Içinde Nörodejeneratif fenotipleri değerlendirilmesi Drosophila Tırmanma Tahliller tarafından Dopaminerjik nöronlar ve Tüm Beyin immün

Bu prosedürün genel amacı, transgenik drosophila'daki dopaminerjik nöronların nörodejenerasyonunu değerlendirmektir. Bu, ilk olarak GAL dört UAS sistemi aracılığıyla tirozin hidroksilaz promotörü kontrolü altında istenen transgenlerin eksprese edilmesiyle gerçekleştirilir. İşlemin ikinci adımı, istenen genotipteki sinekleri toplamak, cinsiyete göre ayırmak ve yaşlandırmaktır.

Üçüncü adım, sineklerin yaşlandıkça negatif coğrafi eksen ile tırmanma aktivitesini test etmektir. Son adım, farklı yaşlarda toplanan diseke beyinlerden alınan dopaminerjik nöronların sayısını saymaktır. Sonuç olarak, sonuçlar hayvanın lokomotor davranışındaki ve dopaminerjik nöron popülasyonunun boyutundaki değişiklikleri gösterecektir.

Bu yaklaşımın sonuçları, Parkinson hastalığı gibi nörodejeneratif hastalıkların tedavisine kadar uzanır. Bu yaklaşım, nöroprotektif genlerin ve farmakolojik müdahalelerin tanımlanmasına yardımcı olabilir Testi ayarlamak için, istenen genotiplerin yaşa uygun sineklerini seçin. Onları cinsiyetlerine göre ayırın ve rastgele 20 ila 30 hayvandan oluşan kohortlar halinde gruplandırın.

Her kohort istatistiksel bir örneği temsil eder. Sirkadiyen ritimlerin lokomotor davranış üzerindeki etkilerini kontrol etmek için kohortları 12 saatlik aydınlık karanlık bir döngüde ve test odasında tekrarlanabilecek bir sıcaklıkta tutun. Kohortun şişelerini her iki ila üç günde bir değiştirin ve bunları haftalık olarak tutarlı bir zamanda test edin.

Testten 30 dakika önce, her bir kohortu karbondioksit ile uyuşturun ve bunları bantla birleştirilmiş boş gıda şişelerinden yapılmış etiketli bir plastik tüpe aktarın. Sinekler beş ila 10 dakika sonra uyanık olmalıdır, ancak anesteziden tam iyileşme yaşa ve genotipe göre değişir ve optimize edilmelidir. Şimdi. Test şişelerinin arkasını görüntülemek için bir yükseklik ölçeği oluşturun.

Bir beyaz kağıt parçası üzerinde bir ila 20 santimetre arasındaki mesafeleri işaretleyin. Ardından teraziyi yerine sabitleyin. Şimdi test edilecek tüpleri yaklaşık 20 ila 30 santimetre uzaklıktaki ölçeğe göre hizalayın.

Şişelerin kare görünümüne sahip bir dijital kamera yerleştirin. Tüplerin ve terazinin üzerindeki etiketlerin net bir şekilde göründüğünden emin olun. Konumlandırıldıktan sonra kaydı başlatın ve dijital bir zamanlayıcı başlatın.

Şimdi birkaç saniye boyunca bir tüpe dokunun. Tüm sinekler tüpün dibini toplamalıdır. Bu adımı, tüm deney boyunca aynı süre ve aynı kuvvetle tutarlı bir şekilde yaptığınızdan emin olun.

Bir dakika sonra, art arda 15 denemenin ikincisi için knockdown'ı tekrarlayın. 15 denemenin tümü tamamlandığında, filmleri görsel olarak inceleyerek sinekleri taze şişelere geri koyun. Kohort başına gerçekleştirilen 15 denemenin her biri için, iki santimetre işaretinin üzerindeki sinek sayısını sayın.

10 saniye geçtikten sonra, iki santimetre işareti ampirik olarak belirlenir, test edilen birçok yaşta tüm kontrollerin 10 saniye sonra geçtiği mesafedir. 15 denemeden elde edilen ortalama puanı alın ve bunu, işareti geçen kohort üyelerinin yüzdesi olarak ifade edin. İstatistiksel tekrarların sayısı, 15 deneme ile değil, her grup için test edilen kohort sayısına eşittir.

Bir öğrencinin T-testi, anova veya diğer uygun analiz yöntemlerini kullanarak farklı genotipler arasındaki istatistiksel anlamlılığı değerlendirin. Sinekleri yaklaşık bir dakika boyunca% 70 etanol içeren bir diseksiyon kabına koyun. Kütikül balmumunu çıkarmak için.

Daha sonra sinekleri buz gibi soğuk PBS ile doldurulmuş başka bir diseksiyon kabına aktarın ve beyni diseksiyona devam edin. Sineği ventral tarafı yukarı bakacak şekilde konumlandırın ve isteğe bağlı olarak kanatları ve bacakları çıkarın. Vücuda tutunmak için bir set forseps kullanın ve göz altındaki kütikülü tutmak için başka bir set kullanın.

Ardından kafayı vücuttan uzaklaştırın. Ardından, probu kafadan çekerek çıkarın. Daha sonra kafa kütikülünü yeni deliğin zıt kenarlarından kavrayın ve beyin kafa kapsülünden çıkarılana kadar zıt yönlerde çekin.

Şimdi nazikçe, kalan kütikülü beyin yüzeyinden çıkarın. Ardından hava dolu trakea dokusunun tamamını çıkarın. Bu, aşağıdaki inkübasyon adımları sırasında beynin yüzmesini önleyecektir.

P 200 pipet ucundan bir beyin tutma pipeti hazırlayın. Birkaç milimetre kesin ve PBS'de% 0.1 Triton X 100 ile dengeleyin. Beyinleri PBS'de tamamen% 4 PFA ile doldurulmuş yarım mililitrelik bir tüpe aktarın.

Beyinleri hafif döndürme ile 20 dakika oda sıcaklığında sabitleyin. 20 dakika sonra, PBS'de %0,1 Triton X 100 olan yarım mililitre yıkama tamponu ile sabitleyiciyi değiştirmek için bir P 1000 pipet kullanın. Ters çevirerek karıştırın ve yıkama tamponunu değiştirmeden önce beyinlerin bir dakika inkübe etmesine izin verin.

Bir dakika sonra, yıkama tamponunu ikinci kez değiştirin ve beyinleri oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin. Ardından yıkama tamponunu üçüncü kez değiştirin ve beyinleri 20 dakika daha inkübe edin. Şimdi, yıkama tamponunu çıkarın ve beyinlerin oda sıcaklığında bir saat boyunca yarım milimetre bloke edici tampon içinde inkübe etmesine izin verin.

Bir saat sonra, bloke edici çözeltiye bir ila 100 seyreltme antit antikoru ekleyin. Hafifçe dönerek dört santigrat derecede iki gün inkübe etmesine izin verin. Bloğu çıkarmak için, sabitlemeyi çıkarmak için kullanılan yıkamaları tekrarlayın.

Daha sonra beyinleri, hafif bir rotasyonla dört santigrat derecede iki gün boyunca bloke edici çözelti içinde yarım mililitre bir ila 200 ikincil antikor seyreltmesi ile dengeleyin. Birkaç gün sonra, aynı yıkama prosedürünü kullanarak ikincil antikoru çıkarın. Montaj kızaklarını hazırlamak için bir kapak camına 2 adet 25 mikrolitrelik damla montaj ortamı ekleyin.

Ortada bir boşluk olacak şekilde montaj ortamına iki kapak camı yerleştirin. Slaytların kurumasını bekleyin. Montaj sürgüsünün genişliği konfokal mikroskobun aşamasına uymuyorsa, sürgüne 22 x 22 milimetrelik bir kapak kayması, düzgün bir şekilde oturması için oje kullanın.

Şimdi beynin içinde bulunduğu solüsyonu 50 mikrolitre montaj ortamı ile değiştirin. Kesilmiş bir P 200 ucu ile pipetleyerek beyinleri montaj ortamı ile dengeleyin. Ardından, beyinleri hendeğe aktarmak için kesilmiş bir P 200 ucu kullanın.

Montaj slaytında, beyinleri ön veya arka taraflarını görecek şekilde yönlendirin. Daha sonra üzerlerini 1.5 numara kapak astarı ile örtün ve bir köşeden, tüm havayı çıkarmak için kapak camları arasındaki boşluğu montaj ortamı ile doldurun. Slaytların kurumasını bekleyin ve ardından incelemeden önce oje ile kapatın.

İnsan alfa-sinüklein, tırmanma testinde TH GAL dört sürücüsü kullanılarak DA nöronlarında eksprese edildi. Bu transgeni eksprese eden erkekler, yaşa uygun kontrollere göre hızlandırılmış bir düşüş sergiledi ve NRF 2D NA bağlanma partnerini ifade eden coex olarak uçtu. Matematik S dişileri, farklı genotiplerdeki dört haftalık erkek sinekleri karşılaştırarak benzer sonuçlar gösterdi.

PPL bir nöron sayısını ölçmek için immünofloresan tabanlı DA nöron sayıları kullanıldı. Alfa-sinüklein eksprese eden sineklerde küçük ama önemli bir PPL bir nöron kaybı bulundu. Bu videoyu izledikten sonra, CLA testleri ve tirozin aase immünofloresan ile transgenik zoadaki varg nöronlarının nörodejenerasyonunun nasıl değerlendirileceğini iyi anlamış olmalısınız.

İzlediğiniz için teşekkürler.