Yeni Bir Ex vivo Kültür Yöntemi

Bu prosedürün genel amacı, ex vivo kültür için embriyonik kalbi eksize etmektir. Bu, önce hamile bir dişi fareden rahim boynuzunun alınmasıyla gerçekleştirilir. Daha sonra, bir embriyo alınır ve diseksiyon için hazırlanır.

Daha sonra kalbi görselleştirmek için embriyonik göğüs duvarı açılır. Son olarak, kalp eksize edilir ve seyreltik matrigel içeren bir kültür kuyusuna yerleştirilir. Sonuç olarak, parlak alan mikroskobu altında görüntüleme yoluyla sağlıklı bir canlı kalbi gösteren sonuçlar elde edilebilir.

Bu tekniğin sallama kültürleri gibi diğer yöntemlere göre en büyük avantajı, kalbin ya boncuk konjuge bir protein gibi lokal ajanlarla ya da matrijele küçük bir molekül eklemek gibi global ajanlarla tedavi edilebilmesidir. Bu tekniğin sonuçları, kardiyovasküler hastalıklar için tedaviye kadar uzanır, çünkü kalbin özel bölümlerindeki olayların tüm sağlam organ bağlamında incelenmesine izin verir. İstenilen embriyonik günde zamanlanmış bir hamile fareye ötenazi yaptıktan sonra, enstitünüz tarafından onaylanan bir teknik kullanarak, karın boşluğunu açmadan ve uterus boynuzunu alıp çıkarmadan önce dişiye liberal olarak% 70 etanol püskürtün.

Rahim boynuzunu soğuk bir XPBS içeren bir Petri kabına yerleştirin ve durulayın. Çanağı incelemeye hazır olana kadar buzun üzerine yerleştirin. Daha sonra, ekli embriyonik torbaları ortaya çıkarmak için uterus boynuzunu orta hattan kesin.

Embriyonik bir torbayı kesin ve bir embriyoyu soğuk PBS ile ikinci bir Petri kabına yerleştirin. Rahim boynuzu ile çanağı buzun üzerine yerleştirin. Embriyonun başını kestikten sonra, embriyoyu sırt üstü yerleştirin ve kesin.

Kalbi ve akciğerleri görselleştirmek için göğüs duvarını açın. Sahneye bağlı olarak, göğüs duvarı şeffaf olabilir. Genotipleme yapılacaksa embriyonun kuyruğunu saklayın.

Forseps kullanarak kalbi dikkatlice kaldırın ve aşağıdaki damarları kesin. Sonra kalbi serbest bırakmak için büyük damarların üzerini kesin. Gerekirse, yabancı dokuları çıkarın.

Kalbi, soğuk PBS ile doldurulmuş ve buzun üzerine oturmuş 24 kuyulu bir tabağın bir kuyusuna yerleştirin. Tüm embriyonik kalpleri izole etmek için diseksiyonu tekrarlayın. Laminer akış başlığında, seyreltik matri jeli buz üzerinde tutarken soğuk matri jeli ve istenen kültür ortamını bire bir oranında birleştirin.

500 ila 1000 mikrolitre çözeltiyi 24 kuyulu bir kültürün kuyucuklarına pipetleyin. Bunu buzun üzerine koyun. Eksize edilen kalpleri dikkatlice toplayın ve matrigel içeren kültür kabının ayrı ayrı kuyucuklarına yerleştirin.

Gömülü bir kalbin oryantasyonu çok önemliyse, ters çevrilmiş bir mikroskobu ve çevresindeki alanı bolca püskürtmek için %70 etanol kullanın. Daha sonra davlumbazda çalıştıktan sonra kalbi buz üzerindeki mat jelin kuyusuna yerleştirin. Plakayı bir mikroskop tablasına yerleştirin ve mat jel katılaşmaya başladığında kalbi hızla yönlendirin.

Kültür kabını nemlendirilmiş 37 santigrat derece inkübatöre yerleştirin ve matri jelin yaklaşık 30 dakika katılaşmasına izin verin. Bir mil içeren her bir oyuğa orta, bir mililitre önceden ısıtılmış kültür ekleyin. Kalpler en az dört gün kültürde kalabilir.

İstenirse, cyto 16 gibi bir floresan canlı hücre kalıbı ekleyin. Canlı kalp fotoğrafını görselleştirmek, kalbin gömülü olduğu konuma bağlı olarak görünen tarafıyla sınırlı olacaktır. Tam montaj görüntüleme veya kesit alma yapılacaksa, kültür ortamını çıkarın.

Soğuk% 4 formaldehit ile değiştirin ve tabağı 30 dakika boyunca buzun üzerine koyun. Matrigel çözüldükten sonra, sabitleyici ve matrijeli taze formaldehit ile değiştirin ve kalpleri gece boyunca dört santigrat derecede sabitleyin. Kalpleri PBS veya Triss ile yıkayın ve daha fazla analize kadar dört santigrat derecede saklayın.

24 saat boyunca ex vivo kültürlendiğinde, koroner damar sistemi, burada gösterildiği gibi uteroda tutulan nispeten yaşlı bir embriyodan çıkarılan bir kalbe benzer görünür. E 16.5'te eksize edilen ve dört gün boyunca ex vivo kültürlenen kalplerin hemat, toin ve eoin analizi, büyük arterlerin duvarları ve kalbin ventriküler ve interventriküler septal miyokardları dahil olmak üzere genel morfolojinin dolaşım eksikliğine rağmen sağlam kaldığını göstermektedir. Koroner osteo, ok ucu ile gösterildiği gibi belirgindir.

Bununla birlikte, oklarla gösterilen ve hem h hem de d ile gözlenen DNA parçalanması ve DAPI, kompakt miyokardda ve büyük damarların çevresinde belirgindir. Ayrıca, miyokard, ex vivo kültürlenmiş kalp hala atıyor olsa bile, uteroda gelişen bir E 18.5 embriyosundan elde edilen bir kalbe kıyasla daha az yoğundur. Bu nedenle, bu kalplerin sürdürülebileceği süre veya aşama konusunda sınırlamalar vardır.

Bu kültür tekniği, kalpleri floresan olarak etiketlemek için de kullanılabilirken, kültürde endotelyal spesifik bir floresan boya ile inkübasyonu takiben kalpler 48 saat boyunca kültürlenir. Bu durumda, görselleştirme kalbin oryantasyonuna ve dokunun opaklığına bağlı olarak sınırlıdır. Ventriküler miyokarddan sonraki histolojik kesitler, sito 16'nın ventriküller içindeki sub epikardiyal damarları etiketlemek için dış hücre katmanlarına nüfuz edebildiğini ve burada gösterildiği gibi is selektin ile birlikte lokalize olduğunu doğrulamaktadır 30 saat boyunca ex vivo kültürlemeden sonra, bir E 14.5 embriyosundan çıkarılan bir kalp, atriyum ve ventriküller arasında tutarlı kasılma ve ilerleme hızı gösterir.

Bu tekniği uygularken, kalbi çıkarırken nazik ve dikkatli olmak önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, embriyonik bir fare kalbinin nasıl kesileceğini ve kültürleneceğini iyi anlamış olmalısınız.