Name: Kanal Hücreleri Toplama kültür İlköğretim Rat İç Medüller (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 11 s
Description: Öğrenin, sıçan iç medüller toplayıcı kanal hücrelerini izole etme ve kültürleme yöntemini. Arjinin-vazopressin aracılı su geri emiliminin moleküler mekanizmalarını incelemek için bu protokol kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Deutsche Forschungsgemeinschaft (; KL 1415/3-2 ve KL 1415/4-2 DFG) tarafından desteklenmiştir.

1. Hazırlık <ol><li> Kültür kaplarına hazırlanması <ol><li> Çözülme Kollajen Tip 4 de IV O / N ° C ve% 0.1 steril asetik asit içinde çözülür. Kullanmak için ses hücreleri numaralı seribaşı için olduğu yemekler türüne ve sayısına bağlıdır. 2 mg / cm 2 kullanın. </li><li> En az 1 saat oda sıcaklığında inkübe edin ve yemekler için damıtılmış su (A tridest) ile iki kez yıkanır. </li><li> Yemekler düzgün kurumasını bekleyin. </li></ol></li><li> Ortam takviyesi <ol><li> 500 ml orta 1.75 g glukoz ekleyerek kadar 4,5 g / L glikoz düzeyini artırmak. Orta 600 mOsmol ayarlamak için, sırasıyla, 200 ve 100 mOsmol mOsmol tarafından ozmolarite geliştirmek için, 100 mM NaCl ve 100 mM üre ekleyin. </li><li> 600 mOsmol DMEM ortamı,% 1 esansiyel olmayan amino asitler,% 1 ultroser, 500 uM DBcAMP, 20 U / ml nistatin ve 0.25 ug / ml gentamisin (50 ug / ml &#39;lik bir konsantrasyon ile stok solüsyonu 1:200 seyreltme) ekleyin taze hazırlama gününde. </li></ol></li&gt; <li> Enzim çözeltisi <ol><li> 1 mg / ml hiyaluronidaz ile 2.2 mg / ml kollajenaz ekleyin DPBS içeren 0.25 mg / ml gentamisin ve nistatin. 2 böbrek iç medullae parçalamak için bu enzim çözeltisi, 1 ml hazırlayın. Çözelti süzme ile sterilize edilmesi gerekir ve 50 ml Falcon tüpleri içinde depolanır. </li></ol></li></ol> 2. İlköğretim Rat İç Medüller yetiştirme Kanal (IMCD) Hücreleri Toplama Tüm hayvan inceleme işlemleri, yerel ve federal mevzuata uygun olarak yapılacak olan. <ol><li> CO 2 fareler (CO 2 ile doymuş bir kutu içinde) veya izofluran (; 2-2.5% izofluran ile hava akışı 350-400 ml / dk U-400 Anestezi ünitesi, Univentor Ltd, Malta) uyuşturan. Beyazımsı iç ve koyu dış medulla arasındaki sınırın tam tespiti izin kanama için hayvan başını kesmek. Buna ek olarak, kanama izole eritrositlerin sayısını en aza indirir. Böbrekler çıkarın vebuz üzerinde gentamisin ve nystatin (yukarıya bakınız) ile desteklenmiş steril DPBS yıkayın. Bütün adımları steril temiz tezgah koşullar altında yapılacak olan. </li><li> Aşırı sıvı kaldırmak için steril bir kompres üzerine DPBS çözüm böbrek aktarın. Steril forseps ve makas ile yağ böbrek kapsülü çıkarın. </li><li> Böbrek hala kompres sabit dış (kortikal) tarafının uzunlamasına ekseni yanında biraz kesilmiş olması. Tamamen kesmek için, ancak renal pelvis bağlı, tek parça halinde bırakmak değil emin olun. </li><li> Kavisli makas ile dikkatli bir şekilde gül parıltılı dış medulla ile çevrilidir beyazımsı iç medullae, incelemek. Buz üzerinde bir 60 mm kültür çanak gentamisin ve nistatin içeren, DPBS onları toplamak. </li><li> Tüm medullae izole ve buz üzerinde toplanan sonra, sadece tampon ile kaplıdır bir seviyeye DPBS hacmini azaltmak. 5 küpler halinde medullae kesmek için steril bir jilet kullanınmm 3. </li><li> Bir ateşe kısa bir süre tutarak eritin ve steril Pasteur pipet keskin ucunu yuvarlak. Pipet devam etmeden önce soğutulur emin olun. </li><li> Yuvarlak Pasteur pipeti kullanılarak hiyaluronidaz ve kolajenaz (1.3.1) taze olarak hazırlanmış steril bir enzim çözeltisi içeren 50 ml Falcon tüplerine doku süspansiyonu aktarın. Sıkıca kapağını kapatın ve 37 ° C 1.5 için düzenli bir masa su banyosunda sürekli ajitasyon (220 rpm) altında inkübe - 2 saat. </li><li> Süspansiyon ezilerek için, homojen bir süspansiyon bulanık hale gelene kadar yuvarlak Pasteur pipeti (yukarıya bakın) ile bir kaç kez aşağı karışımı pipet ve. </li><li> 300 xg&#39;de 5 dakika ve 16 ° C için süspansiyon santrifüj Süpernatantı atın, pelet tekrar gentamisin ve nystatin ve santrifüj içeren, DPBS iyice tekrar süspansiyon. Bir kez bu yıkama adımı yineleyin. </li><li> Tam takviye orta ve c içine tohum onları hücrelerin tekrar süspansiyonulture yemekler ve / veya mikro-titre iyi plakaları. 2 medullae (1 hayvan) hazırlanması biri 60 mm kültür çanak için yeterli hücreleri verecektir. </li><li> 24 saat sonra, 600 mOsmol DMEM ile iki kez yıkama ve hücreler taze ortam ilave edin. Bir sonraki haftada 2-3 kez hücreleri (Şekil 1) yıkanmalıdır. 6-8 gün sonra tohumlama, IMCD hücre deneyleri için de kullanılabilir. Deney başlamadan önce 24 saat DBcAMP ve nystatin olmadan ortamda bunları tasarlamak unutmayın. Aksi takdirde AQP2 plazma zarında sadece yer alacaktır. </li></ol>

<ol><li>Stoos, B. A., Naray-Fejes-Toth, A., Carretero, O. A., Ito, S., Fejes-Toth, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+mouse+cortical+collecting+duct+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Characterization of a mouse cortical collecting duct cell line.</a> Kidney International. 39, 1168-1175 (1991).</li>
<li>Graham, F. L., Smiley, J., Russell, W. C., Nairn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+a+human+cell+line+transformed+by+DNA+from+human+adenovirus+type+5%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+general+virology%22%5BJournal%5D)">Characteristics of a human cell line transformed by DNA from human adenovirus type 5.</a> The Journal of general virology. 36, 59-74 (1977).</li>
<li>Gluzman, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SV40-transformed+simian+cells+support+the+replication+of+early+SV40+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SV40-transformed simian cells support the replication of early SV40 mutants.</a> Cell. 23, 175-182 (1981).</li>
<li>Ala, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+studies+of+twelve+mutant+V2+vasopressin+receptors+related+to+nephrogenic+diabetes+insipidus%3A+molecular+basis+of+a+mild+clinical+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%3A+JASN%22%5BJournal%5D)">Functional studies of twelve mutant V2 vasopressin receptors related to nephrogenic diabetes insipidus: molecular basis of a mild clinical phenotype.</a> Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 9, 1861-1872 (1998).</li>
<li>Richardson, J. C., Scalera, V., Simmons, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+two+strains+of+MDCK+cells+which+resemble+separate+nephron+tubule+segments%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Identification of two strains of MDCK cells which resemble separate nephron tubule segments.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 673, 26-36 (1981).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aquaporin+2+Promotes+Cell+Migration+and+Epithelial+Morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%3A+JASN%22%5BJournal%5D)">Aquaporin 2 Promotes Cell Migration and Epithelial Morphogenesis.</a> Journal of the American Society of Nephrology: JASN. , (2012).</li>
<li>Perantoni, A., Berman, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+Wilms%27+tumor+line+%28TuWi%29+and+pig+kidney+line+%28LLC-PK1%29+typical+of+normal+kidney+tubular+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22In+vitro%22%5BJournal%5D)">Properties of Wilms' tumor line (TuWi) and pig kidney line (LLC-PK1) typical of normal kidney tubular epithelium.</a> In vitro. 15, 446-454 (1979).</li>
<li>Katsura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constitutive+and+regulated+membrane+expression+of+aquaporin+1+and+aquaporin+2+water+channels+in+stably+transfected+LLC-PK1+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Constitutive and regulated membrane expression of aquaporin 1 and aquaporin 2 water channels in stably transfected LLC-PK1 epithelial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, 7212-7216 (1995).</li>
<li>Hull, R. N., Cherry, W. R., Weaver, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+and+characteristics+of+a+pig+kidney+cell+strain%2C+LLC-PK%5BTitle%5D)+AND+%22In+vitro%22%5BJournal%5D)">The origin and characteristics of a pig kidney cell strain, LLC-PK.</a> In vitro. 12, 670-677 (1976).</li>
<li>Nedvetsky, P. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reciprocal+regulation+of+aquaporin-2+abundance+and+degradation+by+protein+kinase+A+and+p38-MAP+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Reciprocal regulation of aquaporin-2 abundance and degradation by protein kinase A and p38-MAP kinase.</a> J. Am. Soc. Nephrol. 21, 1645-1656 (2010).</li>
<li>Iolascon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Two+Novel+Missense+Mutations+in+the+AQP2+Gene+Causing+Nephrogenic+Diabetes+Insipidus%5BTitle%5D)+AND+%22Nephron+Physiology%22%5BJournal%5D)">Characterization of Two Novel Missense Mutations in the AQP2 Gene Causing Nephrogenic Diabetes Insipidus.</a> Nephron Physiology. 105, p33-p41 (2007).</li>
<li>Deen, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aquaporin-2+transfection+of+Madin-Darby+canine+kidney+cells+reconstitutes+vasopressin-regulated+transcellular+osmotic+water+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%3A+JASN%22%5BJournal%5D)">Aquaporin-2 transfection of Madin-Darby canine kidney cells reconstitutes vasopressin-regulated transcellular osmotic water transport.</a> Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 8, 1493-1501 (1997).</li>
<li>Valenti, G., Frigeri, A., Ronco, P. M., D'Ettorre, C., Svelto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+functional+analysis+of+water+channels+in+a+stably+AQP2-transfected+human+collecting+duct+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Expression and functional analysis of water channels in a stably AQP2-transfected human collecting duct cell line.</a> The Journal of Biological Chemistry. 271, 24365-24370 (1996).</li>
<li>Steele, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomerase+immortalization+of+principal+cells+from+mouse+collecting+duct%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Telomerase immortalization of principal cells from mouse collecting duct.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 299, F1507-F1514 (2010).</li>
<li>Bens, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corticosteroid-dependent+sodium+transport+in+a+novel+immortalized+mouse+collecting+duct+principal+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%3A+JASN%22%5BJournal%5D)">Corticosteroid-dependent sodium transport in a novel immortalized mouse collecting duct principal cell line.</a> Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 10, 923-934 (1999).</li>
<li>Hasler, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+term+regulation+of+aquaporin-2+expression+in+vasopressin-responsive+renal+collecting+duct+principal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Long term regulation of aquaporin-2 expression in vasopressin-responsive renal collecting duct principal cells.</a> The Journal of Biological Chemistry. 277, 10379-10386 (1074).</li>
<li>Miller, R. L., Sandoval, P. C., Pisitkun, T., Knepper, M. A., Hoffert, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vasopressin+inhibits+apoptosis+in+renal+collecting+duct+cells%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Vasopressin inhibits apoptosis in renal collecting duct cells.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. , (2012).</li>
<li>Kleinman, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basement+membrane+complexes+with+biological+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Basement membrane complexes with biological activity.</a> Biochemistry. 25, 312-318 (1986).</li>
<li>Storm, R., Klussmann, E., Geelhaar, A., Rosenthal, W., Maric, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osmolality+and+solute+composition+are+strong+regulators+of+AQP2+expression+in+renal+principal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Osmolality and solute composition are strong regulators of AQP2 expression in renal principal cells.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 284, 189-198 (2003).</li>
<li>Maric, K., Oksche, A., Rosenthal, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aquaporin-2+expression+in+primary+cultured+rat+inner+medullary+collecting+duct+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Aquaporin-2 expression in primary cultured rat inner medullary collecting duct cells.</a> Am. J. Physiol. 275, 796-801 (1998).</li>
<li>Liebenhoff, U., Rosenthal, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Rab3-%2C+Rab5a-+and+synaptobrevin+II-like+proteins+in+a+preparation+of+rat+kidney+vesicles+containing+the+vasopressin-regulated+water+channel%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Identification of Rab3-, Rab5a- and synaptobrevin II-like proteins in a preparation of rat kidney vesicles containing the vasopressin-regulated water channel.</a> FEBS Lett. 365, 209-213 (1995).</li>
<li>Lorenz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+AMP+is+sufficient+for+triggering+the+exocytic+recruitment+of+aquaporin-2+in+renal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Cyclic AMP is sufficient for triggering the exocytic recruitment of aquaporin-2 in renal epithelial cells.</a> EMBO Rep. 4, 88-93 (2003).</li>
<li>Tamma, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+prostaglandin+E2+analogue+sulprostone+antagonizes+vasopressin-induced+antidiuresis+through+activation+of+Rho%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">The prostaglandin E2 analogue sulprostone antagonizes vasopressin-induced antidiuresis through activation of Rho.</a> J. Cell Sci. 116, 3285-3294 (2003).</li>
<li>Maric, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+volume+kinetics+of+adherent+epithelial+cells+measured+by+laser+scanning+reflection+microscopy%3A+determination+of+water+permeability+changes+of+renal+principal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Cell volume kinetics of adherent epithelial cells measured by laser scanning reflection microscopy: determination of water permeability changes of renal principal cells.</a> Biophys. J. 80, 1783-1790 (2001).</li>
<li>Gonzalez, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiotensin+II+stimulates+renin+in+inner+medullary+collecting+duct+cells+via+protein+kinase+C+and+independent+of+epithelial+sodium+channel+and+mineralocorticoid+receptor+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Angiotensin II stimulates renin in inner medullary collecting duct cells via protein kinase C and independent of epithelial sodium channel and mineralocorticoid receptor activity.</a> Hypertension. 57, 594-599 (2011).</li>
<li>Chou, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+aquaporin-2+trafficking+by+vasopressin+in+the+renal+collecting+duct.+Roles+of+ryanodine-sensitive+Ca2%2B+stores+and+calmodulin%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Regulation of aquaporin-2 trafficking by vasopressin in the renal collecting duct. Roles of ryanodine-sensitive Ca2+ stores and calmodulin.</a> The Journal of Biological Chemistry. 275, 36839-36846 (2000).</li>
<li>Uawithya, P., Pisitkun, T., Ruttenberg, B. E., Knepper, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+profiling+of+native+inner+medullary+collecting+duct+cells+from+rat+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Genomics%22%5BJournal%5D)">Transcriptional profiling of native inner medullary collecting duct cells from rat kidney.</a> Physiological Genomics. 32, 229-253 (2008).</li>
<li>Tchapyjnikov, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+profiling+of+nuclei+from+native+renal+inner+medullary+collecting+duct+cells+using+LC-MS%2FMS%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Genomics%22%5BJournal%5D)">Proteomic profiling of nuclei from native renal inner medullary collecting duct cells using LC-MS/MS.</a> Physiological Genomics. 40, 167-183 (2010).</li>
<li>Stefan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmentalization+of+cAMP-dependent+signaling+by+phosphodiesterase-4D+is+involved+in+the+regulation+of+vasopressin-mediated+water+reabsorption+in+renal+principal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Compartmentalization of cAMP-dependent signaling by phosphodiesterase-4D is involved in the regulation of vasopressin-mediated water reabsorption in renal principal cells.</a> J. Am. Soc. Nephrol. 18, 199-212 (2007).</li>
<li>Klussmann, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+inhibitory+role+of+Rho+in+the+vasopressin-mediated+translocation+of+aquaporin-2+into+cell+membranes+of+renal+principal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">An inhibitory role of Rho in the vasopressin-mediated translocation of aquaporin-2 into cell membranes of renal principal cells.</a> J. Biol. Chem. 276, 20451-20457 (2001).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.

Biz primer sıçan IMCD hücrelerinin hazırlanması ve kültür için ayrıntılı bir protokol mevcut. Bu yaklaşım bir sıçan 20 hücreleri 21 cm 2 kadar verir. Deney, standart hücre kültürü ekipman gerektirir ve yaklaşık 6 saat içinde, tek bir kişi tarafından yapılabilir. Dolayısıyla, bu yaklaşım, bir standart laboratuar yöntemi olarak uygundur. Primer fare IMCD hücreleri, 96 oyuklu plakalar, 60 mm yemekler arasında, farklı büyüklükte kültür tabaklarında tohumlanmış edilebilir. B...

A correction was made to <a href="http://www.jove.com/video/50366">Culturing Primary Rat Inner Medullary Collecting Duct Cells</a>. There was an error with an author's name. The author's last name had a typo and was corrected to: Enno Klussmann instead of: Enno Klussman

A correction to author list has been made for article Culturing Primary Rat Inner Medullary Collecting Duct Cells.

Erratum: Culturing Primary Rat Inner Medullary Collecting Duct Cells

Böbreğin toplayıcı ana hücrelerde, arjinin-vasopresin (AVP) su ekleme uyararak su emilimini kontrol plazma zarı içine kanal aquaporin 2 (AQP2). AVP adenilat siklaz ve böylece cAMP oluşumunu uyarıcı G-protein çiftli vazopressin tip-2 reseptörü (V2R) bağlanır. Bu sinyal akışının başlatılması protein kinaz A (PKA) aktivasyonuna yol açar. PKA plazma zarı içine hücre içi veziküllerden yeniden dağıtımı için en önemli tetikleyici olan, 256 (S256) serin de AQP2 fosforile. Membran ekleme ozmotik degrade ve ince ayar vücut su dengesinin birlikte su geri emilimini kolaylaştırır. Nedeniyle AVP salgı veya AVP-aktif sinyal nedenleri veya sapmaları AVP-aracılı su geri emiliminin bozulmasına, ciddi hastalıklar ile ilişkilidir. V2R veya AQP2 mutasyonlar neden azalma su geri emilimini bir elev ise, nefrojenik diabetes insipidus yol açarated kan plazma AVP düzeyi, kronik kalp yetmezliği ve uygunsuz antidiüretik hormon salgılanması (SIADH) en sendromu gibi kardiyovasküler hastalıklar aşırı su geri emilimini ile ilişkilidir. AVP-aracılı su geri emilimini önemi sadece hastalık kendi ima kaynaklanıyor. AQP2 taşıyan için veziküller ve plazma zarı ile füzyon AVP bağlı translokasyon şu anda iyi anlaşılmış değildir kesinlikle cAMP-bağımlı exocytic süreci temsil eder. Bir cAMP bağımlı ekzositozu için diğer örnekleri, böbrek ve H renin salınımı + mide salgı vardır. Bu nedenle renal ana hücrelerde AQP2-translokasyon düzenleyen moleküler mekanizmaların açıklanması, sadece diğer hücre tipleri içindeki moleküler süreçleri anlamak yardımcı olur, ancak, aynı zamanda AVP-aracılı su emiliminin bozuklukları ile bağlantılı hastalıkların tedavisi için yeni terapilere yol açabilecektir . Emekanizmaları kontrol AQP2 lucidating kanalı temel hücre modelleri toplama gerektirir. Bunun için farklı memeli böbrek hücre hatları bir dizi kullanılabilir. Ancak, bu modeller birkaç sakıncaya sahiptir. Birçok hücre sistemlerinde AQP2 protein düzeyi (Tablo 1; M1, HEK293, COS-7, MDCK, LLC-PK1) düşüktür 1-10, ektopik diğerleri aşın insan (MCD4, WT10) 11,12 veya sıçan (CD8) 13 AQP2. MCD4 ve COS-7 hücreleri içinde V2 reseptörü ifade değildir. Bildiğimiz kadarıyla orada böbrek iç medüller toplayıcı, AQP2 ifade en bol olan böbrek bir kısmının türetilmiştir kullanılabilir bir model olarak kalıcı bir hücre hattı, ancak kortikal toplayıcı 1,11,13-16 gelen . Bu tür hücre modelleri örnek, yaygın olarak kullanılan ölümsüzleştirdi mpkCCD (örneğin 17) veya yeni kurulan mTERT-CCD 14 hücre hatları içindir. Her iki hücre hatları ve endojen olarak ifade AQP2 V2R ancak türetilen yanakortikal toplama kanalı büyük olasılıkla kanal (IMCD) hücreleri toplamak iç medüller göre farklı bir proteom içerir. Bunlar örneğin farklı Na ifade etmelidir + taşıma sistemleri. Burada, V2R ve AQP2 endojen ifade kültürü birincil IMCD hücrelere bir protokol mevcut. Bu model, bu nedenle, böbrek toplama kanalında en yakın fizyolojik durumu temsil eder. Kültür kurulması gereğine göre sadece standart laboratuar ekipmanları vb laboratuarlar kolayca bu yaklaşım kabul edebilir.

<table><tbody><tr><td>Kollajen Tip IV Fare</td><td>BD Biosciences</td><td>356233</td><td></td></tr><tr><td>Hyaluronidaz</td><td>SIGMA</td><td>H6254</td><td></td></tr><tr><td>Kollajenaz tipi CLS-II</td><td>Biochrom AG</td><td>C2-22</td><td></td></tr><tr><td>DMEM + GlutMAX</td><td>Invitrogen GIBCO</td><td>21885108</td><td></td></tr><tr><td>Nystatin</td><td>SIGMA</td><td>N4014</td><td></td></tr><tr><td>Ultroser G</td><td>Sitojen</td><td>15950-017</td><td></td></tr><tr><td>Esansiyel olmayan amino asitler (NEA)</td><td>Biochrom AG</td><td>K0293</td><td></td></tr><tr><td>Gentamisin</td><td>Invitrogen GIBCO</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>DBcAMP</td><td>BIOLOG</td><td>D009</td><td></td></tr></tbody></table>

kanal hücreleri toplama kültür İlköğretim rat İç medüller

Culturing Primary Rat Inner Medullary Collecting Duct Cells

Arginin-vazopressin (AVP) böbrek kanalı temel hücre toplanması ve böylece ince ayar vücut su dengesi suyun geri emilimini kolaylaştırır. AVP, hücrelerin yüzeyi üzerinde vasopresin V2 alıcıları (V2R) ile bağlanır ve böylece, cAMP sentezini indükler. Bu su kanalı aquaporin 2 (AQP2) fosforlaştıncı değişikliklere yol açan hücresel sinyal sürecini hızlandırır. Protein kinaz A AQP2 phoshorylates ve böylece birincil idrar su geri emilimini kolaylaştırmak plazma zarı içine hücre içi veziküllerden AQP2 en translokasyon tetikler. Asıl hücrelerde hipofiz veya AVP-aktif sinyal gelen AVP serbest sapmaları sırasıyla, merkezi ya da nefrojenik diabetes insipidus neden olabilir; yüksek bir kan plazma AVP düzeyi, kronik kalp yetmezliği ve uygunsuz antidiüretik hormon salgılanması sendromu gibi kardiyovasküler hastalıklar ile ilişkilidir. Burada, cultivati ​​için bir protokol mevcutifade V2R ve AQP2 endojen kanal (IMCD) hücreleri, toplama birincil sıçan iç medüller on. Hücreler AQP2 bölgesinin kontrolü altında yatan moleküler mekanizmaların için uygun olan ve bu nedenle AVP-aracılı su emiliminin bozulmasına ile bağlantılı hastalıkların tedavisi için yeni bir ilaç bulmak için hedefler. IMCD hücreleri sıçan böbrek iç medullae elde edilir ve altı ila sekiz gün tohumlama sonra deneyler için kullanılır. IMCD hücreleri düzenli hücre kültürü yemekleri, matara ve farklı biçimlerde mikro-titre plakalar kültür olabilir, işlem sadece birkaç saat gerektirir ve standart hücre kültürü laboratuarlar için uygundur.

Primer fare IMCD hücreleri başarılı ekimi 6-8 gün tohumlama sonra konfluent tek tabaka (Şekil 2) ile sonuçlanır. 60 mm kültür çanak başına yaklaşık 6 x 10 6 hücre vardır. Bu tip IV kolajen, bir bazal membran bileşeni 18 ile kaplanmış olduğu gibi sıkı bir şekilde hücreler, kültür tabaklarına uygun. Bu nedenle, IMCD hücreleri birkaç ayrıntılı yıkama işlemleri sırasında bile terketmez. Yukarı, kültürlenmiş hücreler,% 80, endojen V2R ve AQP2 ifade eder. AQP2 yoksun hücreler interkalate...

Arginin-vazopressin (AVP) böbrek temel hücreleri tarafından su geri emilimini kolaylaştırmak yoluyla vücudun su dengesi ince ayar kontrol eder. Burada, AVP-aracılı su geri emilimini moleküler mekanizmaları hakkında aydınlatılması için uygun toplayıcı kanal hücrelerinin primer sıçan iç medüller yetiştiriciliği için bir protokol mevcut.

Kanal Hücreleri Toplama kültür İlköğretim Rat İç Medüller

Arginine-vasopressin (AVP) facilitates water reabsorption by renal collecting duct principal cells and thereby fine-tunes body water homeostasis. AVP ...

Bu prosedürün genel amacı, VP aracılı su geri emiliminin incelenmesine uygun sıçan primer intermedüller toplama kanal hücreleri veya IMCD hücreleri üretmektir. Bu işlem, öncelikle sıçan böbreklerinin çıkarılmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, iç medullanın çevresindeki dış medulla ve korteksten izole edilmesidir.Ardından, tekil hücrelerin serbest bırakılması için iç meli yapılar enzimatik olarak sindirilir. Son adım, principal hücreleri süspanse edip seçmek ve ardından bunları kültür kaplarına ekmektir. Nihayetinde, hücre ekiminden altı ila sekiz gün sonra hücreler deneylerde kullanılmaya hazır hale gelir.Hücre kültürü sistemi, VP aracılı su geri emiliminin ve muhtemelen diğer CAP bağımlı TIC süreçlerinin altında yatan moleküler mekanizmaların aydınlatılması için uygundur. Ayrıca sistem, VP aracılı su geri emiliminin düzensizliği ile ilişkili hastalıkların tedavisi için yeni ilaç adaylarının ve ilaç hedeflerinin keşfinde kullanılabilir. Prosedür, laboratuvarımızdan bir doktora öğrencisi ve laboratuvarımız teknisyenleri Beata Eman ve Andrea Giller tarafından gösterilecektir.Buradaki zaman çizelgesi sahnesini takip ederek, kültür kaplarını kolajenle kaplayın. Tip dört, işlemin yapılacağı günden bir gün önce, önce besiyerini ve enzim çözeltilerini hazırlayın. Taze hazırlanmış DMEM besiyerine takviyeler ekleyin.Enzim çözeltisini hazırlamak için, filtreli DPBS'ye mililitre başına bir miligram hyaluronidase ve mililitre başına 2,2 miligram kollajenaz ekleyin. Çözeltiyi sterilize edin ve 50 mililitrelik bir Falcon tüpünde saklayın.Sindirilen her iki böbrek iç medullası için bir mililitre enzim çözeltisi hazırlayın. Bu protokolün en zor adımı iç medullaların diseksiyonudur. Başarıyı sağlamak için, ötanaziden sonra hayvanların kanı boşaltılır; bu işlem, iç ve dış medulla arasındaki ışıltılı sınırın tespit edilmesini kolaylaştırır.Böbrekleri çıkarın ve daha önce hazırlanan steril DPBS içerisinde saklayın. Steril koşullar altında çalışarak, Gentamicin Nystatin ile desteklenmiş DPBS çözeltisindeki böbrekleri, fazla sıvıyı uzaklaştırmak için steril bir komprese aktarın.Ardından, steril bistüri ile, böbrek kompres üzerinde sabitlenmiş haldeyken yağlı böbrek kapsülünü çıkarın. Dış veya kortikal tarafın boylamsal eksenine yakın bir kesi yapın. Tamamen kesmediğinizden, renal pelvis kısmında hala bağlantılı ve tek parça halde bıraktığınızdan emin olun.Ardından, parıltılı gül rengindeki dış medullayı ve beyazımsı iç medullayı tanımlayın. Kavisli makaslar kullanarak, iç medullayı çevreleyen dış medulladan dikkatlice ayırın. Dokuyu daha önce hazırlanan DPBS çözeltisine yerleştirin.Tüm Meli'ler izole edilip buz üzerinde toplandıktan sonra, Gentamicin ve Nystatin ile desteklenmiş DPBS çözeltisinin hacmini, Meli'lerin sadece tamponla kaplanacağı bir seviyeye indirin. Meli'leri yaklaşık beş milimetreküplük küpler halinde kesmek için steril bir jilet kullanın. Ardından, steril bir pasti pipetinin keskin ucunu kısa süreliğine aleve tutarak eritip yuvarlayın.Soğuduktan sonra, doku süspansiyonunu daha önce hazırlanmış taze steril enzim çözeltisi içeren 50 mililitrelik bir Falcon tüpüne aktarmak için bu pipeti kullanın. Tüpü bir su banyosuna yerleştirin ve sürekli ajitasyon altında 37 degrees Celsius sıcaklıkta bir buçuk ila iki saat boyunca inkübe edin.Bu sürenin ardından, süspansiyon homojen bir şekilde bulanıklaşana kadar karışımı pipetle birkaç kez yukarı aşağı çekin. Tamamen homojen hale geldikten sonra, süspansiyonu beş dakika boyunca santrifüjleyin. Ardından, süpernatanı atın.Pelleti süspanse edin ve tekrar santrifüjleyin. Bu yıkama adımını bir kez daha tekrarlayın. Hücreleri tamamen desteklenmiş besiyerinde tekrar süspanse edin ve kültür kaplarına veya mikrotiter kuyucuk plalarına ekleyin; izole edilen IMCD hücrelerinin yanı sıra eritrositler ve hücre kalıntıları, ekimden hemen sonra mikroskop altında değerlendirilebilir.Bu işlem, 24 saat sonra izole edilen hücre sayısı hakkında önceden bir fikir verecektir. Hücreleri 600 milli osmoles DMEM ile yıkayın ve taze besiyeri ekleyin. Sonraki hafta boyunca hücreler iki ila üç kez yıkanmalıdır.IMCD hücreleri, burada görüldüğü üzere konfluens düzeyine ulaştıklarında, ekimden altı ila sekiz gün sonra deneyler için hazır olmalıdır. Deneye başlamadan önce hücreleri 24 saat boyunca DBC MP ve INE içermeyen besiyerinde inkübe etmeyi unutmayın. Aksi takdirde, aquaporin two temel olarak plazma membranında yerleşecektir.Primer sıçan IMCD hücrelerinin başarılı bir şekilde kültüre edilmesi, ekimden altı ila sekiz gün sonra konfluent bir monolayer ile sonuçlanacaktır; arginine, vazopressin veya forskolin ile stimüle edildiğinde, burada görüldüğü gibi aqp iki intrasellüler veziküllerden plazma membranına transloke olur. Ek olarak, bu western blot'ta gösterildiği gibi, IMCD hücrelerinde AQP iki ekspresyonu, 30 dakikalık bir VP veya forline uygulaması üzerine artmaktadır. Bu prosedürü takiben, D-N-A-R-N-A izolasyonu, R-T-P-C-R ve İmmünpresipitasyon deneyleri gerçekleştirilir.İç toplama kanalı hücrelerinin genlerini ve gen ürünlerini analiz etmek için Western kan analizi ve immünofloresan mikroskopi uygulanabilir. Endojen proteinleri eksprese eden bu hücre kültürü sistemi, tarafsız tarama yaklaşımlarında kullanım için özellikle caziptir.

culturing-primary-rat-inner-medullary-collecting-duct-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu, yeni doğmuş sıçan yavruların üstün servikal ganglion (SCG) birincil sempatik nöronlar izole ve kültür nasıl açıklayan bir protokoldür.

Rat Üstün Servikal Ganglia (SCG) kültür Sempatik Nöronlar Protokolü

Biz kemirgen embriyolardan hipokampal ve kortikal nöronlar yalıtmak ve kültürüne hızlı bir metodoloji tanıtılmıştır. Bu protokol bize neredeyse saf nöronal kültürlerin gerekli olduğu deneyler yapmasına imkan tanıyor.

Sıçan Embriyonik Nöral Hücre İzolasyonu ve Kültür: Bir Hızlı Protokol

Bu videoda, çok çeşitli moleküler biyoloji ve hücre kültürü çalışmaları için renal tübüler epitel hücrelerini izole etme ve saflaştırma adımlarını gösteriyoruz.

Murin Renal Hücre İzolasyonu: Renal Tübüler Epitel Hücrelerinin Primer Kültürünü İzole Etmek ve Oluşturmak İçin Bir Teknik

Bu videoda, sıçan omurgasından dorsal kök gangliyon (DRG) hücrelerinin izole edilmesi ve kültürlenmesi için bir teknik gösterilmektedir. Omurgadan eksize edilen DRG'ler enzimlerle muamele edilir ve tek hücreli bir süspansiyon elde etmek için mekanik olarak ayrıştırılır. Hücreler, sırasıyla glial hücre proliferasyonunu sınırlayan ve nöronal büyümeyi destekleyen inhibitörler ve büyüme faktörleri içeren bir ortamda kültürlenir.

Bir Sıçan Omurgasından Primer Dorsal Kök Gangliyon Hücre Kültürü Oluşturulması

Bu iletişim kuralı yalıtım, kültür ve kalsifikasyon sıçan kaynaklı Vana interstisyel hücrelerin son derece fizyolojik vitro manken kireçlenmeler aort kapak hastalığı (CAVD) açıklanmaktadır. Bu fare modeli sömürü CAVD araştırma hücre ve moleküler mekanizmaları bu karmaşık patolojik süreç altında yatan Exploring kolaylaştırır.

Birincil fare malzemelerin yalıtım ve Vana interstisyel hücreleri: Aort Kapak kalsifikasyon eğitim için yeni bir Model

Bu iletişim kuralı yalıtmak ve daha sonra böbrek biyolojik fonksiyonları ex vivomitokondriyal bioenergetics de dahil olmak üzere, değerlendirmek için alt kültürlü fare birincil renal tübüler hücreler karakterize için düşük maliyetli bir yaklaşım sağlar.

Yalıtım, karakterizasyonu ve yüksek işlem hacmi ekstraselüler akı analiz fare birincil Renal tübüler epitel hücresi

Adrenal korteks tarafından salgılanan hormon stres ve hastalıklara karşı hayvanlar için hayati önem taşımaktadır. Burada, adrenal hücreler kültür birincil fare için bir iletişim kuralı mevcut. Adrenal steroidogenesis ve lipit sentezi ilgi reaktif mekanizmalarının araştırılması için iyi bir tüp bebek platform olabilir.

Sıçan Adrenokortikal hücreleri ve deneyleri Steroidogenic fonksiyonların birincil kültür

Bu protokol, birincil nöronlar için tekrarlanabilir bir protokol oluşturmaya ve daha fazla hücresel deney için sıçan mesanesinden glia izolasyonu oluşturmaya çalışır.

Yetişkin Sıçan İdrar Kesesinden Primer Nöronların ve Gliaların İzolasyonu ve Kültürü

Bu yazı, embriyonik sıçan sempatik nöronların superior servikal gangliyondan izole ve kültürlenmesini açıklamaktadır. Ayrıca immünositokimyasal boyama ve kütle spektrometrik analizi için nöronal özler hazırlamak için ayrıntılı protokoller sağlar.

Morfolojik ve Proteomik Analiz için Embriyonik Superior Servikal Ganglia'dan Sıçan Sempatik Nöronlarının Culturing

Bu makale, neonatal Sprague-Dawley (SD) sıçanlarından primer retinal Müller hücrelerinin izole edilmesi için ayrıntılı bir protokol sunmaktadır. Prosedür, göz kürelerinin enükleasyonunu, retina dokusunun diseksiyonunu, hücrelerin çıkarılmasını ve tanımlanmasını ve sonraki hücre kültürü için temel hususları içerir.

Sprague-Dawley (SD) Sıçanlarından Primer Retinal Müller Hücrelerinin İzolasyonu ve Kültürü

Öğrenin, sıçan iç medüller toplayıcı kanal hücrelerini izole etme ve kültürleme yöntemini. Arjinin-vazopressin aracılı su geri emiliminin moleküler mekanizmalarını incelemek için bu protokol kullanılır.

Kanal Hücreleri Toplama kültür İlköğretim Rat İç Medüller

Daha fazla video keşfet