Hedefli-esteraz ile ER Kalsiyum Doğrudan Görüntüleme Kaynaklı Boya Yükleme (TED)

Aşağıdaki deneyin genel amacı, kalsiyum dinamiklerini doğrudan canlı hücrelerin endoplazmik retikulumunun lümeninde görselleştirmektir. Bu, hücrelerin hedeflenen esteraz kaynaklı boya veya TED vektör yapısı ile endoplazmik retikulumda karbox esteraz CS iki'yi aşırı eksprese etmek için dönüştürülmesiyle elde edilir. Daha sonra, hücreler, plazma ve ER zarlarından yayılan aseto metil ester kalsiyum indikatör grip oh beş NA ile inkübe edilir.

Sonra karboksil esteraz parçalanır. Ester grubu, er'deki kalsiyuma duyarlı göstergeyi serbest bırakır. Lümen ve floresan kalsiyum kompleksleri oluşur.

Canlı hücre görüntülemeye dayalı olarak ER'deki serbest kalsiyum konsantrasyonundaki değişiklikleri gösteren sonuçlar elde edilir. Bu yöntem, hücresel kalsiyum homeostazının düzenlenmesi ile ilgili temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Kalsiyum sinyalleri en sık sitozolde izlenir, bu nedenle kalsiyumun hücre dışı boşluktan veya hücre içi ER kalsiyum deposundan sitozole aktığı yerde kolayca ayırt edilemez.

Bu sınırlamanın üstesinden gelmek için, hedefli esteraz kaynaklı indirme geliştirdik. Bu yöntemle acil servisten salınan kalsiyum direkt olarak izlenir. Yaklaşım rahatsız edici değildir.

Plazma zarı bozulmadan kalır ve hücre içi sinyal kaskadları korunur. Genel olarak, yönteme başvuran bireyler deneyime ihtiyaç duydukları için mücadele edeceklerdir. TED Vektör ifadesinde, Karboksilaz CES ikisine kaynaşmış bir cent proteinini ifade eden vektör yapıları geliştirdik.

Bu, deneyler sırasında AR kalsiyum görüntülemeye uygun hücreleri kolayca tanımlamamızı sağlar, bu da güçlü kırmızı floresan ve yalnızca orta ila güçlü kalsiyum indikatör floresansı ile karakterize edilen hücrelerdir. Bu floresan etiketler endoplazmik retikulum boyunca eşit olarak dağıtılmalıdır ve nükleer bölgede yoktur. Başlamadan önce.

Metin protokolüne göre yapay beyin omurilik sıvısı veya A BOS ve grip oh beş NAM hazırlayın. A BOS'u oda sıcaklığına önceden ısıtın ve derin glikoz ekleyin, A CSF'yi beş dakika boyunca karbojenle havalandırın. Daha sonra, her biri iki milimolar nihai konsantrasyonlara bir molar kalsiyum klorür ve magnezyum klorür stok çözeltileri ekleyin.

Canlı görüntüleme mikroskobunu ve bilgisayar programını başlattıktan sonra, sahte bir görüntüleme odasında bolluğa başlayın ve tüp sistemini dengeleyin, satır içi çözelti ısıtıcısını ve görüntüleme odasını mikroskop sahnesinde önceden ısıtın ve sistemi 32 ila 37 santigrat dereceye kadar dengeleyin. Hücrelere boya yüklemek için indirme prosedürüne başlamadan önce, 100 mikrolitre önceden ısıtılmış A CSF'yi beş milimolar grip oh beş NAM'den oluşan 0.5 mikrolitrelik bir alikota ekleyin ve çözeltiyi 90 saniye boyunca bir su banyosu sonikatında çözündürün 400 mikrolitre ön ısıtma görüntüleme solüsyonunu dört veya 24 oyuklu bir plakanın bir kuyucuğuna aktarın. Beş mikromolar çözeltiden 500 mikrolitre üretmek için D çözeltisini aynı kuyuya ekleyin.

Daha sonra, uygun bir süre boyunca kuyu inkübasyonuna hücrelerle birlikte bir kapak fişi dikkatlice yerleştirin 37 santigrat derecede bir hücre kültürü inkübatöründe DI yükleme süresi ve D konsantrasyonu hücre tipine, hücre yoğunluğuna ve deneylere özel ihtiyaçlara bağlıdır. Uzun inkübasyon süreleri hücrelere, özellikle primer nüans ve glial hücrelere zarar verebilir ve bu, fizyolojik uyaranlara yanıt verme için kritik öneme sahiptir. 30 dakikadan fazla inkübasyon, yalnızca ER kalsiyumunun küçük mikro alanlarda, örneğin dikenlerin MUE'lerinde dağılımını araştırmak için ER kalsiyum lokalizasyon deneyleri için yararlı olacaktır İnkübasyondan hemen sonra, kapak fişini görüntüleme solüsyonu içeren başka bir hücre kültürüne aktarın.

Hücreleri görüntüleme odasına monte etmeye hazırlanmak için, görüntüleme odasına yüksek vakumlu gres uygulamak için bir boya fırçası kullanın. Küçük hacimli 10 ila 12 milimetrelik kapak fişleri için kendi kendimize yapılan görüntüleme odaları kullanıyoruz, böylece dakikada 15 kata kadar tampon değişimine kadar yüksek perfüzyon hızlarına izin veriyoruz. Grip oh beş ve yüklü hücrelerin bulunduğu kapak fişini alın ve ıslak tutmak için küçük bir damla görüntüleme solüsyonu ekleyin.

Ardından kapak kızağını ters çevirin ve hücreleri görüntüleme odasına monte edin. Kapak contasını silikon yapıştırıcıya bastırmak ve cam kapak contasının altındaki kalan tamponu silmek için pamuklu çubuk kullanın. Ardından, sahte görüntüleme odasını deneysel görüntüleme odasıyla değiştirin.

Hücre seçimi için sürekli perfüzyonla hücreleri beş ila 10 dakika yıkayın. Acil serviste grip oh beş ve kalsiyum iki'nin hızlı foto ağartmasını, iki ila dört hertz'lik yüksek bir tarama hızını, küçük bir görüntü boyutunu ve mikroskopta yüksek bir kazancı önlemek için minimum miktarda lazer aydınlatması kullanın. Bitki deneyine göre.

Deneyin başında, grip oh beş ve kalsiyum etiketinin hücresel dağılımını ve kırmızı carbox cel esteraz yapısının kırmızı floresan etiketini belgeleyin. Buradaki ilgilendiğiniz hücrede, yüksek çözünürlüklü X, YZ görüntü yığınlarına sahip temsili nöronlar, belirli deneysel koşullar altında ER kalsiyum dinamiklerini izlemek için XYT görüntüleme gerçekleştirir. Sistemimiz için tipik ayarlar, metin protokolünün ikinci tablosunda listelenmiştir: Görüntüleme çözeltisi ile sürekli perfüzyon altında ER kalsiyumundaki değişiklikleri izleyin, tampon değişim hızları, hücre yıkama için dakikada 1.5 mililitredir ve sarko, endoplazmik, retikulum, kalsiyum, iki a, TPA ve dakikada üç mililitre, bir TP ve DHPG tarafından stimülasyon ve metabotropik glutamat reseptörü için agonist.

Burada glial hücreler 10 saniye boyunca 200 mikromolar A TP ile uyarılır. Görüntüleri işlemek için, çok renkli görüntüleme için Image J programında görüntü yığınını açın. Yazılım tarafından istendiğinde RBG kanallarını bölün.

İlgilendiğiniz bölgeleri belirleyin. Amaca bağlı olarak, ER'nin tamamının veya er'nin küçük bölgelerinin etrafına ilgi alanları çizin. İlgilendiğiniz bir bölgedeki ortalama piksel yoğunluğunu okumak için zaman serisi çözümleyicisi eklentisini kullanın.

Bu formülü kullanarak floresandaki arka plan düzeltilmiş bağıl değişiklikleri F sıfır üzerinden delta F ile hesaplayın. Floresandaki nispi değişiklikleri, Y ekseni için sıfır üzerinde delta F ve x ekseni için zaman ile bir iz olarak sunun. Bu şekilde, he A hücreleri, kortikal astrositler ve hipokampal nöronlar, kırmızı bir floresan TED vektörünü ifade eder ve düşük afiniteli kalsiyum göstergesi ile etiketlenir.

Floresan kalsiyum indikatör kompleksi, tüm hücre tiplerinin endoplazmik retikulumuna lokalizedir. Bu şekil, grip oh beş N etiketli glia hücresini göstermektedir. CIN tedavisi sırasında, bir hücrenin plazma zarı CIN tedavisinden önce ve sonra hasar görürse parlak bir sitozolik etiketleme görülür.

Bu, grip oh beş N'nin de endojen esterazlar tarafından sitozolde salındığını ortaya koymaktadır. Bu deneyde, grip ile TED etiketlemesinden sonra, kültürlenmiş hipokampal nöronların kalsiyum tükenmesine sirka bloker siklonik asit neden olur. Burada gösterilen ilgi alanı başına ortalama floresan yoğunluğundaki muazzam değişimin, bir TP ile uyarılan fare cortico GL hücreleri ile hızlandırılmış bir seri olduğunu unutmayın. Floresan aniden düşer ve geri kazanılır, ER kalsiyum salınımını ve yeniden doldurulmasını temsil eder Eşzamanlı olarak, kırmızı floresan proteinin floresansı, tüm deneylerde olmasa da bazılarında zaman içinde floresan yoğunluğundaki değişimi gösteren arduvaz ağartma diyagramlarının bir sonucu olarak marjinal olarak azalır.

Floresan değerleri, başlangıçtaki floresan yoğunluk seviyelerine geri dönmez, çünkü stimülasyon sırasında bazı grip oh beş N kompleksi kaybolur. Bu film, grip oh beş N kalsiyum kompleksi ile etiketlenmiş ve bir TP ile uyarılmış yüksek çözünürlükte iki enfekte BHK 21 hücresini göstermektedir. TP'nin neden olduğu kalsiyum salınımının ve ER kalsiyum deposunun yeniden doldurulmasının, ER tübüllerinin ince yapılarında görselleştirildiğine dikkat edin. Bu prosedüre katılırken, sadece mükemmel sağlıklı hücrelerin fizyolojik kalsiyum tepkileri gösterdiğini hatırlamak önemlidir.

Bu nedenle, aynı hücre partisi ile bir günde bir dizi birbiriyle ilişkili kalsiyum homeostazı deneyi yapmanızı öneririz. Deneyimlerimize dayanarak, beş N'lik boya gribi en iyi sonucu verir, ancak bu kalsiyum göstergesi çok fazla kırılmaya dayanıklı değildir. Bu nedenle, bu yöntem daha ağartıcıya dirençli düşük afiniteli kalsiyum indikatörlerinin geliştirilmesinden fayda sağlayacaktır.

Bu videoyu izledikten sonra, sentetik düşük afiniteli kalsiyum indikatörleri ile E kalsiyum geçişini nasıl görüntüleyeceğinizi iyi anlamış olmalısınız. Bu göstergeler, kalsiyum dinamiklerini yüksek zamansal çözünürlükle izlemenizi sağlar. Bu nedenle, yöntemimiz sinaptik plastisitede yer alan kalsiyum sinyal kaskadlarının araştırılması ve nörodejeneratif hastalıklar için hücresel modellerde kalsiyum homeostazındaki değişikliklerin izlenmesi için faydalı olabilir.