Protozoa astarlanmış Bakteriler ile uysal Memeli Hücre Enfeksiyonlar

Bu prosedürün genel amacı, memeli konakçı hücrelerinin müteakip enfeksiyonu için bir ara konakçıdan floresan olarak izlenebilir bakterileri hasat etmek ve ölçmektir. Burada GFP'yi eksprese eden Legionella mala, doğal konakçı protozoan acan amip, castellani tek tabakalarını enfekte etmek için kullanılır. El mala daha sonra seçici lizis ile hasat edilir ve bakteri konsantrasyonu daha sonra protozoanın floresan emisyon seyreltmesine dayalı bir formül kullanılarak hesaplanır.

Astarlanmış bakteriler daha sonra memeli hücre tek katmanlarını enfekte etmek için kullanılır. Son olarak, memeli hücrelerindeki bulaşıcı bakteri sayısı, koloni oluşturan birimleri geri kazanmak için floresan mikroskobu, akış sitometrisi ve kaplama lizatlarının bir kombinasyonu kullanılarak belirlenir. Elde edilen veriler, yapay ortamda yetiştirilen aynı suşla karşılaştırıldığında, hazırlama aşamasında protozoan hücrelerde yetiştirilen bakteriler için kazanılan patojenik bir avantaj olduğunu göstermektedir.

Bu tekniği, bakterilerdeki belirli virülans faktörlerinin ekspresyonunun tek başına in vitro kültivasyon yoluyla indüklenemediğini gözlemleyerek geliştirdik. Kültürlenmiş tek hücre tabakalarının tipik enfeksiyon modelleri, lejyonella ve diğer bazı bakteriler için in vitro kültürlenmiş bakterileri kullanır. Proteozomlar, bakterilerin patojenik bir avantaj kazandığı çoğalma için doğal bir rezervuar sağlar.

Açıklayacağımız teknik, yalnızca hücre içi büyüme bağlamında üretilen bir virülans faktörünün katkısını doğru bir şekilde ölçmek için proteazom asal bakterilerinin miktarının belirlenmesine izin verir. Prosedürü göstermek bendon olacaktır. Aynı zamanda bir araştırma görevlisi olan araştırma görevlisi Sam Renan ve doktora sonrası araştırmacı Amri Lama, Testte kullanılan tüm L pneumophila suşlarını, IPTG ile indüklenebilir GFP'yi kodlayan plazmid PAM 2 39 ile dönüştürmek için elektroporasyon kullanarak bu işleme başlayın, bakterileri 37 derecede bir çalkalayıcı üzerinde üç saat boyunca inkübe edin, her dönüşümden bir yayıcı çizgi bakteri kullanarak tek bir plakaya koyun ve 37 santigrat derecede 72 saat boyunca inkübe edin.

Üç gün sonra, bakteri suşunun tek bir kolonisini bir milimolar IPTG içeren üç mililitre ortama aktarın ve gece boyunca 37 santigrat derecede bir orbital çalkalayıcı üzerinde sabit faza kadar büyütün. Ertesi gün, 10 mikrolitre kültürü bir cam slayta aktarın ve bir kapak fişi uygulayın. Ardından, GFP ifadesini doğrulamak için slaydı mikroskop altında görüntüleyin.

Uygun uyarma ve emisyon filtreleri altında 60 x'lik bir objektif kullanılarak, mikroskobun GFP kanalı kullanılarak görüntülendiğinde saf bir floresan yeşili olan çok sayıda bakteri çubuğu görülmelidir, eğer tüm bakteriler floresan ise, her birinin 100 mikrolitrelik bir alikotunu seyrelterek amobiyi enfekte etmeye hazırlanın in vitro kültür, steril H2O'da bir ila 10'a kadar. Kloramfenikol ve 900 mikrolitre suda mililitre başına 6.25 mikrogram bir milimolar IPTG içeren 100 mikrolitre A YE ortamı kullanarak bir boşluk bırakın. Daha sonra, ekteki belgede verilen formülü kullanarak bir spektrofotometre kullanarak seyreltmenin OD 600 ölçümlerini alın.

Her in vitro kültür için çok sayıda enfeksiyon veya 20 MOI'de bir kuyuyu enfekte etmek için gerekli hacmi hesaplayın. Bakteriyel sıvı kültürlere başlamadan 24 saat önce, acan MEbA castellani ABI kültürlerindeki ortamı değiştirin. Ertesi gün bir hemo sitometre kullanarak hücreleri toplayın ve sayın.

Bunu yapmak için, şişeye dokunarak hücreleri yerinden çıkarın ve bir numuneyi 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Daha sonra, bir alikotu trian mavisi boyası ile karıştırın ve hemo sitometre slaytına yükleyin. Hücreleri hafif bir mikroskop altında saydıktan sonra, amobiyi taze ortamla, tekrar eden bir pipetleyici tohumu kullanarak mililitrede bir kez 10 ila altıncı hücre nihai konsantrasyonuna seyreltin.

12 Gece boyunca inkübe edilmiş oda sıcaklığında ABI'nin bir mililitrelik alikotu olan iyi ruh kültürü plakaları. Bu prosedürün en zor yönü, hazırlama adımı sırasında ortaya çıkan güçlü enfeksiyondur. Bunu başarmaya yardımcı olmak için, kaybı önlemek için amipleri yıkarken manuel bir pipetleyici kullanıyoruz.

Amip özellikle yapışkan değildir ve yıkama veya ortam değiştirme adımları sırasında kolayca kaybolabilir veya çıkarılabilir. İnkübasyondan sonra, 12 kuyulu hücre kültürü plakalarının kuyularını bir mililitre steril PBS ile üç kez yıkamak için 10 mililitrelik bir serolojik pipet ve manuel bir pipet yardımcısı kullanın. PBS'yi aspire ettikten sonra, her birine bir mililitre enfeksiyon ortamı ekleyin.

Daha sonra plakaları oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. Daha sonra, her bir kuyucuktaki enfeksiyon ortamına bakteri süspansiyonu ekleyerek kuyucukların her birini 20'lik bir MOI'de enfekte edin, plakayı beş dakika boyunca 400 kez G'de santrifüjleyin. Döndürme işleminden sonra, plakayı 37 santigrat derece su banyosunda beş dakika boyunca yüzdürün.

Plakayı 18 saat boyunca 37 santigrat derece% 5 karbondioksit inkübatörüne aktarın. İnkübasyonu takiben, başarılı bir hazırlama adımını takiben enfeksiyonu doğrulamak için bir floresan mikroskobu bulunur. Konakçı hücrelerin %90'ı, bu birleştirilmiş faz kontrast ve floresan görüntülerinde gösterildiği gibi yeşil hilal olarak görünen GFP eksprese eden bakterilerle doldurulmuş büyük VAE'ler içermelidir.

Şu anda, çoğu kastin göz hücresi maksimum bakteri yüküne ulaşmıştır, ancak popülasyonun parçalanması minimumdur. Işık mikroskobu altında, amobi yuvarlak ve ayrılmış görünmelidir. Efektörlerin ICM aracılı translokasyonunu destekleyemeyen mutant bir suş olan nokta, alçı bir gözde büyümemelidir.

Bu nedenle, minimum floresan tespit edilmelidir. Amobi düz görünecek ve tek tabaka sağlam olmalıdır. Hedef hücreler olarak görev yapan insan akut monositik lösemi veya THP bir hücreleri, ekteki belgede tarif edildiği gibi 12 oyuklu bir plaka üzerinde hazırlanmış olmalıdır.

THP'yi bir hücreyi PBS ile üç kez yıkayın. Daha sonra, TP'yi bir hücreyi 37 santigrat derece,% 5 karbondioksitte bir saat boyunca inkübe edin% 10 FBS ile bir mililitre taze RPMI 1640 ekleyin. Bakteriyel lizatı hazırlamak için, ortamı asaldan Tobi'ye aspire edin.

Daha sonra onları bitlemek için 500 mikrolitre buz, soğuk, steril, ultra filtrelenmiş su ekleyin ve 10 dakika boyunca buzun üzerine koyun. Ardından, lizatları süzüntüye göre çekin. Toplam floresansı belirlemek için 15 mililitrelik konik tüpler yazın.

Havuzlanmış lizatların her biri için emisyonu 512 nanometrede ölçün. Bir floresan plaka okuyucusunda 96 oyuklu bir plaka kullanarak, formüle göre havuzlanmış lizatlar için bir OD 600 ölçümü hesaplayın. Ekteki belgede, lizat arka planını belirlemek için enfekte amip ile aynı deneysel koşullara tabi tutulan enfekte olmamış amobi lizatlarını kullanın.

Daha sonra her bir lizat havuzu için, 20'lik bir MOI'de bir hedef hücre kuyusunu enfekte etmek için gereken hacmi hesaplayın. Bakteriyel gen ifadesindeki herhangi bir değişikliği sınırlamak için lizatları buz üzerinde tutun. Enfeksiyondan önce, lizizden sonraki 30 dakika içinde, hesaplanan MOI'de koşul başına üç kuyu TP bir hücreyi enfekte edin.

Havuzlanmış lizatların kullanılması, kuyu setinin enfekte olmamasını sağlar ve negatif bir kontrol görevi görür. Akış sitometrik analizi için. Plakayı beş dakika boyunca 400 kez G'de santrifüjleyin.

Döndürme işleminden sonra, plakayı 37 santigrat derece su banyosunda beş dakika boyunca yüzdürün. Plakayı, enfeksiyondan bir saat sonra, bir saat boyunca 37 santigrat derece% 5 karbondioksit inkübatörüne aktarın. Ortamı aspire edin ve kuyuları üç kez yıkayın.

PBS ile,% 10 FBS içeren bir mililitre taze RPMI 1640 ekleyin ve plakayı inkübatöre geri koyun. Hem hazırlama aşamasında hem de hedef hücre aşaması enfeksiyonlarında enfeksiyon seviyelerini belirlemek için TP bir hücresini 14 ila 16 saat boyunca inkübe edin. Enfekte olmuş kuyuları 10 x veya 20 x büyütmede bir floresan mikroskobu kullanarak görüntüleyin.

Daha sonra akış sitometrisi tripsin gözleri ile hedef hücre enfeksiyonunu ölçmek için, enfekte THP bir hücre ve PBS ile karıştırarak bunları kuyulardan nazikçe yıkayın. Bir pipet ile hücreleri 1.5 mililitrelik mikro santrifüj tüplerine çekin ve ardından iki dakika boyunca 1.800 kez G'de santrifüjleyin. Döndürmeden sonra, peletleri bir mililitre PBS dönüşünde 1.800 kez G'de tekrar askıya alındıktan sonra, ortaya çıkan süspansiyonlar oldukça bulanıktır.

Enfekte olmamış hedef hücreler kullanılarak akış sitometresindeki hatların tıkanmasını önlemek için ek PBS'de bir ila üç oranında seyreltilmeli, bir kez ayarlandıktan sonra bir akış sitometresinde ileri taraf saçılımını çizin, 488 nanometre lazer uyarımı ve FL bir kanal kullanarak her hedef hücre enfeksiyonu örneği için toplam 20.000 olay toplayın. Verileri analiz yürüyüşü için ayrı bir bilgisayara aktardıktan sonra, enfekte olmamış hücreleri dışlamak ve burada gösterildiği gibi bir histogramda floresan yoğunluğunu çizmek için hücre popülasyonlarını yakaladıktan sonra, akış sitometrisi için hasat edilen hücrelerin CFU kaplaması ile enfeksiyonun etkinliğini inceleyin. Numunelerin ultra filtrelenmiş suda 10 ila eksi bir, 10 ila eksi iki ve 10 ila eksi üç plakada, her seyreltmenin 20 mikrolitresini, mililitre başına 6.25 mikrogram kloramfenikol ile A-C-Y-E-A plakasının üçte birine seri seyreltme hazırlayın.

Plakaları inkübasyonu takiben 72 saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Bir protozoan astarlı bakteri popülasyonu elde etmek için bir kürdan ve hücre sayacı kullanarak kolonileri sayın. GFP'yi eksprese etmek için indüklenen vahşi tip L phis suşları.

20 MOI'de 18 saat boyunca bir castellani tek katmanını enfekte etmek için kullanıldı. GFP eksprese eden bakteriler daha sonra protozoan astarlı bakterileri in vitro kültürlenmiş bakterilerle karşılaştırmak için bir hedef hücre evresi enfeksiyonunda amobiyi yeniden enfekte etmek için kullanıldı. Bir castella tek tabakası inkübe edildi.

10'luk bir MOI'de 18 saat, bu mikrograflarda görülebileceği gibi, protozoan astarlı bakteriler, protozom ve astarlanmış bakteriler kullanarak hedef hücre makrofajlarının enfeksiyonunu ölçmek için aynı MOI'de in vitro kültürlenmiş bakterilere göre önemli bir patojenik avantaja sahiptir. PMA farklılaşmış THP'ye bir makrofaj, proteazomdan hasat edilen vahşi tip L pneumophila ile enfekte edildi ve 14 saat boyunca hazırlama aşaması enfeksiyonu ile enfekte edildi. Daha sonra burada görüldüğü gibi enfeksiyonu ölçmek için akış sitometrisi yapıldı.

Floresandaki doğru kayma, popülasyondaki toplam enfekte olmuş hücrelerin bir ölçüsüdür. Floresan sinyalin artan yoğunluğu, makrofaj başına bakteri sayısı ile ilişkilendirilebilir: enfekte olmamış TP'nin floresansı, bir makrofaj kırmızı ile gösterilir ve enfekte hücrelerin floresansı yeşil ile gösterilir. Bir kez ustalaştıktan sonra, her şey doğru bir şekilde gerçekleştirilirse, bu teknik toplamda yaklaşık iki hafta içinde tamamlanabilir.

Unutmayın, bu işlemi yaparken proteazom ve tek tabakayı rahatsız etmemek önemlidir. Yıkama adımlarınız sırasında manuel bir pipet kullanmak, astarlanmış enfeksiyonlarınız için verimi artırmaya yardımcı olacaktır. Lejyonella ile çalışmanın can theba tehlikeli olabileceğini unutmayın.

Bu nedenle, bu prosedürü gerçekleştirirken aerosol üretimini önlemek gibi önlemler alın.