Name: Hedefli-esteraz ile ER Kalsiyum Doğrudan Görüntüleme Kaynaklı Boya Yükleme (TED) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: Öğrenin, canlı hücrelerde endoplazmik retikulum kalsiyum dinamiklerini TED yöntemiyle görüntülemeyi. Bu teknik, düşük afiniteli indikatör boyaların ER lümeninde açığa çıkarılmasını sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) BL567/3-1 ve Friedrich-Baur-Stiftung hibe tarafından desteklenmiştir. Biz Tag-TTT-T2 bize sağlamak için Kaliforniya, San Diego Üniversitesi&#39;nde Roger Y. Tsien, Howard Hughes Tıp Enstitüsü Laboratuvarları teşekkür etmek istiyorum. Biz çok şükür ki bize lentiviral plazmid FUGW sağlayan ve psPAX2/pMD2.G için David Baltimore, California Institute of Technology, Pasadena, ve Didier Trono, Cenevre, Cenevre, Üniversitesi kabul.

<ol><li>Berridge, M. J., Bootman, M. D., Roderick, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signalling%3A+dynamics%2C+homeostasis+and+remodelling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Calcium signalling: dynamics, homeostasis and remodelling.</a> Nature reviews. Molecular Cell Biology. 4, 517-529 (2003).</li>
<li>Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+versatility+and+universality+of+calcium+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The versatility and universality of calcium signalling.</a> Nature reviews. Molecular Cell Biology. 1, 11-21 (2000).</li>
<li>Agulhon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+is+the+role+of+astrocyte+calcium+in+neurophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">What is the role of astrocyte calcium in neurophysiology.</a> Neuron. 59, 932-946 (2008).</li>
<li>Augustine, G. J., Santamaria, F., Tanaka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+calcium+signaling+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Local calcium signaling in neurons.</a> Neuron. 40, 331-346 (2003).</li>
<li>Berridge, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+calcium+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Neuronal calcium signaling.</a> Neuron. 21, 13-26 (1998).</li>
<li>Grienberger, C., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+calcium+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging calcium in neurons.</a> Neuron. 73, 862-885 (2012).</li>
<li>Neher, E., Sakaba, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+roles+of+calcium+ions+in+the+regulation+of+neurotransmitter+release%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Multiple roles of calcium ions in the regulation of neurotransmitter release.</a> Neuron. 59, 861-872 (2008).</li>
<li>Jaepel, J., Blum, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+ER+calcium+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Capturing ER calcium dynamics.</a> European Journal of Cell Biology. 90, 613-619 (2011).</li>
<li>Verkhratsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiology+and+pathophysiology+of+the+calcium+store+in+the+endoplasmic+reticulum+of+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Physiology and pathophysiology of the calcium store in the endoplasmic reticulum of neurons.</a> Physiological Reviews. 85, 201-279 (2005).</li>
<li>Burdakov, D., Petersen, O. H., Verkhratsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraluminal+calcium+as+a+primary+regulator+of+endoplasmic+reticulum+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Intraluminal calcium as a primary regulator of endoplasmic reticulum function.</a> Cell Calcium. 38, 303-310 (2005).</li>
<li>Streb, H., Irvine, R. F., Berridge, M. J., Schulz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Release+of+Ca2%2B+from+a+nonmitochondrial+intracellular+store+in+pancreatic+acinar+cells+by+inositol-1%2C4%2C5-trisphosphate%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Release of Ca2+ from a nonmitochondrial intracellular store in pancreatic acinar cells by inositol-1,4,5-trisphosphate.</a> Nature. 306, 67-69 (1983).</li>
<li>Choi, J. H., Ryu, S. H., Suh, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On%2Foff-regulation+of+phospholipase+C-gamma+1-mediated+signal+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Enzyme+Regulation%22%5BJournal%5D)">On/off-regulation of phospholipase C-gamma 1-mediated signal transduction.</a> Advances in Enzyme Regulation. 47, 104-116 (2007).</li>
<li>Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRP+channels+as+cellular+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">TRP channels as cellular sensors.</a> Nature. 426, 517-524 (2003).</li>
<li>Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STIMulating+store-operated+Ca%282%2B%29+entry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">STIMulating store-operated Ca(2+) entry.</a> Nature Cell Biology. 11, 669-677 (2009).</li>
<li>Soboloff, J., Madesh, M., Gill, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensing+cellular+stress+through+STIM+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Sensing cellular stress through STIM proteins.</a> Nature Chemical Biology. 7, 488-492 (2011).</li>
<li>Erdmann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+calmodulin+with+Sec61alpha+limits+Ca2%2B+leakage+from+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Interaction of calmodulin with Sec61alpha limits Ca2+ leakage from the endoplasmic reticulum.</a> The EMBO Journal. 30, 17-31 (2011).</li>
<li>Schäuble, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BiP-mediated+closing+of+the+Sec61+channel+limits+Ca%282%2B%29+leakage+from+the+ER%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">BiP-mediated closing of the Sec61 channel limits Ca(2+) leakage from the ER.</a> The EMBO Journal. , (2012).</li>
<li>Park, M. K., Choi, Y. M., Kang, Y. K., Petersen, O. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+endoplasmic+reticulum+as+an+integrator+of+multiple+dendritic+events%5BTitle%5D)+AND+%22The+Neuroscientist+%3A+a+review+journal+bringing+neurobiology%2C+neurology+and+psychiatry%22%5BJournal%5D)">The endoplasmic reticulum as an integrator of multiple dendritic events.</a> The Neuroscientist : a review journal bringing neurobiology, neurology and psychiatry. 14, 68-77 (2008).</li>
<li>Cooney, J. R., Hurlburt, J. L., Selig, D. K., Harris, K. M., Fiala, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endosomal+compartments+serve+multiple+hippocampal+dendritic+spines+from+a+widespread+rather+than+a+local+store+of+recycling+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Endosomal compartments serve multiple hippocampal dendritic spines from a widespread rather than a local store of recycling membrane.</a> The Journal of Neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 22, 2215-2224 (2002).</li>
<li>Holbro, N., Grunditz, A., Oertner, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+distribution+of+endoplasmic+reticulum+controls+metabotropic+signaling+and+plasticity+at+hippocampal+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Differential distribution of endoplasmic reticulum controls metabotropic signaling and plasticity at hippocampal synapses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 15055-15060 (2009).</li>
<li>Terasaki, M., Slater, N. T., Fein, A., Schmidek, A., Reese, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+network+of+endoplasmic+reticulum+in+cerebellar+Purkinje+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Continuous network of endoplasmic reticulum in cerebellar Purkinje neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 7510-7514 (1994).</li>
<li>Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+imaging+of+cortical+neurons+using+Fura-2+AM%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Calcium imaging of cortical neurons using Fura-2 AM.</a> J. Vis. Exp. (23), e1067(2009).</li>
<li>Lang, S., Schäuble, N., Cavalie, A., Zimmermann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+cell+calcium+imaging+combined+with+siRNA+mediated+gene+silencing+identifies+Ca%282%29%28%2B%29+leak+channels+in+the+ER+membrane+and+their+regulatory+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Live cell calcium imaging combined with siRNA mediated gene silencing identifies Ca(2)(+) leak channels in the ER membrane and their regulatory mechanisms.</a> J. Vis. Exp. (53), e2730(2011).</li>
<li>Rudolf, R., Mongillo, M., Rizzuto, R., Pozzan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Looking+forward+to+seeing+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Looking forward to seeing calcium.</a> Nature reviews. Molecular Cell Biology. 4, 579-586 (2003).</li>
<li>Mank, M., Griesbeck, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded calcium indicators.</a> Chemical Reviews. 108, 1550-1564 (2008).</li>
<li>Miyawaki, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+indicators+for+Ca2%2B+based+on+green+fluorescent+proteins+and+calmodulin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin.</a> Nature. 388, 882-887 (1997).</li>
<li>Montero, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+dynamic+changes+in+free+Ca2%2B+concentration+in+the+endoplasmic+reticulum+of+intact+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Monitoring dynamic changes in free Ca2+ concentration in the endoplasmic reticulum of intact cells.</a> The EMBO Journal. 14, 5467-5475 (1995).</li>
<li>Griesbeck, O., Baird, G. S., Campbell, R. E., Zacharias, D. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reducing+the+environmental+sensitivity+of+yellow+fluorescent+protein.+Mechanism+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Reducing the environmental sensitivity of yellow fluorescent protein. Mechanism and applications.</a> The Journal of Biological Chemistry. 276, 29188-29194 (2001).</li>
<li>Ishii, K., Hirose, K., Iino, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca2%2B+shuttling+between+endoplasmic+reticulum+and+mitochondria+underlying+Ca2%2B+oscillations%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Ca2+ shuttling between endoplasmic reticulum and mitochondria underlying Ca2+ oscillations.</a> EMBO Reports. 7, 390-396 (2006).</li>
<li>Palmer, A. E., Jin, C., Reed, J. C., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bcl-2-mediated+alterations+in+endoplasmic+reticulum+Ca2%2B+analyzed+with+an+improved+genetically+encoded+fluorescent+sensor%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Bcl-2-mediated alterations in endoplasmic reticulum Ca2+ analyzed with an improved genetically encoded fluorescent sensor.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 17404-17409 (2004).</li>
<li>Hofer, A. M., Machen, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technique+for+in+situ+measurement+of+calcium+in+intracellular+inositol+1%2C4%2C5-trisphosphate-sensitive+stores+using+the+fluorescent+indicator+mag-fura-2%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Technique for in situ measurement of calcium in intracellular inositol 1,4,5-trisphosphate-sensitive stores using the fluorescent indicator mag-fura-2.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 2598-2602 (1993).</li>
<li>Solovyova, N., Verkhratsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+of+free+calcium+in+the+neuronal+endoplasmic+reticulum%3A+an+overview+of+modern+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Monitoring of free calcium in the neuronal endoplasmic reticulum: an overview of modern approaches.</a> Journal of Neuroscience Methods. 122, 1-12 (2002).</li>
<li>Solovyova, N., Veselovsky, N., Toescu, E. C., Verkhratsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca%282%2B%29+dynamics+in+the+lumen+of+the+endoplasmic+reticulum+in+sensory+neurons%3A+direct+visualization+of+Ca%282%2B%29-induced+Ca%282%2B%29+release+triggered+by+physiological+Ca%282%2B%29+entry%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Ca(2+) dynamics in the lumen of the endoplasmic reticulum in sensory neurons: direct visualization of Ca(2+)-induced Ca(2+) release triggered by physiological Ca(2+) entry.</a> The EMBO Journal. 21, 622-630 (2002).</li>
<li>Rehberg, M., Lepier, A., Solchenberger, B., Osten, P., Blum, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+non-disruptive+strategy+to+target+calcium+indicator+dyes+to+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">A new non-disruptive strategy to target calcium indicator dyes to the endoplasmic reticulum.</a> Cell Calcium. 44, 386-399 (2008).</li>
<li>Blum, R., Verkhratsky, A., Petersen, O. H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBlum%2C+R+%22Calcium+imaging+of+intracellular+organelles%3A+endoplasmic+reticulum%22">Calcium imaging of intracellular organelles: endoplasmic reticulum</a>. 43, Humana Press. (2010).</li>
<li>Shaner, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+the+photostability+of+bright+monomeric+orange+and+red+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Improving the photostability of bright monomeric orange and red fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 5, 545-551 (2008).</li>
<li>Lois, C., Hong, E. J., Pease, S., Brown, E. J., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+transmission+and+tissue-specific+expression+of+transgenes+delivered+by+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors.</a> Science. 295, 868-872 (2002).</li>
<li>Zufferey, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-inactivating+lentivirus+vector+for+safe+and+efficient+in+vivo+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Self-inactivating lentivirus vector for safe and efficient in vivo gene delivery.</a> Journal of Virology. 72, 9873-9880 (1998).</li>
<li>Zufferey, R., Nagy, D., Mandel, R. J., Naldini, L., Trono, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiply+attenuated+lentiviral+vector+achieves+efficient+gene+delivery+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Multiply attenuated lentiviral vector achieves efficient gene delivery in vivo.</a> Nature Biotechnology. 15, 871-875 (1997).</li>
<li>Li, D., Herault, K., Oheim, M., Ropert, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FM+dyes+enter+via+a+store-operated+calcium+channel+and+modify+calcium+signaling+of+cultured+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">FM dyes enter via a store-operated calcium channel and modify calcium signaling of cultured astrocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 21960-21965 (2009).</li>
<li>Blum, R., Petersen, O. H., Verkhratsky, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBlum%2C+R+%22Calcium+measurement+methods%22">Calcium measurement methods</a>. Verkhratsky, A., Petersen, O. H. Vol. Neuromethods 43 (Springer protocols), Humana Press. 147-167 (2010).</li>
<li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+esterase-ester+pair+for+targeting+small+molecules+with+cellular+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Selective esterase-ester pair for targeting small molecules with cellular specificity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 4756-4761 (2012).</li>
<li>Samtleben, S., Blum, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+vectors+for+direct+ER+calcium+imaging+with+targeted-estersase+induced+dye+loading%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Improved vectors for direct ER calcium imaging with targeted-estersase induced dye loading.</a> , In preparation (2012).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.

TED yöntemin avantajları ve dezavantajları son yayınları 34,35 yaygın olarak tartışılmıştır. Yukarıda tarif edilen diğer yöntemleri ile karşılaştırıldığında, TED hücreleri bozan ve perfüze problemini önlediği. Ayrıca, iki açıdan vurgulanması gerekir. ER kalsiyum görüntüleme için TED prensibi TED vektör yapıları yardımıyla ve düşük afiniteli bir sentetik AM-esterlerin (2). Verimli ve tercihli serbest bırakılması ile ER lümeninde aktif karboksilesteraz bölgesinin (1). Hedeflenen ifade gerektirir ER lümen kalsiy...

ER fizyolojik kalsiyum yanıtları çözmek için, biz ER içine sentetik kalsiyum hassas boyaların yakalama artırmak için yeni bir strateji geliştirdi. Bu yöntem hücre dışı kalsiyum varlığında serbest ER kalsiyum doğrudan, olmayan yıkıcı gerçek zamanlı izleme sağlar. ER Kalsiyum fonksiyonu ve sinyal Kalsiyum sinyalleri farklı hücre tipleri, örneğin kas hücreleri, nöronlar ve öğrenme ve hafıza 1,2 sinaptik iletim bir katılımı kas kasılması aracılık gelen glial hücreler ve işlevleri aralığında bulunur. Kalsiyum gen transkripsiyonu, hücre çoğalması, nöronal uyarılabilirliği, hücre ölümü ve olaylar 1-7 sinyalizasyon diğer hücre düzenlenmesinde yer almaktadır, çünkü serbest kalsiyum konsantrasyonunu değişiklikler yüksek bir bilimsel ilgi vardır. Bütün bu hücre içi kalsiyum sinyalleri işlevsel olarak bağlı ve hücre içi kalsiyum katkıda bulunmaktadırmağaza dinamikleri 8-10. Tüm kalsiyum sinyalleri arasında ortak bir özelliği hücre dışı alan arasında kalsiyum akışını, sitoplazmada ve organeller, özellikle ER ve mitokondri olduğunu. Bu, farklı sinyal bileşenleri tarafından algılanır ve bu organellerin içinde kalsiyum konsantrasyonunda dinamik değişiklikler olur. Genel olarak, 100-800 uM arasındaki ER aralıkları içinde kalsiyum konsantrasyonu, sitoplazmada kalsiyum konsantrasyonu yaklaşık 100 nM, ve hücre dışı ortamda konsantrasyon 1-2 mm civarındadır. Buna göre, sitoplazmada 2,9,10 doğru kalsiyum akışı için yüksek bir kimyasal itici güç vardır. En yaygın olarak incelenmiştir ER-türevi kalsiyum sinyaller daha sonra fosfolipaz C (PLC), aktive G-protein bağlı reseptörler (GPCR), uyarımı bağlıdır. Da PLC inositol 1,4,5-trisphosphate (IP 3) 1 üretir. Onun rec IP 3 bağlayıcı üzerineeptor (IP 3-Rec, Şekil 1) ER-membran, kalsiyum iyonları ER lümeninde salınır. Tarihsel olarak, ER IP 3-aracılı kalsiyum sürümü ilk - bile dolaylı - Streb ve arkadaşları tarafından asiner pankreatik hücrelerde ölçülen 1.983 11.. Bu yayın, ilk kez önerilen asetilkolin, fosfolipaz C ve IP 3 içeren bir sinyal akışında. Kalsiyum serbest Bu şekilde genellikle IP 3-bağlı kalsiyum sürümü (IiCR) (Şekil 1) olarak adlandırılır. Reseptör tirozin kinazlar, bağlantılar IP 3 yükseklik 12 sonra sinyal ER kalsiyum büyüme faktörleri ve nörotrofik faktörlerin etkisi ile fosfolipaz Cγ arasında kinaza bağımlı aktifleştirme. IiCR ek olarak, kalsiyum yüksekliği riyanodin Re, voltaj-bağımlı kalsiyum kanallarının (Ca V) ve daha sonra kalsiyum ile indüklenen kalsiyum tahliyesinin (CICR) ile, örneğin, iyonotropik kalsiyum girişini aracılık edilebilirreseptör (RYR). IiCR ve CICR fizyolojik mağaza ile çalışan kalsiyum girişi (Soce) ile bağlantılıdır. Soce ER kalsiyum serbest bırakılması için bir sensör STIM (stroma etkileşen molekül), bir işlem içerir. STIM geçici reseptör potansiyel bir kanal (Trp) 13, Orai kalsiyum kanalları 14 ve hatta voltaj kapılı kalsiyum kanalları 15 (Şekil 1) yoluyla hücre-dışı kalsiyum girişini teşvik ettiği gösterilmiştir. ER kalsiyum kaybı dinamik aktif pompalar kalsiyum geri ER içine Sarko-endoplazmik retikulum kalsiyum ATPaz (SERCA), bir eylem tarafından kurtarılır. Bu thapsigargin gibi ilaçlar ile SERCA Engelleme sitozolik bölmesine ER kalsiyum sürekli bir kaybı tanıttı. Bu ER kalsiyum &quot;kaçak&quot; gibi Sec61 protein kompleksi 16,17 (Şekil 1) olarak ER intramembrane gözenek kompleksleri neden olur. 1998 yılında, Berridge bir model, &quot;bir nöron modeli içinde nöron&quot;, hangi yayınlandıh nöronal kalsiyum 5 entegre ER bir ilke fizyolojik rolünü göstermektedir. Bu model nöronal plazma zarı 5 bir hücre içi &quot;görüntü&quot; oluşturan sürekli ER membran sisteminin varlığını dikkate alır. Bu ikili ökaryotik membran sistemi nöronlarda hızlı ve yavaş kalsiyum sinyallerinin zamansal ve mekansal entegrasyonu için temel bir ön koşul olduğu iddia edildi. Aynı nöron farklı dikenler veya dendritler eş zamanlı veya daha sonra da meydana kalsiyum sinyalleri hücrenin soma ya da 5,18 toplanır ER, ile çekirdeğine veriliyor. Daha sonra, bunların toplamı sinyal şelaleden gen transkripsiyonu veya entegrasyon nöron, düzenleme heyecanlanma üzerinde etkileri olabilir. Bu nedenle, ER kalsiyum sinyallerinin birleştirilmesi destekler. Bu kavram için bir ön koşul çeşitli çalışmalar tarafından iddia edilmiştir ve en az somato-d kanıtlanmıştır ki tek bir hücre, içinde ER sürekliliği olanendritic alanları ve kısa bir mesafe aksonal projeksiyonlar 19-21. Uzun aksonal projeksiyonlar içinde ER süreklilik olup olmadığını tartışma meselesidir. ER membran üzerinden ücretsiz kalsiyum akışını ölçmek için Stratejiler Kalsiyum sinyalleri en sık sitoplazmada 22,23 izlenir. Bu nedenle, kolaylıkla hücre dışı Ca2 + veya 6,24 hücre içi mağazalarından sitozolüne akan olup olmadığını ayırt edilemez. Bu sınırlama üstesinden gelmek için, doğrudan ER kalsiyum görüntüleme için metodolojik stratejiler geliştirilmiştir. Özet olarak, aşağıdaki stratejileri kullanılmıştır:. (1) genetik olarak işlenmiş protein göstergeleri: 25-27 protein tabanlı, düşük afiniteli bir Ca2 + göstergeleri, bir kalsiyum algılama proteini ile kombinasyon halinde biyolüminesans proteini aequorin veya GFP kullanımı ER-hedefli. Bu genetik Ca 2 + göstergeleri (GeCIS) canBir sinyal peptidi yardımıyla ER hedeflenebilir ve aktif bir saklama ve geri çağırma motifi kullanılarak ER tutulur. Cameleon bölünmüş YC7.3ER 29 ve Cameleon D1 30 ve Cameleon ilkesine Ortak ER Ca 2 + göstergeleri baz Cameleon YC4.3 26,28 bulunmaktadır. AM-ester düşük afinite Ca 2 (2) Doğrudan esteraz tabanlı boya yükleme + göstergeleri 31,32. Gösterge boyaların (Mag-Fura2-AM, Mag-Fluo4-AM veya Fluo5N-AM)-türevleri AM geçmek bir lipofilik, kalsiyum-duyarsız durumda biyolojik membranlar. Daha sonra, sitoplazmada gibi ER, endojen esterazlar AM-ester grubunun yarılma ve sitoplazmada aktif olan boya belirli bir miktarda arkasında ve ER bırakarak, Ca2 + göstergesi bırakın. Sitozolik kalsiyum konsantrasyonu de de altında kalır Bu nedenle, bu yaklaşım sürece ER yüksek bir kalsiyum konsantrasyonu koşulları altında yararlıdırözellikle karakteristik kalsiyum sinyalleri (düşük mcM örneğin nM) sırasında düşük afinite göstergelerin koruması sınırı,. Plazma zarının geçirgenliği 32 ile birlikte (3) AM ester yükleme., Kalan sitosolik Ca2 + gösterge yapay bir hücre içi tampon içinde bir &quot;hafif&quot; deterjan (örneğin saponin) küçük miktarlarda bulunan plazma membran geçirgenliği ile çıkarılır. Bu nedenle, hücre içi zarlar doğrudan plazma zarında &quot;gözenekler&quot; yoluyla, hücre içi tampon IP 3 ile, örneğin, güdülenebilir. (4) Ca 2 tam hücre konfigürasyonu ve eş zamanlı ölçüm altında sitoplazmada Diyaliz + ER lümeni ve sitosol içinde 32,33. Bir hücre olanlar, düşük afiniteli bir Ca2 + göstergesi (örneğin, Mag-Fura2-ile yüklenir AM,), rasyometrik UV ışık. Daha sonra, bir yama pipet, herhangi bir geri kalan cyt yardımıylaosolic düşük afiniteli bir Ca2 + göstergesi Yüksek afiniteli bir Ca2 + göstergesi (örneğin, Flu-3, görünür ışık) ihtiva eden bir tampon maddesi ile sitoplazmada üzerinden dializ edilir. Bu strateji, sitosolik ve ER türetilen sinyallerin eş zamanlı kayıt sağlar. (5) Hedefli-esteraz bağlı boya yükleme 8,34. Bir karboksilesteraz (CES) ER lümenine hedefleyen ve düşük afinite Ca 2 + göstergelerin AM-ester formunun etkin yakalama için yüksek esteraz aktivite sağlar. Hedefli-esteraz bağlı boya yükleme (TED) ER lümen için düşük afinite Ca 2 + göstergelerin hedef artırmak için, TED geliştirilmiştir. TED ekspresyon yapıları ile elde edilir, bir ER hedeflenen fare karboksilesteraz (CES2) (Şekil 2), bir aşırı gerektirir. Yeniden birleştirici bir yapı CES-salgılayan hücrelerin bir kalsiyum AM-ester şekli ile inkübe edilirdicator boya (Fluo5N-AM, Şekil 2). Daha sonra, ER, boya Ca 2 + dönüştürülür duyarlı membran geçirgen Ca2 nedenle ER lümeninde 8 de yüksek bir konsantrasyon olarak, boya tutucu yüksek esteraz ile + göstergesi kompleksi (Fluo5N/Ca 2 +), , 34. Yöntem SERCA 17 abluka sonra örneğin doğrudan &quot;kaçak kanalları&quot;, ile metabotropik, purinerjik-veya glutamat reseptörleri 8,34 ile örneğin IiCR-yollardan ER kalsiyum-serbest araştırmak ve ER kalsiyum tükenmesi görselleştirmek için özellikle yararlıdır , 34. Deneyimlerimizi için düşük afinite Ca 2 + göstergesi Fluo5N-AM şu anda TED boya yükleme stratejisi ile kullanmak için mevcut en iyi göstergesidir. Fluo5N-AM, Ca2 + için düşük bir afiniteye sahiptir (ayrışma sabiti Kd ~ 90 uM, Şekil 2), hemen hemen-floresan ile AM-formunda olduğu, ancak calciu üzerine yüksek floresans emisyon içerirm bağlayıcı 8,34. Fluo5N/Ca 2 + kompleksi gibi FITC, Alexa 488 veya eGFP gibi standart boyalar karşılık ~ 490 nm standart bir ışık kaynağı ile heyecanlı olabilir. Sitosolik kalsiyum sinyalleri hemen hemen düşük uM aralığında bir konsantrasyonuna ulaşmak ve bu ancak sitoplazmada Fluo5N 35 tarafından tespit edilir. TED performansını artırmak için, birkaç rekombinant vektör yapıları (Şekil 3) geliştirilmiştir. Başlangıçta, CES2 kodlama dizisi (RefSeq katılım sayısı NM_145603, CES2c) ve en iyi TED performansa dayalı TED vektörler CES yapıları istikrarlı ifade ile görülmektedir. Yeni TED vektörler kırmızı floresan proteini TagRFP-T2 36 erimiş CES2 temel bir unsuru ifade eder. Bu vektörler hücrelere transduse tespit etmek ve Fluo5N/Ca 2 değişikliklerin normalizasyonu için bir iç kontrol olarak, kızıl flüoresans kullanmak için kullanılabilir olması avantajına sahiptir + floresan. Kırmızı floresan da stimülasyon koşullar altında ER ve ER dinamikleri değişikliklerin yapısal dağılımı görselleştirmek için imkan sunuyor.

<table><tbody><tr><td>(S)-3,5-DHPG (Dihidroksifenilglisin)</td><td>Tocris</td><td>0805</td><td></td></tr><tr><td>5';-ATP-Na2, ATP disodyum tuzu hidrat</td><td>Sigma</td><td>A26209-1G</td><td></td></tr><tr><td>B-27 takviyesi, 50x</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Karbamoilkolin klorür (Charbachol)</td><td>Sigma</td><td>C4382-1g</td><td></td></tr><tr><td>Siklopiazonik asit (CPA)</td><td>Çıkış bilimsel</td><td>Asc-300</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsülfoksit (DMSO)</td> <td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, Glutamax</td><td>Invitrogen-Gibco</td><td>31966-047</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'nun Ca / Mg içermeyen PBS'si 1x</td><td>PAA</td><td>H15-002</td><td></td></tr><tr><td>Fetal buzağı serumu</td><td>Invitrogen-Gibco</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-5N-, 10 x 50 &mu; g</td><td>Invitrogen</td><td>F14204</td><td></td></tr><tr><td>Glutamat</td><td>Ascent scientific</td><td>Asc-049</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Invitrogen</td><td>35050-038</td><td></td></tr><tr><td>Jambonun F12 besin karışımı</td><td>Invitrogen-Gibco</td><td>21765-029</td><td></td></tr><tr><td>Hank's BSS (1x) Ca'sız, Mg olmadan, Fenol Kırmızısı ile, HBSS</td><td>PAA Laboratuvarları</td><td>H15-010</td><td></td></tr><tr><td>At serumu</td><td>SHD3250YK</td><td>Linearis</td><td></td></tr><tr><td>İyonomisin Ca2+ tuz</td><td>Yükseliş bilimsel</td><td>Asc-116</td><td></td></tr><tr><td>murin EGF </td><td>PreproTech</td><td>315-09</td><td></td></tr><tr><td>N2 takviyesi 100x</td><td>Invitrogen</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>Nörobazal ortam</td><td>Invitrogen-Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F127, düşük UV emilimi, 2g</td><td>Invitrogen</td><td>P6867</td><td></td></tr><tr><td>Poli-DL-ornitin hidrobromür PORNO</td><td>Sigma</td><td>P8638</td><td></td></tr><tr><td>Poli-D-lizin hidrobromür</td><td>Sigma</td><td>P7280</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-Lizin</td><td>Sigma</td><td>P2636</td><td></td></tr><tr><td>Thapsigargin</td><td>Calbiochem</td><td>586005-1mg</td><td></td></tr><tr><td>TryLE Express</td><td>Invitrogen</td><td>12605-028</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin</td><td>Worthington</td><td>LS-003707</td><td></td></tr><tr><td>Glycine MAX (soya fasulyesi)</td> <td>Sigma</td><td>T6522</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">MaterialsConfokal sistemden tripsin inhibitörü</td></tr><tr><td>: ters çevrilmiş lazer tarama mikroskobu: IX81 ile FV1000</td><td>Olympus</td><td></td><td>kullanıcıya özel konfigürasyon</td></tr><tr><td>Konfokal sistem: lazer birleştirici FV10 ve diyot lazerler (405, 473, 559, 635)</td><td>Olympus</td><td></td><td>Kullanıcıya özel konfigürasyon</td></tr><tr><td>Konfokal sistem: spektral dedektörlü FV10-SPD tarama kafası</td><td>Olympus</td><td></td><td>kullanıcıya özel konfigürasyon</td></tr><tr><td>Isıtıcı kontrolörü TC-344B</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0101</td>, <td>hat içi çözelti ısıtıcısını kontrol etmek için</td></tr><tr><td>NIH ImageJ yazılımı</td><td>WS Rasband, ImageJ, ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri, <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsb.info.nih.gov/ij/</a>, 1997--2006</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amaç: UAPON20XW340 NA 0,7 WD 0,35</td><td>Olympus</td><td>N2709100</td><td></td></tr><tr><td>Amaç: UPLFLN40XO</td><td>Olympus</td><td>N1478700</td><td></td></tr><tr><td>Amaç: UPLSAPO60XO/1.35, WD=0.15</td><td>Olympus</td><td>N1480700</td><td></td></tr><tr><td>Perfüzyon odası, ters</td><td>ısmarlama</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Perfüzyon odası, RC-49FS</td><td>Warner Instruments</td><td>W4 64-1709</td><td></td></tr><tr><td>Perfüzyon tüpü: PT-49</td><td>Perfüzyon için</td><td>Warner Instruments</td><td>64-1730</td></tr><tr><td>Peristaltik pompa MiniPlus 3 (4 kanal)</td><td>Gilson</td><td>n.a.perfüzyon</td> <td>pompası</td></tr><tr><td>Tek sıralı çözelti ısıtıcısı SH-27B</td><td>Isıtıcı</td><td>kontrolörü tarafından kontrol edilen</td>Warner Instruments <td>64-0102</td></tr><tr><td>Emme tüpleri: ST3R</td><td>Perfüzyon için</td><td>Warner Instruments</td><td>64-1407</td></tr><tr><td>Isıtma eki: Tempocontrol 37-2 dijital 2 kanallı</td><td>Pecon</td><td>n.a.</td><td></td></tr></tbody></table>

hedefli-esteraz ile er kalsiyum doğrudan görüntüleme kaynaklı boya yükleme (ted)

Direct Imaging of ER Calcium with Targeted-Esterase Induced Dye Loading (TED)

Kalsiyum dinamikleri görselleştirme hücre fizyolojisi kalsiyum rolünü anlamak önemlidir. Kalsiyum dinamikleri incelemek için, sentetik floresan Ca 2 + göstergeleri, popüler olmuştur. Burada TED (= hedef-esteraz bağlı boya yükleme), Ca 2 serbest bırakılması geliştirmek için bir yöntem ortaya koymaktadır + farklı hücre tipleri ER lümeninde göstergesi boyalar. Bugüne kadar, TED hücre hatları, glial hücreler, in vitro ve in nöronlar kullanılmıştır. Vektör yapıları kullanarak ER lümen yüksek bir karboksilesteraz faaliyet hedefleyen etkin, rekombinant üzerinde TED üsleri olduğunu ifade karboksilesterazdan (CES). En son TED vektörleri böylece aynı anda iki-renkli görüntüleme sağlayan kırmızı floresan proteini kaynaşmış CES2 temel bir öğesi içerir. Ilgili ER yapısı kırmızı görünürken ER serbest kalsiyum dinamikleri, tek bir renkte görüntülü. Prosedürün başlangıcında, hücreler bir lentivirüs ile transduse edilmiştir. Daha sonra, enfekte olmuş hücreler,yeniden nihayet canlı hücre görüntüleme sağlamak için lamelleri numaralı seribaşı. Daha sonra, canlı hücrelerin asetoksimetil ester (AM-ester) düşük afinite Ca 2 formu inkübe edilir + göstergeleri, örneğin Fluo5N-AM, Mag-Fluo4-AM, veya Mag-Fura2-AM. Ca2 + göstergesi ve hidrofilik bir floresan boya / Ca 2 + kompleksi, AM formundan hidrofobik yan zincirler kapalı ER bölmektedir içinde esteraz oluşan ve ER lümeninde tutulur. Boya Yükleme işleminden sonra, hücreler, bir ters konfokal lazer tarama mikroskobu de analiz edilmiştir. Hücreler sürekli Zil benzeri çözümleri ile perfüze ve Acil kalsiyum dinamikleri zaman atlamalı görüntüleme doğrudan görsel vardır. ER kalsiyum deposunun dolum floresan bir artış üreten ise ER kalsiyum açıklaması, ilgi bölgelerinde floresan azalma ile tanımlanır. Son olarak, zaman içinde floresan yoğunluğundaki değişiklik kadar taşınmış / F 0 hesaplama ile belirlenmektedir.

Bu protokol ücretsiz ER kalsiyum doğrudan görüntüleme için olmayan bir yıkıcı bir yaklaşım sağlar. Düşük afiniteli sentetik Ca 2 + göstergeleri yayımlanan ve hedeflenen bir ER yardımıyla, rekombinant esteraz enzim aktivitesi ile ER lümen içinde sıkışıp kalırlar. ER lümen için Ca 2 + göstergesi boyaların Geliştirilmiş yükleme ER kalsiyum deposu dinamikleri doğrudan ve hızlı görüntüleme sağlar. TED için hücre tipleri Yöntemin etkinliği hücre hatl...

Hedefli-esteraz bağlı boya yükleme (TED) floresan görüntüleme ile hücre içi kalsiyum deposu dinamiklerinin analizini destekler. Yöntem sentetik düşük afinite Ca yerel maskesinin geliştirir endoplazmik retikulum (ER), bir rekombinant karboksilesteraz hedeflenmesi üs<sup&gt; 2 +</supER lümeninde&gt; göstergesi boyalar.

Hedefli-esteraz ile ER Kalsiyum Doğrudan Görüntüleme Kaynaklı Boya Yükleme (TED)

Visualization of calcium dynamics is important to understand the role of calcium in cell physiology. To examine calcium dynamics, synthetic fluorescent ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, canlı hücrelerin endoplazmik retikulum lümenindeki kalsiyum dinamiklerini doğrudan görselleştirmektir. Bu, endoplazmik retikulumda karboksiesteraz CS iki'yi aşırı eksprese etmek için hücrelerin hedefli esterazla indüklenen boya veya TED vektör yapısıyla transdüse edilmesiyle sağlanır. Ardından hücreler, plazma ve ER membranlarından difüzyonla geçen asetometil ester kalsiyum indikatörü flu oh five NA ile inkübe edilir.Ardından karboksil esteraz parçalama işlemini gerçekleştirir. Ester grubu, ER lümenindeki kalsiyum duyarlı indikatörü serbest bırakır ve floresan kalsiyum kompleksleri oluşur.Canlı hücre görüntülemesine dayalı olarak, ER'deki serbest kalsiyum konsantrasyonundaki değişimleri gösteren sonuçlar elde edilir. Bu yöntem, hücresel kalsiyum homeostazının düzenlenmesine ilişkin temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Kalsiyum sinyalleri en sık sitozolde izlenir, bu nedenle kalsiyumun sitozole hücre dışı boşluktan mı yoksa hücre içi ER kalsiyum deposundan mı aktığı kolayca ayırt edilemez.Bu kısıtlamayı aşmak için, hedeflenmiş esteraz indüklemeli boşaltma yöntemi geliştirmişiz. Bu yöntemle, ER'den salınan kalsiyum doğrudan izlenmektedir. Bu yaklaşım, yapıya zarar vermeyen (non-disruptive) bir yöntemdir.Plazma membranı bütünlüğünü korur ve hücre içi sinyal yolakları muhafaza edilir. Genel olarak, bu yöntemi uygulayan kişiler deneyime ihtiyaç duydukları için zorlanacaklardır. TED Vektör ekspresyonunda, Karboksilaz CES iki'ye füzyonlanmış bir sent protein eksprese eden vektör yapıları geliştirmiş bulunmaktayız.Bu, deneyler sırasında AR kalsiyum görüntüleme için uygun hücreleri kolayca tanımlamamıza olanak tanır; bu hücreler, güçlü kırmızı floresan ve yalnızca orta ila güçlü kalsiyum indikatörü floresansı ile karakterize edilir. Bu floresan etiketler, endoplazmik retikulum boyunca eşit şekilde dağılmış olmalı ve nükleer bölgede bulunmamalıdır. Başlamadan önce.Yapay beyin omurilik sıvısı (A CSF) ve flu oh beş NAM'ı metin protokolüne göre hazırlayın. A CSF'yi oda sıcaklığına kadar ön ısıtmaya tabi tutun ve dekstroz ekleyin; A CSF'yi beş dakika boyunca karbogen ile havalandırın. Ardından, kalsiyum klorür ve magnezyum klorürün 1 M'lık stok çözeltilerini, her birinin son konsantrasyonu 2 mM olacak şekilde ekleyin.Canlı görüntüleme mikroskobu ve bilgisayar programı başlatıldıktan sonra, sahte bir görüntüleme odasında perfüzyona başlayın ve tüp sistemini dengeleyin; hat içi çözelti ısıtıcısını ve mikroskop tablasındaki görüntüleme odasını önceden ısıtarak sistemi 32 ile 37 °C arasında dengeleyin. Hücrelere boya yüklemek için yükleme prosedürünü başlatmadan önce, 5 mM fluo-4 NAM'ın bir 0,5 µL'lik alikotuna 100 µL önceden ısıtılmış A CSF ekleyin ve çözeltiyi su banyosunda çözün; 90 saniye boyunca sonikasyon uygulayın. Önceden ısıtılmış görüntüleme çözeltisinin 400 µL'sini dörtlü veya 24'lü bir plakanın bir kuyucuğuna aktarın. 5 µM'lık bir çözeltinin 500 µL'sini elde etmek için aynı kuyucuğa D çözeltisini ekleyin.Ardından, üzerinde hücrelerin bulunduğu bir lamelini dikkatlice kuyucuğa yerleştirin ve 37 °C'lik bir hücre kültürü inkübatöründe uygun bir süre boyunca inkübe edin. Yükleme süresi ve D konsantrasyonu; hücre tipine, hücre yoğunluğuna ve deneyin özel gereksinimlerine bağlıdır. Uzun inkübasyon süreleri hücrelere, özellikle de primer nöron ve glial hücrelere zarar verebilir ve bu durum fizyolojik stimülilere verilen yanıt için kritiktir. 30 dakikadan fazla inkübasyon, yalnızca küçük mikro domainlerdeki (örneğin, spine'ların MUE'leri) ER kalsiyum dağılımını incelemek amacıyla yapılan ER kalsiyum lokalizasyon deneyleri için yararlı olacaktır. İnkübasyonun hemen ardından lameli, görüntüleme çözeltisi içeren başka bir hücre kültürü kuyucuğuna aktarın.Hücreleri görüntüleme haznesine yerleştirmeye hazırlanmak için, bir boya fırçası yardımıyla görüntüleme haznesine yüksek vakum gresi uygulayın. 10 ila 12 milimetrelik lameller için, küçük bir hacme sahip olan ve böylece dakikada 15 kata kadar tampon değişimi gibi yüksek perfüzyon hızlarına olanak tanıyan kendi yapımımız görüntüleme haznelerini kullanıyoruz. Flu oh beş ve yüklenmiş hücrelerin bulunduğu lameli alın ve nemli kalmasını sağlamak için üzerine küçük bir damla görüntüleme solüsyonu ekleyin.Ardından lamelini ters çevirin ve hücreleri görüntüleme haznesine yerleştirin. Lameli silikon yapıştırıcıya bastırmak ve cam lamelin altındaki kalıntı tamponu temizlemek için bir pamuklu çubuk kullanın. Daha sonra, sahte görüntüleme haznesini deneysel görüntüleme haznesiyle değiştirin.Hücre seçimi için hücreleri beş ila 10 dakika boyunca sürekli perfüzyonla yıkayın. Flu oh five ve ER'deki calcium two'nun hızlı fotobeyazlamasını önlemek için mikroskopta minimum lazer aydınlatması, iki ila dört hertz yüksek tarama hızı, küçük görüntü boyutu ve yüksek kazanç ayarlarını kullanın. Bitki deneyine göre uygulayın.Deneyin başlangıcında, flu oh five ve kalsiyum etiketinin hücresel dağılımı ile kırmızı karboksil sel esteraz konstrüktünün kırmızı floresan etiketini belgeleyin. Burada ilgilendiğiniz hücredeki temsili nöronlar için yüksek çözünürlüklü X, YZ görüntü yığınları ile belirli deneysel koşullar altında ER kalsiyum dinamiklerini izlemek amacıyla XYT görüntüleme gerçekleştirin. Sistemimiz için tipik ayarlar, metin protokolünün tablo 2'sinde listelenmiştir. Görüntüleme çözeltisi ile sürekli perfüzyon altında ER kalsiyumundaki değişimleri izleyin; tampon değişim hızları hücre yıkama ve sarkoplazmik endoplazmik retikulum kalsiyum iki ATPazların bloke edilmesi yoluyla depoların boşaltılması için 1,5 ml/dk ve ATP ile metabotropik glutamat reseptörü agonisti olan DHPG ile stimülasyon için 3 ml/dk'dır.Burada glial hücreler, 10 saniye boyunca 200 micromolar ATP ile stimüle edilmektedir. Görüntüleri işlemek için, çok renkli görüntüleme için Image J programında görüntü yığınını açın. Yazılım tarafından istendiğinde RGB kanallarını ayırın.İlgi bölgelerini belirleyin. Amaca bağlı olarak, ya tüm ER'nin ya da ER'nin küçük bölgelerinin etrafına ilgi bölgeleri çizin. Bir ilgi bölgesindeki ortalama piksel yoğunluğunu okumak için zaman serisi analizörü (time series analyzer) eklentisini kullanın.Bu formülü kullanarak, delta F bölü F sıfır ile arka plan düzeltmeli göreceli floresan değişimlerini hesaplayın. Göreceli floresan değişimlerini, Y ekseni delta F bölü F sıfır ve X ekseni zaman olacak şekilde bir grafik olarak sunun. Bu şekildeki A hücreleri, kırmızı floresan TED vektörü eksprese eden kortikal astrositler ve hipokampal nöronlardır ve düşük afiniteli kalsiyum indikatörü ile işaretlenmişlerdir.Fluo-5N. Floresan kalsiyum indikatörü kompleksi, tüm hücre tiplerinin endoplazmik retikulumunda lokalize olmuştur. Bu şekil, Fluo-5N ile işaretlenmiş glia hücrelerini göstermektedir. CIN tedavisi sırasında, bir hücrenin plazma membranı hem CIN tedavisi öncesinde hem de sonrasında hasar görmüşse, parlak bir sitozolik işaretleme görülür.Bu durum, Fluo-5N'nin endojen esterazlar tarafından sitozole de salındığını ortaya koymaktadır. Bu deneyde, Fluo-5N ile TED etiketlemesinin ardından, kültüre edilmiş hipokampal nöronların ER kalsiyum boşalması, SERCA blokörü siklonik asit ile gerçekleştirilir. Burada gösterilen, ATP ile stimüle edilen fare kortikal glia hücrelerinin zaman ayarlı serisinde gözlemlenen, ilgi alanı başına ortalama floresans yoğunluğundaki muazzam değişime dikkat ediniz. Floresans aniden düşer ve ardından toparlanır; bu durum ER kalsiyum salınımını ve yeniden dolumunu temsil eder. Eş zamanlı olarak, kırmızı floresan proteinin floresansı, fotobeyazlatma sonucunda marjinal olarak azalır; diyagramlar bazı deneylerde, ancak hepsinde değil, floresans yoğunluğunun zaman içindeki değişimini göstermektedir.Bazı fluo-5N kompleksleri stimülasyon sırasında kaybolduğu için floresan değerleri başlangıçtaki floresan yoğunluk seviyelerine geri dönmez. Bu video, fluo-5N kalsiyum kompleksleri ile işaretlenmiş ve ATP ile stimüle edilmiş, yüksek çözünürlüklü bir karboksilaz 2 enfekte BHK 21 hücresini göstermektedir. ATP tarafından tetiklenen kalsiyum salınımının ve ER kalsiyum deposunun yeniden dolumunun, ER tübüllerinin ince yapılarında görselleştirildiğine dikkat edin. Bu prosedür uygulanırken, yalnızca tamamen sağlıklı hücrelerin fizyolojik kalsiyum yanıtları gösterdiğini hatırlamak önemlidir.Bu nedenle, bir dizi birbiriyle ilişkili kalsiyum homeostaz deneyinin aynı hücre grubuyla tek bir günde gerçekleştirilmesini öneririz. Deneyimlerimize dayanarak, beş N'lik boya akışının en iyi sonucu verdiği görülmüştür, ancak bu kalsiyum indikatörü ağarmaya karşı çok dayanıklı değildir. Bu nedenle, bu yöntem daha fazla ağarma direnci olan düşük afiniteli kalsiyum indikatörlerinin geliştirilmesiyle daha etkili hale gelecektir.Bu videoyu izledikten sonra, sentetik düşük afiniteli kalsiyum indikatörleri ile hücre dışı kalsiyum geçişlerinin nasıl görüntüleneceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Bu indikatörler, hücre dışı kalsiyum dinamiklerini yüksek zamansal çözünürlükle izlemenize olanak tanır. Bu nedenle, yöntemimiz sinaptik plastisiteye dahil olan kalsiyum sinyal kaskadlarının araştırılması ve nörodejeneratif hastalıkların hücresel modellerinde kalsiyum homeostazındaki değişikliklerin izlenmesi için faydalı olabilir.

direct-imaging-er-calcium-with-targeted-esterase-induced-dye-loading

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Endoplazmik retikulum, protein biyogenezi ve kalsiyum homeostazında önemli bir rol oynar. Biz, bize Ca2 + kaçak kanal rolü ele almak ve kendi varsayılan düzenleyici mekanizmaların karakterize sağlayan deneysel bir sistem kurduk. Bu sistem siRNA aracılı gen susturulması ve canlı hücre Ca2 + görüntüleme içerir.

Canlı Hücre Kalsiyum Görüntüleme siRNA aracılığı ile gen susturma ile birlikte Ca tanımlar 2 + ER Membran Kaçak Kanallar ve Düzenleme Mekanizmaları

Bu makalenin amacı, dijital bir immunofluorescent mikroskop kullanılarak sıçan pial arteriyel dilim östrojen reseptör-α immunofluorescent algılama (ERα) optimize etmek için bir yöntem göstermektir.

Rat pial arteriollerde Östrojen Reseptör-α Dijital Immunofluorescent Mikroskobu kullanılarak görüntülenmesi

Nöron ağları geliştirme spontan aktivite, kalsiyum duyarlı göstergesi boyalar AM ester formları kullanarak ölçülebilir. Nöronal aktivasyon gösteren hücre içi kalsiyum değişiklikler, bir veya iki foton görüntüleme göstergesi floresan geçici değişiklikler olarak algılanır. Bu protokol, gelişimsel bağımlı nöron ağları bir dizi için adapte...

Kortikal Ağları Geliştirme Fonksiyonel Kalsiyum Görüntüleme

Biz canlı hücre konfokal görüntüleme vasıtasıyla, endoplazmik retikulum (ER) içerisinde yerleşik transfekte floresan protein dağılımı ve hareketliliği incelemek için kullanılan görüntüleme yaklaşımı tarif eder. Biz de ultrastruktural bu subselüler bölmesinin mimarisi üzerine kendi ifade etkisini analiz.

Kültür Hücrelerinin retikulum Subdomain&#39;ler Görselleştirme

Burada, Ca2+ göstergeleri ile yüklü sağlam memeli hücrelerinde floresan mikroskobu kullanarak yerel IP3 aracılı Ca2+ olaylarını görüntüleme tekniklerini ve bu olayların tanımlanmasını ve analizini otomatikleştiren bir algoritma sunuyoruz.

Görüntüleme Yerel Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Kültürlenmiş memeli hücrelerinde sinyaller

Endoplazmik retikulum kalsiyum homeostazı çeşitli patolojilerde bozulur.  ER kalsiyum deposundaki bozulmaları tespit etmek için salgılanan bir ER kalsiyum izleme proteini (SERCaMP) raportörü kullanılabilir.   Bu protokol, ER kalsiyum homeostazını in vitro ve in vivo olarak incelemek için bir Gaussia lusiferaz SERCaMP'nin kullanımını açıklar.

Bir kullanılması Endoplazmik retikulum kalsiyum dengesi İzleme<em&gt; Gaussia</em&gt; Lusiferaz SERCaMP

HEK293'ün endoplazmik / sarkoplazmik retikulumdaki (ER / SR) hızlı kalsiyum geçişlerini ve gerçek zamanlı floresan mikroskopisi kullanarak iskelet kası C2C12 hücrelerini izlemek için hedeflenmiş genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergesi (GECI) Catcher + 'ün uygulanması için protokoller sunuyoruz. Yerinde K d ölçümü ve kalibrasyonu için bir protokol de tartışılmıştır.

Hedeflenen Ca ile ER / SR Kalsiyum Salınımının İzlenmesi<sup&gt; 2+</sup&gt; Sensör Catcher<sup&gt; +</sup

Burada bir protokol için tek tek hücre tiplerinin fare nöromusküler kavşakta nüfus sinyal görüntü kalsiyum mevcut.

Ex Vivo Hücre özgü kalsiyum fare diyafram Üçlü sinaps sinyal görüntüleme

Burada bir iletişim kuralı için Ca2 + sinyaller hücre altı çözünürlükte diseksiyon sağlayan Ca2 + düşsel nöronlar ve gliyal hücreler, mevcut. Bu işleme genetik olarak kodlanmış Ca2 + göstergeleri ifade izin tüm hücre tipleri için geçerlidir.

Yerel Ca2 + sinyalleri membran hedefli Ca2 + göstergeleri tarafından kültürlü hücrelerdeki diseksiyon

Bu protokol, beyin ensheathing perisitlerinden floresan kalsiyum görüntülerini ve uyuşturulmış farelerde yakındaki kan damarlarından kan akışı verilerini elde etmek ve analiz etmek için adımlar sunar. Bu teknikler duvar hücresi fizyolojisi çalışmaları için yararlıdır ve herhangi bir hücre tipinde kalsiyum geçicilerini araştırmak için uyarlanabilir.

Vivo Transgenik Farelerde Beyin Perisit Kalsiyumu ve Hemodinamik Görüntüleme

Mevcut protokol, yüksek verimli ilaç taraması ve toksisite testi için iPSC kaynaklı kardiyomiyositlerde (iPSC-CM'ler) tetiklenen hücresel aktivitenin tüm optik kontrolünü ve gözlemini açıklamaktadır. Zaman ve uzaydaki fenotipik kalıpların multi-parametrik nicelleştirilmesi gösterilmiştir. İlaçların saatler boyunca uzun vadeli etkileri veya günler boyunca sıralı ölçümler gösterilmiştir.

Toksisite Testi ve Fenotipik İlaç Taraması için iPSC Türevi Kardiyomiyositlerde Yüksek Verimli Optik Kontrol ve Kalsiyum Sinyalinin Kaydedilmesi

Öğrenin, canlı hücrelerde endoplazmik retikulum kalsiyum dinamiklerini TED yöntemiyle görüntülemeyi. Bu teknik, düşük afiniteli indikatör boyaların ER lümeninde açığa çıkarılmasını sağlar.

Hedefli-esteraz ile ER Kalsiyum Doğrudan Görüntüleme Kaynaklı Boya Yükleme (TED)

Daha fazla video keşfet