Yeni Bir Yüksek çözünürlüklü In vivo Görüntüleme Tekniği

Bu işlemin genel amacı, kemik iliği kaynaklı progenitör hücrelerin zamanla normal beyin ve beyin tümörü ilişkili damar sistemine alım paternlerini takiben yüksek çözünürlüklü tek hücreli görüntülerini elde etmektir. Bu, floresan kemik iliği progenitör hücreleri elde etmek için donör farelerden tibia ve femurun çıkarılması ve daha sonra bu hücrelerin radyasyona maruz kalan bir alıcı fareye enjekte edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, bir kraniyal pencere odası içindeki kimerik farelerde intrakraniyal GB M ksenogreftleri oluşturmaktır.

Daha sonra, fareler stereotaktik güdümlü radyasyon dahil olmak üzere çeşitli tedavi rejimlerine tabi tutulur. Son adım, fareleri iki fotonlu konfokal mikroskopta görüntülemektir. Sonuç olarak, bu metodoloji, çeşitli modellerde intrakraniyal vaskülarizasyon mekanizmalarını dinamik olarak incelemek için kullanılabilir.

Bu tekniğin ex vivo doku histopatolojisi gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, beyindeki damar oluşumu ile ilgili kritik dinamik bilgileri inceleyebilmemizdir. Bu nedenle, interkraniyal neovaskülarizasyon mekanizmalarını çevreleyen temel soruları cevaplayabiliriz. Bu yöntem intrakraniyal neovaskülarizasyon hakkında bilgi sağlamak için kullanılabilse de, intrakraniyal iskemi veya inme nörodejeneratif hastalık ve beyne tümör hücresi metastaz mekanizmaları gibi beyindeki diğer sistemlere ve hastalık süreçlerine de uygulanabilir.

Bu videonun amacı doğrultusunda, katı aseptik tekniği takip edemedik. Bu nedenle, biyogüvenlik başlığı 12 inç'ten fazla açıklıktır ve hayvanlar örtülmez, bu da izleyiciye daha net bir görüntü ve deneysel çalışma prosedürlerini yönlendirmek için daha iyi erişim sağlar. Aseptik tekniğe kesinlikle uyulmalıdır.

Bu prosedüre, GFP donör faresinin floresan ekspresyonunu onaylayarak başlayın ve kurumsal hayvan bakım komitesi yönergelerine göre ötenazi yapın. Ardından, aseptik koşullarda çalışırken her iki arka bacakları temizleyin ve tibia ve uyluk kemiğini çıkarın. Kemiklerdeki tüm fazla dokuyu soyun.

Ardından, çıkarılan dört kemiğin her iki ucundan uç plakaları çıkarın. Bunları 22 gauge iğne ve bir mililitre steril PBS ile yıkayın. Tüm kemik iliği temizlendikten sonra berraklaşırlar.

Daha sonra, çıkarılan kemik iliği süspansiyonunu karıştırın. Yaklaşık 20 milyon hücre içermelidir, bu da üç konakçı farenin sulandırılması için yeterlidir. Daha sonra, 3 adet 27 gauge tüberkülin iğnesi hazırlayın ve her birine 300 mikrolitre kemik iliği süspansiyonu çekin.

Fare sınırlayıcıya yerleştirilmişken. Kendinizi yönlendirmek için sırt kuyruk yüzeyini işaretleyin. Daha sonra süspansiyonu daha önce ışınlanmış üç yan kuyruk damarına enjekte edin.

Aseptik koşullar altında çalışan bu prosedürde kızak farelerini sallayın. Kimerik kemik iliği başını sallayan kızak farelerini uyuşturun ve iacuc onaylı preemptif analjezi uygulayın. Kornea dehidrasyonunu önlemek için gözyaşı jeli uygulayın.

Kafayı önce Betadine solüsyonuyla, ardından alkolle temizleyin ve fazla tüyleri alın. Ardından alttaki saç derisini alkolle daha fazla temizleyin. Kulakların orta noktasından gözlerin hemen üstüne kadar bir kesi yapın.

Altta yatan kafatasının yaklaşık beş milimetresini ortaya çıkarmak için ilk kesiğin her iki yanındaki kafa derisini çıkarın. Ardından kafatası yüzeyinin anatomik işaretlerini tanımlayın. Daha sonra,% 2 lidokain epinefrin çözeltisi enjekte ederek periosteuumu tanımlayın ve kaldırın.

Daha sonra, periosteuumu keskin bir aletle kafatası yüzeyinden uzaklaştırın. Ardından, kafatasının sağ yarım küresinde hem Lambda hem de bgma'dan eşit uzaklıkta 2,7 milimetrelik dairesel bir kemik flebini zayıflatmak için 2,7 milimetrelik bir TR rafine matkap kullanın. Altta yatan dura ve dokuyu korumak için matkapla kemiğe nüfuz etmeyin.

Şimdi, diseksiyon, cımbız ve diş kancasını kasıtlı ancak kontrollü bir kuvvetle kullanarak zayıflamış kemik flebini çıkarın. Ardından, 10 mikrolitre hücre süspansiyonlu 30 gauge Hamilton şırınga yükleyin ve iğneyi stereotaktik çerçeveye yerleştirin. Ardından fareyi stereotaktik çerçevenin üzerine yerleştirin.

İğneyi oluşturulan pencerenin orta noktasına hizalayın, bundan sonra iğneyi kortikal yüzeye değene kadar indirin. Ardından dijital koordinatları sıfırlayın. Şimdi iğneyi kortikal dokuya 3.2 milimetre indirin.

Sonra 0.2 milimetre geri çekin ve üç milimetreye enjekte edin. Derinlik enjeksiyonu dakikada 10 mikrolitre hızında yapılmalıdır. Enjeksiyon tamamlandığında, yavaşça geri çekmeden önce iğneyi bir dakika yerinde bırakın.

Ardından fareyi çerçeveden çıkarın. Daha sonra, beyin yüzeyini nemli tutun. Steril PBS damlaları kullanarak.

2,7 milimetrelik pencereyi kapatmak için beyin yüzeyine üç milimetrelik bir kapak fişi yerleştirin. Sonra çevredeki kafatası kemiğini kurutun. Ardından, kafa derisi dokusunu kafatası kemiğine yapıştırmak için veteriner bağı uygulayın ve kapak kayışını yerinde tutun.

Cam altına sızacağı ve görüntüleme potansiyelini azaltacağı için çok fazla uygulamayın. Ardından, taze diş akrilik tozunu ve solüsyonu başlıkta karıştırın ve karışımı 22 gauge iğne kullanarak veteriner bağı üzerine uygulayın. Sıkı bir sızdırmazlık sağlamak için, akriliği cam kapak kaymasının kenarı ile hafifçe örtüşecek şekilde uygulayın, ancak cam kapak kızağını kapatmayacak şekilde uygulayın.

Bu adımda, anestezi uygulanmış bir fareyi, evin tasarladığı XAD 2 25 stereotaktik ışınlayıcının içindeki özel bir kafa tutucuya yerleştirin. İki milimetrelik bir alüminyum filtreden 360 tepe kilo voltajında ve 40 miliamperde çalışan x-ışını tüpü ile 0.05 derecelik bir koni ışınlı CT taraması elde edin. Sahneyi, radyasyon ISO merkezi sağ hemisfere hedeflenecek ve dorsal ventral yönde merkezi olacak şekilde konumlandırmak için görüntüyü kullanın.

Radyasyonu hedeflemek için çok çeşitli kolimatörler mevcuttur, bu da modelin uyarlanabilirliğini gösterir. Bu durumda, yarım küre ışınlaması için sekiz milimetreye 11 milimetre kullanıyoruz. Yarım küre kolimatörünü X RAD 2 25 stereotaktik ışınlayıcıya yerleştirin.

Anatomik kemik yapılarını bularak ve monitörde sahne pozisyonunu manuel olarak ayarlayarak başın doğru konumlandırılmasını sağlamak için kolimatör aracılığıyla hem üstten hem de alttan tek BT ortogonal görüntüleri elde edin. XAD 2 25 IRRADIATOR alüminyum filtreyi 0,93 milimetre bakır arıtma filtresiyle değiştirin. Daha sonra x-ışını tüpü programını 225 tepe illa voltajında ve 13 miliamperde çalıştırın ve radyasyon dozunun yarısını üstten AP yönünde uygulayın.

Portalı alt konuma getirin ve radyasyon dozunun ikinci yarısını alttan PA yönünde uygulayın. Bu prosedürde, daha önce oluşturulmuş intrakraniyal pencere faresini uyuşturun ve pencereyi alkol spreyi kullanarak temizleyin. Konfokal mikroskop üzerindeki kanalları, oluşturulan kimerik fareye entegre edilmiş florokromlar tarafından belirlendiği şekilde ayarlayın.

Alternatif olarak, görüntüleme oturumları arasındaki değişkenliği azaltmak için önceki ayarları yeniden kullanın. Bu durumda görüntüleme için gerekli olan herhangi bir etiketi lateral kuyruk venine, damar sistemi için dekstran enjekte edin. Fareyi, kalıplanabilir hamuru ile destekleyerek özel yapım kafa tutucuya ters çevirin, kafanın lazere dik olduğundan emin olun ve kısıtlayıcıyı hareketli mikroskop aşamasına düz bir şekilde yükleyin.

İlk kanal lazerini açın ve doğrudan odanın penceresindeki lazer ışını kesişme noktasına bakarak intrakraniyal pencerenin ortasına konumlandırın. Beş x lens ile tüm pencere için her kanalın bir görüntüsünü alın ve 10 x ve 20 x uzun menzilli lenslerle diğer yüksek çözünürlüklü görüntüler için bir harita olarak kullanın. Bu şema, cerrahi işlemle ilgili teknik hataları vurgular ve her birinin üretilen görüntüler üzerindeki etkisini gösterir.

Pencerenin altında sıkışan hava, görüntülerde kabarcıklar olarak görünecektir. Cam üzerindeki akrilik birikinti, uzak kırmızı kanalda otomatik floresandır ve görüş alanının bir kısmını bloke eder. Benzer şekilde, görüntüleme sırasında camdaki kir, görüntülerde otofloresan esneme olarak ortaya çıkar.

Mükemmel kafa içi pencere bile mikroskop altına girdiğinde problemlerle karşılaşabilir. Nefes alan artefaktlar çizgili görüntülere neden olurken, farenin çerçeve üzerinde kötü konumlandırılması bölümlere ayrılmış bir görüntüye neden olur. Lazer, görüntü işleme sonrası ile dokunun sadece bir kısmını geçtiğinden, gerçek CFP sinyalini ortaya çıkarmak için GFP görüntülerinin CFP görüntülerinden çıkarılabildiği CFP etiketli hücreler için ek bir kanal eklemek mümkündür.

Ek olarak, kollajen dört lifin ikinci harmonik nesil otofloresan karakteristiğini kullanarak, damar sisteminin bazal zarını görüntüleyebiliyoruz. Beş floresan kanalının mevcudiyeti, kullanıcıya bu belgede açıklanan yeni yansıtma modelinin büyük miktarda esnekliğini ve uyarlanabilirliğini sağlar. Bu prosedürü denerken, cerrahi prosedürler sırasında kullanılan tehlikeli ürünleri akılda tutmak önemlidir.

Uzun süreli görüntüleme boyunca beyin dokusunun zarar görmemesini sağlamak için titiz olmak ve ayrıntılara özellikle dikkat etmek de önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, floresan progenitör hücrelere sahip kimerik bir farenin nasıl oluşturulacağını iyi anlamalı ve terapötik müdahale olsun ya da olmasın tümör hücresi implantasyonunu takiben intrakraniyal vaskülatür sisteminin yüksek çözünürlüklü gerçek zamanlı görüntülerini yakalayabilmelisiniz.