Kültür Hücreler Kanser ile ilişkili Sinyal İletimi sorgulanması için bir Multiplexed Lusiferaz tabanlı Tarama Platformu

Aşağıdaki protokolün genel amacı, birden fazla hücresel okumayı aynı anda izleyerek gen fonksiyonunun genom ölçeğinde sorgulanmasını sağlamaktır. Bu gösterimde, sırasıyla P 53 WINT ve KRAS yolak aktivitelerini izlemek için Firefly RAN ve Cipro Dina Luciferase tabanlı raporlayıcılar kullanılmıştır. Bu üç raporlayıcı, ilgilenilen bir geni hedefleyen irna ile birlikte bir kolorektal kanser hücre hattı olan HCT one 16 hücrelerine birlikte transfekte edilmiştir.

Ardından, hücre lizatlarında ateş böceği ve vanilya lusiferaz aktiviteleri, Cipro DEA lusiferaz aktivitesi ise salgılanan bir enzim olduğu için kültür ortamında ölçülür. Deney sisteminin tekrarlanabilirliğinin yanı sıra, bu üç kanserle ilgili yolaktaki genlerin ortak ve özgün etkilerini ortaya çıkarma yeteneğini gösteren orta düzeyde sonuçlar elde edilir.

Bu tekniğin mikrodiziler veya çok renkli sondalar gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, hücresel transkripsiyon çıktılarını incelemenin uygun maliyetli, evrensel ve ekonomik bir yolu olmasıdır. Bu yöntem, moleküler düzeyde hedeflenmiş terapötik stratejilerin geliştirilmesi gibi kanser araştırmalarındaki soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Geçici transfeksiyon protokolümüz, tarama kurulumu için düşük çaba ve minimum ön hazırlık süresi gerektirse de, kuyucuklar arası sinyal değişkenliğini artırması muhtemeldir; bu durum, kuyucuklardan gelen mutlak değerlere bakmak yerine rapor oranlarının incelenmesiyle giderilebilir. Bu prosedüre başlamak için, %80 ila %90 konfluense ulaşmış HCT 116 hücreleri içeren beş adet 10 santimetrekarelik plakayı PBS ile yıkayın ve ardından her bir plaka için hücreleri tripsinizasyon ile toplayın.

Bir mililitre tripsin solüsyonu kullanın ve ardından %2 FBS ve %1 penisilin-streptomisin içeren 10 mililitre DMEM ile nötralize edin. Süspansiyondaki hücreleri 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve yaklaşık 130 G'de beş dakika santrifüjleyin. Süpernatantı uzaklaştırın ve hücre peletini 10 mililitre besiyerinde yeniden süspande edin.

Hücre sayısını bir hücre sayacı ile belirleyin ve ardından mililitre başına 10⁵ hücre içeren bir hücre solüsyonu hazırlayın. Çok damlalı otomatik sıvı dağıtıcı plaka kullanarak, bir sonraki adım için 150 mililitre hücre süspansiyonu ayırın. 96 kuyucuklu bir kültür plakasının her kuyucuğuna 100 µL veya 10⁴ hücre ekleyin.

Bu durumda hücre süspansiyonu, 1296 kuyucuklu plaklara ekim yapmak için yeterli olmalıdır. Transfeksiyon karışımı hazırlanırken, hücrelerin bulunduğu plakları %5 karbondioksit içeren bir inkübatörde 37 °C'de inkübe edin. Burada kullanılan yüksek kaliteli reporter konstrükt DNA, standart MIDI prep kitleri kullanılarak izole edilmiş ve 1 mg/mL final konsantrasyona seyreltilmiştir.

Her bir reporter için; 30 µL P 53, FL, 30 µL eight X-T-C-F-R-L, 30 µL elk one G, 4 µL U-A-S-C-L ve 4 µL H₂O'yu birleştirerek 100 µL reporter konstrukt stok çözeltisi hazırlayın. Bu işlem, reporterların final oranının 1:1:1:0,2 olduğu ve final DNA konsantrasyonunun 0,3 mg/mL olduğu bir DNA karışımıyla sonuçlanacaktır. Ardından, 1296 hücreyi transfekte etmek için yeterli miktarda I-R-N-A-D-N-A transfeksiyon karışımları hazırlayın.

Kuyucuklu plakalar için, plaka başına üç µg/mL nihai konsantrasyona sahip bir DNA çözeltisi elde etmek amacıyla, QIAGEN efektleme kitinden alınan 8 mL EC tamponunda 80 µL reporter konstrükt stok çözeltisi seyreltilir. DNA çözeltisinden 20 µL, 96 kuyucuklu bir PCR plakasının her bir kuyucuğuna eklenir. Kullanılacak 96 kuyucuklu plaka sayısı, test edilecek irna havuzlarının miktarına bağlıdır.

Örneğin, bu durumda değerlendirme için 4 adet 96 kuyucuklu plakaya ihtiyaç duyulacaktır. Bir biyome otomatik sıvı aktarıcı kullanarak 384 farklı siRNA havuzundan, seyreltilmiş DNA stokunu içeren PCR plakasının ilgili kuyucuklarına iki mikrolitre beş mikromolar siRNA aktarın. Ardından, DNA siRNA plakasının her kuyucuğuna bir mikrolitre güçlendirici çözelti ekleyin.

Yükseltici reaksiyonun oda sıcaklığında beş dakika boyunca gerçekleşmesine izin verin. Ardından, her kuyucuğa üç mikrolitre transfeksiyona etki eden reaktif ekleyin ve oda sıcaklığında 10 dakika daha inkübe edin. Transfeksiyon kompleksi oluşumunu durdurmak için, PCR plakasının her kuyucuğuna %2 FBS ve %1 penisilin streptomisin içeren 10 mikrolitre DMEM ekleyin.

HCT one 16 hücreleri içeren 1296 kuyucuklu plakaları inkübatörden çıkarın. Her bir transfeksiyon üç tekrarlı olarak gerçekleştirileceği için, hücre içeren 96 kuyucuklu bir plakanın her bir kuyucuğuna 10 µL transfeksiyon karışımı aktarın. Aynı karışım, hücre içeren iki ek 96 kuyucuklu plakaya da uygulananacaktır.

Hücreleri, transfeksiyona karışımları ile birlikte 37 °C'de, %5 karbondioksit içeren nemlendirilmiş bir ortamda 36 saat boyunca inkübe edin. Hücrelerin transfeksiyonundan 36 saat sonra, lusiferaz aktiviteleri ölçüme hazır hale gelir.

Bu çalışma, biri kültür besiyerine salgılanan ve diğer ikisi hücre sitoplazmasında eksprese edilen çoklu raporlar içerdiğinden, kültürdeki Cipro Dina lusiferaz veya CL aktivitesini belirlemek için hem kültür besiyerinden hem de hücresel lizattan ölçümler alınacaktır. Besiyeri replika plakası.

Beyaz opak 96 kuyucuklu plakaya 20 µL kültür ortamı ekleyin. Multi drop kullanarak her kuyucuğa 20 µL CL analiz tamponu ekleyin. Ardından, her kuyucuğa 10 µL Cipro Dina Lucifer ve substrat ekleyin ve ateş böceği lüsiferaz ile vanilla lüsiferaz aktivitelerini belirlemek için bir lüminometre kullanarak CL aktivitesini saptayın; öncelikle hücre lizatları hazırlanmalıdır.

Her bir plakayı ters çevirip besiyerini lavaboya boşaltarak hücrelerden kültür besiyerini uzaklaştırın. Kalan besiyerini, ters çevrilmiş plağı kağıt havlu üzerine hafifçe vurarak temizleyin. Hücrelerin bulunduğu her bir kuyucuğa 30 µL bir x pasif lizis tamponu ekleyin.

Plakaları, oda sıcaklığında beş dakika boyunca orta hızda ayarlanmış bir platform sarsıcısının üzerine yerleştirin. Beş dakika sonra, hücrelerin bulunduğu her bir kuyucuğa 20 µL lusiferaz analiz reaktifi ekleyin ve ateş böceği lusiferaz aktivitesini lüminometre kullanarak hemen ölçün. Ardından, ateş böceği lusiferaz aktivitesini durdurmak için "stop and glow" reaktifi ekleyin ve ardından lusiferaz aktivitesini ölçün.

Çoklama işleminden önce, üç farklı tarama platformunun sağlamlığı ayrı ayrı değerlendirilmiştir. Belirtilen kolorektal kanser hücre hatları, sırasıyla WNT beta-Catenin, P 53 veya KRAS'ı hedefleyen siRNA havuzlarıyla birlikte sekiz adet XTCF, PP 53, ta Luke veya ALK one Firefly Luciferase kodlayan raporlayıcı yapılarla transfekte edilmiştir. Her bir hücre hattı için yolakla ilgili genotipler belirtilmiştir.

Her bir tarama platformunun gücü, söz konusu sinyal iletim yolu üzerindeki indüklenmiş etkilerin tekrarlanabilirliği ile değerlendirildi. Bu temsili sonuçlarda gösterildiği üzere, betain ve siRNA'ların RKO hücrelerindeki sekiz XTCF raporlayıcı aktivitesi üzerinde herhangi bir etkisi yoktur. Bu durum; sırasıyla APC yolundan yoksun olan ve baskılayıcı proteine sahip olmayan DLD-1 ile aktif formda beta-katenin eksprese eden HCT-116 hücrelerinin aksinedir.

Ardından, bu raporların, grafiklerde belirtilen siRNA havuzları kullanılarak Wnt beta-catenin, P53 ve KRAS sinyal iletim yollarının gen aktivitelerinin eş zamanlı ölçümleri için birlikte kullanılabileceği gösterilmiştir. Y ekseninde göreceli lusiferaz aktiviteleri, X ekseninde ise hedeflenen ilgili gene yönelik siRNA'lar gösterilmektedir. Örneğin, beta-catenin'i hedefleyen bir siRNA havuzu, P53 ve KRAS yollarını önemli ölçüde etkilemezken, Wnt beta-catenin yol aktivitesini azaltmaktadır.

Multiplex bir raporlayıcı sistem geliştirilmeye çalışılırken, ilgili hücre hattının transfeksiyon bölgesi ve raporlayıcı sinyal amacı açısından optimize edilmesi önemlidir.