetişkin fare ventriküler cardiomyoctyes fonksiyonel analizi için önceki soruşturmalarda modifiye gibi metodolojileri, mevcut. Bu izolasyon protokolünün kadar 72 saat boyunca başarılı bir şekilde kültürlendi ve geçici olarak adenovirüs ile transfekte sahip Ca2 +-dayanıklı, uyarılabilen kardiyomiyositlerde sonuçlanır. Bu izole edilmiş hücrelere ait işlevleri MMSYS 14,24 ve görüntüleme sistemi ayrıca tartışılacaktır yama kelepçe kullanılarak değerlendirilebilir.

<table><tbody><tr><td>Sodyum Klorür</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum Klorür</td><td>Sigma</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>Magnezyum Klorür</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Fosfat Monobazik</td><td>Sigma</td><td>S8282</td><td></td></tr><tr><td>D-glikoz minimum</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Taurin</td><td>Sigma</td><td>T0625</td><td></td></tr><tr><td>2,3-Bütandion monoksit</td><td>Sigma</td><td>B0752</td><td></td></tr><tr><td>Kollajenaz B</td><td>Roche Uygulamalı Bilimler</td><td>11088807001</td><td></td></tr><tr><td>Kollajenaz D</td><td>Roche Uygulamalı Bilimler</td><td>11088858001</td><td></td></tr><tr><td>Streptomyces griseus Sigma'dan Proteaz XIV</td><td>Sığır Serumu Sigma'dan</td><td></td> P5147 <td></td></tr><tr><td>Albümin</td><td></td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Kalsiyum Klorür</td><td>Sigma</td><td>C8106</td><td></td></tr><tr><td>Minimum Esansiyel Medya</td><td>Sigma</td><td>51411C</td><td></td></tr><tr>Sığır serumu <td>Sigma</td><td>A8412</td><td></td>L-glutamin<td>Sigma'dan elde edilen albümin çözeltisi</td></tr><tr><td></td><td></td><td>G3126</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>İnsülin-transferrin-sodyum selenit ortamı ek</td><td>Sigma</td><td>I1884</td><td></td></tr><tr><td>Sezyum Klorür</td><td>Sigma</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/289329?lang=en&amp; region=US" target="_blank">289329</a></td><td></td></tr><tr><td>Glutamat</td><td>Sigma</td><td>G3291</td><td></td></tr><tr><td>Adenozin 5'-trifosfat magnezyum tuzu</td><td>Sigma</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>Etilen glikol-bis(2-amin&#8211; thylether)-N, N, N ', N'-tetraasetik asit</td><td>Sigma</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Sezyum Hidroksit Çözeltisi</td><td>Sigma</td><td>232041</td><td></td></tr><tr><td>Tetraetilamonyum hidroksit çözeltisi</td><td>Sigma</td><td>86643</td><td></td></tr><tr><td>OptiVisor optik cam dürbün vizörü</td><td>Dohegan Optik Şirketi A.Ş.</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Doku forsepsleri, 5.5", 1x2 dişler</td><td>Roboz Scientific</td><td>RS-8164</td><td></td></tr><tr><td>Moloney forseps - 4.5" (11.5 cm) uzunluğunda hafif eğri, tırtıklı </td><td>Roboz Scientific</td><td>RS-8254</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #3 Forseps, Dumostar, uç boyutu 0.17 x 0.10mm</td><td>Roboz Scientific</td><td>RS-4966</td><td></td></tr><tr><td>Paketleyici Sivrisinek Forseps 5" Düz Düz</td><td>Roboz Scientific</td><td>RS-7114</td><td></td></tr><tr><td>Mikro Diseksiyon Makası 4.5" Kavisli Keskin/Keskin </td><td>Roboz Scientific</td><td>RS-5917</td><td></td></tr><tr><td>Mikro Diseksiyon Makası 3.5" Düz Keskin/Keskin20mm</td><td>Roboz Scientific</td><td>RS-5907</td><td></td></tr></tbody></table>

İzolasyon, kültür ve yetişkin fare cardiomyoctyes fonksiyonel karakterizasyonu

Isolation, Culture, and Functional Characterization of Adult Mouse Cardiomyoctyes

Kültür birincil kardiyomiyositlerindeki (CMS) kullanımı, kalp hastalığı anlayışımızı ilerleyen kalp hastalığı olan kemirgen modellerinde güçlü bir tamamlayıcı sağladı. Özellikle, hasta koşulları ve hastalığa neden olan mutasyonlar ile iyon homeostazı, iyon kanalı fonksiyonu, hücre uyarılabilirliğini ve uyanlma-kasılma kuplajı ve değişiklikler çalışma yeteneği kalp hastalıkları hakkında önemli bilgiler sağlamıştır. Ayrıca, kültür yetişkin CMS taklit etmek yeterli ölümsüzleştirdi hücre hattı eksikliği ve yenidoğan CMS sınırlamaları (erişkin CMS yapısal ve işlevsel biyomekanik özelliği nedeniyle birçok eksikliği olan), sinyal yolları arasındaki karmaşık etkileşimin anlayışımızı engel var iyon kanalları ve erişkin izole kardiyomiyositlerin okuyan önemini güçlendirilmesi erişkin kalp kasılma özellikleri. Burada, adenoviral-Expre ile gen ekspresyonunun izolasyon, kültür, manipülasyon için yöntemler sunmakssed proteinleri ve erişkin fare kardiyomiyositlerin sonraki fonksiyonel analiz. Bu tekniklerin kullanımı hücresel eksitabilitesi düzenleyen yolları, Ca 2 + dinamiklerini ve kasılma sinyalizasyon içine mekanik anlayış geliştirmek ve kardiyovasküler hastalık çok daha önemli fizyolojik karakterizasyonu sağlamak için yardımcı olacaktır.

Çubuk şeklinde, çizgili ve (kendiliğinden dayak değil) hareketsiz hücrelerde (Şekil 5A) yetişkin cardiomyoctyes sonuçlarının izolasyonu. Ölü hücreleri yuvarlak bakmak ve hiçbir çizikleri mevcut olacaktır. Hareketsiz hücreler kültürlendi ve gen ekspresyonu (Şekil 5B ve 5C) işlemek için adenovirüs ile transfekte edilmiş olabilir. Kültür 24 saat, canlı hücrelerin morfolojisi değişmez sonra hala Ca2 +-toleranslı ve bunlar saha uyarısıyla tempolu edilebilir. Öneri...

Burada bir perfüzyon Langendorff sistemi kullanılarak erişkin fare cardiomyoctyes izolasyonunu tarif eder. Elde edilen hücreler, + toleranslı elektriksel olarak hareketsiz Ca2 ve kültürlenmiş ve adeno-veya gen ekspresyonunu değiştirmek için lentivirüsler ile transfekte edilmiş olabilir. Bunların işlevi de MMSYS sistemi ve yama kelepçe teknikler kullanılarak analiz edilebilir.

İzolasyon, Kültür ve Yetişkin Fare Cardiomyoctyes Fonksiyonel Karakterizasyonu

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of ...

Bu prosedürün genel amacı, erişkin ayna kardiyomiyositlerini izole etmek, kültüre etmek ve kasılma ile kalsiyum yönetimi süreçlerini görselleştirmektir. Bu işlem, öncelikle fare kalbinin çıkarılıp oda sıcaklığındaki PBS içine yerleştirilmesiyle gerçekleştirilir; kalp, şemada gösterildiği gibi kap içinde veya videoda olduğu gibi doğrudan perfüzyon sistemine bağlı iğne üzerinde kanüle edilebilir.Üçüncü adım, sistemden perfüzyon, tampon ve ardından enzim tamponu pompalayarak kalbi yıkamak ve sindirmektir. Son adım ise ventrikülleri bir transfer tamponu kabına kesmek ve dokuyu pens yardımıyla nazikçe kıymık haline getirmektir. Nihayetinde, sonuçlar tüm hücre ve/veya sarkomer uzunluk ölçümleri ile rasyometrik analizler aracılığıyla bireysel kardiyomiyosit hücre kasılmasını ve kalsiyum yönetimini gösterebilir.İyon optik sistemi ile RO 2:00 AM gibi kalsiyum indikatörleri. Genellikle bu yöntemde yeni olan kişiler, damara veya kalbin kendisine zarar vermeden kalbi aorta üzerinden hızlıca asmanın zorluğu nedeniyle güçlük çekerler. Yaklaşık 12 haftalık yetişkin farelerin abdominal boşluğuna 150 USP heparin sodyum enjekte edin.Fare eğerle dehidre olmuşsa, bir cc salin solüsyonu enjekte edin. Fareyi, ağırlığa bağlı dozda ketamin ksilazin karışımı enjekte ederek anesteziye alın. Farelerin, arka ekstremite ayak parmağı sıkıştırma refleksinin kaybı ve solunum hızının yavaşlaması yoluyla derin anestezi altında oldukları kontrol edilir. Sedate edilmiş fareyi operasyon pedine sabitleyin, ardından kalbi çıkarıp fizyolojik salin içeren bir kaba yerleştirin.Opti vision diseksiyon gözlüklerini kullanarak aortu tanımlayın ve açığa çıkarın. Hücre izolasyonu için aort çevresindeki dokunun temizlenmesi gerekmemektedir. Aort kökü net bir şekilde göründüğü sürece, pompayı perfüzyon tamponu ile hazırlayın.Hatları doldurmak ve kabarcık olmadığını kontrol etmek için hızlı hızda pompalama yapmaya başlayın. Ardından, kalp perfüzyonu için akış hızını ayarlamak amacıyla düşük hızda pompalama yapın. Perfüzyon tamponunun sıcaklığını 37 °C'de tutmak için sirkülasyonlu bir su banyosu kullanın.Aortu bir çorap gibi iğnenin üzerine yerleştirmek için mikro diseksiyon pensi kullanın. İğnenin ucunun asendan aortta, ideal olarak sağ innominat damarın distalindeki aort kökünde olduğundan emin olun. Ardından, aortun üst kısmına 10 santimetre uzunluğunda bir sutur ipeği bağlayarak kalbi iğneye sabitleyin.Bağlamanın, sağ innominat arterin altında, asendan aorta seviyesinde olduğundan, ancak aynı zamanda iğnenin ucunun ve aort kapağının üzerinde olduğundan emin olun. Şimdi kalbi konik kabın içine indirin. Bu, ortam sıcaklığının korunmasına yardımcı olur.Kalbi, dakikada 1 mL hızla beş dakika boyunca perfüzyon tamponu ile perfüze edin ve perfüzyon sıvısının konik camda toplanarak kalbi çevrelemesini sağlamak için cam hazne çıkışını kapatın. Bu aşamada, kalbin hacminin arttığını görmelisiniz. Ayrıca, kalp dokusundaki kanın yerini perfüzyon sıvısının alması dokuda solgunluğa neden olacaktır.Hortumu perfüzyon tamponu kabından enzim tamponu kabına taşımak için pompayı durdurun. PERFU sekizini boşaltmak için çıkış klembini serbest bırakın. Kalbi perfüze etmeye başlamak için pompayı yeniden çalıştırın.Enzim tamponu akış hızı dakikada bir mililitre olacak şekilde, enzim tamponunun kalbi çevrelemesine izin vermek için çıkış hattını tekrar klempleyin. Enzim kalbe perfüze olurken ve bağ dokusunu sindirirken, kalp soluklaşacak ve yapısal bütünlüğü azalacaktır. Yeni başlayanlar için perfüzyon hattını bir manometre ile bağlamak faydalıdır.Manometre, iğnenin konumunun aort kapağının üzerinde olduğundan ve ventrikül içinde olmadığından emin olmak için de kullanılabilir. Düşük basınç, iğnenin ventrikül boşluğunda olduğunu; yüksek basınç ise iğnenin kapağa temas ettiğini gösterir. Kalp sindirilirken, bağ dokusu direnci koruyamadığı için basınç hızla düşecektir.Sindirilmiş kalpten ventriküllerin ne zaman kesileceğini belirlemek için, kalbi konik camdan kaldırın, pensle kalbi hafifçe sıkın ve kontrol etmek için küçük bir Petri kabına birkaç damla PERFU sekiz toplayın. Eğer 8 ila 10 dakika içinde tekil hücreler damlıyorsa, ventriküler basınç düşmüş demektir ve tekil hücrelerin Perfu sekize girdiğini görebilmeniz gerekir. Bunlardan herhangi biri ilk kez görüldüğünde, daha homojen bir hazırlık için ventrikülleri kalpten kesin ve transfer tamponu A ile dolu bir kaba alın.Sağ ventrikülü kesip çıkarın ve kıyıp incelemek üzere sol ventrikülü geride bırakın. Sağ ventrikül ile ilgileniliyorsa, ayrılmadan sonra kıyılabilir. Mikro diseksiyon pensleri kullanarak her bir ventrikülü ayrı ayrı kıyın. Başarılı bir sindirim işlemi, kıyma işleminden sonra neredeyse hiç katı doku parçası bırakmayacak ve dokunun çoğu disosyasyon sonrası amorf hale gelecektir.Dokuyu daha fazla ayrıştırmak için, ucu kesilmiş plastik bir pastör pipeti aracılığıyla akıtın. 45 derecelik bir açıyla, kare gözenekli bir eleği kıskaçlar kullanarak küçük bir huniye sabitleyin ve bu filtreleme düzeneğini 15 milliliterlik bir tüpe yerleştirin. Hücre solüsyonunu kaptan almak için modifiye edilmiş pastör pipetini kullanın ve solüsyonu 15 milliliterlik tüpe filtreleyin.Canlı hücrelerin tüpün dibine çökmesi için birkaç dakika bekleyin. Hacmin iki tüpe bölünmesi daha hızlı sonuç verir. Ali'den sonra pelletleme işlemi yapılır.Dört ayrı 15 mililitrelik tüpe, dört farklı kalsiyum çözeltisinin her birinden 2,5 mililitre aktarın. Çökmüş hücre peletini ilk kalsiyum çözeltisine dikkatlice aktarmak için standart pipet kullanın. Hücrelerin tüpün dibine çökmesini bekleyin ve işlemi tekrarlayın.Çöken hücrelerin her bir kalsiyum çözeltisi aracılığıyla aktarılması. Hücreler dördüncü kalsiyum çözeltisine aktarıldığında, tüpün kapağını kapatın ve tüpü yan çevirin. Ark lambasının öncelikle başlatıldığından emin olarak MM SIS sistemine güç verin.Ardından sistemi kalsiyum tamponu B ile hazırlayın. Pompadan gelen tüpleri MM cis odasının uygun giriş ve çıkışlarına bağlayın. Odaya, genellikle 20 x 25 milimetre boyutlarında, uygun büyüklükte bir cam lameli sabitleyin. Hücre çözeltisinden 500 µL miktarını küçük bir eppendorf tüpüne aktarın.Odayı kararttıktan sonra hücrelere 0,5 µL PHE 2:00 AM ekleyin ve oda sıcaklığında, karanlıkta beş ila yedi dakika inkübe edilmelerini sağlayın. Şimdi, kamberden kalsiyum tamponu B'yi dikkatlice akıtmaya başlayın. Akış başlatıldıktan hemen sonra, kamber sıcaklığını 37 °C'ye çıkarmaya başlayın.Hücre konsantrasyonuna bağlı olarak, modifiye edilmiş bir pipet kullanarak lamıcam üzerine bir veya iki damla hücre solüsyonu yükleyin ve hücrelerin çökelmesini bekleyin. Odacık içindeki hücre yoğunluğu, tekil ve üst üste binmemiş hücrelerin veri toplama platformunda kolayca görülebileceği şekilde olmalıdır.Odacığın bağlantı kabloları aracılığıyla myo Pacer'a bağlı olduğundan emin olun ve deney için voltaj ile frekans ayarlarını yapmaya başlayın. Doğru frekansta atan bir hücre seçin ve bunu çerçeveleme açıklığına taşıyın. Tüm hücrenin, sarko aynaları görünecek şekilde yatay olarak yönlendirilmiş pencerenin merkezinde yer alması için kamerayı ve çerçeveleme açıklığı boyutlarını ayarlayın.Ardından, kutuyu hücrenin belirgin sarkomerler içeren bir bölgesine yerleştirin ve güç spektrumunun zirvesini optimize etmek için odak ayarını yapın. Ayrıca, mavi yumuşatma penceresini ve siyah kontrast bilgisini optimize etmek için mikroskobun parlaklığını ayarlayın. Fotomültipliyeri açın ve kayda başlayın.Yeterli veri kaydedildikten sonra, kaydı geçici olarak durdurmak için duraklat'a tıklayın. Durdur'a tıklamayın. Bu işlem kaydı sonlandıracaktır ve söz konusu hücre için herhangi bir arka plan kaydedilemeyecektir.Şimdi, görüntüleme penceresinin odağını veya boyutlarını değiştirmeden, mikroskop tablasını lamine üzerindeki herhangi bir hücrenin veya hücresel materyalin görülmediği bir alana taşıyın. Ardından, arka plan ölçümünü kaydetmek için "resume" butonuna tıklayın. Yeterli arka plan verisi kaydedildikten sonra, kaydı sonlandırmak için "stop" butonuna tıklayın.Ardından, o hücreye ait tüm izleri tek bir ZPT dosyasına kaydetmek için dosya kaydet'e tıklayın. Erişkin kardiyomiyositlerin izolasyonu, kendiliğinden atmayan, çubuk şeklinde, çizgili ve kuiesent hücrelerle sonuçlanır; ok başı, çizgilemesi olmayan yuvarlak ölü hücreleri göstermektedir. Kuiesent hücreler kültüre edilebilir ve gen ekspresyonunu manipüle etmek için adenovirüs ile transfekte edilebilir. 24 saatlik kültürden sonra canlı hücrelerin morfolojisi değişmez.Bunlar hâlâ kalsiyuma toleranslıdırlar ve alan stimülasyonu ile hızlandırılabilirler. %85 ila %90 oranında canlı hücre verimi elde etmek mümkündür. Miyositlerin kontraktilitesini ve kalsiyum geçişlerini ölçmek için vahşi tip C 57 black six faresinden alınan hücrelerle MM SIS sistemi kullanılmıştır. Eş zamanlı olarak.Kontraktilite ve kalsiyum yönetimi ölçümleri, fira 2:00 AM'in bağlı ve bağlı olmayan formlarının oranının ölçülmesiyle yapılmıştır; oran ölçümleri düzenekler arasında hafifçe farklılık gösterebilir, ancak sağlıklı hücreler genellikle 1,5 ile 2,5 arasında skor alır. Kontraktilite ve kalsiyum izlerinden elde edilen verileri analiz etmek için, her bir hücre için karakteristik bir iz oluşturmak amacıyla izlerin ortalaması alınmıştır. sys yazılımında bulunan bir mono transient veri analiz algoritması kullanılarak, karakteristik izlerden sistolik ve diyastolik fonksiyon parametreleri oluşturulmuştur.Bu videoyu izledikten sonra, tekil yetişkin deniz kardiyomiyositlerinin nasıl izole edileceğine dair iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

isolation-culture-functional-characterization-adult-mouse

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Birincil fare kardiyomyosit kültürleri miyofibriler organizasyon ve fonksiyon soruşturma için önemli araçlardan biridir. Aşağıdaki protokol neonatal fare kalpleri birincil kardiyomiyositlerde izolasyonunu ve kültür açıklar. Elde edilen kültürler, daha sonra kardiyomiyosit biyomekanik, biyokimyasal ve hücre-biyolojik tahlillerin çeşitli için kullanılabilmektedir.

İzolasyon ve Kültür Yenidoğan Fare kardiyomiyositlerin

Yabani tip ve mutant farelerden alınan bireysel kardiyomiyositler, kasılmalarını ve kalsiyum geçişlerini incelemek için kalpten izole edilebilir. Bu, hücresel disfonksiyonun herhangi bir nedenden dolayı kalp disfonksiyonuna katkısının karakterizasyonuna izin verir.

Fare kardiyomiyositlerde İzolasyon ve Fizyolojik Analizi

Biz yetişkin fare kardiyomiyositlerin izolasyonu için güvenilir bir yöntem açıklanmaktadır. Bu protokol, genetik olarak tadil edilmiş farelerin çeşitli fonksiyonel yetişkin kardiyomiyositlerde kültürü için tutarlı bir sonuç elde edilir.

İzolasyon ve Kültür Yetişkin Fare Hücre Sinyal için kardiyomiyositlerin ve<em&gt; In vitro</em&gt; Kalp hipertrofisi

Bu protokol, yüksek verim, saflık ve canlılığa sahip yetişkin fare kardiyomiyositlerinin tekrarlanabilir izolasyonu ve uzun süreli kültürü için adım adım bir yöntemi açıklar.

İzolasyon, Kültür ve Yetişkin Fare kardiyomiyositlerde İletimi

Yöntemler yama kelepçe elektrofizyoloji veya görüntüleme çalışmaları için yetişkin farelerin sinoatriyal düğüm miyosit (SAMs) izolasyonu için gösterilmiştir. İzole edilmiş hücreler, doğrudan kullanılabilir ya da bu tür genetik olarak kodlanmış muhabir olarak ilgi proteinlerin ekspresyonuna izin vermek için kültür içinde muhafaza edilebilir.

Yetişkin fareler ile Sinoatriyal Düğüm miyositlerin İzolasyonu, Kültür ve Fonksiyonel Karakterizasyonu Yöntemleri

Bu makalede genel izolasyon, karakterizasyonu ve kardiyak kök hücreleri (CSCs) Yetişkin fare kalp farklılaşma için protokolü standartlaştırmak için hedeftir. Burada, fare CSCs yalıtmak için bir yoğunluk degrade Santrifüjü yöntemi ve CSC kültür, yayılmasını önleme ve farklılaşma cardiomyocytes içine hazırlanmış yöntemlerini açıklar.

Yalıtım, karakterizasyonu ve yetişkin fare kalp kalp kök hücre farklılaşma

Bu protokol, bir öbek sindirim yaklaşımı kullanarak yetişkin fare kalbi tek atriyal kardiyomiyositler izole etmek için kullanılır. Bu yaklaşım, yama kelepçe çalışmalarında atriyal miyosit elektrofizyolojisini karakterize etmek için kullanılabilecek sağ veya sol atriyal miyositleri izole etmek için kullanılır.

Yetişkin fareler atriyal Miyoksit izolasyonu

Burada, yetişkin fare ve sıçan kardiyomiyositlerinin izolasyon, transfeksiyon ve uzun vadeli kültürü için bir protokol sıyoruz.

İzolasyon, Transfeksiyon ve Yetişkin Fare ve Sıçan Kardiyomiyositlerinin Uzun Süreli Kültürü

Miyositlerin ve miyosit olmayanların tek bir yetişkin fare kalbinin hem atria hem de ventriküllerinden eşzamanlı izolasyonu için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu protokol, yüksek oranda uygulanabilir kardiyak miyositlerin ve miyosit olmayanların tutarlı verimini sağlar ve fenotipleme ve in vitro analiz için en uygun hücreye özgü kültür koşullarını detaylandırmaz.

Yetişkin Fare Kalbinden Atriyal Miyositler, Ventrikül Miyositleri ve Miyosit Olmayanların Eşzamanlı İzolasyonu ve Kültürü

Kardiyolojide hücresel ve moleküler fonksiyonel deneyler için altın standart kardiyomiyositlerdir. Bu makalede, fare kardiyomiyositlerini izole etmek için Langendorff dışı tekniğe yapılan uyarlamalar açıklanmaktadır.

Fare kardiyomiyositlerini sürekli olarak izole etmek için basit ve etkili bir yöntem

Keşfedin yetişkin fare kardiyomiyositlerinin Langendorff perfüzyon sistemiyle izolasyonunu ve fonksiyonel karakterizasyonunu. Bu yöntem, kalp fonksiyonu ve gen ekspresyonu araştırmaları için Ca2+ toleranslı hücreler sağlar.

İzolasyon, Kültür ve Yetişkin Fare Cardiomyoctyes Fonksiyonel Karakterizasyonu

Daha fazla video keşfet