Name: Içinde Nörodejeneratif fenotipleri değerlendirilmesi Drosophila Tırmanma Tahliller tarafından Dopaminerjik nöronlar ve Tüm Beyin immün (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: Öğrenin Drosophila'da dopaminerjik nöronların yaşla ilişkili nörodejenerasyonunu değerlendirmek için tırmanma testleri ve immünhistokimya yöntemlerini. Bu teknikler motor fonksiyon değişikliklerini ve nöron kaybını nicelendirir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz yararlı tartışmalar için teknik yardım ve Gerasimos P. Sykiotis için, sinek hisse senetleri için Christine Sommers Leo Pallanck teşekkür ederim. Bu çalışma MCB için NIH eğitim bursu T32CA009363 tarafından finanse edildi

1. Irkilme indüklenen Negatif Geotaxis Testi <ol><li> Istenen genotip sinekler seçin, onları 20-30 hayvan kohortlarında grup rastgele, cinsiyete göre ayırın ve 2-3 günde bir yeni gıda şişeleri içine çevirmek, test sinekler her set (yani yaş olarak eşleştirilmiş kohort, bir kohort / genotip) haftada en az bir kez. </li><li> Olumsuz geotaxis test öncesi otuz dakika, CO 2 sinekler uyutmak ve iki boş gıda şişeleri (Malzeme Tablo) (oda boyutları net bir bant ile açılışlarında katıldı ile yapılan ön etiketli şeffaf plastik tüpler koyun: 19 cm x 2.85 cm). Bizim deneyleri biz genellikle 25 sinekler / tüp kullanın. Not. Anestezi iyileşme süresi birkaç saat birkaç dakika değiştirilebilir (örneğin O / N) ve test edilmiş özel genotipleri için optimize edilmelidir. </li><li> Dikey yüzeyler üzerinde kurutma kağıdı ve bant bir kağıt parçası üzerinde farklı yüksekliklerde (1 ila 20 cm) kabul ete, tezgah dik. </li><li> Kağıt önünde tüpler yerleştirin: tüpler tüm uyumlu olmalı ve doğru yükseklik ölçümü sağlamak için kağıda olabildiğince yakın olmalıdır. </li><li> Bir stand (bir pipet kutusu gibi) üzerinde, kağıt 20-30 cm bir mesafede, tüplerin önünde dijital fotoğraf makinesi (&quot;Özel Ekipman&quot; Tablo) yerleştirin, &quot;film&quot; seçeneğini seçin ve start kayıt, bu zamanda da ardışık denemeler arasındaki zaman takip etmek için bir zamanlayıcı başlamalıdır. </li><li> Sinekler, birkaç saniye (örneğin 10 saniye) ile tüp dokunarak tüpün altındaki toplanır. Bu aşama, bütün deney boyunca (yani aynı süre, aynı gücü, aynı operatör) düzgün bir şekilde yapılmalıdır. </li><li> 10 sn için dijital kamera ile kayıt sinekler hareketlerini. </li><li> Bir dakika aralıklarla adımları 1.5-1.7 on dört kez tekrarlayın. </li><li> Veri analiz: <ol type="a"><li> Yukarıdaki olan sinekler sayısınıKaydedilen filmlerin görsel muayene ile 10 saniye sonra 2 cm işareti. Not: Bizim test koşullarında sinekler &#39;olumsuz geotaxis davranışı şaşırtıcı sonra geçen ilk 10 saniye ötesinde değil mi (yani sinekler onları şaşırtıcı sonra her yöne 10 sn hareket başladı). Minimum mesafe 2 cm olan bu zaman penceresi kontrol sinekler (THGal4 sürücü ifade yani 1 haftalık sinekler, Şekil 1 efsane bakınız) yükseldi. Böylece, farklı yaş ve davranış başlatıldıktan sonra genotip 10 sn sineklerin tırmanma faaliyetleri analiz etmek için bir referans olarak 2 cm işareti kullanılır. Bu parametreler (farklı genetik arka ya da laboratuar koşullarına bağlı olarak, örneğin), test sinekler davranış farklılıkları hesaba katmak için ayarlanması gerekebilir. Bizim test koşullarında, tüm test edilen genotipler kontrol genotip sinekler benzer şekilde daha kötü bir performans veya dikkat edin. </li><li> On beş gelen sonuçların ortalaması alındenemeler. </li><li> Tüp (=% tırmanma aktivitesi) sinek sayısı yüzdesi olarak ifade ortalama, tekrar sayısını (N) her genotip için test bağımsız kohort sayısına göre verilir </li><li> Zaman içinde farklı genotipleri arasında istatistiksel olarak anlamlı değerlendirin. Bu, bir Student t testi (iki genotip karşılaştırırken) veya GraphPad (GraphPad Yazılım, Inc.La Jolla gibi ticari yazılımları kullanarak Bonferroni post-hoc testi (çoklu karşılaştırmalar yaparken) ardından 2-yönlü ANOVA analizi ile gerçekleştirilebilir CA, ABD). </li></ol></li></ol> Dikkat Bu, oda sıcaklığında, aynı ışık koşulları altında, günün aynı zamanda tüm testleri gerçekleştirmek. 12 saat aydınlık / karanlık döngüsü ortamda sinekler tutulması sinekler &#39;lokomotor davranışları üzerindeki sirkadiyen ritim etkisini kontrol etmek için tavsiye edilir. 2. Tirozin Hidroksilaz İmmünofloresanTüm Beyin Mounts Testi Çözümler ve tamponlar Sabitleme çözeltisi: fosfat içinde% 4 paraformaldehit (PFA), salin (PBS) tamponlu Yıkama tamponu: PBS içinde% 0.1 Triton X-100, 0.1 M Tris-HCl, pH 7.5, 0.15 M NaCl,% 0.1 Triton X-100 ve% 0.5 BSA: tampon engelleme Montaj ortamı: Mowiol-Dabco (E Harlow, D. Lane, Antikorlar-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories Press, Cold Spring Harbor, NY, ABD, 10:418 (1988 &#39;de tarif protokolü)) Prosedür <ol><li> Manikür balmumu kaldırmak için yaklaşık 1 dakika 70% EtOH ile dolu bir diseksiyon çanak sinek koyun. </li><li> Transferi buz gibi soğuk PBS ile dolu bir diseksiyon çanak uçar. </li><li> Beyin teşrih: <ol type="a"><li> Ventral yüzü yukarı (: kaldır kanatları ve bacakları isteğe bağlı) ile anında yerleştirin. </li><li> Vücuttan uzak baş çekin: kullanmak birine forseps setibeyin zarar vermemek için göz altında manikür üzerinde tutmak için vücut ve başka bir üzerinde tutmak </li><li> Hortum çıkarın. </li><li> Hortum çıkardıktan sonra açık kalan yarık karşı tarafında baş manikür üzerinde tutmak ve beyin baş kapsül kaldırılır kadar ters yönde çekin. </li><li> Beyin tüm manikür çıkarın. </li><li> Tüm hava dolu trakeal doku kaldırmak, bu aşağıdaki İnkübasyon sırasında yüzen beyin engeller. </li></ol></li><li> P-200 pipet ucu kapalı birkaç milimetre kesin ve% 0.1 Triton X-100/PBS çözümü ile dengelenmesi </li><li> Hazırlanan P-200 pipet kullanarak,% 4 PFA / PBS 0.5 ml ile dolu bir 0.5 ml Eppendorf tüp beyin aktarmak ve diseksiyon tamamlanana kadar buz üzerinde tutmak. </li><li> 20 dakika oda sıcaklığında beyin Fix: Bir raf üzerinde Eppendorf tüpleri koyarak ve bir nutator raf koyarak hafif bir rotasyon uygulamak. </li><li> Fiksatif çıkarınP-1000 mikro pipet kullanarak, 0,1% Triton X-100/PBS 0.5 ml, tersine çevirerek karışımı ekleyin ve 1 dakika boyunca inkübe izin verme, bir kez bu yıkama adımı tekrarlayın. </li><li> İkinci yıkama tamponu çıkarın,% 0.1 Triton X-100/PBS 0.5 ml ekleyin ve 20 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe izin, bu adım, iki kez tekrarlayın. </li><li> Yıkama tamponu çıkarın ve beyinleri, oda sıcaklığında 1 saat süre ile (0.1 M Tris-HCl, pH 7.5, 0.15 M NaCl,% 0.1 Triton X-100 ve% 0.5 BSA) bloke tamponu içinde inkübe sağlar. </li><li> 4 iki gün, ° C, yumuşak rotasyon ile (adım 2.6. Bakınız) için, engelleme çözümü anti-TH antikor 1:100 seyreltme (&quot;özel reaktiflerin Tablosu&quot; na bakınız) ile beyin kuluçkaya yatmaktadır. </li><li> Adımları 2.7 yıkama tekrarlayın. ve 2.8 .. </li><li> Nazik rotasyon ile, 4 ° C&#39;de, iki gün boyunca, ikincil antibodyin engelleme çözümü bir 1:200 seyreltme ile beyin dengelenmesi. </li><li> Adımları 2.7 yıkama tekrarlayın. ve 2.8 .. </li><li> Şekil 2A&#39;da gösterildiği gibi sürgü hazırlayın: <ol type="a"><li> Birdd 2 cam kapak (24 x 60 mm,. 1.5) montaj medya X 25 ul damla. </li><li> Yeri montaj medya slayt ortasında bir boşluk bırakarak ve kurumaya bırakın iki kapak gözlük (boyutu 18 x 18 mm,. 2). </li></ol> Not. Sizin konfokal mikroskop sahnede numune tutucu kontrol edin. Sen biter biri (oje ve bant kullanın) bir 22 x 22 mm 1.5 cam kapak takarak cam kapak 25 x 75 mm slayt aynı boyutta yapabilirsiniz. </li><li> Yıkama tamponu çıkarın, montaj medya 50 ul ekleyin ve beyinleri aşağı yukarı pipetleme ve ile onunla gelmesini sağlayınız. </li><li> Bir kesim P-200 pipet (adım 2.4) iki lamelleri arasındaki boşlukta slayt için beyin transferi ve hiçbir bir lamel ile bunları kapatın kullanma. 1.5 (Şekil 2A görmek, yönlendirmek için slaytta beyin 7). Not: Numunelerin anterior ve poste de görselleştirme izin vermek için, iki kapak camları arasına monte edilir,beynin posterior tarafı. </li><li> Tüm hava kaldırmak için bir köşesinden pipet,, montaj medya ile kapak gözlük arasındaki tüm boşluğu doldurmak kuru ve oje ile sızdırmazlık sağlar. </li><li> Bir konfokal mikroskop kullanarak 1.0 mikron adım boyutu (Drosophila yetişkin beyin dopaminerjik kümelerin anatomik tanımlama için 7) ile z ekseni boyunca optik bölümleri bir dizi elde belirli bir kümede dopaminerjik nöron sayısı değerlendirmek. </li></ol>

<ol><li>Bayersdorfer, F., Voigt, A., Schneuwly,, Botella, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine-dependent+neurodegeneration+in+Drosophila+models+of+familial+and+sporadic+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol.+Dis%22%5BJournal%5D)">Dopamine-dependent neurodegeneration in Drosophila models of familial and sporadic Parkinson's disease.</a> Neurobiol. Dis. 40, 113-119 (2010).</li>
<li>Feany, M. B., Bender, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Drosophila+model+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A Drosophila model of Parkinson's disease.</a> Nature. 404, 394-398 (2000).</li>
<li>Friggi-Grelin, F., Coulom, H., Meller, M., Gomez, D., Hirsh, J., Birman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+expression+in+Drosophila+dopaminergic+cells+using+regulatory+sequences+from+tyrosine+hydroxylase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Targeted gene expression in Drosophila dopaminergic cells using regulatory sequences from tyrosine hydroxylase.</a> J. Neurobiol. 54, 618-627 (2003).</li>
<li>Gargano, J. W., Martin, I., Bandari, P., Grotewiel, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+iterative+negative+geotaxis+%28RING%29%3A+a+new+method+for+assessing+age-related+locomotor+decline+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Gerontol%22%5BJournal%5D)">Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila.</a> Exp. Gerontol. 40, 386-395 (2005).</li>
<li>Hirth, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+melanogaster+in+the+study+of+human+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22CNS+Neurol.+Disord.+Drug+Targets%22%5BJournal%5D)">Drosophila melanogaster in the study of human neurodegeneration.</a> CNS Neurol. Disord. Drug Targets. 9, 504-523 (2010).</li>
<li>Lundell, M., Hirsh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+and+spacial+development+of+serotonin+and+dopamine+neurons+in+the+Drosophila+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Temporal and spacial development of serotonin and dopamine neurons in the Drosophila CNS.</a> Dev. Biol. 165, 385-396 (1994).</li>
<li>Mao, Z., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eight+different+types+of+dopaminergic+neurons+innervate+the+Drosophila+mushroom+body+neuropil%3A+anatomical+and+physiological+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">Eight different types of dopaminergic neurons innervate the Drosophila mushroom body neuropil: anatomical and physiological heterogeneity.</a> Front Neural Circuits. 3, 5(2009).</li>
<li>Mizuno, H., Fujikake, N., Wada, K., Nagai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-Synuclein+Transgenic+Drosophila+As+a+Model+of+Parkinson%27s+Disease+and+Related+Synucleinopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Parkinsons+Dis%22%5BJournal%5D)">Alpha-Synuclein Transgenic Drosophila As a Model of Parkinson's Disease and Related Synucleinopathies.</a> Parkinsons Dis. 2011, 212706(2011).</li>
<li>Neckameyer, W. S., Woodrome, S., Holt, B., Mayer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+and+senescence+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol.+Aging%22%5BJournal%5D)">Dopamine and senescence in Drosophila melanogaster.</a> Neurobiol. Aging. 21, 145-152 (2000).</li>
<li>Trinh, K., Moore, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+the+phase+II+detoxification+pathway+suppresses+neuron+loss+in+Drosophila+models+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Induction of the phase II detoxification pathway suppresses neuron loss in Drosophila models of Parkinson's disease.</a> J. Neurosci. 28, 465-472 (2008).</li>
<li>White, K. E., Humphrey, D. M., Hirth, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dopaminergic+system+in+the+aging+brain+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The dopaminergic system in the aging brain of Drosophila.</a> Front Neurosci. 4, 205(2010).</li>
<li>Whitworth, A. J., Wes, P. D., Pallanck, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+models+pioneer+a+new+approach+to+drug+discovery+for+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov.+Today%22%5BJournal%5D)">Drosophila models pioneer a new approach to drug discovery for Parkinson's disease.</a> Drug Discov. Today. 11, 119-126 (2006).</li>
<li>Wu, J. S., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+dissecting+Drosophila+melanogaster+brains+for+live+imaging+or+immunostaining%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">A protocol for dissecting Drosophila melanogaster brains for live imaging or immunostaining.</a> Nat. Protoc. 1, 2110-2115 (2006).</li>
<li>Barone, M. C., Sykiotis, G. P., Bohmann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+activation+of+Nrf2+signaling+is+sufficient+to+ameliorate+neurodegenerative+phenotypes+in+a+Drosophila+model+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Dis.+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Genetic activation of Nrf2 signaling is sufficient to ameliorate neurodegenerative phenotypes in a Drosophila model of Parkinson's disease.</a> Dis. Model Mech. 4 (5), 701-707 (2011).</li>
</ol>

Biz hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.

Deneyleri farklı hastalık bağlı genetik arka (5 yorumlanan) yanı sıra yaşlanma DA nöronların bakım yolları veya küçük bileşikleri sinyal, belirli genlerin rolü incelemek için yararlı bir yaklaşım sağlamak Burada anlatılan. Drosophila irkilme indüklenen Negatif geotaxis davranış bu yöntem özellikle PD-bağlantılı mutasyonlar varlığında farklı genetik arka bölgesi DA nöronların işlevselliği için Okuması işlevsel olarak kullanılmıştır. Farklı çalışmalar arasında bazı farklılı...

Burada açıklanan testlerin özgüllüğü dopaminerjik nöronların 3 spesifik ekspresyon elde etmek için tirozin hidroksilaz geninin düzenleyici sekansları yararlanan bir Gal4 sinek hattının kullanımına dayanır. Tirozin hidroksilaz, dopamin sentezinde ilk ve oran-sınırlayıcı aşama katalize eder. In vivo DA nöronların (örnek 6 bakınız) tanımlamak için uygun bir aday TH yapma dopamin ile, o, yetişkin sinek beyin örtüşmekte TH immünoreaktivite. Ayrıca, THGal4 salgılama modelini dopa dekarboksilaz gen ayarlayıcı sıralan içerir ve DA nöronlarda sadece transgenik ekspresyonu sağlayan bu DdcGal4 gibi diğer Gal4 hatları, bu daha spesifik olan, ama aynı zamanda 3 glial hücreler serotonerjik nöronların alt gruplarında . Feany ve Bender (2000) ilk PD-bağlantılı insan α-sinüklein geninin pan-nöronal ifade sta en ilerici kaybını hızlandırır görülmektedirDrosophila rtle bağlı olumsuz geotaxis davranış. Biz expressionof bir α-sinüklein transgen 10 sürücü DA-nöron spesifik THGal4 satırını kullanarak benzer sonuçlar gözlenmiştir ve bu Nrf2 yolunun nöroprotektif rolünü incelemek için bu fonksiyonel Okuması kullanmış PD 14 Drosophila modeli. Burada açıklanan belirli tahlil 2 ve 3 uyarlanmıştır. Drosophila beyin (örneğin 11 ve 7 için bakınız) konfokal mikroskopi ile tüm beyin bağlar görselleştirilebilir en az 5 farklı topakçıklar halinde düzenlenmiş olan birden fazla 100 da nöronlar (PPL1, PPL2, PAL PPM1 / 2, PPM3) içerir. Ancak, yaşa bağlı nörodejenerasyon PD-bağlantılı genler mutasyona uğramış nerelerde sinekler gözlenen / insan hastalıkları modellemek için aşırı eksprese değil, 9 yaşında, 11 ile Drosophila beyin düşüşler DA nöron sayısı olup olmadığını hala tartışmalıdır5. DA nöronlarda insan α-sinüklein ifadesi gibi bir etkisi vardır ve bu nedenle, PD için bir model olarak kullanılmıştır. Burada DA nöronlar hücre belirteci olarak TH kullanarak bağlar tüm beyin saymak için bir test tarif. Bu deney, 13 ve 10 den adapte edilmiştir.

<table><tbody><tr><td>Rabbit anti-tyrosine hydroxylase antibody</td><td>Millipore</td><td>AB152</td><td></td></tr><tr><td>Donkey TRITC-labeled anti rabbit IgG antibody</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>711-026-152</td><td></td></tr><tr><td>Mowiol</td><td>Calbiochem</td><td>475904</td><td></td></tr><tr><td>DABCO</td><td>Sigma</td><td>D2522</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Ekipmanlar</td></tr><tr><td>Polistiren tüpler</td><td>VWR</td><td>89092-734</td><td>28.5 x 95 mm</td></tr><tr><td>Dijital kamera</td><td>Canon</td><td>PowerShot A3100IS (model)</td><td>12.1 Megapiksel 4X Optik Zoom</td></tr><tr><td>Cam kapakçıklar no. 1.5</td><td>VWR</td><td>48366 205 48393 252</td><td>Boyutlar: 18 x 18 mm, 24 x 60 mm</td></tr><tr><td>Cam kapakçıklar no. 2</td><td>VWR</td><td>48368-040</td><td>Boyut: 18 x 18 mm</td></tr><tr><td>Diseksiyon tabakları</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>70543-01</td><td>Boyut: 30 mm O.D.</td></tr><tr><td>Dumostar No. 5 forseps</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72705-01</td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Carl Zeiss</td><td>Stemi 2000 (model)</td><td></td></tr><tr><td>Konfokal mikroskop</td><td>Leica</td><td>SP2 veya SP5 (model)</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Malzemeler Tablosu.</td></tr></tbody></table>

içinde nörodejeneratif fenotipleri değerlendirilmesi<em&gt; drosophila</em&gt; tırmanma tahliller tarafından dopaminerjik nöronlar ve tüm beyin immün

Assessing Neurodegenerative Phenotypes in Drosophila Dopaminergic Neurons by Climbing Assays and Whole Brain Immunostaining

Drosophila melanogaster sinir sisteminde yaşlanma ve patolojik dejeneratif süreçleri incelemek için değerli bir model organizmadır. Deneysel bir sistem olarak sinek avantajları kendi genetik tractability, kısa yaşam süresi ve gözlemlemek ve kantitatif karmaşık davranışları analiz imkanı içerir. Drosophila beynin belirli bir nöron popülasyonları hastalık bağlantılı genlerin ifadesi, Parkinson ve Alzheimer 5 insan nörodejeneratif hastalıklar modellemek için de kullanılabilir. Dopaminerjik (DA) nöronlar yaşlanma insan beyninde en savunmasız nöron popülasyonları arasında yer almaktadır. Parkinson hastalığında (PH), en sık görülen nörodejeneratif hareket bozukluğu, DA nöron hızlandırılmış kaybı lokomotor fonksiyon ilerleyici ve geri dönüşü olmayan bir düşüşe yol açar. Yaş ve çevresel toksinler ek olarak, DA nöronların kaybı kodlama spesifik mutasyonlar şiddetlenirçeşitli genlerin veya organizatörü bölgeleri. Örneğin PD-ilişkili alellerinin belirlenmesi in vivo DA nöronların nörodejenerasyon incelemek için bir model olarak Drosophila kullanımı için deneysel olarak içerir. Örneğin, Drosophila DA nöronlar özetler, insan hastalığı bazı özellikleri, DA nöronların sürekli bir şekilde azalması gibi ve azalan lokomotor fonksiyonunu 2 PD-bağlantılı insan α-sinüklein geninin ifadesi. Buna göre, bu model başarılı PH 8 potansiyel terapötik hedefleri tespit etmek için kullanılmıştır. Tüm yetişkin beyin irkilme-kaynaklı olumsuz geotaxis tepki ve tirozin hidroksilaz immün dayalı bir tırmanma testi DA nöron sayısı izlemek için bağlar: Burada sık Drosophila DA nöronların yaşa bağlı nörodejenerasyon incelemek için kullanılmıştır iki deneyleri tarif farklı yaşlarda. Her iki durumda da, UAS t in vivo sentezlenmesiniDA spesifik nöronlarda ransgenes bir tirosin hidroksilaz (TH) promotör-Gal4 sürücüsü satır 3, 10 kullanılarak elde edilebilir.

Bu tahliller PH 14 bir Drosophila modelinde stres koruyucu Nrf2 yolunun rolünü incelemek için burada açıklanan kullandık. Bu model, bir TH Gal4 sürücü 2, 10 ile DA nöronlarda insan α-sinüklein geninin ifadesini dayanır. Şekil 1 TH Gal4 sürücünün kontrolü altında farklı transgenlerin ifade erkek sinekler bir irkilme-kaynaklı negatif geotaxis (tırmanma) testinin temsili bir sonuç göstermektedir. Tüm genotipler zamanla lokomotor aktivite bir düşüş...

Burada dopaminerjik (DA) nöronların yaşa bağlı nörodejenerasyon incelemek için kurulmuştur iki deneyleri tarif<em&gt; Drosophila</em&gt;: Tırmanma / DA nöronları dejenerasyon ve tüm beyin bağlar DA nöronlar belirlemek ve saymak için kullanılan tirozin hidroksilaz immün işlevsel etkilerini incelemek için izin verir irkilme-kaynaklı negatif geotaxis testi.

Içinde Nörodejeneratif fenotipleri değerlendirilmesi<em&gt; Drosophila</em&gt; Tırmanma Tahliller tarafından Dopaminerjik nöronlar ve Tüm Beyin immün

Drosophila melanogaster is a valuable model organism to study aging and pathological degenerative processes in the nervous system. The advantages of the ...

Bu prosedürün genel amacı, transgenik drosophila'da dopaminerjik nöronların nörodejenerasyonunu değerlendirmektir. Bu, öncelikle GAL dört UAS sistemi aracılığıyla tirosin hidroksilaz promotörünün kontrolü altında istenen transgenlerin ifade edilmesiyle gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, istenen genotipteki sinekleri toplamak, cinsiyet ve yaşlarına göre ayırmak ve yaşlandırmaktır.Üçüncü adım, sinekleri yaşlandıkça negatif jeo eksen aracılığıyla tırmanma aktivitelerini test etmektir. Son adım, farklı yaşlarda toplanan beyinlerden ayrılmış dopaminerjik nöronların sayısını saymaktır. Sonuç olarak, sonuçlar hayvanın lokomotor davranışında ve dopaminerjik nöron popülasyonlarının büyüklüğünde değişiklikler gösterecektir.Bu yaklaşımın uygulamaları, Parkinson hastalığı gibi nörodejeneratif hastalıkların tedavisine uzanır. Bu yaklaşım, nöroprotektif genlerin ve farmakolojik müdahalelerin tanımlanmasına yardımcı olabilir. Testi kurmak için, istenen genotipteki yaşa uygun sinekler seçin. Cinsiyet ve yaşlarına göre ayırın ve rastgele 20 ila 30 hayvandan oluşan gruplara bölün.Her grup istatistiksel bir örnekleme temsil eder. Grupları, lokomotor davranış üzerindeki sirkadiyen ritimlerin etkilerini kontrol etmek için 12 saatlik bir ışık-karanlık döngüsünde tutun ve test odasında tekrar edilebilecek bir sıcaklıkta tutun. Grupların kavanozlarını iki ila üç günde bir değiştirin ve haftalık olarak tutarlı bir zamanda test edin.Testten 30 dakika önce, her grubu karbondioksit ile uyuşturun ve boş gıda kavanozlarından yapılmış ve bantla birleştirilmiş, etiketli plastik bir tüpe aktarın. Sineğin uyanması beş ila 10 dakika sürer, ancak anesteziden tam olarak kurtulmak yaş ve genotiplere göre değişir ve optimize edilmelidir. Şimdi. Test kavanozlarının arkasında görülecek bir yükseklik ölçeği oluşturun.Bir beyaz kağıda bir ila 20 santimetre arasındaki mesafeleri işaretleyin. Ardından ölçeği pozisyona sabitleyin. Şimdi, test edilecek tüplerin, ölçeğin yaklaşık 20 ila 30 santimetre ötesindeki konumuna hizalanmasını sağlayın.Viallerin kare görünümünü gösteren bir dijital kamera yerleştirin. Tüplerin üzerindeki etiketlerin ve ölçeğin açıkça görülebilir olduğundan emin olun. Konumlandırıldıktan sonra, kaydı başlatın ve dijital bir zamanlayıcı başlatın.Şimdi, bir tüpe birkaç saniye hafifçe vurun. Tüm sinekleri tüpün dibine toplamanız gerekir. Bu adımı tüm deney boyunca aynı süre ve güçle tutarlı bir şekilde yapın.Bir dakika sonra, 15 ardışık denemede ikinci olan yeniden vuruşu tekrarlayın. 15 deneme tümü tamamlandığında, sinekleri görsel olarak inceleyerek filmleri inceleyerek yeni kavanozlara geri dönün. Her kohortta gerçekleştirilen 15 deneme için, iki santimetre işaretinin üzerindeki sinek sayısını sayın.10 saniye geçtikten sonra, iki santimetre işareti deneysel olarak belirlenir, bu, kontrol sineklerinin çoğu test edilen yaşlarda 10 saniye sonra geçtikleri mesafedir. 15 denemeden elde edilen ortalama skoru alın ve bunu kohortun üyelerinin işareti geçtiği yüzde olarak ifade edin. İstatistiksel tekrarların sayısı, her grup için test edilen kohorların sayısına eşittir, 15 denemeye göre değildir.Farklı genotipler arasındaki istatistiksel önemi, öğrenci T testi, anova veya diğer uygun analiz yöntemleri kullanarak değerlendirin. Sinekleri, kütikül mumunu çıkarmak için yaklaşık bir dakika boyunca 70% etanol içeren bir diseksiyon kabına koyun.Daha sonra, sinekleri buz gibi soğuk PBS ile dolu başka bir diseksiyon kabına aktarın ve beyni çıkarmaya başlayın. Sineği, ventral tarafı yukarı bakacak şekilde yerleştirin ve isteğe bağlı olarak kanatları ve bacakları çıkarın. Vücuda tutunmak için bir maşa kullanın ve diğeriyle göz altındaki kütikülü tutun.Sonra, başı vücuttan çekin. Ardından, proboskiyi baştan çekerek çıkarın. Ardından, yeni deliğin karşı kenarlarından baş kütikülünü kavrar ve zıt yönlerde çekerek beyni baş kapsülünden çıkarın.Şimdi, beynin yüzeyinden kalan kütikülü hassas bir şekilde çıkarın. Ardından tüm hava dolu trake dokusunu çıkarın. Bu, beynin aşağıdaki inkübasyon adımlarında yüzmesini önleyecektir.P 200 pipet ucu ile bir beyin taşıma pipeti hazırlayın. Birkaç milimetre kesin ve PBS içinde %0,1 Triton X 100 ile dengeleyin. Beyinleri, PBS içinde %4'lük PFA içeren yarım mililitrelik bir tüpe aktarın.Beyinleri oda sıcaklığında hafifçe döndürerek 20 dakika boyunca sabitleyin. 20 dakika sonra, bir P 1000 pipet kullanarak sabitleyiciyi, PBS içinde %0,1 Triton X 100 olan yıkama tamponunun yarım mililitresiyle değiştirin. Ters çevirerek karıştırın ve beyinlerin bir dakika boyunca inkübe edilmesine izin verin, daha sonra yıkama tamponunu değiştirin.Bir dakika sonra, yıkama tamponunu ikinci kez değiştirin ve beyinleri oda sıcaklığında 20 dakika boyunca inkübe edin. Ardından, yıkama tamponunu üçüncü kez değiştirin ve beyinleri başka 20

assessing-neurodegenerative-phenotypes-drosophila-dopaminergic

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Davranış testleri, lokomotor fonksiyonları ölçme öğrenme ve hafıza...

Assaying Lokomotor, Öğrenme ve Hafıza Açıkları. Drosophila Nörodejenerasyon, modeller

Bu video, sinek hareketini ölçmek için basit bir yöntemi açıklar ve gerçekleştirilen tırmanma testini gösterir. Sinek tırmanma testi, negatif bir jeotaksi tepkisine dayanan genel bir motor fonksiyon testidir.

Sinek Tırmanma Deneyi: Drosophila melanogaster'de Genel Hareketi Test Etmek İçin Bir Yöntem

Drosophila melanogaster'de nörodejeneratif bozukluklar için bir model olarak optimize edilmiş, ucuz ve güvenilir bir negatif jeotaksi testi sunuyoruz. Hafif lokomotor kusurlara karşı daha hassas olan bu test, potansiyel genetik etkileşimlerin ve ilaç hedeflerinin taranmasına yardımcı olacaktır.

Nörodejeneratif Hastalıkların bir Drosophila Modelinde Tırmanma Kusur Kantitatif Analiz

Drosophila yaygın nörodejenerasyonu incelemek için bir model sistem olarak kullanılmaktadır. Bu protokol, beyinde vakuol oluşumu ile tespit edildiği üzere, sayısal edilebilir dejenerasyonu bir yöntemi tarif etmektedir. Aynı zamanda dolayı bir örnek olarak işleme ve kesit kontrol ve deney sinekler tarafından deneysel prosedüre etkileri en aza indirir.

Kitle Histoloji nörodejenerasyon belirlememize<em&gt; Drosophila</em

Bu iletişim kuralı diseksiyon ve yetişkin Drosophila melanogaster immunostaining açıklar beyin dokuları. Özellikle, bu iletişim kuralı doğru nöronal gelişim birçok yönlerini temel genel prensipler ortaya çıkarmak için kullanılabilecek örnek nöronal alt kümeleri olarak Drosophila mantar beden ve photoreceptor nöronlar kullanımı vurgulamaktadır.

Diseksiyon ve mantar vücut immünfloresan boyama ve yetişkin Drosophila melanogaster beynindeki nöronlar Photoreceptor

Bu adım adım protokolü Drosophila negatif geotaxis davranışı sinekler yüzlerce ev sahipliği yapan ve eylemlerinin bir elektrik motoru ile eşitler otomatik çoklu silindir sistemi kullanarak çözümler. Eşitleme sinek negatif geotaxis davranış, dijital kaydedilen ve analiz kendi kendine tasarlanmış RflyDetection yazılım kullanarak denetlesinler.

Ateş, Drosophila modeli yetişkin tırmanma davranışı çözümlemek için bir otomatik hızlı yinelemeli negatif Geotaxis tahlil

Protein toplama ve merkezi sinir sistemi Drosophila modellerinin autophagic akı floresan-görüntüleme tabanlı cep biyolojik çalışmalar nicel veri ayıklamak için bir basit ve uyarlanabilir iş akışı geliştirdiğimiz ateş.

Ateş Drosophila ImageJ kullanarak Fluorescently Tagged proteinlerin tarafsız analizi ile yılında niceliksel hücre biyolojisi

Drosophila melanogaster'da nörodejenerasyon gösteren mutantlar için ekrana ileri genetik bir yaklaşım kullanarak bir protokol sunuyoruz. Bu bir tırmanma tahlil, Histoloji analizi, gen haritalama ve sonuçta nörokoruma süreci ile ilgili yeni genler belirlemek için DNA sıralaması içerir.

In vivo Ileri genetik ekran Drosophila melanogaster yeni Nörokoruyucu genler tanımlamak için

Bu çalışma, dekapitasyon, fiksasyon, kriyoseksiyon, floresan boyama, immün boyama ve görüntülemeyi içeren, konfokal ve multifoton görüntülemeye genişletilebilen basitleştirilmiş bir doku işleme protokolü sunmaktadır. Yöntem, gelişmiş motor becerilere olan ihtiyacı atlayarak karmaşık diseksiyonlarla karşılaştırılabilir etkinliği korur. Kantitatif görüntü analizi, kapsamlı bir araştırma potansiyeli sağlar.

Gelişmiş beyin floresan boyaması ve immün boyama için Drosophila kafalarının doğrudan kriyoseksiyonu

Protokol, geleneksel memeli modellerine bir alternatif olarak lokomotor disfonksiyonun nicelleştirilmesi yoluyla meyve sineğindeki nörotoksisiteyi değerlendirmek için yüksek verimli, uygun maliyetli bir yöntem sunar. Farmasötik bileşiklerin, çevresel ajanların veya genetik modifikasyonların nörotoksik etkilerini hassas, tekrarlanabilir ve etik açıdan uygun bir model kullanarak değerlendirmeyi amaçlar.

Drosophila melanogaster'de Lokomotor Disfonksiyonun Nörotoksisite için Bir Okuma Olarak Davranışsal Analizi

Öğrenin Drosophila'da dopaminerjik nöronların yaşla ilişkili nörodejenerasyonunu değerlendirmek için tırmanma testleri ve immünhistokimya yöntemlerini. Bu teknikler motor fonksiyon değişikliklerini ve nöron kaybını nicelendirir.

Içinde Nörodejeneratif fenotipleri değerlendirilmesi Drosophila Tırmanma Tahliller tarafından Dopaminerjik nöronlar ve Tüm Beyin immün (Video) | JoVE Journal

Içinde Nörodejeneratif fenotipleri değerlendirilmesi

Daha fazla video keşfet