Pankreas Beta Hücreleri ile insülin salgılanması Etkileyen Ekstrasellüler Protein etkileşimleri kokültürü Analizi

Bu prosedürün genel amacı, spesifik transmembran proteinlerin hücre dışı alanlarını içeren hücre içi etkileşimlerin beta hücre fonksiyonunu ve daha spesifik olarak insülin sekresyonunu nasıl etkilediğini araştırmaktır. Bu, ikinci adımda ilgilenilen proteini içeren bir plazmid ile bir memeli hücre hattının ilk kesiti ile gerçekleştirilir. Bir beta hücre hattı, memeli hücreleri ile ko-kültürdür.

Son adımda, glukoz ile uyarılmış insülin sekresyonunun değerlendirilmesini sağlamak için ko-kültür farklı glukoz konsantrasyonlarına sahip besiyerlerinde inkübe edilir. Sonuç olarak, insülin radyo immünolojik testleri veya Eliza, kültürlenmiş beta hücreleri tarafından ortama salgılanan insülin seviyelerini değerlendirmek için kullanılır. Bu tekniğin, gen aşırı ekspresyonu ve knockdown gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, mRNA ve protein ekspresyonunun bozulmasını önlemesi ve potansiyel olarak beta hücre sağlığını ve/veya proteinin spesifik etkileşiminin analizlerini karıştırabilecek şekillerde işlev görmesini önlemesidir.

Hücrelerin plakanın tabanına eşit şekilde yayılmasını sağlamak için HEC 2 93 hücrelerini, oyuk başına 0,5 mililitre HEC 2 93 ortamında 24 oyuklu bir plakaya aktararak başlayın. Plakayı, kuyuda oluşan dalgaya senkronize bir hızla her seferinde bir eksen boyunca sallayın. HEC 2 93 hücreleri% 100 co-akıcılığa ulaştığında, iki mikrolitre lipo 2000'de ilgilenilen proteini kodlayan 0.8 mikrogram plazmit ile kültürleri transfekte eder.

Lipo protokolüne göre, gösterilmek üzere olan ko-kültürün genel şeması burada enzimatik olmayan bir hücre çıkarıcı kullanılarak gösterilmiştir. Bu adıma, bir T 75 kültür şişesinin altından yaklaşık %70 ila 80 akıcılıkta INS bir hücresini hasat ederek başlayın. Hücreleri oda sıcaklığında 150 Gs'de üç dakika döndürdükten sonra, peleti bir buçuk mililitre yarım INS içinde yeniden süspanse etmek için bir P 1000 pipet kullanın.

Daha sonra 10 mililitrelik bir pipet kullanarak fazladan 24 mililitre karışık ortam ekleyin ve hücreleri yeniden askıya alın, ortamı HEC 2, 9, 3 hücrelerini içeren 24 oyuklu plakanın kuyularından aspire edin. Daha sonra bir P 1000 pipet kullanarak, kuyu kenarları boyunca altıgen hücre tabakasına 500 mikrolitre INS tek hücreli süspansiyonu nazikçe ekleyin. Her altı kuyucuktan sonra, INS one hücrelerini yeniden askıya almak için 10 mililitrelik bir pipet kullanın.

Yine homojen hücre süspansiyonunu sağlamak için. Şimdi deney protokolüne bağlı olarak hücreleri 24 ila 48 saat inkübe edin. Hücreler istenen deney süresi boyunca inkübe edildikten sonra, her seferinde bir kuyucuk, ko-kültür ortamını bir elinizle aspire edin ve ortamı hemen diğer elinizle Krebs ringer bikarbonat tamponunda 250 mikrolitre 2.5 milimolar glikoz ile değiştirin.

Ko kültürleri bir saat boyunca ön inkübe ettikten sonra, düşük glikozlu KRB tamponunu 250 mikrolitre 2.5 milimolar veya 20 milimolar glikoz ile değiştirin. Bir saatlik inkübasyondan sonra, KRB tamponunu mikro füj tüplerine aktarın ve tüpler santrifüjdeyken tamponu 1500 Gs ve dört santigrat derecede beş dakika döndürün. Hemen plakaya proteaz inhibitörleri içeren 100 mikrolitre rippa hücre lizis tamponu ekleyin ve plakayı dört santigrat derecede 20 dakika inkübe edin.

Tüplerin dönmesi bittiğinde, daha sonra insülin radyo immünoassay veya Eliza ile analiz edilmek üzere 200 mikrolitre süpernatanı çıkarın. Son olarak, 10.000 g'da 15 dakika boyunca hücre lizatını aşağı çevirin ve ardından insülin radyo immünoassay veya Eliza ile analiz için 50 mikrolitre SNAT'ı çıkarın. Burada, burada NLX olarak adlandırılan bir nöro liggen izoformunu eksprese etmek üzere transfekte edilen HC2 93 hücreleri ile INS bir beta hücresinin ko-kültüründen elde edilen sonuçlar gösterilmektedir.

NLX ekspresyonu, bazal ve insülin sekresyonunu kokültürlenmiş I NS one hücreleri tarafından arttırdı. NX hücre dışı alanı, INS bir hücrenin daha fazla insülin salgılamasına neden olmak için I NS bir hücre yüzeyindeki başka bir protein veya molekül ile etkileşime girmelidir. Ko-kültür sistemini kullanan diğer analiz türlerinden elde edilen sonuçlar bu sonraki iki grafikte gösterilmektedir.

Bu ilk grafikte, NLY ile birlikte kültürlenen INS bir hücrelerinin insülin içeriğindeki artış gösterilmiştir. Bu deneyde ise RNA, hücre katmanından toplandı ve R-T-Q-P-C-R ile analiz edildi. NLY ile ko-kültür, insülin ve PDX bir mRNA seviyelerini arttırdı.

Bu prosedürü takiben, transfekte edilen proteinin hücre dışı etkileşimlerinin hücre yapısında veya gen ekspresyonunda değişikliklere neden olup olmayacağı gibi ek soruları yanıtlamak için QPCR veya kantitatif immünohistokimya gibi ek yöntemler uygulanabilir.