Kültür Hücreler Kanser ile ilişkili Sinyal İletimi sorgulanması için bir Multiplexed Lusiferaz tabanlı Tarama Platformu

Aşağıdaki protokolün genel amacı, birden fazla hücresel okumayı aynı anda izleyerek gen fonksiyonunun genom ölçeğinde sorgulanmasını sağlamaktır. Bu gösterimde, sırasıyla P 53 WINT ve KRAS yolak aktivitesini izlemek için Firefly RAN ve Cipro Dina Luciferaz tabanlı raportörler kullanılmıştır. Bu üç raportör, bir kolorektal kanser hücre hattı olan HCT one 16 hücrelerine ilgi çekici bir geni hedefleyen irna ile transekte edilmiştir.

Daha sonra, Cipro DEA lusiferaz aktivitesi sırasında hücre lizatlarında ateşböceği ve vanilya lusiferaz aktiviteleri ölçülür. Kültürde salgılanan bir enzim ölçülür. Tahlil sisteminin tekrarlanabilirliğinin yanı sıra, kanserle ilgili bu üç yol içindeki genlerin ortak ve benzersiz eylemlerini ortaya çıkarma yeteneğini gösteren orta sonuçlar elde edilir.

Bu tekniğin mikroray veya çok renkli gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, transkripsiyon hücresel çıktılarına bakmanın uygun fiyatlı, evrensel ve uygun maliyetli bir yolu olmasıdır. Bu yöntem, moleküler hedefli terapötik stratejilerin geliştirilmesi gibi kanser araştırmalarındaki soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Geçici transfect protokol çabamız IL ve ekran kurulumu için minimum ön zaman taahhüdü olsa da, kuyulardan gelen mutlak arızalara bakmak yerine rapor oranlarına bakarak karşılanabilecek kuyu sinyal değişkenliğini büyük olasılıkla iyi bir şekilde artıracaktır Bu prosedüre başlamak için, PBS ile %80 ila 90 birleşik HCT'den oluşan beş adet 10 santimetre karelik plakayı bir 16 hücreyle yıkayın ve ardından her plaka için tripsin izasyonu ile hücreleri hasat edin.

Bir mililitre tripsin çözeltisi kullanın, ardından %2 FBS ve %1 penisilin içeren 10 mililitre DMEM ile nötralize edin. Streptomisin, askıdaki hücreleri 50 mililitrelik bir konik tüpe aktarır ve beş dakika boyunca yaklaşık 130 G'de santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve hücre peletini 10 mililitre ortamda yeniden süspanse edin.

Hücre sayısını bir hücre sayacı ile sayın ve ardından mililitre başına 10 ila beşinci hücre içeren bir hücre çözeltisi yapın. Çok damlalı otomatik sıvı dağıtıcı plaka kullanarak bir sonraki adım için 150 mililitre hücre süspansiyonu tutun. 100 oyuklu bir kültür plakasının her bir oyuğunda 10 mikrolitre veya dördüncü hücreye 96.

Bu durumda hücre süspansiyonu, 1296 kaplaması için yeterli olmalıdır. Kuyu plakaları, transfeksiyon karışımını hazırlarken% 5 karbondioksit içeren bir inkübatörde plakaları 37 santigrat derecede hücrelerle inkübe eder. Burada kullanılan yüksek kaliteli raportör yapı DNA'sı, standart MIDI hazırlık kitleri kullanılarak izole edildi ve mililitre başına bir miligramlık bir nihai konsantrasyona seyreltildi.

Her muhabir için, aşağıdaki 30 mikrolitre P 53, FL 30 mikrolitre sekiz X-T-C-F-R-L, 30 mikrolitre geyik, bir G, dört altı mikrolitre U-A-S-C-L ve dört mikrolitre H, iki oh. Bu, raportörlerin bire bire bir ila 0.2'si arasında bir nihai orana ve mililitre başına 0.3 miligramlık bir nihai DNA konsantrasyonuna sahip bir DNA karışımı ile sonuçlanacaktır. Daha sonra, 1296'yı kesmek için yeterli I-R-N-A-D-N-A transfeksiyon karışımlarını hazırlayın.

Kuyu plakaları, mililitre plaka başına üç mikrogramlık bir nihai konsantrasyona sahip bir DNA çözeltisi elde etmek için QIAGEN etki kitinden sekiz mililitre EC tamponu içinde raportör yapı stok çözeltisinin 80 mikrolitresini seyreltir. 96 oyuklu bir PCR plakasının her bir oyuğuna 20 mikrolitre DNA çözeltisi. 96 kuyulu plakanın sayısı, kaç tane irna havuzunun test edileceğine bağlı olacaktır.

Örneğin, bu durumda, değerlendirmek için 4 96 kuyu plakasına ihtiyacımız olacak. Bir biyom otomatik sıvı işleyici kullanan 384 farklı sir a havuzu, her beş mikromolar siRNA'nın iki mikrolitresini, seyreltilmiş DNA stokunu içeren PCR plakasının ilgili kuyusuna aktarır. Daha sonra, DNA siRNA plakasının her bir oyuğuna bir mikrolitre arttırıcı çözelti ekleyin.

Arttırıcı reaksiyonun oda sıcaklığında beş dakika boyunca gerçekleşmesine izin verin. Daha sonra her bir oyuğa üç mikrolitre etkili transfeksiyon reaktifi ekleyin ve oda sıcaklığında 10 dakika daha inkübe edin. Transfeksiyon kompleksi oluşumunu durdurmak için, PCR plakasının her bir oyuğuna% 2 FBS ve% 1 penisilin streptomisin içeren 10 mikrolitre DMEM ekleyin.

İnkübatörden HCT bir 16 hücre içeren 1296 kuyulu plakayı alın. Her bir transfeksiyon üç nüsha halinde gerçekleştirileceğinden, hücreleri içeren 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 10 mikrolitre transfeksiyon karışımı aktarın. Aynı karışım, hücre içeren iki ek 96 oyuklu plakaya uygulanacaktır.

Hücreleri, 36 saat boyunca% 5 karbondioksit ile nemlendirilmiş bir ortamda, 37 santigrat derecede transfeksiyon karışımları ile inkübe edin. Hücrelerin transfeksiyonundan 36 saat sonra. Lusiferaz aktiviteleri ölçüm için hazırdır.

Bu çalışma, biri kültür ortamına salgılanan ve diğer ikisi hücre sitoplazmasında eksprese edilen birden fazla raportör içerdiğinden. Kültürdeki Cipro Dina lusiferaz veya CL aktivitesini tespit etmek için hem kültür ortamından hem de hücresel lizattan ölçümler elde edilecektir. Orta çoğaltma plakası.

Beyaz opak 96 oyuklu bir plakaya 20 mikrolitre bir kültür ortamı. Çoklu damlayı kullanarak, her bir oyuğa 20 mikrolitre CL tahlil tamponu ekleyin. Daha sonra, her bir oyuğa 10 mikrolitre Cipro Dina Lucifer ve substrat ekleyin ve ateşböceği lusiferaz ve vanilya lusiferaz aktivitelerini tespit etmek için bir luminometre kullanarak CL aktivitesini tespit edin, önce hücre lizatları yapılmalıdır.

Her bir plakayı ters çevirerek ve ortamı bir lavaboya atarak kültür ortamını hücrelerden çıkarın. Baş aşağı plakayı kağıt havluların üzerine hafifçe vurarak kalan ortamı çıkarın. Her bir hücre kuyucuğuna 30 mikrolitre bir x pasif lizis tamponu ekleyin.

Plakaları, oda sıcaklığında beş dakika boyunca orta hızda ayarlanmış bir platform külbütörüne yerleştirin. Beş dakika sonra, her bir hücre oyuğuna 20 mikrolitre lusiferaz tahlil reaktifi ekleyin ve luminometreyi kullanarak ateşböceği lusiferaz aktivitesini hemen ölçün. Ardından, ateşböceği lusiferaz aktivitesini söndürmek için durdurma ve kızdırma reaktifi ekleyin ve ardından lusiferaz aktivitesini ölçün.

Çoğullamadan önce, üç farklı tarama platformunun sağlamlığı ayrı ayrı değerlendirildi. Belirtilen kolorektal kanser hücre hatları, sırasıyla WINT, beta-Katenin, P 53 veya KAS'ı hedefleyen siRNA havuzları ile birlikte sekiz XTCF, PP 53, ta Luke veya ALK, bir Firefly Luciferaz kodlama raportör yapısı ile transfekte edildi. Her hücre hattı için yolla ilgili genotipler belirtilmiştir.

Her bir tarama platformunun gücü, bu indüklenen etkilerin ilgili sinyal iletim yolu üzerinde tekrarlanabilirliği ile değerlendirildi. Bu temsili sonuçlarda gösterildiği gibi, betain ve siRNA'ların RKO hücrelerindeki sekiz XTCF raportör aktivitesi üzerinde hiçbir etkisi yoktur. DLD bir ve HCT bir 16'nın aksine, sırasıyla A PC yolağında eksik olan hücreler, proteini baskılar ve aktive edilmiş bir beca tenin formunu eksprese eder.

Daha sonra, bu raportörlerin, bu grafiklerde belirtilen IRNA havuzları kullanılarak rüzgar beta-katenin P 53 ve KRAS sinyal iletim yollarının gen aktivitesinin eşzamanlı ölçümleri için birlikte kullanılabileceği gösterilmiştir. Bağıl lusiferaz aktiviteleri Y ekseninde gösterilir ve belirtilen ilgilenilen geni hedefleyen siRNA'lar X ekseninde gösterilir. Örneğin, beta-katenini hedefleyen bir siRNA havuzu, P 53 ve KRA S yollarını önemli ölçüde etkilemezken, rüzgar beta-katenin yolu aktivitesini azaltır.

Bir multipleks raportör sistemi geliştirmeye çalışırken, transfeksiyon bölgesi ve raportör sinyal amacı için ilgili hücre hattını optimize etmek önemlidir.