Name: Pankreas Beta Hücreleri ile insülin salgılanması Etkileyen Ekstrasellüler Protein etkileşimleri kokültürü Analizi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 51 s
Description: Öğrenin, ekstrasellüler protein etkileşimlerinin pankreas beta hücrelerinde insülin salgılanmasını nasıl etkilediğini. HEK293 hücreleri ile beta hücrelerinin kokültürü yöntemi, hücre sağlığını bozmadan transmembran proteinlerin işlevini incelemeyi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Sağlık hibe R01DK080971 ve Juvenil Diyabet Araştırma Vakfı hibe 37-2009-44 Ulusal Enstitüleri tarafından desteklenmiştir. Biz UCSD Pediatrik Diyabet Araştırma Merkezi (PDRC) alınan destek de teşekkür ederiz.

1. HEK293 Katman Transfeksiyon <ol><li> 50 ml FBS, 5 ml 100X Penisilin / streptomisin solüsyonu, 5 ml 100x L-glutamin solüsyonu ve 500 ul amfoterisin: DMEM 500 ml&#39;lik şişelerde (4.5 ug / ml glükoz, fenol kırmızısı ile ve glutamin olmadan) ekleyerek HEK293 hücre ortamı hazırlayın B. </li><li> De başına HEK293 medya 0.5 ml kullanarak 24 plaka HEK293 hücreleri plaka. Hücrelerin plakanın alt üzerine yayılıyor emin olun. </li><li> HEK293 hücreleri plazmid Lipofectamine protokolüne uygun olarak ilgi duyulan proteini (bir memeli ifade vektörünün içine) ve Lipofectamine 2000 2 ul kodlama 0.8 mikrogram ile% 100 birbirine karışmış, transfekte ulaşır. Biz memeli hücrelerinde ifade için tasarlanmış pcDNA 3.3 omurga kullanmak için seçtiniz. </li><li> İsteğe bağlı olarak, 6 saat inkübasyon sonrasında değişimi transfeksiyon ortamı normal HEK293 ortam ile Lipofektamin protokolde tarif edildiği. </li><li> Transfekte prote ifade değerlendirmekolarak, transfekte edilmiş doku kültürü gözenekli bir alt kümesini ifade edilen protein immunofloresans tespiti için ya da standart teknikler kullanılarak protein ekspresyonu, Western blot analizi için kullanılabilir. </li></ol> 2. HEK293 hücreleri isteğe bağlı fiksasyonu Transfekte protein ifade Transfekte HEK293 hücreleri hafifçe HEK293 hücreleri (örneğin aşağıda adım 3.9) yaşayan veya (ayrıca Tartışma) tek seferde birçok deneyler için plakaların önceden etkin hazırlık sağlamak için zararlı olabilir medyada kokültürü kolaylaştırmak için sabitlenebilir. <ol><li> HEK293 hücrelerinde protein ifade zaman ders belirlemek için pilot çalışmalar yapmak. </li><li> HEK293 hücre tabakası transfecting sonra, ifade en üst düzeyde ilişkili sonrası transfeksiyon zaman noktasında hücrelerden medya aspire. Bu ilk 24 saat içinde meydana gelirse, transfeksiyondan 24 saat sonra aspire kadar yoktur. </li><li> HE YıkamaYavaşça D-PBS ile K293 hücreleri daha sonra 500 ul% 4 paraformaldehit (PFA) ekleyin ve 30 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. (% 4 PFA çözüm yapmak için, 1X PBS içinde% 16 solüsyonu ile başlar ve 1X PBS 1:4 sulandırmak.) </li><li> Steril PBS kullanarak, yavaşça 4 ° C de PBS O / N hücreleri 3 kez yıkama ve inkübe </li><li> Hücreler steril PBS ile 3 kez yıkayın, daha sonra PBS ekleyin ve 4 bırakın ° C kadar ihtiyaç duyulan (maksimum saklama süresi ifade protein bağlı olarak değişebilir. Biz gözlenen etkileri önemli değişiklikler olmadan 2 hafta için neuroligin izoformlar ifade etmek için transfekte HEK293 hücreleri saklamak insülin salınımı üzerinde). </li></ol> 3. HEK293 Hücreler ile INS-1 Beta Hücreleri Co-kültür <ol><li> (Glikoz ve fenol kırmızı ve glutamin olmadan) 500 ml RPMI 1640 ekleyerek INS-1 ortamı hazırlayın: 50 ml FBS, 5 ml 100X Penisilin / streptomisin, 5 ml 100X L-glutamin çözeltisi, 5 ml sodyum piruvat, 500 ul amfoterisin B, 500 ul beta-merkaptoetanol (bu medi neredeyse aynıdırum tipik olarak beta-mersaptoetanol ilavesi) hariç olmak üzere birinci adacık kültürü için kullanılmıştır. </li><li> (Veya başka bir enzimatik olmayan hücre sökücü) Hücre-striptizci kullanarak, hasat INS-1 T75 kültürü şişesi altındaki kapalı confluency yaklaşık% 70-80 olarak hücreleri. Her şişe 48 kuyu için yaklaşık yeterli hücre sağlayacaktır. </li><li> INS-1 ve HEK medya bir 50/50 karışımı içinde tekrar süspansiyon 1,200 rpm&#39;de 3 dakika boyunca santrifüj hücre aşağı iplik sonra. INS-1 hücreleri, bir% 70-80 oranında konfluent şişeye, karma ortamın yaklaşık 25 ml süspansiyon haline getirin. </li><li> Yerine canlı HEK293 hücreleri daha paraformaldehid giderildi HEK293 hücreleri kullanıyorsanız,% 100 yerine karışık teknik daha INS-1 medya INS-1 hücreleri tekrar süspansiyon. </li><li> 10 ml&#39;lik bir pipet kullanarak, homojen bir hücre süspansiyonu için pelet hücreleri çıkarmak. </li><li> HEK293 hücreleri üzerinde ortamı çıkarmak için aspire. </li><li> Bir P1000 pipet kullanarak, yavaşça o kenarları boyunca HEK hücre tabakası üzerine INS-1 hücre süspansiyonu 500 ul ekleyinf iyi. Her 6 kuyu sonra, homojen bir hücre süspansiyonu sağlamak için tekrar INS-1 hücreleri tekrar süspansiyon 10 ml&#39;lik bir pipet kullanın. Kokültürü kurulum genel şeması Şekil 1 &#39;de tasvir edilmiştir. </li><li> Deneysel protokol bağlı olarak 24-48 saat boyunca inkübe hücreleri. </li><li> Fazla 48 saat kokültürü süresi gerekiyorsa, HEK293 hücreleri düzeltmek için bölüm yukarıdaki 2 isteğe bağlı adımları kullanın. </li><li> Birincil ayrışmış kemirgen ya da insan adacıklar kullanarak [örneğin vallahi 11-15 öncesinde protokolleri görmek] ise, 5 ml kalem / strep, 5 böyle RPMI gibi uygun bir ortam ml L-Glut, 0.5 ml amfoterisin-B yerine kullanılmasını sağlamak INS-1 medya. Bir çünkü potansiyel olarak gerekli adacıklar çok sayıda uygulamada, bir 24 plaka ayrışmış adacık hücreleri kullanabilirsiniz rağmen, göz bir 48 plaka (iyi başına daha az adacık hücre gerektiren) için ölçekleme aşağı verilmesi önerilir. Bir 48 plaka üzerinde, çözülme değerinde yaklaşık 100 adacık ekleyinbaşlatmak için plaka başına ted hücreleri. Ayrışma etkinliği ve kullanılan yönteme bağlı olarak, daha az sayıda adacık gerekebilir. </li></ol> 4. Glikoz insülin salgılanması Uyarılmış <ol><li> 1 saat arasında, en az KRB 2.5 mM glükoz (Krebs-Ringer bikarbonat tamponu), 250 ul hücre Preincubate. , Preincubate kokültürü orta kaldırmak ve hemen KRB ile değiştirmek için. Bu değişim ortamdaki oksijene INS-1 hücreleri etkisini en aza indirmek için, bir seferde bir tane de yapılmalıdır. Diğer düşük (2.5 mM) glukoz KRB pipetleme sırasında tek elle aspire. </li><li> 2.5 mM veya bir zamanda iyi KRB tamponu biri 20 mM glükoz ya da 250 ul inkübasyon öncesi değişimi KRB. </li><li> Belirli bir deney için uygun olduğu takdirde, örneğin 100 uM IBMX gibi ek salgı daha sağlam bir uyarılmış insülin salgılama tepkisi üretmek için ilave edilebilir. Özellikle ayrışmış birincil adacık beta hücreleri artmış glukoz konsantrasyonları Alon için kötü duyarlıE, yani IBMX veya diğer salgı burada özellikle ilave 16,17 dikkate alınmalıdır. </li><li> Inkübasyondan 1 saat sonra, ortam tüpler mikrofuge&#39;de ve 5 dakika boyunca 1500 x g&#39;de dönmeye aktarın. </li><li> Süpernatant 200 ul çıkarın ve insülin RIA veya ELISA ile analiz için kullanabilirsiniz. </li><li> Hücre lisatı hazırlamak için, (% 1.0 IGEPALCA-630 veya Nonidet P-40,% 0.5 sodyum deoksikolat,% 0.1 SDS, 50 mM Tris, pH 8.0, 150 mM NaCI), proteaz inhibitörleri için RIPA hücre parçalama tamponu 100 ul hemen 4 de medya ve inkübe kaldırarak ° C 20 dakika sonra plaka. </li><li> 10,000 x g &#39;de 15 dakika boyunca lizat Spin ve insülin RIA ve ELISA ile analiz için süpernatan 50 ul çıkarın. </li></ol>

<ol><li>Kelly, C., McClenaghan, N. H., Flatt, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+islet+structure+and+cellular+interactions+in+the+control+of+insulin+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Islets%22%5BJournal%5D)">Role of islet structure and cellular interactions in the control of insulin secretion.</a> Islets. 3, 41-47 (2011).</li>
<li>Konstantinova, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EphA-Ephrin-A-mediated+beta+cell+communication+regulates+insulin+secretion+from+pancreatic+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">EphA-Ephrin-A-mediated beta cell communication regulates insulin secretion from pancreatic islets.</a> Cell. 129, 359-370 (2007).</li>
<li>Jain, R., Lammert, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-cell+interactions+in+the+endocrine+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Obes.+Metab%22%5BJournal%5D)">Cell-cell interactions in the endocrine pancreas.</a> Diabetes Obes. Metab. 11, Suppl 4. 159-167 (2009).</li>
<li>Poitout, V., Olson, L. K., Robertson, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin-secreting+cell+lines%3A+classification%2C+characteristics+and+potential+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Metab%22%5BJournal%5D)">Insulin-secreting cell lines: classification, characteristics and potential applications.</a> Diabetes Metab. 22, 7-14 (1996).</li>
<li>Craig, A. M., Graf, E. R., Linhoff, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+build+a+central+synapse%3A+clues+from+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">How to build a central synapse: clues from cell culture.</a> Trends in Neurosciences. 29, 8-20 (2006).</li>
<li>Scheiffele, P., Fan, J., Choih, J., Fetter, R., Serafini, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroligin+expressed+in+nonneuronal+cells+triggers+presynaptic+development+in+contacting+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Neuroligin expressed in nonneuronal cells triggers presynaptic development in contacting axons.</a> Cell. 101, 657-669 (2000).</li>
<li>Abderrahmani, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+traits+are+required+for+glucose-induced+insulin+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Neuronal traits are required for glucose-induced insulin secretion.</a> FEBS Lett. 565, 133-138 (2004).</li>
<li>Lowe, A. W., Madeddu, L., Kelly, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocrine+secretory+granules+and+neuronal+synaptic+vesicles+have+three+integral+membrane+proteins+in+common%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Endocrine secretory granules and neuronal synaptic vesicles have three integral membrane proteins in common.</a> The Journal of Cell Biology. 106, 51-59 (1988).</li>
<li>Suckow, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+neurexin%2C+neuroligin%2C+and+their+cytoplasmic+binding+partners+in+the+pancreatic+beta-cells+and+the+involvement+of+neuroligin+in+insulin+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Expression of neurexin, neuroligin, and their cytoplasmic binding partners in the pancreatic beta-cells and the involvement of neuroligin in insulin secretion.</a> Endocrinology. 149, 6006-6017 (2008).</li>
<li>Suckow, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcellular+neuroligin-2+interactions+enhance+insulin+secretion+and+are+integral+to+pancreatic+beta+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Transcellular neuroligin-2 interactions enhance insulin secretion and are integral to pancreatic beta cell function.</a> The Journal of Biological Chemistry. 287, 19816-19826 (2012).</li>
<li>Kohnert, K. D., Hehmke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+suspensions+of+pancreatic+islet+cells%3A+a+comparison+of+methods%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biochem.+Biophys.+Methods%22%5BJournal%5D)">Preparation of suspensions of pancreatic islet cells: a comparison of methods.</a> J. Biochem. Biophys. Methods. 12, 81-88 (1986).</li>
<li>Qi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+pancreatic+islet+isolation%3A+Part+I%3A+digestion+and+collection+of+pancreatic+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Human pancreatic islet isolation: Part I: digestion and collection of pancreatic tissue.</a> J. Vis. Exp. (27), e1125(2009).</li>
<li>Qi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+pancreatic+islet+isolation%3A+Part+II%3A+purification+and+culture+of+human+islets%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Human pancreatic islet isolation: Part II: purification and culture of human islets.</a> J. Vis. Exp. (27), e1343(2009).</li>
<li>Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+pancreatic+islet+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Murine pancreatic islet isolation.</a> J. Vis. Exp. (7), e255(2007).</li>
<li>Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+murine+islet+isolation+and+subcapsular+kidney+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation.</a> J. Vis. Exp. (50), e2096(2011).</li>
<li>Hauge-Evans, A. C., Squires, P. E., Persaud, S. J., Jones, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+beta-cell-to-beta-cell+interactions+are+required+for+integrated+responses+to+nutrient+stimuli%3A+enhanced+Ca2%2B+and+insulin+secretory+responses+of+MIN6+pseudoislets%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Pancreatic beta-cell-to-beta-cell interactions are required for integrated responses to nutrient stimuli: enhanced Ca2+ and insulin secretory responses of MIN6 pseudoislets.</a> Diabetes. 48, 1402-1408 (1999).</li>
<li>Spiess, Y., Smith, M. A., Vale, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superfusion+of+dissociated+pancreatic+islet+cells+attached+to+Cytodex+beads%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Superfusion of dissociated pancreatic islet cells attached to Cytodex beads.</a> Diabetes. 31, 189-193 (1982).</li>
<li>Pham, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+gene+expression+in+HEK293+cells%3A+peptone+addition+posttransfection+improves+recombinant+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Transient gene expression in HEK293 cells: peptone addition posttransfection improves recombinant protein synthesis.</a> Biotechnol. Bioeng. 90, 332-344 (2005).</li>
<li>Thomas, P., Smart, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HEK293+cell+line%3A+a+vehicle+for+the+expression+of+recombinant+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Toxicol.+Methods%22%5BJournal%5D)">HEK293 cell line: a vehicle for the expression of recombinant proteins.</a> J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 51, 187-200 (2005).</li>
<li>Maurisse, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+transfection+of+DNA+into+primary+and+transformed+mammalian+cells+from+different+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Comparative transfection of DNA into primary and transformed mammalian cells from different lineages.</a> BMC Biotechnol. 10, 9(2010).</li>
</ol>

Biz ifşa hiçbir şey yok.

Burada açıklanan kokültürü yöntemi özel beta-hücre yüzey, transmembran proteinlerin fizyolojik önemini belirlemek için etkili bir yol sağlar, ve özel olarak ekstrasellüler etki. Hücre yüzeyi üzerinde bir ilgi protein görüntüleme HEK293 hücreleri ile temas içinde kültürlenmesi beta hücreleri ya da insülinoma hücrelerine (örneğin, burada kullanılan INS-1 hücreleri gibi) ile, deney doğrudan zarar vermeden hücre dışı protein-protein etkileşimleri etkilerini belirlemek için dizayn edilebilir hücrelerin hücre içi ortamı. Ilgi...

Burada belirli bir transmembran proteinin hücre dışı etki insülin salgılanması nasıl etkilediğini araştırmalar kolaylaştırmak için bir yöntem açıklanmaktadır. Pankreatik beta hücre yüzeyi üzerinde proteinler (veya muhtemelen diğer moleküller) ile söz konusu protein etkileşimleri gibi bir yöntem problar etkiler. Gibi bir yöntem beta hücreleri tarafından veya diğer komşu hücreler (örneğin, endotel hücreleri, nöronlar, pankreatik alfa hücreleri) ifade eden hücre yüzeyi proteinlerinin transsellüler etkileşimler (örneğin, komşu yüzeyinde etkileşim ortakları ile etkileşim yoluyla yoluyla beta hücresi fonksiyonunu etkileyebilir nasıl araştırmalar sağlar: beta hücreleri). , Hücresel plazma membranında hücre dışı ortam arasında bir köprü olarak hizmet veren yapısal ve fonksiyonel proteinlerin kompleks bir dizi içerir. Transsellüler bağlantı oluşumu ile ya da plastik sinyal olaylarını başlatılarak, hücre yüzeyi proteinleri arasındaki etkileşimi koordine yardımcı olabilirKomşu hücrelerin fonksiyonu. Pankreas beta hücreleri pankreas adacık içinde bir araya kümelenmiş ve glikoz dengesini 1 korumak için koordineli bir şekilde hareket edilir. Hücre dışı epha-ephrinA ve glikoz ile uyarılan insülin salgılanmasının düzenlenmesinde neuroligin-2 etkileşimlerinin önemi, örneğin, ortaya çıkardı, bu daha da açık hale gelmektedir, bitişik yüzeyleri üzerinde proteinler arasında meydana gelen hücre dışı etkileşimler artan bilgi beta hücreleri insülin salgılanması, beta hücre fonksiyonel olgunlaşması ve 1-3 glikoz dengesinin bakım tam bir anlayış kazanmak için büyük önem taşıyacaktır. Burada açıklanan yöntemin amacı, belirli bir transmembran veya başka şekilde-hücre yüzeyi ile ilişkili proteinler içeren transsellüler etkileşimleri beta hücre fonksiyonu üzerindeki etkileri araştırmalar sağlamaktır. Farklı ifade yapıları ile transfekte HEK293 hücreleri, B üzerindeki etkileri ile birlikte-kültür beta hücreleri tarafındanFarklı hücre yüzey proteinleri ya da mutasyona uğramış varyantları eta hücre fonksiyonu bunların etkin bir şekilde araştırılabilir. Bu beta hücreleri transfekte etmek için kendilerini kalmadan gerçekleştirilir. Kültür beta hücreleri veya in vivo olarak demonte, knockout ya da aşırı çalışmalarla özellikle transsellüler etkileşimlerinin rol izahı potansiyel analizi etkilemesi için değişik şekillerde beta hücre sağlık ve / veya fonksiyonunu etkileyen, beta hücresi mRNA ve protein ekspresyonu, doğrudan pertürbasyon gerektiren özel hücre dışı etkileşim etkileri. Bu, aynı zamanda, hedeflenen proteinlerin hücre içi etki düzeyleri değiştirmek ve daha fazla, transsellüler etkileşimlerin etkileri ayırt edilmesi ya da aynı hücrede protein arasındaki etkileşimlere bağlı etkileri izin vermez yaklaşır. Burada, beta-hücrelerinin insülin salgılayan kapasitesi ve yanıt belirli transsellüler etkileşimlerin etkilerini belirlemek için bir yöntem olup DescriIBED. Bu yöntem, INS-1 hücreleri, 4 gibi insülin salgılayan beta-hücre hatları, ve ayrışmış primer veya kemirgen, insan beta hücreleri için de geçerlidir. Bu HEK293 (veya COS) hücre katmanları ifade belirli nöronal proteinlere kültürlü nöronların maruz kalma bulundu neurobiologists, tarafından geliştirilen kokültürü modelleri dayandığını sürücü sinaps oluşumu 5,6 proteinleri tespit olabilir. Nöronal sinaps salgı makine arasında ve beta hücrelerinin paralellikler göz önüne alındığında, beta-hücre fonksiyonu ve fonksiyonel olgunlaşma benzer transsellüler etkileşimleri 7-9 ile tahrik olabilir gerekçeli. Bu etkileşimler prob amacıyla, beta hücreleri ilgi 10 bir protein ifade eden HEK293 hücreleri bir tabaka üzerinde kültüre edildiği tarifnamede açıklanan sistem geliştirilmiştir. Bu sistem, hücre-dışı protein-protein etkileşimleri manipüle edilir ise, beta hücre sitoplazması bakir kalmasını sağlar.

<table><tbody><tr><td>pcDNA 3.3 vektör/omurga</td><td>Invitrogen</td><td>K830001</td><td></td></tr><tr><td>Lipofektamin 2000</td><td>Invitrogen</td><td>18324012</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Mediatech</td><td>45001-312</td><td></td></tr><tr><td>Kalem/strep çözümü</td><td>Mediatech</td><td>45001-652-1</td><td></td></tr><tr><td>Amfoterisin B</td><td>Mediatech</td><td>45001-808-1/30</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Mediatech</td><td>45001-404</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS</td><td>Mediatech</td><td>45001-434</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Piruvat</td><td>Mediatech</td><td>45001-710-1</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercapt&#8211; thanol</td><td>Invitrogen</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>Hücre sıyırıcı</td><td>Mediatech</td><td>45000-668</td><td></td></tr><tr><td>T75 Şişesi</td><td>BD</td><td>1368065</td><td></td></tr><tr><td>%16 Paraformaldehit</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>50980487</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Mediatech</td><td>45001-130</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu</td><td>Mediatech</td><td>MT35010CV</td><td></td></tr><tr><td>IBMX</td><td>Sigma</td><td>I5879-100MG</td><td></td></tr><tr><td>RIPA lizis tamponu</td><td>Sigma</td><td>R0278</td><td></td></tr></tbody></table>

pankreas beta hücreleri ile insülin salgılanması etkileyen ekstrasellüler protein etkileşimleri kokültürü analizi

Coculture Analysis of Extracellular Protein Interactions Affecting Insulin Secretion by Pancreatic Beta Cells

Hücre yüzey proteinleri arasındaki etkileşim, komşu hücrelerin fonksiyonu koordine yardımcı olur. Pankreas beta hücreleri pankreas adacık içinde bir araya kümelenmiş ve glikoz dengesini korumak için koordineli bir şekilde hareket edilir. Bu komşu beta hücrelerinin yüzeylerinde transmembran proteinler arasındaki etkileşimleri beta-hücre fonksiyonu önemli belirleyicileri olduğu giderek daha açık hale gelmektedir. Kültür beta hücreleri veya in vivo olarak demonte, knockout ya da aşırı çalışmalarla özellikle transsellüler etkileşimlerinin rol izahı potansiyel etkileri analiz karıştırabileceklerinden edemeyeceği şekilde beta hücresi, sağlık ve / veya fonksiyonunu etkileyen, mRNA ve protein ekspresyonu, doğrudan pertürbasyon gerektiren spesifik etkileşimler. Bu yaklaşım, aynı zamanda hedef proteinlerin hücre içi etki düzeyleri değiştirebilir ve dis olmak için aynı hücre zarı içindeki proteinler arasındaki etkileşimlere bağlı etkileri önleyebilirtranssellüler etkileşimlerin etkileri bir biçimde ayrılır. Burada beta hücrelerinin insülin salgılayan kapasitesi ve yanıt belirli transsellüler etkileşimlerin etkilerini belirlemek için bir yöntem sunulmuştur. Bu yöntem, INS-1 hücreleri gibi beta-hücre hatları, ve ayrışmış primer beta hücreleri için de geçerlidir. Bu HEK293 (veya COS) sinaps oluşumu sürüş için önemli hücre tabakaları tespit proteinler üzerinde ifade belirli nöronal proteinlere kültürlü nöronların maruz kalma bulundu neurobiologists, tarafından geliştirilen kokültürü modelleri dayanmaktadır. Nöronal sinapsların ve beta hücrelerinin salgı makine arasındaki paralellikler göz önüne alındığında, beta-hücre olgunlaşması benzer transsellüler etkileşimleri ile tahrik olabilir gerekçeli. Biz beta hücreleri ilgi bir protein ifade eden HEK293 hücreleri bir tabaka üzerinde kültive edildiğinde, bir sistem geliştirilmiştir. Bu modelde, beta hücre sitoplazması dokunulmamış bir hücre dışı protein-protein ETKİLEŞİM ikenns manipüle. Öncelikle glikoz ile uyarılan insülin sekresyonunda çalışmalar burada odak rağmen, diğer işlemler analiz edilebilir, örneğin, gen ekspresyonunda değişmeler gibi immünolojik veya QPCR tarafından belirlenir.

Burada açıklanan yöntem kullanılarak, insülin salgılanması üzerindeki protein neuroligin farklı türevleri etkisini test ettik. Bu beta hücresi işlevi, 10 neuroligin-2 etkisini araştıran eden yayımlanmış çalışma tamamlar. Şekil 2, örneğin, burada adlandırılan bir neuroligin izoformu ifade etmek için transfekte HEK293 hücreleri ile birlikte coculturing INS-1 beta hücrelerinden elde edilen sonuçları göstermektedir NL- X Bu deney NL-X insülin salgısını artırdığı transsellüler etkileşimleri yürütm...

Transsellüler protein etkileşimleri pankreatik beta hücre fonksiyonu önemli belirleyicidir. Burada ayrıntılı bir yöntem uyarlanmış özel transmembran proteinler insülin salgılanmasını nasıl etkilediğini araştıran sinaptogenez-için bir kokültürü model. Transfekte edilmiş HEK293 hücreleri ilgili proteinlerin ifade eder; beta hücreleri transfekte edilmiş veya başka şekilde doğrudan tedirgin gerekmez.

Pankreas Beta Hücreleri ile insülin salgılanması Etkileyen Ekstrasellüler Protein etkileşimleri kokültürü Analizi

Interactions between cell-surface proteins help coordinate the function of neighboring cells. Pancreatic beta cells are clustered together within ...

Bu prosedürün genel amacı, spesifik transmembran proteinlerin hücre dışı alanlarını içeren transhücresel etkileşimlerin beta hücre fonksiyonunu ve daha spesifik olarak insülin salınımını nasıl etkilediğini araştırmaktır. Bu işlem, ilk olarak bir memeli hücre hattının ilgilenilen proteini içeren bir plazmid ile transfekte edilmesiyle ve ikinci adımda bir beta hücre hattının memeli hücrelerle birlikte kültürlenmesiyle gerçekleştirilir.Son adımda, glikozla stimüle edilmiş insülin sekresyonunun değerlendirilmesine olanak sağlamak amacıyla ko-kültür, farklı glikoz konsantrasyonlarına sahip besiyerlerinde inkübe edilir. Nihayetinde, kültürlenen beta hücreleri tarafından besiyerine sekrete edilen insülin seviyelerini değerlendirmek için insülin radyo immünosayımı veya ELISA kullanılır. Bu tekniğin gen aşırı ekspresyonu ve nakavt gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, beta hücresi sağlığını ve/veya fonksiyonunu potansiyel olarak etkileyebilecek ve proteinin spesifik etkileşim analizlerini karmaşıklaştırabilecek mRNA ve protein ekspresyonu bozulmalarından kaçınmasıdır.Hücrelerin plakanın tabanına eşit şekilde yayılmasını sağlamak için, HEC 2 93 hücrelerini kuyu başına 0.5 milliliters HEC 2 93 medyum ile bir 24 kuyucuklu plakaya aktararak başlayın. Plakayı, kuyucukta oluşan dalga ile senkronize bir hızda, her seferinde tek bir eksen boyunca sallayın. HEC 2 93 hücreleri %100 konfluens düzeyine ulaştığında, kültürleri iki microliters lipo 2000 içinde çözünmüş, ilgilenilen proteini kodlayan plazmidin 0.8 micrograms miktarıyla transfekte edin.Lipo protokolüne göre, birazdan gösterilecek olan ko-kültürün genel şeması, enzimatik olmayan bir hücre ayırıcı kullanılarak burada tasvir edilmiştir. Bu adıma, INS one hücrelerini T 75 kültür flaskının tabanından yaklaşık %70 ila %80 konfluens seviyesindeyken hasat ederek başlayın. Hücreleri oda sıcaklığında 150 Gs hızda üç dakika boyunca santrifüjledikten sonra, peleti bir mililitre yarı INS one ve yarı oranında resüspande etmek için bir P 1000 pipet kullanın.Ardından, ek 24 mililitre karışık medya eklemek ve hücreleri yeniden süspande etmek için 10 mililitrelik bir pipet kullanın; HEC 2 9 3 hücrelerini içeren 24 kuyucuklu plakanın kuyucuklarındaki medyayı aspire edin. Daha sonra, P 1000 pipet kullanarak, INS 1 hücre süspansiyonunun 500 mikrolitresini kuyucuğun kenarları boyunca HEC hücre tabakasının üzerine nazikçe ekleyin. Her altı kuyucukta bir, INS 1 hücrelerini yeniden süspande etmek için 10 mililitrelik bir pipet kullanın.Homojen bir hücre süspansiyonu sağlamak için tekrar karıştırın. Şimdi, deneysel protokole bağlı olarak hücreleri 24 ila 48 saat boyunca inkübe edin. Hücreler istenen deneysel süre boyunca inkübe edildikten sonra, her seferinde bir kuyucuk olacak şekilde, bir elinizle ko-kültür ortamını aspire edin ve diğer elinizle ortamı derhal 250 µL 2.5 mM glukoz içeren Krebs ringer bikarbonat tamponu ile değiştirin.Ko-kültürler bir saat boyunca ön inkübasyona tabi tutulduktan sonra, düşük glukozlu KRB tamponunu 250 µL 2,5 mM veya 20 mM glukoz ile değiştirin. Bir saatlik başka bir inkübasyonun ardından, KRB tamponunu mikrosantrifüj tüplerine aktarın ve tüpler santrifüjdeyken tamponu 1500 Gs ve 4 °C'de beş dakika boyunca çöktürün. Hemen ardından plakaya proteaz inhibitörleri içeren 100 µL RIPA hücre liziz tamponu ekleyin ve plağı 4 °C'de 20 dakika boyunca inkübe edin.Tüplerin santrifüj işlemi tamamlandığında, daha sonra insülin radyo immünassay veya Eliza ile analiz edilmek üzere süpernatandan 200 microliters alın. Son olarak, şu an hücre lizatı olan örneği 10, 000 gs hızında 15 dakika boyunca santrifüjleyin ve ardından insülin radyo immünassay veya Eliza ile analiz için SNAT'tan 50 microliters alın. Burada, burada NLX olarak adlandırılan bir nöroligin izoformunu eksprese etmek üzere transfekte edilmiş HC 2 93 hücreleri ile INS one beta hücrelerinin ko-kültüründen elde edilen sonuçlar gösterilmektedir.NLX ekspresyonu, birlikte kültürlenen INS-1 hücrelerinin bazal ve stimüle edilmiş insülin sekresyonunu artırmıştır. INS-1 hücrelerinin daha fazla insülin salgılamasına neden olmak için NLX hücre dışı alanının, INS-1 hücresinin yüzeyindeki başka bir protein veya molekül ile etkileşime girmesi gerekmektedir. Birlikte kültür sisteminin kullanıldığı diğer analiz türlerinden elde edilen sonuçlar sonraki iki grafikte gösterilmiştir.Bu ilk grafikte, NLY ile birlikte kültürlenen INS1 hücrelerinin insülin içeriğindeki artış gösterilmektedir. Bu deneyde, hücre tabakasından RNA elde edilmiş ve R-T-Q-P-C-R ile analiz edilmiştir. NLY ile birlikte kültürleme, insülin ve PDX1 mRNA seviyelerini artırmıştır.Bu prosedürün ardından, transfekte edilen proteinin hücre dışı etkileşimlerinin hücre yapısında veya gen ifadesinde değişikliklere yol açıp açmadığı gibi ek soruları yanıtlamak için QPCR veya kantitatif immünohistokimya gibi ek yöntemler uygulanabilir.

coculture-analysis-extracellular-protein-interactions-affecting

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Çalışmada insan embriyonik kök hücreleri pankreas farklılaşma uyarması yönlendirilmiş bir farklılaşma yaklaşım anlatılmaktadır. Büyük önem insülin salgılayan hücrelerin içine pankreas ataları edilen insan embriyonik kök hücre bulma olduğu endotel hücre ko-kültür aracılık olgunlasmasi.

İnsan Embriyonik endotel hücre Co-kültür aracılık Olgunlaşma Bir Yönetmen Farklılaşma Yaklaşım Pankreas insülin üreten hücreler için Kök Hücre

Langerhans adacıkları izole edilmiş fare kullanılarak in vitro β-hücre fonksiyonu denenmesi diyabet patofizyolojisi ve terapötik çalışmada önemli bir bileşenidir. Çok sayıda alt-uygulama mevcut olmakla birlikte, bu protokol, spesifik olarak β-hücresi fonksiyonunu belirleyen önemli bir parametre olarak hücre içi siklik adenozin monofosfat (cAMP) ölçümünü açıklamaktadır.

Fare Pankreas Adacık İzolasyonu ve hücre içi cAMP Belirlenmesi için Bir Yöntem

diyabet araştırma alanı için kritik zorluklar adacık β-hücre çoğalmasını düzenleyen ve β-hücre yenilenmesini teşvik etmek için yöntemler geliştirmek moleküler mekanizmalarını anlamak için vardır. Burada yüksek içeriği tarama yöntemi belirlemek ve küçük moleküllerin β-hücresi replikasyon teşvik aktivitesi sunulmuştur değerlendirmek.

Bir Yüksek içerik<em&gt; İn Vitro</em&gt; Pankreas Adacık β-hücre çoğaltma Keşif Platformu

Beta-hücre işlevselliği tek hücreli çözünürlükte kalsiyum akını için genetik olarak kodlanmış bir muhabir kullanarak değerlendirilir kan şekeri homeostazı için önemlidir.

Zebra balığı adacıkları tek hücreli çözünürlük kalsiyum Imaging'i kullanma Beta hücre fonksiyonu Analizi

Ex vivo pankreas adacık çalışmalar diyabet araştırma için önemlidir. Onların yerli 3 boyutlu mimari kültürlü adacıkları çalışmaya varolan zaman alıcı, verimsiz ve az kullanılan tekniklerdir. Bu eser bütün kültürlü adacıkları yüksek kalitede parafin bölümleri oluşturmak için yeni, basit ve etkili bir yöntem açıklanır.

Pankreas adacık parafin kesitler için katıştırma

Bu protokol, özellikle primer insan Islet örneklerinden Beta hücrelerinde mitofagoy protein kompleksi oluşumunun nicel analizi için bir yöntem özetliyor. Bu teknik, değerli insan pankreatik beta hücre örneklerinde önemli olan sınırlı biyolojik materyalden mitophaginin analizini sağlar.

Yakınlık ligasyon assay kullanarak ınsan pankreatik Beta hücrelerinde situ Içinde endojen Mitophagy kompleksleri görselleştirme

Bu protokol, bir insülin bağlantılı gaussia Lusiferaz ile Beta hücrelerinden insülin salgılanması için bir vekil olarak orta verim ile hızlı düşük maliyetli Lusiferaz nasıl gerçekleştirileceğini açıklar. Tahlil en lüminesans plaka okuyucular ve çok kanallı pipetler ile gerçekleştirilebilir.

Bir Co-salgılanmış luciferase Surrogate kullanarak bağıl Insülin salgılanmasını ölçme

Bu protokol, bir siklik adenozin monofosfat (cAMP) biyosensörünün, bir cAMP fark detektörünün in situ (cADDis) ve bir mikroperifüzyon sisteminin adenoviral iletimini kullanarak hücre içi sinyal olaylarının senkron edinimi ve birlikte kaydı ve birincil insan psödoisletleri tarafından insülin ve glukagon salgılanması için bir yöntemi açıklar.

Floresan Biyosensör Dinamiğinin ve Hormon Salgı Profillerinin Senkron Değerlendirmesi için İnsan Psödoislet Sistemi

Bu çalışma, pankreas adacıklarında sitokin kaynaklı apoptozu ve β hücreye özgü ölümü değerlendirmek için konfokal mikroskopi ile birlikte hücre ölümü ve apoptozun çok boyamalı floresan bazlı belirteçlerini kullanmaktadır. Hücre dışı uyaranlara yanıt olarak hücre ölümü ve apoptozdaki mekansal ve zamansal değişiklikleri ortaya çıkarır.

İzole Pankreas Adacık Tedavisi ve Apoptoz Ölçümü

Bu çalışma, fare pankreasındaki fonksiyonel birincil adacıqları ve asinar hücreleri verimli bir şekilde çıkaran basitleştirilmiş bir yöntem geliştirdi ve Akut Pankreatit Kaynaklı Diyabetin patogenezinde hücrelerarası iletişimi incelemek için değerli bir araç sağladı.

Farelerden Birincil Adaçik Ve Birincil Pankreas Asinar Hücrelerinin Eşzamanlı İzolasyonu İçin Basit ve Hızlı Bir Yöntem

Öğrenin, ekstrasellüler protein etkileşimlerinin pankreas beta hücrelerinde insülin salgılanmasını nasıl etkilediğini. HEK293 hücreleri ile beta hücrelerinin kokültürü yöntemi, hücre sağlığını bozmadan transmembran proteinlerin işlevini incelemeyi sağlar.

Pankreas Beta Hücreleri ile insülin salgılanması Etkileyen Ekstrasellüler Protein etkileşimleri kokültürü Analizi

Daha fazla video keşfet