Name: Canlı Fare Damar İltihabı ve trombüs oluşumu sırasında Activated Endotel üzerinde heterotypic Trombosit nötrofil Etkileşimleri Gerçek zamanlı Görüntüleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 18 s
Description: Keşfedin, canlı farelerde floresan intravital mikroskopi kullanarak aktive endotel üzerindeki trombosit-nötrofil etkileşimlerini gerçek zamanlı görüntüleme yöntemini. Bu teknik, damar hastalıklarının dinamiklerini anlamak ve farmakolojik müdahaleleri test etmek için değerli bilgiler sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri ile hibe (JC P30 HL101302 ve RO1 HL109439) ve Amerikan Kalp Derneği (JC SDG 5270005) tarafından kısmen desteklenmiştir. A. Barazia bir T32HL007829 NIH eğitim hibesi ile desteklenmiştir.

1. Intravital Mikroskop hazırlanması (Şekil 1A) <ol><li> (125 mM NaCI, 4.5 mM KCI, 2.5 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 17 mM NaHCO 3, pH 7.4) tampon superfusion hazırlayın. </li><li> 37 tampon sıcaklık ve bir termo-kontrollü battaniye korumak için bir dolaşım su banyosu açın ° C. Azot gazı (% 5 CO 2, nitrojen ile dengeli) ile tampon havalandırınız. </li><li> Mikroskop sistemi açın (Sutter Lambda DG-4 yüksek hızlı dalga değiştirici, iş istasyonu bilgisayar, Olympus BX61W mikroskop, MPC-200 çoklu manipülatör, ROE-200 sahne denetleyici, yüksek hızlı kamera ve yoğunlaştırıcı). </li><li> Vasküler inflamasyon modeli için,% 100 dikroik ayna kullanın. Lazer yaralanma ile trombüs oluşumunu teşvik etmek için, 50/50% ayna ile% 100 ayna yerini ve Micropoint lazer ablasyon sistemi açın. </li></ol> 2. Intravital Mikroskopi Cremaster&#39;ın kas hazırlanması (Şekil 1B) <ol><li> Bir uyuşturketamin (125 mg / kg vücut ağırlığı (BW)) ve atlara ip enjeksiyonu (12.5 mg / kg BW) göre erkek fare (6-8 hafta, eski C57BL / 6). Illinois Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu University tüm hayvan bakımı ve deney prosedürleri onayladı. Bir vasküler inflamasyon modeli için (cerrahi öncesi 2-2.5 saat) önceden görüntüleme intrascrotally bir fare 3 saat içine fare TNF-α (250 ul serum fizyolojik içinde 0.5 mg) enjekte. </li><li> Bir intravital mikroskop tepside 37 ° C&#39;de bir termo-kontrollü battaniye üzerinde fare yerleştirin. </li><li> Forsepsi kullanarak boyun yüzeyinde deri çekin ve yukarı makas ile 1 cm yatay boyun deri orta hat kesilirken. </li><li> Yavaşça künt makas kullanarak servikal kas açın ve trakea çevreleyen kas kaldırın. </li><li> Solunum güçlüğü ortadan kaldırmak için trakea içine bir PE90 tüp kanüle. </li><li> Nazikçe servikal kas sol tarafında kaldırmak ve çevre dokulardan juguler ven izole. </li><li> C annuantikorlar ve ek anestezik infüzyonu için juguler ven içine geç PE10 tüp. </li><li> Yavaşça çekin ve yatay olarak skrotal deride kesilirken. Deney boyunca doku bütünlüğünü korumak için, önceden ısıtılmış tampon cerrahi alan üzerinde superfused edildi. </li><li> Tek forcep ile alt karın üzerine basın ve dikkatle diğer forcep ile testis çekin. </li><li> Testis etrafında çevreleyen bağ dokuları çıkartın. </li><li> Dikey cremaster kas kesilirken ve çevre iğneleyerek bir intravital mikroskop tepsi üzerinde bir cam lamel üzerinde kas düzleştirin. </li><li> Veri toplamadan önce stabilize kası için 10-20 dk bekleyin. 30-45 um arasında bir çapa sahip Cremaster&#39;ın kas arteriyoller (trombüs oluşumunu) ve venüllerin (damar iltihabı) çalışma için seçilmiştir. </li><li> Anestezi koşulları sağlamak için, aynı anestezi juguler cannulus yaklaşık olarak her 30 dk 30-50 ml demlenmeye. </li></ol> &lt;p class = &quot;jove_title&quot;&gt; 3. TNF-α-ile indüklenen vasküler enflamasyon için intravital Mikroskopisi <ol><li> Intravital mikroskop, açık SlideBook 5.0 yazılımı üzerinde fare yerleştirilmesinden sonra ve uygun optik ve objektif (60X) ayarlamak için menü çubuğunda &quot;Odak Pencere&quot; üzerine tıklayın. </li><li> Dylight infüze 488-konjüge sıçan anti-fare CD42c (100 ul tuzlu su içinde 0.1 mg / g BW) ve Alexa Fluor 647-konjüge sıçan anti-fare Gr-1 antikor (100 ul tuzlu su içinde 0.05 mg / g BW) bir boyun cannulus sayesinde . </li><li> Menü çubuğuna gidin ve araç çubuğundaki &quot;Görüntü Yakala&quot; üzerine tıklayın. </li><li> Yeni bir menü açılır; &quot;Resim&quot; olarak, yüksekliği &quot;460&quot; 1x1 gibi &quot;Bin Faktörü&quot; seçeneğini seçin ve &quot;640&quot; width ve. </li><li> &quot;Filtre Seti&quot; olarak, her biri için poz süresini teşhir ve ayarlamak istediğiniz kanallar için onay kutusunu işaretleyin. Örneğin, açık kanal: 10 msn, FITC kanal: 50 msn ve Cy5 kanal: 50 msn. </li><li> Zaman noktalarında ve aralık sayısını ayarlamak için &quot;Time-Lapse Yakalama&quot; seçeneğini seçin. For inflamasyon modelinde, zaman noktalarının sayısını 200 msn lik bir aralıkla (: 5 dk Toplam geçen zaman) ile 1000-1500 ayarlanır. </li><li> O kanal için belirlenen pozlama seferde tek bir düzlem görüntüyü görmek için &quot;Test&quot; i tıklayın. Histogram yeterli yoğunluk dağılımı (çok kanallı yakalama için, her bir kanal için bu işlemi yineleyin) gösterene kadar maruz kalma süresi ve / veya mikroskop ışık ayarlayın. </li><li> Bir kez tüm parametreleri &quot;Görüntü Yakala&quot; in (kanalları, pozlama süreleri, vb) ayarlanır, yakalama başlamak için &quot;Başlat&quot; seçeneğini seçin. </li><li> Vasküler enflamasyon modelinde bir iltihaplı cremaster venül üst yarısı içinde 5 dakika boyunca haddeleme ve yapışkan trombositler ve nötrofil izler. Sekiz ila on farklı venüllerde bir fare kaydedilir. </li><li> Görüntüleri 157 mikron x 118 mikron bir pencere boyutu veren 60X toplam büyütme (1.0 NA su immersiyon objektif) kullanılarak alınmıştır. </li><li> Deney tamamlandıktan sonra, fareler servikal dislocatio ile ötenazin. </li></ol> 4. Venüler İnflamasyon Modeli için Veri Analizi <ol><li> SlideBook 5.0 yazılımı açın ve bir dosyayı açmak için menü çubuğunda &quot;Klasör&quot; tıklatın. </li><li> Açılan kanal menüsünü tıklayın ve &quot;Aç, FITC, Cy5, vb&quot; seçeneğini </li><li> &quot;(Kırmızı ve yeşil çubuklar) Renormalize&quot; ve kanalı seçin tıklayın. Kabaca floresans sinyali optimize sola veya sağa kırmızı ve yeşil çubuklar sürükleyin. </li><li> &quot;Uygula&quot; ve &quot;Tamam&quot; görüntüyü güncellemek için tıklayın. </li><li> Varsayılan olarak geçerli ekran seçmek için &quot;Küçük Düğme&quot; tıklayın. </li><li> Yakalanan timelapse görüntü oynayın ve 5 dk süresince haddeleme ve yapışık nötrofil say. </li><li> Trombosit trombüs oluşumunu analiz etmek, &quot;Maske&quot; gidin ve &quot;Oluştur&quot; u seçin. </li><li> Bir maskeyi ve &quot;mevcut görüntü olarak&quot; işareti adlandırın. </li><li> Ana görünümünde &quot;Marquee Tool&quot; in &quot;Büyük kalem simgesi&quot; tıklayın. </li><li> Bir arka plan maske ayarlamak için ana görünümünde geminin dışındaki bir bölge renklendirin. </li><li> T gito &quot;Maske&quot;, &quot;Bu Düzlem Kopyala&quot;, &quot;mevcut timepoint Kopyala maske&quot; tıklayın ve &quot;tüm zaman noktalarında&quot; seçeneğini tıklayın ve &quot;Tamam&quot; a tıklayın. </li><li> Arka plan sinyalini hesaplamak için, &quot;İstatistik&quot; gidin ve &quot;Maske İstatistikleri&quot; butonuna tıklayınız. </li><li> Görüntü Kapsam &quot;Cari 2D Time Lapse veya 4D Resim (ler)&quot; tıklayın ve Maske Kapsamında &quot;Tüm Maske&quot; seçeneğini seçin. Yakalama tarihi altında, &quot;Alan (piksel)&quot; Morfometri altında Yoğunluğu altında &quot;Maksimum Yoğunluk&quot; seçeneğini seçin ve &quot;Export&quot; (Bu istatistik yöntemini tıklatın bize sağlar Özellikler olarak, &quot;Geçen Zaman (: mm ms hh)&quot; seçin oto-floresans yoğunluğu (arka plan sinyali)) hesaplamak. </li><li> MS Office Excel metin dosyasını açın ve kayıt dönemi boyunca arka sinyalin ortalama değerini hesaplamak. Bu, arka plan floresans şiddetidir. </li><li> Trombüs yoğunluğunu belirlemek için, ana görünümde &quot;Marquee Tool&quot; tekrar &quot;Büyük kalem simgesi&quot; tıklayın. </li><li> Trombosit sinyalini ayarlamak için ana görünümünde kabın içine Renk. </li><li> &quot;Maske&quot; Git, &quot;Bu Düzlem kopyala&quot;, &quot;Tüm zaman noktalarında&quot; select &quot;Geçerli timepoint Kopyala maskesi&quot; seçeneğine tıklayın ve &quot;Tamam&quot; tıklatın. </li><li> &quot;İstatistik&quot; gidin ve &quot;Maske İstatistikleri&quot; butonuna tıklayınız. </li><li> Görüntü Kapsam &quot;Cari 2D Time Lapse veya 4D Resim (ler)&quot; tıklayın ve Maske Kapsamında &quot;Tüm Maske&quot; seçeneğini seçin. Özellikler olarak, seçme &quot;Geçen Süre (ss: dd: ms)&quot; Capture Tarih altında, bize izin &quot;Alan (piksel)&quot; Morfometri altında Yoğunluğu altında &quot;Sum Yoğunluğu&quot; seçin ve &quot;Export&quot; (Bu istatistik yöntemini tıklatın seçin ) kabın içine floresans yoğunluğunu hesaplamak. </li><li> MS Office Excel metin dosyası açın. Trombositlerin Floresans sinyalinin geminin içindeki toplamı yoğunluğu arka plan yoğunluğu x Bölgesi ortalama değeri (piksel) çıkarılarak hesaplanır. Bu, trombosit trombüs floresans şiddetidir. </li><li> 3-5 farklı farelerde 30 farklı venlerde bu işlemi tekrarlayın. Sonra, trombositlerin floresans şiddetinin ortanca değerini hesaplamak. </li><li> Karşınötrofil yuvarlanma ve adezyon analiz, nötrofil haddeleme akını her venül 5 dk içinde belirlenir ve dakikada hücre sayıları olarak sunuldu. &gt; 30 saniye için durağan ve yavaşça sürünerek (&lt;10 mikron üzerinde 30 sn) ama üzerinde atmadım yapışık nötrofil sayısı, sayılan ve 5 dk hücre başına sayı olarak sunuldu. </li></ol> 5. Lazer kaynaklı Arteriolar Tromboz için intravital Mikroskopisi Ablasyon lazer 5-1 Kalibrasyon <ol><li> Mikroskop sahne üzerine yansıtılmış bir slayt yerleştirin, slaytın üst distile su küçük bir damla uygulamak ve yoğunluğunu ayarlayın ve mercek kullanarak odaklanın. </li><li> &quot;Odak Pencere&quot; açın ve SlideBook 5.0 yazılımı &quot;FRAP&quot; sekmesini seçin. </li><li> 40-50 lazer güç ayarlama, hem de &quot;çift tıklayın tekrar&quot; ve &quot;çift tıklayınız boyutu&quot; 8 ayarlanır. Crosshair&#39;i bir dizi getirmek için &quot;Yerler&quot; kutusunu işaretleyin. </li><li> Görev o gelen &quot;Ok&quot; simgesini seçinn Ekranın üst. </li><li> &quot;FRAP Hizalama&quot; sekmesi altında, &quot;bir sonraki Fire&quot; ı tıklatın. Küçük bir nokta monitörde sol alt köşesine yakın görünmelidir. Nokta göründüğünde, çift bunun ortasına tıklayın. Bir kez tıklandığında, başka bir nokta üstünde belirir ve ilk nokta sağında olmalıdır; bunun üzerine çift tıklayın. 16 puan (16 inci nokta sağ alt köşesinde görünecektir.) Kalibrasyon parametrelerini güncellemek tamamlandığında &quot;Kaydet&quot; düğmesini tıklatın için bu işlemi tekrarlayın. </li><li> Kalibrasyon doğruluğunu sınamak için, ekranın ortasında görünmelidir &quot;Merkezi&quot; düğmesi-küçük bir nokta tıklayın. Değilse istenen doğruluk elde edilene kadar, kalibrasyon tekrarlayın. </li></ol> 5-2 Lazer kaynaklı arterioler trombüs oluşumu <ol><li> Mikroskop sahnede bir anestezi fare (2-2 2-12 yordama bakın) yerleştirin. </li><li> &quot;Yakalama&quot; penceresi altında bir protokol seçin veya yeni bir tane oluşturun. Ayarları aşağıdaki gibidir: CY5 (70 msn maruz kalma), Açık (10 msec maruz kalma), ve FITC (50 msn maruz kalma). Görüntü 20 dk (500 msn bir zaman aralığı ile yaklaşık 2.400 kez puan) üzerinde yakalanır. </li><li> Dylight yukarıda tarif edildiği gibi 488-konjüge fare anti-CD42c ile Alexa Fluor 647-konjüge fare anti-Gr-1 antikor süzülür. </li><li> Olarak 3-7 3-3 açıklanan floresan yoğunluğu ve parlak saha görüntü dahil mikroskobu parametrelerini optimize. </li><li> Uygun aydınlık şiddeti veya antikor sinyal, arteriyol yerleştirme ve odak sağlamak için &quot;Test&quot; düğmesine tıklayın. </li><li> Görüntü yakalama işlemini başlatmak için &quot;Başlat&quot; a tıklayın. </li><li> Ablasyon lazer ateş önce, fare işaretçisi simgesi seçilir ve damar duvarında net bir odak olduğunu olduğundan emin olun. </li><li> Lazer atışı için çift damar duvarının 2-3 mikron dahili bir noktayı tıklayın. Arteriyollerde endotel hücrelerinin Yaralanma aydınlık alan görüntü fark olması gereken bir görsel bir şekil değiştirme olur, trombosit birikim izledi. Monitör trombüslazer yaralanmadan sonra 5 dakika boyunca oluşumu. </li><li> Lazer yaralanmadan sonra beş dakika bekleme (trombüs boyutu artık kararlı olmalıdır) ve yakalama iptal. Daha sonra, 20 dakika boyunca yapışkan trombositlere ve haddeleme / yapışık nötrofiller kaydetmek için 500 milisaniye aralığı ile 2400 kez puan ile bir yakalama başlar. Üç ila beş arteriyollerde bir fare kaydedilir. </li><li> Deneyin tamamlanmasından sonra, fareler servikal dislokasyon yolu ile ötenazi yapıldı. </li></ol> 6. Arteriolar Tromboz Model Veri Analizi <ol><li> 4,5 adımları 4.1 üzerine gidin. </li><li> Trombosit trombüs oluşumu sırasında arka plan floresan yoğunluğu elde etmek için, 4.14 adımlarda 4.7 üzerine gitmek. </li><li> &quot;Maske&quot; Git, &quot;Segment&quot;, kanal seçme FITC tıklatın ve Düşük arka plan sinyalin ortalama değerini ekleyin. Click &quot;Uygula&quot; ve &quot;Tamam&quot;. </li><li> Trombosit trombüs floresan yoğunluğu (Dylight 488-konjuge anti-CD42c antikor) analiz etmek, </strong&gt; 4.19 adımlarını 4.18 üzerine gitmek. Antikor sinyalini hesaplamak için, &quot;Sum Yoğunluğu&quot; (&quot;Maksimum Yoğunluk&quot; x &quot;Alan (piksel)&quot;) plan sinyali tarafından çıkarılır. Bu, trombosit trombüs floresans şiddetidir. </li><li> Haddeleme ve yapışık nötrofiller ölçmek için, timelapse oynamak ve gözle 20 dakika boyunca trombosit trombüs üzerinde rulo hücrelerinin sayısını saymak. En azından 2 saniye süre ile trombosit trombüs ile etkileşim sırasında Rolling nötrofil hızında bir azalma olarak tanımlanır. Bağlanan nötrofiller, en az 2 dakika süreyle trombosit trombus bağlı kalan herhangi bir nötrofiller olarak tanımlanır. Haddeleme ve yapışık nötrofil sayısı 20 Dakikada hücre sayıları olarak sunuldu. Rolling hızı bir partikül izleme sistemi kullanılarak hesaplanmıştır. </li></ol>

<ol><li>Wagner, D. D., Frenette, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+vessel+wall+and+its+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The vessel wall and its interactions.</a> Blood. 111, 5271-5281 (2008).</li>
<li>Nieswandt, B., Kleinschnitz, C., Stoll, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ischaemic+stroke%3A+a+thrombo-inflammatory+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Ischaemic stroke: a thrombo-inflammatory disease.</a> J. Physiol. 589, 4115-4123 (2011).</li>
<li>Yang, J., Furie, B. C., Furie, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+of+P-selectin+glycoprotein+ligand-1%3A+its+role+as+a+selectin+counterreceptor+in+leukocyte-endothelial+and+leukocyte-platelet+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb.+Haemost%22%5BJournal%5D)">The biology of P-selectin glycoprotein ligand-1: its role as a selectin counterreceptor in leukocyte-endothelial and leukocyte-platelet interaction.</a> Thromb. Haemost. 81, 1-7 (1999).</li>
<li>Zarbock, A., Polanowska-Grabowska, R. K., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet-neutrophil-interactions%3A+linking+hemostasis+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Rev%22%5BJournal%5D)">Platelet-neutrophil-interactions: linking hemostasis and inflammation.</a> Blood Rev. 21, 99-111 (2007).</li>
<li>Chen, J., Lopez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+of+platelets+with+subendothelium+and+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Interactions of platelets with subendothelium and endothelium.</a> Microcirculation. 12, 235-246 (2005).</li>
<li>Konstantopoulos, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Venous+levels+of+shear+support+neutrophil-platelet+adhesion+and+neutrophil+aggregation+in+blood+via+P-selectin+and+beta2-integrin%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Venous levels of shear support neutrophil-platelet adhesion and neutrophil aggregation in blood via P-selectin and beta2-integrin.</a> Circulation. 98, 873-882 (1998).</li>
<li>Maugeri, N., de Gaetano, G., Barbanti, M., Donati, M. B., Cerletti, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevention+of+platelet-polymorphonuclear+leukocyte+interactions%3A+new+clues+to+the+antithrombotic+properties+of+parnaparin%2C+a+low+molecular+weight+heparin%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Prevention of platelet-polymorphonuclear leukocyte interactions: new clues to the antithrombotic properties of parnaparin, a low molecular weight heparin.</a> Haematologica. 90, 833-839 (2005).</li>
<li>Hidalgo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterotypic+interactions+enabled+by+polarized+neutrophil+microdomains+mediate+thromboinflammatory+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Heterotypic interactions enabled by polarized neutrophil microdomains mediate thromboinflammatory injury.</a> Nat. Med. 15, 384-391 (2009).</li>
<li>Cho, J., Furie, B. C., Coughlin, S. R., Furie, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+role+for+extracellular+protein+disulfide+isomerase+during+thrombus+formation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">A critical role for extracellular protein disulfide isomerase during thrombus formation in mice.</a> J. Clin. Invest. 118, 1123-1131 (2008).</li>
<li>Cho, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+disulfide+isomerase+capture+during+thrombus+formation+in+vivo+depends+on+the+presence+of+beta3+integrins%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Protein disulfide isomerase capture during thrombus formation in vivo depends on the presence of beta3 integrins.</a> Blood. 120, 647-655 (2012).</li>
<li>Gross, P. L., Furie, B. C., Merrill-Skoloff, G., Chou, J., Furie, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte-versus+microparticle-mediated+tissue+factor+transfer+during+arteriolar+thrombus+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">Leukocyte-versus microparticle-mediated tissue factor transfer during arteriolar thrombus development.</a> Journal of Leukocyte Biology. 78, 1318-1326 (2005).</li>
<li>Falati, S., Gross, P., Merrill-Skoloff, G., Furie, B. C., Furie, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+in+vivo+imaging+of+platelets%2C+tissue+factor+and+fibrin+during+arterial+thrombus+formation+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Real-time in vivo imaging of platelets, tissue factor and fibrin during arterial thrombus formation in the mouse.</a> Nat. Med. 8, 1175-1181 (2002).</li>
<li>Barthel, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha+1%2C3+fucosyltransferases+are+master+regulators+of+prostate+cancer+cell+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Alpha 1,3 fucosyltransferases are master regulators of prostate cancer cell trafficking.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 19491-19496 (2009).</li>
<li>Trzpis, M., McLaughlin, P. M., de Leij, L. M., Harmsen, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+cell+adhesion+molecule%3A+more+than+a+carcinoma+marker+and+adhesion+molecule%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Epithelial cell adhesion molecule: more than a carcinoma marker and adhesion molecule.</a> The American Journal of Pathology. 171, 386-395 (2007).</li>
<li>Junt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+visualization+of+thrombopoiesis+within+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Dynamic visualization of thrombopoiesis within bone marrow.</a> Science. 317, 1767-1770 (2007).</li>
<li>Egan, C. E., Sukhumavasi, W., Bierly, A. L., Denkers, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+multiple+functions+of+Gr-1%28%2B%29+cell+subpopulations+during+microbial+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Immunologic+Research%22%5BJournal%5D)">Understanding the multiple functions of Gr-1(+) cell subpopulations during microbial infection.</a> Immunologic Research. 40, 35-48 (2008).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir rakip finansal çıkara beyan.

Burada vasküler inflamasyon ve tromboz sırasında aktive endotel üzerindeki heterotipik trombosit-nötrofil etkileşimleri görselleştirmek için gerçek zamanlı floresan intravital mikroskopi için ayrıntılı bir protokol açıklar. Daha önce, benzer floresans mikroskopik yaklaşımlar trombüs oluşumu ve vasküler inflamasyonun moleküler mekanizması çalışmaya bildirildi. 8,12 heterotipik hücre-hücre etkileşimi yaralanma yerinde vazo-oklüzyon için önemli olabilir bu yana, bu teknoloji için değerli bir araç olacaktır vaskü...

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7447-40-7</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 2H 2 O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10035-04-8</td><td></td></tr><tr><td>MgCl 2 6H 2 O</td><td>Fisher Scientific</td><td>7791-18-6</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td> <td>Fisher Scientific</td><td>144-55-8</td><td></td></tr><tr><td>%0.9 NaCl Salin</td><td>Hospira</td><td>0409-4888-10</td><td></td></tr><tr><td>Ketamin</td><td>Hospira</td><td>0409-2051-05</td><td></td></tr><tr><td>Ksilazin</td><td>Lloyd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>İntramedik Boru (PE 90)</td><td>BD Teşhis</td><td>427421</td> İntramedik Boru (PE 10)BD Teşhis 427401 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Murin TNF-&alfa;</td><td>Ar-Ge D Systems</td><td>410-MT</td><td></td></tr><tr><td>Dylight 488 etiketli sıçan anti-fare CD42b antikoru </td><td>Emfret Analytics</td><td>X488</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647-konjuge anti-fare Ly-6G/Ly-6C (Gr-1) Antikor</td><td>BioLegend</td><td>108418</td><td></td></tr><tr><td>NESLAB EX su banyosu/sirkülatör</td><td>Termo-Bilimsel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Olympus BX61W mikroskop</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TH4-100 Power</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lambda DG-4</td><td>Sutter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MPC-200 çoklu manipülatör</td><td>Sutter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>R&#8211;-200 sahne kontrolörü</td><td>Sutter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C9300 yüksek hızlı kamera</td><td>Hamamatsu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Yoğunlaştırıcı</td><td>Video Kapsamı Uluslararası</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ablasyon Lazeri</td><td>Fotonik Aletler A.Ş.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SlideBook 5.0</td><td>Akıllı Görüntüleme Yenilikleri</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

canlı fare damar İltihabı ve trombüs oluşumu sırasında activated endotel üzerinde heterotypic trombosit nötrofil etkileşimleri gerçek zamanlı görüntüleme

Real-time Imaging of Heterotypic Platelet-neutrophil Interactions on the Activated Endothelium During Vascular Inflammation and Thrombus Formation in Live Mice

Arterioler yaralanma yerinde trombüs oluşumu sırasında aktive endotel aracılık tromboz ve vasküler inflamasyon üzerine aktive trombositler ve lökositler (özellikle nötrofiller) etkileşimi. 1,2, aktive endotel ve subendotelyal matriks proteinlerine yapışkan trombositlere nötrofil yuvarlanma ve yapışma destekliyoruz. 3 Tersine, venüler inflamatuar koşullarda, aktif endotele yapıştığında nötrofil trombositlerin dolaşımdaki adezyon ve birikimi destekleyebilir. Heterotipik trombosit-agregasyonu nötrofil hücreleri arasındaki spesifik reseptör-reseptör etkileşimleri yoluyla sayaç ardışık işlemler gerektirir. 4 O aktive edilmiş endotel hücreleri, böylece yüksek kesme koşulları altında trombosit yapışması ve birikim başlatılması, bu tür von Willebrand faktörü gibi yapışma molekülleri serbest olduğu bilinmektedir. 5 Ayrıca, aktive endotel hücreleri ifade selektinler nötrofil yuvarlanma ve adezyon bir destekd Hücrelerarası adezyon molekülü-1 (ICAM-1), sırasıyla, düşük kesme koşulları altında. 4 Trombosit P-selektin yoluyla nötrofiller ile etkileşime girer p-selektin glikoprotein ligandı-1 (PSGL-1), nötrofil ve böylece β2 integrinler ve sağlam aktivasyonunu uyararak İki hücre türleri arasındaki yapışma. Heterotipik trombosit-nötrofil etkileşimleri tam kan ya da izole edilmiş hücreler 6,7 olarak belirlendiği in vitro deneylerde gelişmelere rağmen, bu çalışmalar vasküler hastalık sırasında oksidatif stres koşulları manipüle edemez. Bu raporda, trombosit ve nötrofil işaretleyici bir fare karşı floresan-etiketli, spesifik antikorlar kullanılarak, TNF-α ile indüklenen inflamasyonu veya lazer kaynaklı takip sırasında aktive endotel üzerinde trombosit ve nötrofil heterotipik etkileşimlerini izlemek için ayrıntılı bir intravital mikroskopik protokol açıklar canlı farelerin cremaster kas mikrodamar yaralanma.

Ayrıntılı bir intravital mikroskopi analizi kullanarak, aktive endotel üzerindeki heterotipik trombosit-nötrofil etkileşimleri trombosit (CD42c) veya nötrofil işaretleyici (Gr-1) canlı farelere karşı floresan etiketli antikorlar infüzyonu ile görüntülenmiştir. TNF-α-kaynaklı venüler enflamasyon modelinde, en çok haddeleme nötrofiller stabil kayıt süresi (3-4,5 saat TNF-α enjeksiyonundan sonra, Şekil 2A&#39;da sırasında ICAM-1 ile aktive β2 İntegrinlerin etkileşim ile muhteme...

Burada vasküler inflamasyon ve canlı farelerde trombüs oluşumu sırasında aktive endotel üzerindeki heterotipik trombosit-nötrofil etkileşimleri görselleştirmek için floresan intravital mikroskobu deneysel bir tekniktir rapor. Bu mikroskobik teknoloji vasküler hastalığın moleküler mekanizmasını incelemek ve patofizyolojik durumlardaki farmakolojik ajanları test için değerli olacaktır.

Canlı Fare Damar İltihabı ve trombüs oluşumu sırasında Activated Endotel üzerinde heterotypic Trombosit nötrofil Etkileşimleri Gerçek zamanlı Görüntüleme

Interaction of activated platelets and leukocytes (mainly neutrophils) on the activated endothelium mediates thrombosis and vascular inflammation.1,2 ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, vasküler hastalıklar sırasında aktive olmuş endotelyum üzerindeki trombositler ve nötrofiller arasındaki tipik etkileşimi görselleştirmektir. Bu işlem, kremaster kası içindeki mikrovaskülatürü görselleştirmek amacıyla canlı farelerde gerçek zamanlı floresan intravital mikroskopi ile gerçekleştirilir. İkinci bir adım olarak, floresanla işaretlenmiş antikorlar infüze edilir ve ortaya çıkan tipik trombosit nötrofil etkileşimlerinin doğrudan görselleştirilmesini kolaylaştırmak için vasküler inflamasyon veya yaralanma başlatılır.Ardından, hücre sayısını ve dinamiklerini nicelleştirmek için kaydedilen veriler analiz edilir. Nihayetinde, aktive edilmiş endotelyum üzerindeki trombositler ve nötrofiller arasındaki doğrudan tipik etkileşimler, gerçek zamanlı intravital mikroskopi ile infüze edilen antikorların floresan sinyaline dayanarak değerlendirilebilir. İntravital mikroskobik tekniğimiz, vasküler inflamasyon ve trombüs oluşumu sırasında aktive endotelyum üzerindeki trombositler ve nötrofiller arasındaki gerçek zamanlı etkileşimlere dair bilgi sağlayabilir.Bu teknoloji, kanser hücreleri ile kan hücreleri arasındaki etkileşimlerin değerlendirilmesi gibi diğ

real-time-imaging-heterotypic-platelet-neutrophil-interactions-on

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu videoda, intraperitoneal olarak lipopolisakkarit enjekte edilen bir fare modelinin mezenterial damarlarındaki kan hücresi-endotel etkileşimlerinin gerçek zamanlı görselleştirmesini gösteriyoruz.

Bir Enflamasyon Fare Modelinde Kan Hücresi-Endotel Etkileşimlerini Analiz Etmek için İntravital Mikroskopi

Bakterilerin kesme gerilimi altındaki kan damarları ile etkileşimini incelemek için, vasküler yapışmaya katkıda bulunan bakteri ve konak faktörlerini incelemeye izin veren bir akış odası ve in vivo mezenterik intravital mikroskopi modeli tanımlanmıştır.

In Vitro ve İn Vivo Modeli Gemi Duvar Altında Akış Koşulları Bakteriyel Yapışma Eğitim için

Farelerde mezenter damarlarının intravital mikroskopisinin bu basitleştirilmiş uygulaması, lökosit-endotel ve trombosit-lökosit etkileşimlerini gözlemlemek için farklı inflamasyon modellerinde kullanılabilir.

Farelerde mesenteriumda Damarlardaki intravital Mikroskopi Lökosit-endotelyal ve Trombosit-lökosit Etkileşimleri

Anestezi uygulanmış farelerde intravital konfokal mikroskopi kullanarak kararlı durum ve enflamatuar koşullar altında mezenterik venlerdeki nötrofillerin ve monositlerin davranışını izlemek için bir protokolü detaylandırıyoruz.

Real Time Anestetize Farelerde Intravital Mikroskopi Mezenterik Damarlardaki nötrofiller ve monositler Görüntüleme

Bu makale aynı zamanda trombosit fonksiyonu ve pıhtılaşmayı ölçen hemostaz deneysel model tanımlamaktadır. Trombosit ve fibrin floresans gerçek zamanlı olarak ölçülür ve platelet yapışma oranı, bir pıhtılaşma hızının, pıhtılaşma başlangıcı belirlenir. Model transfüzyonu için konsantreleri akışı altında trombosit prokoagülan özelliklerini belirlemek için kullanılır.

Trombosit Transfüzyon ve Hemostaz için bir mikroakışkan Akış Odası Modeli Gerçek zamanlı Trombosit Birikimi ve Fibrin oluşumu Tedbirleri

Bu çalışma, trombosit yapışması, yayılması ve akış altında salgı çalışması için bir floresan mikroskopi tabanlı yöntem açıklanmaktadır. Bu çok yönlü platform tromboz ve hemostaz üzerine mekanik araştırma için trombosit fonksiyonunun araştırılmasını sağlar.

Akım altında Trombosit Degranülasyonu ve Salgılamanın Canlı Hücreli Görüntüleme

Hasta kaynaklı endotel ile tam kan etkileşimini araştırmak için in vitro vasküler hastalık modeli salıyoruz. Bu sistem çeşitli koşullar altında primer endotel hücrelerinin trombojenik özelliklerinin incelenmesini sağlar. Bu yöntem özellikle pıhtılaşmanın farklı aşamalarında situ trombojenite ve antikoagülasyon tedavisinin değerlendirilmesi için uygundur.

In Vitro Mikroakışkan Hastalık Modeli Gerçek Zamanlı Olarak Tam Kan-Endotel Etkileşimleri ve Kan Pıhtısı Dinamikleri Çalışma

Burada iki fotonlu mikroskopi kullanarak canlı farelerin kafatası kemiğinin iliğindeki megakaryositleri ve proplateletleri görüntüleme yöntemini açıklıyoruz.

In Vivo Fare Kafatası Kemik İliği'nde Megakaryositlerin ve Proplateletlerin İki FotonLu Görüntülemesi

Lökosit ve trombositlerin işe alınması, arteriyogenez sırasında kollateral arterlerin etkili büyümesi için gerekli olan önemli bir bileşeni oluşturur. Multifoton mikroskopisi, arteriyogenez sırasında lökosit alımını ve ekstravazasyonunu incelemek için in vivo yüksek uzay-zamansal çözünürlüğe ve daha az foto-toksisiteye sahip hücre dinamiklerini izlemek için etkili bir araçtır.

Bir Murin Arka Bacak Modelinde Arteriyogenez Sırasında Lökosit Alımını İzlemek için Multifoton İntravital Görüntüleme

Akış altındaki trombosit fonksiyonu değerlendirilebilir ve simüle edilmiş hemostatik resüsitasyon, travma ve transfüzyon tıbbında uygulamaları olan bir mikroakışkan cihaz kullanılarak modellenebilir.

Trombosit Fonksiyonunun Değerlendirilmesinde Mikroakışkanlar

Keşfedin, canlı farelerde floresan intravital mikroskopi kullanarak aktive endotel üzerindeki trombosit-nötrofil etkileşimlerini gerçek zamanlı görüntüleme yöntemini. Bu teknik, damar hastalıklarının dinamiklerini anlamak ve farmakolojik müdahaleleri test etmek için değerli bilgiler sunar.

Canlı Fare Damar İltihabı ve trombüs oluşumu sırasında Activated Endotel üzerinde heterotypic Trombosit nötrofil Etkileşimleri Gerçek zamanlı Görüntüleme (Video) | JoVE Journal

Canlı Fare Damar İltihabı ve trombüs oluşumu sırasında Activated Endotel üzerinde heterotypic Trombosit nötrofil Etkileşimleri Gerçek zamanlı Görüntüleme

Daha fazla video keşfet