Canlı Fare Damar İltihabı ve trombüs oluşumu sırasında Activated Endotel üzerinde heterotypic Trombosit nötrofil Etkileşimleri Gerçek zamanlı Görüntüleme

Burada vasküler inflamasyon ve canlı farelerde trombüs oluşumu sırasında aktive endotel üzerindeki heterotipik trombosit-nötrofil etkileşimleri görselleştirmek için floresan intravital mikroskobu deneysel bir tekniktir rapor. Bu mikroskobik teknoloji vasküler hastalığın moleküler mekanizmasını incelemek ve patofizyolojik durumlardaki farmakolojik ajanları test için değerli olacaktır.

Aşağıdaki deneyin genel amacı, vasküler hastalık sırasında aktive edilmiş endotel üzerindeki trombositler ve nötrofiller arasındaki tipik etkileşimi görselleştirmektir. Bu, kremaster kası içindeki mikrovaskülatürü görselleştirmek için canlı farelerde gerçek zamanlı floresan intra vital mikroskopi ile elde edilir. İkinci adım olarak, floresan olarak işaretlenmiş antikorlar infüze edilir ve elde edilen tipik trombosit nötrofil etkileşimlerinin doğrudan görüntülenmesini kolaylaştırmak için ular inflamasyon veya yaralanma başlatılır.

Daha sonra, hücre sayısını ve dinamiklerini ölçmek için kaydedilen veriler analiz edilir. Sonuç olarak, aktive edilmiş endotel üzerindeki trombositler ve nötrofiller arasındaki doğrudan tipik etkileşimler, gerçek zamanlı intravital mikroskopide infüze edilen antikorların floresan sinyaline dayalı olarak değerlendirilebilir. İntravital mikroskobik tekniğimiz, vasküler inflamasyon ve trombüs oluşumu sırasında aktive edilmiş endotel üzerindeki trombositler ve nötrofiller arasındaki gerçek zamanlı etkileşimler hakkında bilgi sağlayabilir.

Bu teknoloji, kanser hücrelerinin ve kan hücrelerinin etkileşimlerinin değerlendirilmesi gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. Deneye başlamadan önce, vasküler inflamasyon modeli için mikroskop sistemini açın. Anesteziklerin IP enjeksiyonundan üç saat önce TNF alfa'yı yansıtan intra growly enjeksiyonu.

Sedasyon ile onaylandıktan sonra, herhangi bir solunum zorluğunu ortadan kaldırmak için farenin trakeasına bir PE 90 tüpü kanül yapın. Daha sonra, floresan işaretli antikorların ve ek anesteziklerin infüzyonu için sol juguler ven içine bir PE 10 tüpü kanüle edin. Daha sonra skrotal cildi nazikçe dışarı çekin ve yatay olarak içeri çekin ve cerrahi alanın üzerine ön ısıtma tamponu koyun.

Şimdi bir forseps ile alt karın bölgesine bastırın, diğer forseps büyüklüğünde bir testisi dikkatlice dışarı çekin, araba ana kası dikey olarak ve periferik dokuyu tepsiye sabitleyerek kası bir intravial mikroskop tepsisi üzerindeki bir cam kapak kayması üzerinde düzleştirin. Bu adıma önce DITE 4 88 konjuge sıçan, anti fare CD 42 C ve Alexa floor 6 47 konjuge anti fare GR bir antikoru önceden ayarlanmış juguler kanül yoluyla infüze ederek başlayın. Ardından mikroskobun filtre setinde, maruz kalacak kanalların onay kutusunu işaretleyin ve seçilen her zaman hızlandırılmış çekim için pozlama süresini ayarlayın.

Zaman noktalarının sayısını, toplam beş dakikalık geçen süre için 200 milisaniye aralıklarla 1000 ila 1500 arasında ayarlamak için. Görüntü yakalamada tüm parametreler ayarlandıktan sonra, 157 mikrometreye 118 mikrometre penceresiyle 60 x büyütmede yakalama yakalamaya başlamak için başlat'ı seçin. İktihaplı bir kremaster mekanının üst yarısında beş dakika boyunca nötrofillere yönetici ve yapışık trombositleri izleyin.

Trombosit trombüs oluşumunu analiz etmek için maskele'ye gidin ve oluştur'u seçin. Ardından, ana görünümdeki seçim çerçevesi aracının altında büyük kalem simgesini tıklatın. Ana görünümde teknenin dışındaki bir bölgeyi renklendirmek için kalemi kullanın.

Bir arka plan maskesi ayarlamak için maskeye gidin, bu düzlemi kopyala'ya tıklayın, maskeyi kopyala'ya tıklayın. Geçerli zaman noktasında, tüm zaman noktalarını seçin ve Tamam'ı tıklatın. Arka plan sinyalini hesaplamak için istatistiklere gidin ve maske istatistikleri'ne tıklayın.

Ardından görüntü kapsamında, geçerli 2D hızlandırılmış çekime veya maske kapsamındaki dört D görüntüye tıklayın, özelliklerde maskenin tamamını seçin. Yakalama tarihi altında, geçen süre'yi seçin. Morph geometrisi altında, piksel cinsinden alanı seçin ve yoğunluk altında maksimum yoğunluğu seçin.

Şimdi dışa aktar'ı tıklayın. Metin dosyasını bir elektronik tablo programında açın ve kayıt süresi boyunca arka plan sinyalinin ortalama değerini hesaplayın. Arka plan floresan yoğunluğunu belirlemek için.

Ular inflamasyon modelinde gösterildiği gibi trombosit trombüsü sırasında arka plan floresan yoğunluğunu hesapladıktan sonra, maskeye gidin, segmenti tıklayın, uygun e'yi ve kanalı seçin ve düşük tıklama uygula ve tamam'da arka plan sinyalinin ortalama değerini girin. Ardından istatistiklere gidin ve istatistikleri maskele'ye tıklayın. Şimdi görüntü kapsamında, maske kapsamında geçerli 2D hızlandırılmış veya dört D görüntüye tıklayın, özelliklerde tüm maskeyi seçin, Yakalama tarihi altında Morph geometrisi altında geçen süreyi seçin, piksel cinsinden alanı seçin ve yoğunluk altında biraz yoğunluk seçin.

Ardından dışa aktar'ı tıklayın. Metin dosyasını elektronik tablo programında açın ve trombosit trombüsünün floresan yoğunluğunu hesaplayın. Arterioler trombozu analiz etmek için, az önce gösterildiği gibi DITE 4 88 konjuge anti fare CD 42 C ANDOR 6 47 konjuge anti fare GR bir antikor infüzyonu ile başlayın.

Görüntü yakalama işlemini başlatmak için başlat'a tıkladıktan sonra, lazeri ateşlemek için damar duvarından iki ila üç mikrometre dahili olarak bir noktaya çift tıklayın. Arterioler endotel hücrelerinin yaralanması, parlak alan görüntüsünde belirgin olması gereken görsel bir şekil değişikliğine ve ardından trombosit birikimine neden olur. Lazer yaralanmasından beş dakika sonra, çekimi duraklatın ve iptal edin.

Ardından, 20 dakika boyunca yapışık trombositleri ve haddeleme ve yapışık nötrofilleri kaydetmek için 500 milisaniye aralıklarla 2.400 zaman noktasıyla bir yakalama başlatın. Trombosit trombüsü sırasında arka plan floresan yoğunluğunu ular inflamasyon modelinde olduğu gibi hesapladıktan sonra, maskeye gidin, segmenti tıklayın, fit ve kanalı seçin ve düşük tıklama uygula ve tamam üzerine arka plan sinyalinin ortalama değerini girin. Şimdi görüntü kapsamında, maske kapsamında geçerli 2D hızlandırılmış veya 40 D görüntülere tıklayın, özelliklerde tüm maskeyi seçin, Çekim tarihi altında Geçen süreyi seçin altında Morpho piksel cinsinden alan seç ve yoğunluk altında biraz yoğunluk seçin.

Ardından dışa aktar'ı tıklayın. Metin dosyasını elektronik tablo programında açın ve trombosit trombüsünün floresan yoğunluğunu hesaplayın. Yuvarlanan ve yapışan nötrofilleri ölçmek için zaman atlamalı oynatın ve gözle görülür şekilde yuvarlanan hücrelerin sayısını sayın.

Trombosit trombüsünün 20 dakikadan fazla yuvarlanması, trombosit trombüsü ile en az iki saniye etkileşime girerken nötrofil hızında bir azalma olarak tanımlanır. Yapışık nötrofiller, trombosit trombüsüne en az iki dakika boyunca bağlı kalan herhangi bir nötrofil olarak tanımlanır. Burada, kırmızı renkte nötrofiller ve yeşil renkte trombositler ile ilişkili floresan sinyallerin görünümünün temsili görüntüleri.

Ular iltihabı gösterilirken, ok damardaki kan akışının yönünü gösterir. İltihaplı endotel hücreleri üzerindeki yuvarlanma ve yapışık nötrofil sayısı sırasıyla dakikada 0.25 hücre ve beş dakikada 18.5 hücre olarak belirlendi. Veriler, dört vahşi tip farede ortalama artı veya eksi 30 farklı E'nin standart hatasını temsil eder.

Burada trombositlerin medyan entegre floresan sinyali, zamanın bir fonksiyonu olarak çizilir. Kırmızı renkteki trombositlerin çoğunun, iltihaplı damar duvarından ziyade yeşil renkteki yapışık ve sürünen nötrofillere yapıştığı bulunmuştur. Şimdi lazerin neden olduğu arterioler yaralanmayı takiben nötrofil trombosit etkileşimlerine geçiyoruz.

Bu görüntüler kırmızı renkte tek bir nötrofili göstermektedir ve yeşil renkte trombosit trombüsü üzerinde yuvarlanan sarı ok ile kırmızı renkte ikinci bir nötrofil ile gösterilir ve her ikisi de arteriolar endotel hücreleri üzerinde hızla yuvarlanan beyaz ok ile gösterilir, her ikisi de beş saniyelik bir yakalama aralığı boyunca, burada yine kırmızı renkte tek bir nötrofil, 15 saniyelik bir aralık boyunca yeşil renkte bir trombosit trombüsüne yuvarlanarak ve yapışarak gösterilir. Ok ucu, yuvarlanmayı ve yapışık bir nötrofili tanımlar ve kalın gri ok, kan akışının yönünü gösterir. Burada, trombositlerin medyan entegre floresan sinyali, zamanın bir fonksiyonu olarak çizilir.

Yuvarlanan ve yapışan nötrofillerin sayısı 20 dakika boyunca sırasıyla 21.5 ve 1.6 hücre olarak belirlendi. Nötrofillerin ilk hızlı yuvarlanması endotel hücrelerinde meydana geldi. Nötrofiller trombosit trombüsü ile temas ettiğinde, trombosit trombüsü üzerindeki nötrofillerin yuvarlanma hızı saniyede 8.2 mikrometre aralığında değiştirildi ve pektin ve psgl L birin etkileşimi aracılık etti.

Veriler, lazer yaralanmasından beş dakika sonra yedi vahşi tip farede 14 farklı trombüsün ortalamasının standart hatası olan ortalama artı veya eksi değerleri temsil eder. Trombosit trombüsünün boyutu görüntüleme sırasında nispeten sabit kalır ve nötrofiller trombüs üzerine yuvarlanır ve ona yapışır. Dolaşımdaki trombositlerden gelen floresan sinyali ihmal edilebilir düzeydedir.

Trombosit trombüsünden elde edilenle karşılaştırıldığında, Bu videoyu izledikten sonra, intravital mikroskop sisteminin canlı farelerle nasıl kurulacağını iyi anlamalısınız, bu da trombositler ve nötrofiller arasındaki hetero tipik etkileşimleri gerçek zamanlı olarak görselleştirmenize olanak tanır