Name: Kemirgen Havayolu Epiteli içinde Cilia Motilite Yüksek Çözünürlüklü Görüntüleme için ex vivo Yöntemi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: Öğrenin, fare trakeasından izole edilmiş hava yolu epitelindeki kamçı hareketliliğini ve akışını yüksek hızlı videomikroskopi ile nicel olarak analiz etme yöntemini. Bu teknik, mukosiliyer klerens mekanizmalarını hızlı ve tekrarlanabilir şekilde değerlendirir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Proje, Ulusal Kalp, Akciğer ve Kan Enstitüsü NIH hibe U01HL098180 tarafından desteklenmiştir. Içeriği sadece yazarların sorumluluğundadır ve mutlaka Ulusal Kalp, Akciğer resmi görüşlerini temsil etmez, ve Kan Enstitüsü veya Ulusal Sağlık Enstitüleri

1. Reaktifler Kurulum 1.1 Diseksiyon ve Görüntüleme Orta Leibovitz L-15 ortamına (L15) trakea örneklerin hasat hem de görüntüleme sırasında kullanılan FBS (% 10) ve Penisilin-Streptomisin (100 birim / penisilin G sodyum ve streptomisin sülfat, 100 mg / ml arasında mi) ile ilave edilir. 2. Sığ Kaleli Kültür Odası Meclis Trakea doku tutmak için kullanılan haznesi Şekil 1 &#39;de gösterilmiştir. Odanın zemini cam 35 mm kültür çanak dip olduğunu. Odasının üst ve yan cam tabak içinde 0.3 mm kalınlığında silikon kaplama küçük bir parça yerleştirilerek oluşturulur. Sayfanın kenarı yuvarlak alt çanak uyacak şekilde kesilir ve merkez daha (adım 2.1-2.3 bakınız) sığ bir merkezi oda oluşturmak için kesilir. Bu montaj üzerine, bir 18 mm yuvarlak cam kapak kayma görüntüleme için uygun bir kapalı odasına oluşturmak için yerleştirilir. <ol><li> Tamamen 0,3 mm kalınlığında silikon kaplama bir kare ile bir 18 mm yuvarlak cam kapak kayma kapsamaktadır. </li><li> Standart keskin diseksiyon makas kapak kayma (silikon kaplama dairesel bir tabaka ile sonuçlanan) kenarında gelen aşırı silikon kaplama keserek ile. </li><li> Keskin bir neşter kesip ve kapalı kapak kayma (böylece görüntüleme odasının üst ve yan oluşturan) ortasından silikon kaplama (yaklaşık 10 mm kare) merkezi bir kare kaldırmak ile. </li></ol> 3. Trakea Hasat ve Hazırlık <ol><li> Yerel kurumsal hayvan bakımı uygun olarak fareler Euthanize ve komite ve / veya hükümet yönergeleri izleyin ve batığın doku kadar L15 medya (yazar kadar, sadece gebelik gün 16,5 doğum önce fareler kullanmış olan standart bir plastik 35 mm kültür çanak içine trakea çıkarın , yeni doğan yenidoğan ve yetişkin hayvanların 2). </li><li> Dış bağlı olmayan trakea ilişkili doku çıkarmakkünt diseksiyon kullanarak trakea. </li><li> Sadece mikro diseksiyon makas (Şekil 2A, hat 1) kullanarak krikoid kıkırdak altında enine kesim ile gırtlak çıkarın. </li><li> Mikro diseksiyon makas (Şekil 2A, hat 2) ile sadece karina üzerinde enine kesim ile sol ve sağ ana bronş dalları çıkarın. </li><li> Yavaşça ince forseps ile trakea tutun ve herhangi bir mukus ve kan temizlemek için bir P1000 Pipetman ve P1000 ucu ile banyo L15 orta ~ 1 ml lümen 2-3 kez yıkayın. </li><li> Mikro diseksiyon makas (Şekil 2B, hat 1) ile enine bir kesik ile trakea bir 3-4 halka kesimi kesin. </li><li> Mikro diseksiyon makas (Şekil 2B, hat 2) kullanarak bu kısa trakea segmentinin trachealis kas ortasından uzunlamasına kesin. </li><li> Mikro diseksiyon makas (Şekil 2C kullanarak trakea kıkırdak halkaları ortasından uzunlamasına kesilir Şekil 2B&#39;de gösterildiği gibi) terk&gt;, çizgi). </li></ol> 4. Kirpikler Görüntüleme <ol><li> Transferi trakea doku parçaları, L-15 orta 100-200 ul ile 35 mm cam alt kültür çanak ortasında üzerine aşağı lümen tarafı,. </li><li> Kirpikler oluşturulan akış trakea doku örneği (1 x 10 ~ 11 partikül / ml ya da 2.5% sulu Fluoresbrite Mikro-kürecik süspansiyonu, 20 ul / ml), yıkanan L-15 ortamına floresan 0.20 um arasında bir miktar mikro eklemek ölçmek için kullanılabilir. </li><li> Silikon kaplama oyulmuş pencere oluşturduğu sığ duvarlı odanın ortasında bulunan trakea örnek ile, görüntüleme odasının aşağı trakea örnek silikon levha tarafında üzerine (yukarıda 1-3 Usul bakınız) önceden hazırlanmış yerleştirin (Şekil 1 .) </li><li> Yavaşça yerine sabitlemek için lamel aşağı doğru itin ve kenarları istimal emdiği L-15 ortamı çıkarınga P1000 ucu ve P1000 Pipetman. </li><li> 100X objektif ve DIC optik ile bir ters mikroskop 35 mm cam alt kültür çanak ve trakea örnek monte edin. </li><li> Yüksek hızlı bir kamera ve film satın alma yazılımı kullanarak 200 kirpikler motilite film toplamak + en siliyalı trakeal epitel boyunca saniye başına kare (Şekil 2D kutusu, E Outlined: Kayıtlı filmden örnek hareketsiz görüntü) trachealis kas kenarı kıvrılmış (Ek Film 1). </li><li> FITC epifluorescent görüntüleme ve düşük ışık CCD kamera (Yukarıdaki donanım listesine bakın) kullanarak, kirpikler oluşturulan akış (Ek Movie 2) daha sonra miktar izin vermek için siliyalı trakeal epitel yüzeyi boyunca floresan mikro-hareketin film toplamak. </li></ol> 5. Cilia Motilite kantitasyonu <ol><li> ImageJ yazılım paketi içine DIC görüntülü film yüklemek ve I tarafından tarif edilen teknik takip edilmekain Drummond 13 yenerek kirpikler geçen bir raster çizgi çizmek için satırı aracını kullanın. Bu hattın bir &quot;reslice&quot; hat boyunca kirpikler hareketi bir dalga üreten bir kymograph tipi görüntü oluşturur. Her dalga tepe arasındaki piksel sayısı onları ölçülen (bir piksel = bir film karesini) dakikada atım (yani Hz) sayısı hesaplanabilir hangi değil. </li><li> ImageJ yazılım paketi içine kirpikler oluşturulan akış yük floresan boncuk film ölçmek ve el trakea epitel yüzeyi boyunca floresan boncuk izlemek ve yazılım izlenen her boncuk için boncuk hız ve yön oluşturmak izin MTrackJ eklenti 14 kullanın. </li></ol> Dayak kirpikler mesafe olarak akışını ölçmek için güçlü ölçülen akış büyüklüğü etkileyebilir floresan boncuk kullanırken dikkat edilmelidir. Ek Film 2 boncuk hareketi bu bir iyi bir örnektir. Bu örnekte boncuktahareket dayak kirpikler yüzeyinde hızlı ve önemli ölçüde daha uzakta banyo medyada boncuk için devre dışı bırakır. Bu kontrol etmek için, boncuk iz tek doğru karşılaştırma yapılmasına izin vermek için bütün örneklerde silli epitel üzerinde sabit bir mesafede toplanmalıdır. Son olarak, sıvı akışı temsil verilerini elde etmek, boncuk mümkün olduğunca uzun süre için takip edilmelidir, biz sıvı akışı hesaplamak için 10 + siliyalı hücreleri kapsayacak boncuk parça kullanmayı tercih.

<ol><li>Stannard, W., O'Callaghan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ciliary+function+and+the+role+of+cilia+in+clearance%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Aerosol.+Med%22%5BJournal%5D)">Ciliary function and the role of cilia in clearance.</a> J. Aerosol. Med. 19, 110-115 (2006).</li>
<li>Francis, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+initiation+and+maturation+of+cilia+generated+flow+in+the+newborn+and+postnatal+mouse+airway%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%3A+Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">The initiation and maturation of cilia generated flow in the newborn and postnatal mouse airway.</a> American Journal of Physiology: Lung Cellular and Molecular Physiology. 296, 1067-1075 (2009).</li>
<li>Aune, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+model+of+heterotaxy+with+single+ventricle+spectrum+of+cardiac+anomalies%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Research%22%5BJournal%5D)">Mouse model of heterotaxy with single ventricle spectrum of cardiac anomalies.</a> Pediatric Research. 63, 9-14 (2008).</li>
<li>Tan, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterotaxy+and+complex+structural+heart+defects+in+a+mutant+mouse+model+of+primary+ciliary+dyskinesia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Heterotaxy and complex structural heart defects in a mutant mouse model of primary ciliary dyskinesia.</a> J. Clin. Invest. 117, 3742-3752 (2007).</li>
<li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+parallel+sequencing+identifies+the+gene+Megf8+with+ENU-induced+mutation+causing+heterotaxy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Massively parallel sequencing identifies the gene Megf8 with ENU-induced mutation causing heterotaxy.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 3219-3224 (2009).</li>
<li>Caruso, G., Gelardi, M., Passali, G. C., de Santi, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nasal+scraping+in+diagnosing+ciliary+dyskinesia%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Rhinol%22%5BJournal%5D)">Nasal scraping in diagnosing ciliary dyskinesia.</a> Am. J. Rhinol. 21, 702-705 (2007).</li>
<li>Leigh, M. W., Zariwala, M. A., Knowles, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+ciliary+dyskinesia%3A+improving+the+diagnostic+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Pediatr%22%5BJournal%5D)">Primary ciliary dyskinesia: improving the diagnostic approach.</a> Curr. Opin. Pediatr. 21, 320-325 (2009).</li>
<li>Delmotte, P., Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ciliary+beat+frequency+is+maintained+at+a+maximal+rate+in+the+small+airways+of+mouse+lung+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Cell+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Ciliary beat frequency is maintained at a maximal rate in the small airways of mouse lung slices.</a> Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 35, 110-117 (2006).</li>
<li>Choe, M. M., Tomei, A. A., Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+3D+tissue+model+of+the+airway+wall+and+mucosa%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Physiological 3D tissue model of the airway wall and mucosa.</a> Nat. Protoc. 1, 357-362 (2006).</li>
<li>Fulcher, M. L., Gabriel, S., Burns, K. A., Yankaskas, J. R., Randell, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Well-differentiated+human+airway+epithelial+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Well-differentiated human airway epithelial cell cultures.</a> Methods Mol. Med. 107, 183-206 (2005).</li>
<li>You, Y., Richer, E. J., Huang, T., Brody, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+differentiation+of+mouse+tracheal+epithelial+cells%3A+selection+of+a+proliferative+population%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Lung+Cell+Mol.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Growth and differentiation of mouse tracheal epithelial cells: selection of a proliferative population.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 283, 1315-1321 (2002).</li>
<li>Thomas, B., Rutman, A., O'Callaghan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disrupted+ciliated+epithelium+shows+slower+ciliary+beat+frequency+and+increased+dyskinesia%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+Respir.+J%22%5BJournal%5D)">Disrupted ciliated epithelium shows slower ciliary beat frequency and increased dyskinesia.</a> Eur. Respir. J. 34, 401-404 (2009).</li>
<li>Drummond, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+cilia+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Studying cilia in zebrafish.</a> Methods Cell Biol. 93 (08), 197-217 (2009).</li>
<li>Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+cell+and+particle+tracking%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Methods for cell and particle tracking.</a> Methods Enzymol. 504, 183-200 (2012).</li>
<li>Sisson, J. H., Stoner, J. A., Ammons, B. A., Wyatt, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((All-digital+image+capture+and+whole-field+analysis+of+ciliary+beat+frequency%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">All-digital image capture and whole-field analysis of ciliary beat frequency.</a> J. Microsc. 211, 103-111 (2003).</li>
<li>Schwabe, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+ciliary+dyskinesia+associated+with+normal+axoneme+ultrastructure+is+caused+by+DNAH11+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mutat%22%5BJournal%5D)">Primary ciliary dyskinesia associated with normal axoneme ultrastructure is caused by DNAH11 mutations.</a> Hum. Mutat. 29, 289-298 (2008).</li>
<li>Shah, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+Bardet-Biedl+syndrome+proteins+alters+the+morphology+and+function+of+motile+cilia+in+airway+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Loss of Bardet-Biedl syndrome proteins alters the morphology and function of motile cilia in airway epithelia.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 3380-3385 (2008).</li>
<li>Clary-Meinesz, C. F., Cosson, J., Huitorel, P., Blaive, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature+effect+on+the+ciliary+beat+frequency+of+human+nasal+and+tracheal+ciliated+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+the+Cell+%2F+under+the+auspices+of+the+European+Cell+Biology+Organization%22%5BJournal%5D)">Temperature effect on the ciliary beat frequency of human nasal and tracheal ciliated cells.</a> Biology of the Cell / under the auspices of the European Cell Biology Organization. 76, 335-338 (1992).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Kirpikler yendi frekans ölçümü (CBF) yüksek güç mikroskobu amaç ve hızlı görüntü elde etme donanım 13,15 kullanarak nispeten kolaydır, ve CBF ölçümleri sağlık ve hastalık sırasında mukosiliyer klerens araştıran en çalışmaların temelini oluşturan açıklıyor. CBF ölçüm tek başına CBF mukosiliyer temizleme, ölçüm anlamak için gereklidir Ancak, siliyer oluşturulan akış ve ölçmek için daha zor genellikle göz ardı edilir, her ikisi de kirpikler yendi dalga, hem de temel önemi yok sayar ve CBF ile ilişkili olmayabili...

Hava yolu epitel içinde hareketli kirpikler fonksiyon analizi mukosiliyer temizleme ve akciğer sağlığı 1 etkileyebilir genetik ve çevresel faktörlerin ortaya çıkması için deneysel önemlidir. Görüntüleme fare havayolu epitel için geliştirilen basit bir protokol mutant ve nakavt fare modellerinde hava yolu kirpikler motilite sorgulamak için etkili bir yöntem sağlar ve fare trakeal doku diseksiyonu ve yüksek çözünürlüklü videomikroskopi ile hava yolu kirpikler motilite ex vivo görüntüleme sadece temel becerileri gerektirir. Bu protokol heterotaksi 2-5 ile ilişkili konjenital kalp hastalığı olan mutantlar hareketli kirpikler fonksiyonunun hızlı değerlendirme (kirpikler yendi frekans, kirpikler yendi şekli, kirpikler oluşturulan akış) izin vermek için büyük çaplı bir fare mutagenez ekran sırasında kurulan ve rafine oldu. Havayolu kirpikler hareketliliği incelemek için kullanılan mevcut tekniklerin akut ex vivo türü veya boylam ya toplanabilirin vitro deneysel yaklaşımlar ger terim. Akut deneyler ex vivo insan burun / hava yolu fırça biyopsi görselleştirme 6,7 ve basit enine havayolu bölüm 8 analizini içerir. In vitro yaklaşımlar, hava sıvı arayüzü kültürler ya da hava yolu süspansiyon kültürleri 9-11 gibi farklı siliyalı epitel yaprak oluşturmak için çeşitli hücre kültürü teknikleri kullanmaktadır. Herhangi bir kullanılabilir siliyalı epitel hücreleri deney (4-6 hafta 9,10) için üretilen önce Ancak, bu hava yolu epitel reciliation teknikleri zaman ve eğitim çok önemli bir yatırım gerektirir. Solunum yolu epitel fırça biyopsilerin akut ex vivo analiz yaygın insan klinik çalışmalar için kullanılır, bu yöntem şiddetlenir mekanik doku yaralanması 12 bağlı fare çalışmalarda kullanılabilir değildir. Mutabakatnamelere analizi için bu protokolde belirtilen tekniğiE trakea hava yolu epitel çalıştırmak için sadece basit değildir, ama özel bir diseksiyon becerileri ne videomikroskopi tarafından görüntüleme için bu standart dışında herhangi bir özel ekipman gerektirmez. Bu protokol için pek çok avantajı vardır. Fare trakea doku hasat gerçekleştirmek için hızlı ve kolay olduğu gibi, önce, farelerin, çok sayıda hava yolu kirpikler fonksiyonu hızlı bir şekilde değerlendirilmesi için izin verir. Bu in vitro tedavi farklı kısa vadeli etkileri akut analizi içerebilir. İkinci olarak, bir ex vivo tekniği olan, siliyalı hava yolu epitel bu destek dokularını altta yatan bağlı kalır ve böylece ilgili hücre sinyal yolları korumak. Bu nedenle in vitro reciliated solunum yolu epitel hücrelerinde ile karşılaştırıldığında, bu hazırlık vivo doku ortamda doğal daha iyi bir temsilidir. Üçüncü olarak, bu protokol sağlayan hareketli kirpikler f değerlendirilmesini sağlar farklı kantitatif bir dizi parametre edinimimerhem. Son olarak, havayolu kirpikler görselleştirme için diğer mevcut yöntemlerle aksine, bu protokol kirpikler yendi yüksek çözünürlüklü görüntüleme ve metachronal dalga üretimi için en uygun olan kirpikler Profil görünümü sağlayan, kirpikler yendi yönüne dik açılarda kirpikler görselleştirme sağlar . Bu protokol, farmakolojik ajanlar, genetik faktörler, çevresel maruziyet, ve / veya hava yolu kirpikler fonksiyonu ve üretim / bakım gibi mukus yük gibi mekanik faktörlerin rolü deneysel ihtiyaçlarını geniş bir yelpazede ele yolları bir dizi değiştirilebilir havayolu kirpikler yendi ve metachronal dalga yayılımı.

<table><tbody><tr><td>Leibovitz' s L-15 Orta </td><td>Invitrogen</td><td>21083-027</td><td>Fenol kırmızı </td></tr><tr><td>yok Fetal sığır serumu </td><td>Hiklon</td><td>SH30088.03</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin </td><td>İnvitrojen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>2x ince forseps </td><td>Roboz</td><td>RS-4976</td><td></td></tr><tr><td>Diseksiyon makası </td><td>Roboz</td><td>RS-5676</td><td></td></tr><tr><td>Mikro diseksiyon makası </td><td>Roboz</td><td>RS-5620</td><td></td></tr><tr><td>Neşter </td><td>Roboz</td><td>RS-9801-15</td><td></td></tr><tr><td>P1000 pipet makinesi </td><td>Gilson, Inc</td><td>F123602</td><td></td></tr><tr><td>P1000 uçları </td><td>Moleküler BiyoÜrünler</td><td>2079E</td><td></td></tr><tr><td>18 mm yuvarlak cam kapak astarları </td><td>Fisher Scientific</td><td>430588</td><td></td></tr><tr><td>Plastik 35 mm kültür kapları </td><td>Corning</td><td>430588</td><td></td></tr><tr><td>Cam tabanlı 35 mm kültür kapları </td><td>Warner Instruments</td><td>W3 64-0758</td><td></td></tr><tr><td>Silikon levha 0.012 "(0.3 mm) kalınlığında </td><td>AAA Acme Rubber Co</td><td>CASS-.012X36-63908</td><td></td></tr><tr><td>0.20 & mu; m çaplı Floresbrit YG Karboksilat Mikroküreler </td><td>Polysciences</td><td>09834-10</td><td></td></tr><tr><td>Ters mikroskop, 100x yağ objektifi ve DIC filtreleri ile </td><td>Lecia</td><td>DMIRE2</td><td>Markası kritik değildir. </td></tr><tr><td>100 watt cıva lambası, epifloresan FITC uyarma/emisyon filtreleri</td><td>Lecia</td><td></td><td>Markası kritik değildir.</td></tr><tr><td>Mikroskop aşaması İnkübatör</td><td>Lecia</td><td>11521749</td><td>Kirpiklerin oda sıcaklığında görüntülenmesi durumunda gerekli değildir</td></tr><tr><td>Yüksek hızlı kamera parlak alan </td><td>Vizyon Araştırması</td><td>Phantom v4.2</td><td>Marka kritik değildir. 125 fps'den daha hızlı olmalı</td></tr><tr><td>Yüksek hızlı floresan kamera </td><td>Hamamatsu</td><td>C9100-12</td><td>Marka kritik değildir. 10 fps'den daha hızlı olmalı</td></tr><tr><td>MtrackJ eklentisi</td><td></td> ile<td>film analiz yazılımı</td><td>Ulusal Sağlık Enstitüleri</td> ImageJ</tr></tbody></table>

kemirgen havayolu epiteli içinde cilia motilite yüksek Çözünürlüklü görüntüleme için ex vivo yöntemi

Ex vivo Method for High Resolution Imaging of Cilia Motility in Rodent Airway Epithelia

Mukosiliyer temizleme fonksiyonu içgörü için önemli hareketli kirpikler fonksiyonunun kantitatif analiz için görüntüleme fare havayolu epitel için bir ex vivo tekniği kurulmuştur. Taze hasat fare trakea trachealis kas ile uzunlamasına kesilir ve cam dipli çanak sığ bir duvarlı odasında monte edilir. Trakea örnek uzunlamasına kıvrılmasına trachealis kas yararlanmak için uzun ekseni boyunca konumlandırılmış. Bu tüm trakea uzunluğu boyunca profil görünümünde siliyer hareket görüntüleme sağlar. 200 kare / sn video kirpikler yendi frekans ve siliyer dalga kantitatif analiz sağlamak için diferansiyel girişim kontrast mikroskobu ve bir yüksek hızlı dijital fotoğraf makinesi kullanılarak elde edilir. Görüntüleme sırasında floresan boncuk eklenmesiyle, kirpikler üretilen sıvı akışı da belirlenebilir. Protokol süresi odası hazırlanması için 5 dakika ile yaklaşık 30 dakika,, örnek için 5-10 dakika açıklıklımontaj ve videomikroskopi için 10-15 dk.

Film oynatma% 100; kirpikler yendi (Ek Film 2 yönünde fark akışı ile; Kontrol havayolu kirpikler açıkça görülebilir ve koordineli bir şekilde (film oynatma 15% gerçek zamanlı için yavaşlar Ek Film 1) yenmek için görülen olmalıdır ) gerçek zamanlı. Kirpikler film kantitasyonu, Şekil 3&#39;te görülen benzer sonuçlar vermesi gerekir. Floresan boncuk izleme kirpikler oluşturulan akış hızı ölçümü (Şekil 3D) sağlar ise yüksek hızlı DIC film toplanması, olası ...

Havayolu kirpikler hareketliliği ve kirpikler oluşturulan akış fare trakea kullanarak görselleştirme ve ölçülmesi için kolay ve güvenilir bir tekniktir açıklanmıştır. Bu teknik faktörler çok çeşitli farmakolojik ajanlar, genetik faktörler, çevresel maruziyet, ve / veya mukus yük gibi mekanik faktörler de dahil olmak üzere, kirpikler hareketliliği nasıl etkilediğini belirlemek için değiştirilebilir.

Kemirgen Havayolu Epiteli içinde Cilia Motilite Yüksek Çözünürlüklü Görüntüleme için ex vivo Yöntemi

An ex vivo technique for imaging mouse airway epithelia for quantitative  analysis of motile cilia function important for insight into mucociliary  ...

Bu prosedürün genel amacı, taze izole edilmiş fare trakeası kullanılarak solunumsal CLIA motilitesini ve CLIA tarafından oluşturulan akışı görselleştirmek ve nicelleştirmektir. Bu işlem, öncelikle sığ bir görüntüleme haznesinin hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. Prosedürün sonraki adımları, görüntüleme için trakeal dokunun toplanması ve monte edilmesidir.Ardından, 100 XDIC objektifi ile yüksek hızlı videografi kullanılarak, ters mikroskop yardımıyla C motilitesinin ve CLIA tarafından oluşturulan akışın nasıl görselleştirileceği ve kaydedileceği gösterilmektedir. Son adım, Image J yazılımını kullanarak CLIA vuruş frekansını ve CLIA tarafından oluşturulan akışı nicelleştirerek videoyu analiz etmektir. Nihayetinde sonuçlar, yüksek hızlı video mikroskopisi aracılığıyla solunum yolu CLIA motilitesindeki ve CLIA tarafından oluşturulan akıştaki değişiklikleri gösterebilir.Bu tekniğin mevcut yöntemlere göre temel avantajı, siliyer hareketin tutarlı kantitatif değerlendirmeleri için kemirgen trake epitelinin tekrarlanabilir görüntülemesine olanak tanımasıdır. Bu işlem, minimum eğitimle 20 ila 30 dakika içinde gerçekleştirilebilir. Bu yöntem, özellikle farklı genetik olarak mühendisliği yapılmış ve mutant fare modelleriyle birlikte kullanıldığında, eWAY'de mukus temizliğini düzenleyen hücresel ve moleküler mekanizmalarla ilgili temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.Trake örneklerini tutmak için kullanılan hazneyi, taban veya hazne tabanı oluşturarak kurmaya başlayın. Üst kısım için cam tabanlı 35 milimetrelik bir kültür kabı kullanın. 0.3 milimetre kalınlığında silikon tabaka kullanın.Tabakayı 18 milimetrelik yuvarlak bir lam üzerine yerleştirin ve kenarlarını kesin. Ardından, bir skalpel yardımıyla silikonun ortasından 10 milimetrelik bir kare kesin. Cam lam ve silikon, kültür odasının üst ve yan yüzeylerini oluşturur.Kültür kabına yerleştirilen örneğin üzerine konulacaklardır. Kurumsal yönergelere uygun olarak bir fareyi ötanize ettikten sonra trakeayı cerrahi olarak izole edin. Trakeayı, tamamen batıracak kadar L 15 medyum içeren plastik 35 milimetrelik bir kültür kabına toplayın.Künt diseksiyon yöntemiyle, trakeanın etrafındaki tüm trakeal olmayan dokuları temizleyin. Ardından, mikrodiseksiyon makası kullanarak, krikoid kıkırdağın hemen altından transvers bir kesi ile larinksi çıkarın. Şimdi, ince penset yardımıyla karinanın hemen üzerinden transvers bir kesi yaparak sol ve sağ primer bronşiyel dalları çıkarın.Trakeayı nazikçe tutun. Ardından, bir mililitrelik pipet kullanarak, mukus ve kanı temizlemek için lümeni L 15 medyum ile iki veya üç kez yıkayın. Sonrasında, mikro diseksiyon makasıyla, üç veya dört halkalı bir trakea segmentini çıkarmak için transvers bir kesi yapın.Ardından, küçük trake segmentinde, trake kasının ortasından boylamasına bir kesi yapın. Son olarak, mikrodiseksiyon makaslarını kullanarak trake kıkırdak halkalarının ortasından boylamasına kesin ve görüntüleme için uygun iki trake dokusu bölümü bırakın. Diseksiyondan sonra, trake dokusu segmentlerini lümen tarafı aşağı gelecek şekilde, yaklaşık 100 µL L 15 içeren cam tabanlı kabın merkezine aktarın.L 15 medyumunun mililitre başına 2,5% floresan mikroküre süspansiyonunun 20 microliter'ı ile oluşturulan CLIA akışını nicelleştirmek için. Şimdi silikon ve cam kapağı trakeanın üzerine yerleştirin ve yerine sabitlemek için hafifçe bastırın. Ardından kenarlar boyunca, fazla medyumu bir mill pipetle alın.Şimdi hazneyi, 100x objektif ve DIC optikleri ile donatılmış bir ters mikroskoba aktarın. Yüksek hızlı bir kamera ve film kayıt yazılımı kullanarak, kıvrılmış trake kası kenarındaki siliyen trake epiteli boyunca CLIA motilitesinin saniyede 200'den fazla kare hızında videolarını çekin. FS epitelyal floresan görüntüleme ve düşük ışıklı bir CCD kamera kullanarak, siliyen trake epiteli yüzeyinde hareket eden floresan mikrokürelerin videolarını çekin.CLIA tarafından oluşturulan akışın nicelleştirmesi için bu videoları kullanın. Örnekler, Celia Beat fonksiyonunda herhangi bir fark edilemeyecek değişiklik olmaksızın bir saate kadar görüntülenebilir. CLIA dakika başına vuruş sayısını hesaplayarak başlayın. DIC görüntülenen videoları Image J yazılım paketine yükleyin.Aian Drummond tarafından açıklanan tekniği uygulayın. Bir raster çizgisi çizmek için çizgi aracını kullanın. Atan silia üzerinden geçiş yapın.CA'nın hat boyunca hareketinin bir dalga deseni oluşturduğu grafiğe benzer bir görüntü üretmek için bu hattın bir resim kesiti (res slice) oluşturun. Şimdi bu hat boyunca her bir dalga tepesi arasındaki piksel sayısını sayın. Bu sayım sonucunda.Her bir film karesinin hat boyunca bir pikselle temsil edildiğini bilerek dakikadaki vuruş sayısını hesaplayın. Ardından, C Cate tarafından oluşturulan akışı ölçün. Floresan boncuk filmlerini Image J yazılım paketine yükleyin.MT track J eklentisini kullanarak, trake epiteli yüzeyindeki floresan boncukları manuel olarak takip edin. Yazılım, takip edilen her bir boncuk için hızı ve yönlülüğü hesaplayacaktır. Boncukların siliyalardan uzaklığının, ölçülen akış büyüklüğünü güçlü bir şekilde etkileyebileceğine dikkat edin.Bu örnekte, boncuk hareketi silli hücrelerin yüzeyinde hızlıdır ve banyo ortamındaki daha uzaktaki boncuklar için azalmaktadır; bunu kontrol etmek için, doğru karşılaştırmalar yapabilmek amacıyla tüm örneklerde boncuk izleri yalnızca silli epitelin üzerinde sabit bir mesafeden toplanmalıdır. Son olarak, sıvı akışı için boncukları mümkün olduğunca uzun süre takip edin. Bu hesaplamaları yapmak için 10'dan fazla silli hücrenin önünden geçen boncukların kullanılması tercih edilir.Tanımlanan protokol kullanıldığında, kontrol solunum yolu siliya yapıları net bir şekilde görülmeli ve koordineli bir biçimde hareket ettikleri gözlemlenmelidir. Benzer şekilde, vuruş yönünde belirgin bir akış olmalıdır. Tipik olarak, yüksek hızlı DIC videolarının toplanması, siliya vuruş frekansının nicelendirilmesine olanak tanır ve kaliteli görüntüler sağlar.CLIA boncuk şeklinin kalitatif değerlendirmesi için. Floresan boncukların takibi, CLIA tarafından üretilen akış hızının ölçülmesini sağlar. Yönelimsellik, bir floresan boncuğun toplam yer değiştirmesinin, söz konusu floresan boncuğun iz uzunluğuna bölünmesiyle hesaplanır.Böylece, düz bir yörünge hattı bir puan alır; kıvrımlı bir yol ise çok daha düşük bir değer alır. Bu prosedür uygulanırken, kesim işleminden önce trakes kasının çevresindeki tüm bağ dokusu ve yağ dokusundan düzgünce temizlendiğinin hatırlanması önemlidir.Trake kasının kesildikten sonra kıvrılması, solunum CLIA'sının ideal görüntüleme için konumlandırılmasında esastır. Bu prosedürün ardından, farmakolojik ajanların solunum C aktivitesini nasıl veya neden modüle ettiği gibi ek soruları yanıtlamak amacıyla farmakolojik çalışmalar gibi diğer yöntemler uygulanabilir.

ex-vivo-method-for-high-resolution-imaging-cilia-motility-rodent

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Source: Al Omran, A. J., et al. Fare beyninin lateral ventriküllerindeki ependimal kirpiklerin canlı görüntülenmesi. J. Vis. Exp. (2015). Bu video, ependimal vuruşunu gözlemlemek için diferansiyel girişim kontrastı (DIC) mikroskobu kullanan bir canlı görüntüleme tekniğini göstermektedir Sagital fare beyin bölümlerinde kirpikler. Ependimal kirpikler beyin omurilik sıvısını (BOS) iter ve aktiviteleri, besin açısından zengin bir ortamda tutulan beyin bölümlerinde kaydedilir ve iklim kontrollü bir...

Bir fare beyin bölümünde ependimal hücreli siliyer aktivitenin canlı görüntülenmesi

Intravital mikroskopi canlı hayvanlarda çeşitli biyolojik süreçleri görüntüleme sağlayan güçlü bir araçtır. Bu yazıda, canlı farelerde tükürük bezlerinde bu salgılama granüller gibi alt-hücresel yapıların, dinamiklerini görüntüleme için ayrıntılı bir yöntem sunuyoruz.

Floresan Proteinler ifade Canlı Farelerde Görüntüleme hücrealtı Yapıların Intravital Mikroskopi

Yüksek çözünürlüklü diferansiyel girişim kontrast (DIC) mikroskopi kullanılarak, fare beyin ventriküller içinde yer alan hareketli ependim kirpikler dayak bir ex vivo gözlem canlı görüntüleme ile gösterilmiştir. teknik, özel bir siliyer atan frekansının kayıt ve dayak açısı aynı zamanda bunların hücre içi kalsiyum salınım ilerleme hızı özellikleri sağlar.

Fare Beyin lateral ventrikül Ependimal Cilia Canlı Görüntüleme

Bu çalışmada, ayrıntılı bir ışık mikroskobik tekniği, ultrastrüktürel analiz için bir elektron mikroskobik yöntemle birlikte CPEC kirpiklerin ex vivo hareketinin gerçek zamanlı gözlemi ve analizi için optimize edilmiştir.

Koroid Pleksus Epitel Hücreleri Silier Hareketi Gözlem<em&gt; Ex Vivo</em

Bu yayında, çift modalite radyonüklid görüntüleme kullanarak in vivo farelerde hava yolu mukozirary boşluğunu (MCC) değerlendirme protokollerini açıklıyoruz. Bu protokol, çift SPECT/CT sisteminde fare tüm gövde (MWB) kolimatörleri kullanılarak tek bir foton emisyonlu bilgisayarlı tomografi (SPECT) ve bilgisayarlı tomografi (BT) alma protokolü için tasarlanmıştır.

Farelerde Mukozdiliyel Temizliğin In vivo Değerlendirilmesi

PCD tanısı için başarılı ve yüksek kaliteli siliyer fonksiyonel analizi garanti etmek için, solunum epitel örneklemesi ve işlenmesi için hassas ve dikkatli bir yöntem şarttır. COVID-19 pandemisi sırasında PCD tanı hizmeti vermeye devam etmek için, siliyer videomikroskopi protokolü uygun enfeksiyon kontrol önlemlerini içerecek şekilde güncellenmiştir.

Dijital Yüksek Hızlı Siliyer Videomikroskopi Kullanarak Burun Fırçalama Örneklemesi ve İşleme – COVID-19 Pandemisine Adaptasyon

Bu protokol, nazal epitel hücresi toplanmasını, genişlemesini ve organotipik hava yolu epitel hücre modellerine farklılaşmasını ve canlı hücre görüntüleme ve özel yapım senaryolar yoluyla kirpik vuruş sıklığının nicelleştirilmesini açıklar.

Primer İnsan Nazal Epitel Hücre Modellerinin Silia Beat Sıklığının Ölçülmesi İçin Toplanması, Genleştirilmesi ve Farklılaştırılması

Yüksek hızlı video mikroskopi analizi, gerçekleştirilmesi nispeten kolay, hızlı, uygun maliyetli ve deneyimli ellerde, primer siliyer diskinezinin birinci basamak teşhisi için oldukça güvenilir bir araçtır ve ciddi akciğer hastalıklarının teşhisi ve tedavisinde yer alan her merkezde mevcut olmalıdır.

Primer Siliyer Diskinezinin Birinci Basamak Tanısı için Yüksek Hızlı Video Mikroskopi Analizi

Bu protokol, fareler ve sıçanlar için, optimize edilmiş bir anestezik rejim ve ince ayarlı endoskopik manipülasyon teknikleri kullanılarak solunum ve yutma sırasında gırtlağın yakından, engelsiz video görüntülemesine izin veren bir seri transoral laringoskopi yaklaşımını tanımlar.

Solunum ve yutma sırasında gırtlak hareketinin yakından görüntülenmesi için minimal invaziv murin laringoskopi

Hava-sıvı arayüz kültürü, akciğer hava yolunun apikal tarafını taklit eden primer normal insan bronşiyal epitel hücrelerini farklılaştırarak psödostratifiye hava yolu epiteli geliştirmek için yaygın olarak kullanılır. Burada, siliyer fonksiyon ve membran bütünlüğü gibi biyofiziksel özelliklerini izleyerek kalitesini belirlemek için kolay bir protokol açıklıyoruz.

Psödostratifiye Akciğer Hava Yolu Epitelinin Siliyer Fonksiyonunun ve Membran Geçirimsizliğinin Belirlenmesi

Bu yöntem, bir ARL13B-CENTRIN-2 transgenik fare modelindeki endojen sinyalin, doku toplamadan kirpik organizasyonunun analizine kadar, mineralize dokunun geniş alanlarında üç boyutlu olarak primer kirpikleri yerinde görüntülemek için kullanılmasını tanımlar. Bu protokol diğer doku tiplerine de uygulanabilir.

Kas-İskelet Dokusundaki Primer Kirpiklerin ARL13B-CENTRIN-2 Fare Modeli Kullanılarak Hacimsel Görüntülenmesi ve Analizi

Öğrenin, fare trakeasından izole edilmiş hava yolu epitelindeki kamçı hareketliliğini ve akışını yüksek hızlı videomikroskopi ile nicel olarak analiz etme yöntemini. Bu teknik, mukosiliyer klerens mekanizmalarını hızlı ve tekrarlanabilir şekilde değerlendirir.

Kemirgen Havayolu Epiteli içinde Cilia Motilite Yüksek Çözünürlüklü Görüntüleme için ex vivo Yöntemi

Daha fazla video keşfet