Yeni Bir Yüksek çözünürlüklü

Bu prosedürün genel amacı, kemik iliği kaynaklı progenitör hücrelerin normal beyin ve beyin tümörü ilişkili damar yapısına zaman içindeki göç modellerini takip ederek yüksek çözünürlüklü tek hücre görüntüleri elde etmektir. Bu işlem, donör farelerden tibia ve femurun çıkarılarak floresan işaretli kemik iliği progenitör hücrelerinin elde edilmesi ve ardından bu hücrelerin ışınlanmış alıcı farelere enjekte edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım ise, kranial pencere odası içerisindeki kimerik farelerde intrakranial GBM ksenogreftleri oluşturmaktır.

Ardından, fareler stereotaktik kılavuzlu radyasyon dahil olmak üzere çeşitli tedavi rejimlerine tabi tutulur. Son adım, farelerin iki fotonlu konfokal mikroskop ile görüntülenmesidir. Nihayetinde bu metodoloji, çeşitli modellerde intrakraniyal vaskülarizasyon mekanizmalarını dinamik olarak incelemek için kullanılabilir.

Bu tekniğin ex vivo dokuların histopatolojisi gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, beyindeki damar oluşumuyla ilgili kritik dinamik bilgileri inceleyebilmemizdir. Böylece, intrakraniyal neovaskülarizasyon mekanizmalarını çevreleyen temel sorulara yanıt verebiliriz. Bu yöntem, intrakraniyal neovaskülarizasyon hakkında bilgi sağlamak için kullanılabileceği gibi; intrakraniyal iskemi veya inme, nörodejeneratif hastalıklar ve tümör hücrelerinin beyne metastaz mekanizmaları gibi beyindeki diğer sistemlere ve hastalık süreçlerine de uygulanabilir.

Bu videonun amacı doğrultusunda, katı aseptik tekniğe uymak mümkün olmamıştır. Bu nedenle, izleyicinin daha net bir görüntü elde edebilmesi ve deneysel çalışmalar için prosedürlerin yönelimini daha iyi kavrayabilmesi amacıyla, biyogüvenlik kabininde 12 inçlik bir açıklık bırakılmış ve hayvanlar örtülmemiştir. Uygulamalarda aseptik tekniğe kesinlikle uyulmalıdır.

Bu prosedüre GFP donör faresinin floresan ekspresyonunu doğrulayarak başlayın ve fareyi kurumsal hayvan bakım komitesi kılavuzlarına uygun olarak ötanize edin. Ardından, aseptik koşullar altında çalışarak her iki arka ekstremiteyi temizleyin ve tibia ile femuru çıkarın. Kemikler üzerindeki tüm fazla dokuları sıyırarak temizleyin.

Ardından, çıkarılan dört kemiğin her iki ucundaki uç plakalarını çıkarın. 22 gauge bir iğne ve bir mililitre steril PBS ile yıkama yapın. Tüm kemik iliği boşaltıldığında kemikler şeffaf hale gelecektir.

Ardından, ekstrakte edilen kemik iliği süspansiyonunu karıştırın. Bu süspansiyon, üç konak fare rekonstitüsyonu için yeterli olan yaklaşık 20 milyon hücre içermelidir. Daha sonra, 3 adet 27 gauge tuberkulin iğnesi hazırlayın ve her birine 300 µL kemik iliği süspansiyonu çekin.

Fare sabitleyicide konumlandırılmışken, yönünüzü belirlemek için kuyruğun dorsal yüzeyini işaretleyin. Ardından, süspansiyonu daha önce ışınlanmış üç farenin lateral kuyruk venine enjekte edin.

Bu prosedürde aseptik koşullar altında nod skid fareler kullanın. Kimera kemik iliği nakledilmiş nod skid fareleri anesteziye alın ve IACUC onaylı preemptif analjezi uygulayın. Kornea dehidrasyonunu önlemek için gözyaşı jeli uygulayın.

Baş bölgesini önce Betadine solüsyonu, ardından alkol ile temizleyin ve fazla kılları alın. Sonrasında, alttaki saç derisini alkol ile daha detaylı şekilde temizleyin. Kulakların orta noktasından gözlerin hemen üzerine kadar bir insizyon yapın.

Altta yatan kafatasının yaklaşık beş milimetresini açığa çıkarmak için ilk insizyonun her iki yanındaki saçlı deriyi kaldırın. Ardından kafatası yüzeyinin anatomik işaretlerini belirleyin. Sonrasında, %2'lik lidokainli efedrin çözeltisi enjekte ederek periostu tanımlayın ve kaldırın.

Ardından, keskin bir aletle periostu kafatası yüzeyinden sıyırarak ayırın. Daha sonra, kafatasının sağ hemisferinde, Lambda ve bgma noktalarının her ikisine eşit uzaklıkta, 2,7 mm çapında dairesel bir kemik flebini zayıflatmak için 2,7 mm TR refine matkap kullanın. Alttaki dura ve dokuyu korumak için matkapla kemiği delmeyin.

Şimdi, zayıflatılmış kemik flebini diseksiyon aleti, cımbız ve diş hekimi kancası kullanarak dikkatli ancak kontrollü bir kuvvetle kaldırın. Ardından, 30 gauge bir Hamilton şırıngasına 10 µL hücre süspansiyonu yükleyin ve iğneyi stereotaktik çerçeveye yerleştirin. Son olarak, fareyi stereotaktik çerçeveye yerleştirin.

İğneyi, sonrasında oluşan pencerenin merkez noktasına hizalayın ve kortikal yüzeye değene kadar aşağı indirin. Ardından dijital koordinatları sıfırlayın. Şimdi iğneyi kortikal dokunun 3.2 milimetre içine indirin.

Ardından 0,2 milimetre geri çekin ve üç milimetrede enjeksiyon yapın. Derin enjeksiyon, dakikada 10 µL hızla gerçekleştirilmelidir. Enjeksiyon tamamlandığında, iğneyi yavaşça geri çekmeden önce bir dakika boyunca yerinde bırakın.

Ardından fareyi çerçeveden çıkarın. Sonrasında, steril PBS damlacıkları kullanarak beyin yüzeyini nemli tutun.

2,7 mm'lik pencereyi kapatmak için beyin yüzeyine üç milimetrelik bir lam yerleştirin. Ardından çevredeki kafatası kemiğini kurulayın. Sonrasında, kafa derisi dokusunu kafatası kemiğine yapıştırmak ve lamı sabit tutmak için vet bond uygulayın.

Camın altına sızarak görüntüleme potansiyelini düşürebileceği için çok fazla uygulamayın. Ardından, taze dental akrilik tozunu ve solüsyonu çeker ocak içerisinde karıştırın ve karışımı 22 gauge bir iğne kullanarak vet bond üzerine uygulayın. Sıkı bir sızdırmazlık sağlamak için akrilikle cam lamelin kenarının hafifçe üst üste binmesini sağlayın, ancak cam lameli tamamen kapatmayın.

Bu adımda, anestezi uygulanmış bir fareyi, özel tasarım XAD 2 25 stereotaktik iradyatör içerisindeki özel kafa sabitleyiciye yerleştirin. X-ışını tüpü 40 peak kilovolt ve 0.05 miliamperde, iki milimetrelik alüminyum filtre üzerinden çalıştırılarak 360 derecelik konik ışınlı BT taraması gerçekleştirin. Radyasyon ISO merkezinin sağ hemisferle hizalandığı ve dorsal ventral yönde merkezlendiği şekilde sahnenin konumlandırılması için görüntüyü kullanın.

Radyasyonu hedeflemek için kullanılabilecek çok çeşitli kolimatörler mevcuttur, bu da modelin uyarlanabilirliğini göstermektedir. Bu durumda, hemisferik ışınlama için 8 mm x 11 mm boyutunda olanı kullanıyoruz. Hemisferik kolimatörü X RAD 2 25 stereotaktik ışınlayıcıya yerleştirin.

Kafanın doğru konumlandırıldığından emin olmak için, anatomik kemik yapıları belirleyerek ve monitör üzerinden sahne konumunu manuel olarak hassas bir şekilde ayarlayarak, kolimatör aracılığıyla hem üstten hem de alttan tekil ortogonal BT görüntüleri elde edin. XAD 2 25 IRRADIATOR alüminyum filtresini 0,93 milimetre bakır tedavi filtresiyle değiştirin. Ardından, x-ışını tüpü programını 225 peak illa voltaj ve 13 miliamperde çalıştırın ve radyasyon dozunun yarısını üstten AP yönünde uygulayın.

Gantry'yi alt konuma geri getirin ve radyasyon dozunun ikinci yarısını alttan PA yönünde uygulayın. Bu prosedürde, önceden oluşturulmuş intrakraniyal pencere faresini anestezi altına alın ve pencereyi alkol spreyi kullanarak temizleyin. Konfokal mikroskop üzerindeki kanalları, oluşturulan kimerik fareye entegre edilen florokromlara göre ayarlayın.

Alternatif olarak, görüntüleme oturumları arasındaki değişkenliği azaltmak için önceki ayarları yeniden kullanın. Bu durumda, görüntüleme için gerekli olan tüm etiketleri yan kuyruk venine enjekte edin (damarlanma için dekstran). Fareyi, şekillendirilebilir plastikle destekleyerek özel yapım kafa sabitleyicinin üzerine ters şekilde yerleştirin; başın lazere dik olduğundan emin olun ve sabitleyiciyi hareketli mikroskop tablasına düz bir şekilde yerleştirin.

İlk kanal lazerini açın ve oda haznesinin penceresindeki lazer ışını kesişme noktasına doğrudan bakarak lazeri intrakraniyal pencerenin merkezine konumlandırın. 5x lens kullanarak tüm pencerenin her bir kanal için görüntüsünü alın ve bunu 10x ve 20x uzun menzilli lenslerle alınacak diğer daha yüksek çözünürlüklü görüntüler için harita olarak kullanın. Bu şema, cerrahi işlemle ilgili teknik hataları vurgulamakta ve her birinin üretilen görüntüler üzerindeki etkisini göstermektedir.

Pencerenin altında hapsolan hava, görüntülerde kabarcıklar şeklinde görünecektir. Cam üzerindeki akrilik birikintileri, uzak kırmızı kanalda otofloresan özellik gösterir ve görüş alanının bir kısmını engeller. Benzer şekilde, görüntüleme sırasında pencere üzerindeki kirler, görüntülerde otofloresan lekeler olarak belirir.

Mükemmel bir intrakraniyal pencere bile mikroskop altına alındığında sorunlarla karşılaşabilir. Solunum artefaktları çizgili görüntülere neden olurken, farenin çerçeve üzerindeki hatalı konumlandırılması parçalı bir görüntüye yol açar. Lazer, görüntü sonrası işleme ile dokunun yalnızca bir kısmını kestiğinden, CFP etiketli hücreler için ek bir kanal eklemek mümkündür; böylece gerçek CFP sinyalini ortaya çıkarmak için GFP görüntüleri CFP görüntülerinden çıkarılabilir.

Ek olarak, kolajen dört liflerinin ikinci harmonik üretim otofloresans özelliğini kullanarak, damar sisteminin bazal membranını görüntüleyebiliyoruz. Beş floresan kanalın mevcut olması, kullanıcıya bu makalede açıklanan yeni aynalama modelinde geniş bir esneklik ve uyarlanabilirlik sağlar. Bu prosedürü uygularken, cerrahi işlemler sırasında kullanılan tehlikeli ürünlerin göz önünde bulundurulması önemlidir.

Uzun süreli görüntüleme boyunca beyin dokusunun zarar görmemesini sağlamak için titiz olmak ve detaylara özellikle dikkat etmek esastır. Bu videoyu izledikten sonra, floresan progenitör hücrelere sahip kimera bir farenin nasıl oluşturulacağını iyi derecede kavramış olmalı ve buna bağlı olarak, terapötik müdahale olan veya olmayan tümör hücresi implantasyonu sonrası intrakraniyal vaskülatürün yüksek çözünürlüklü gerçek zamanlı görüntülerini yakalayabilmelisiniz.