Dinamik Etkileşimler 3D Yapısal Analiz için karşılıklı Mikroskopi

Bu prosedürün genel amacı, konakçı hela hücreleri ile etkileşime giren dinamik küçük HIV bir parçacıklarını görüntüleyerek korelasyon floresan ışığı ve kriyo-elektron mikroskobu yönteminin kullanımını göstermektir. Bu, ilk olarak topuk hücrelerinin bir cam tabanlı kültür kabında altın bulucu EM ızgarası üzerinde kaplanması ve büyütülmesi ve topuk hücrelerinin GFP etiketli HIV bir partikülleri ile enfekte edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, HIV ile enfekte olmuş hücrelerin hızlandırılmış yüksek hızlı 3D canlı hücre konfokal görüntülerini toplamak ve vitrifikasyondan sonra tek partikül dinamikleri için otomatik 3D partikül izleme ile görüntüleri analiz etmektir.

Numune, canlı hücre görüntüleme verilerinden elde edilen aynı viral parçacıklar, daha yüksek çözünürlüklü 3D kriyo-elektron tomografi analizi için kriyo floresan görüntülerde bulunur. Son adım, HIV bir parçacıkları içeren tanımlanmış tüm pozisyonlar için eğik kriyo EM projeksiyon serilerini toplamak ve imad yazılımını kullanarak ağırlıklı bir geri projeksiyon algoritması ile 3D tomları yeniden oluşturmaktır. Sonuç olarak, dinamik kırınımı, sınırlı viral partikülleri ve bunların konakçı hücrelerle etkileşimlerini doğrudan görselleştirmek için gelişmiş 3D korelasyonlu canlı hücre floresan mikroskobu ve yüksek çözünürlüklü kriyo-elektron tomografisi kullanılır.

Çalışmamız, yalnızca HIV bir enfeksiyon olaylarının doğrudan görüntülenmesine izin veren bir korelasyon yöntemi geliştirmeyi amaçlamaktadır Canlı hücre floresan benzeri mikroskopi, kriyo floresan mikroskobu ve kriyo-elektron tomografisini bu şekilde birleştirerek, canlı hücre ve kriyo floresan sinyalleri, kriyo-elektron tomografisinde örneklemeyi büyük ölçüde yönlendirmek için kullanılabilir. Ayrıca, kriyo-elektron tomografisinden elde edilen yapısal bilgiler, floresan etiketli hedeflerin yaşam tarzı görüntülemesi yoluyla elde edilen dinamik fonksiyonel verilerle tamamlanabilir. Bu tekniğin veya mevcut yöntemin ana avantajı, yüksek çözünürlüklü 3D mercan elektron tomografisi yaklaşımı ile gelişmiş korelasyonlu yüksek hızlı 3D yaşam tarzı görüntülemenin, HIV tip bir ve enfeksiyonun erken evresinde konak hücre etkileşimleri gibi doğası gereği yakalanması zor olan dinamik olayları incelemek için uygulanmasıdır.

Izgarayı hücre kültürü kızdırması için hazırlamak için, 200 gözenekli R'nin karbon tarafını iki üzeri iki quanti folyo, altın EM bulucu ızgarayı 25 saniye boyunca 25 miliamperin altında boşaltın. EM ızgarasını, mililitre fiber nin çözeltisi başına 50 mikrogramlık 40 mikrolitrelik bir damlacık üzerine karbon tarafı aşağı bakacak şekilde yüzdürerek fiber nin ile kaplayın. Dezenfeksiyon plakası hela hücrelerini bir cam tabanlı kültür kabında mililitrede iki kez 10 ila dördüncü hücre yoğunluğunda ızgaraya dezenfeksiyon için iki saat boyunca bir doku kültürü başlığında bırakın.

Uygun takviyeleri olan DMEM'de, HIV enfeksiyonundan bir saat önce HIV enfeksiyonundan yaklaşık 18 saat önce% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede hücreleri inkübe edin, cam tabanlı kültür kabındaki hela hücrelerine bir floresan hücre izleyici ekleyin ve floresan boyanın alımına izin vermek için tabağı 37 santigrat derecede 10 dakika inkübe edin, hücreleri PBS ile yıkayın ve 50 mikrolitre önceden ısıtılmış taze ortam ekleyin. Çanağı, süpürülmüş alan konfokal tarayıcı mikroskobunun 37 santigrat derecesinde canlı hücre odasına yerleştirin. Cryo EM, numunenin nispeten ince bölgelerini gerektirdiğinden.

En çok dağıldıkları iki mitoz aşaması arasındaki hücrelerle kare başına bir ila üç hücre içeren birden çok alan seçin ve gelecekteki görüntüleme için bu konumları NIS öğe yazılımıyla düz bir şekilde saklayın. Daha sonra, hücreleri VSVG (V-F-P-V-P-R içeren sahte HIV bir parçacıkları ve virüs parçacıklarını tabağın alt kuyusuna enfekte edin, EM ızgarasını bozmamaya dikkat edin. Görüntüleme pozisyonları zaten seçilmiş ve saklanmış olduğundan, varyanların eklenmesinden hemen sonra, 20 ila 40 dakika boyunca önceden seçilen pozisyonlarda hızlandırılmış yüksek hızlı 3D konfokal görüntüler toplayın.

Konfokal canlı hücre görüntülemeden hemen sonra, kültür kabını buzla soğutulmuş bir bakır blok üzerine yerleştirin ve kriyo EM numune hazırlama odasına aktarın. EM ızgarasını özel cımbızlara yükleyin, artık kültür ortamını filtre kağıdı ile hızlı bir şekilde kurulayın, hemen 0,2 mikron floresan mikro kürelerle karıştırılmış 15 nanometre altın boncuk çözeltisinin mikrolitreleri için ızgaraya yerleştirin. Floresan mikro küreler, floresan ve kriyo-EM arasındaki korelasyona yardımcı olmak için kullanılır.

En iyi sonuçları elde etmek için optimize edilmiş lekeleme parametreleri ile dalma dondurma için cımbızları vitrifikasyon cihazına yükleyin. Kriyo floresan ışık mikroskobu prosedürüne başlamak için, lensi sıcak ve dondan uzak tutmak için objektif lensin üzerine yerleştirilmiş bir manşona kuru bir nitrojen gazı hattı bağlayın, ev yapımı bir kriyo floresan numune aşaması ters çevrilmiş bir floresan ışık mikroskobuna monte edin. Kriyo s'un sıvı nitrojen girişini bağlayınamp kendinden basınçlı dozlayıcıya ve sıvı nitrojen taşma koruma çıkışını uygun bir kaba yerleştirin.

Donmuş hidratlı numune ızgarasını bakır blok üzerindeki EM numune kartuşuna yerleştirin ve ızgarayı yerinde tutmak için üstüne bir ön soğutma C klips halkası yerleştirin. Kartuşu kriyo aşaması aramasının iç haznesine yerleştirin ve canlı hücre görüntüleme verilerinden aynı virüs parçacıklarını bulun. EM ızgarasının bir indeksi olduğundan, hem canlı hücre görüntülerinde hem de kriyo floresan görüntülerinde aynı parçacığı ızgara üzerinde lokalize etmek kolaydır.

Uzun çalışan bir objektif lense sahip bir ışık mikroskobu kullanarak kriyo koşulları altında belirlenen konumlarda kriyo DIC ve floresan görüntüleri elde edin. Kriyo floresan görüntüleme sırasında, kriyo aşamasındaki sıvı nitrojen seviyesini periyodik olarak kontrol edin ve kriyo-elektron tomografisi için numune aşamasını negatif 170 santigrat derecenin altında tutmak için gerektiğinde kendi kendine basınçlı bir dozlayıcı ile yeniden doldurun. Numune ızgarasını, 140 x büyütmede düşük doz arama modunda bir alan emisyon tabancası ile donatılmış bir elektron mikroskobunun kriyo transfer istasyonuna yükleyin.

Kriyo floresan görüntülerinin elde edildiği bölgeleri veya ızgara karelerini tanımlayın. İlişkili alanın düşük büyütmeli bir kriyo EM görüntüsünü kaydedin ve konumu, 3.500 x büyütmede düşük doz arama modu altında bir sahne dosyasına kaydedin. 100 mikronluk bir objektif diyafram araması ekleyin ve GFP sinyalleriyle ilişkili tüm konumları ikinci aşama dosyasına kaydedin.

Eğilme açısı aralığı, elektron dozu, odak dışı değer ve eğilme şemaları dahil olmak üzere bir eğim serisi elde etmek için tomografi parametrelerini ayarlayın. Bu prosedüre başlamak için kaydedilen tüm pozisyonlar için eğim serileri edinin. Ana pencereyi, Tomo Graham hesaplamasının birkaç aşaması aynı anda ayarlanabilecek veya takip edilebilecek şekilde yapılandırın, gerekli parametreleri değiştirin ve her işlem adımının gerektirdiği belirli programları çalıştırın.

Son aşamada, 0,6'dan küçük bir ana kalıntı hatasıyla tam hizalanmış bir yığın oluşturun ve ağırlıklı bir geri projeksiyon algoritması kullanarak Toms'u yeniden oluşturun. Virüs parçacıklarının dinamik davranışını karakterize etmek için Im mod'da. HIV one ile enfekte olmuş hela hücreleri, yüksek hızlı konfokal canlı hücre mikroskobu ile görüntülendi ve partikül hareketleri otomatik 3D partikül takibi ile analiz edildi.

Bu temsili şekilde, sarı ok ucu ile gösterilen tek bir yeşil floresan viral parçacık, birkaç dakikalık zaman atlamasını önlemek için çerçeveler arasında üç dakikalık bir zaman aralığı ile 3D konfokal yığınlarda izlendi. Bu, son konfokal canlı hücre görüntüsünün toplanması ile dalma donması arasında meydana gelebilir. Kriyo EM kartuşları içinde donmuş hidratlı numunelerin görüntülenmesi için bir kriyo floresan ışık mikroskobu aşaması tasarlanmış ve üretilmiştir.

Işık mikroskoplarında panel A, bakır kriyo numune aşamasını soğutmak için kullanılan sıvı nitrojen ile doldurulmuş, kendi kendine basınçlı bir çözücüyü gösterir. Panel B, beyaz ok ucu ile gösterilen iç hazne ile kriyo numune aşamasının üst iç görünümünü gösterir. Numune ızgarası, siyah okla gösterilen bir bakır blok platformun ortasında bulunan E EM numune kartuşunun üzerine yerleştirilir.

Bu platform, polar olmayan elektron mikroskopları ile kullanılmak üzere eklenmiştir. Numune ızgarası ile yüklendikten sonra, kartuşlar ağlama floresan ışığı için iç hazneye aktarılır. Mikroskopi panelleri C ve D, polar olmayan bir kriyo-elektron mikroskobu ile kullanım için ızgarayı yerinde tutmak için bir bakır halka yerleştirmeden önce ve sonra sırasıyla numune kartuşunu gösterir.

İleri korelasyon yaşam hücresi mikroskobu ve kriyo-elektron tomografisi için prosedürün faydası, bir konakçı topuk hücresi ile etkileşime giren floresan olarak işaretlenmiş HIV V bir partikülünün doğrudan görüntülenmesi ile gösterilmiştir. Panel A'da gösterilen bir kriyo ışık mikroskobu aşaması ile kaydedilen bir DIC görüntüsü, panel B'de gösterilen GFP etiketli parçacıkların bir kriyo floresan görüntüsü ile kaplanır. Kırmızı paneller C, D ve E, sırasıyla 140 x 3, 500 x ve 27, 500 x'te B ve C panellerinde daire içine alınmış bir floresan partikülü içeren bölgenin düşük dozlu kriyo-EM görüntüleridir.

Panel E'deki iç kısım, tomografik eğim serisi panellerin alınmasından sonra kaydedilen büyütülmüş bir görünümdür, FG ve H, Z yönünde 21 nanometrelik bir mesafe ile ayrılmış üç adet dört nanometre kalınlığında tomografik dilimi gösterir. Parçacık ve helo hücre zarı arasındaki bağlantılar, hem iç kısımdaki projeksiyon görüntüsünde hem de panel E'de ve tomografik dilimlerde oklarla gösterilir. F ve g panellerinde.

Hızlandırılmış konfokal lipo hücre floresan görüntüleme ve ardından kriyo-elektron tomografisi kullanarak dinamik virüs ve steril etkileşimleri analiz etmek için gelişmiş bir korelasyon yaklaşımı sağlamak için basit bir protokol seti sunduk. Bu prosedürü denerken, floresan görüntü ile elektron mikroskobu görüntüsü arasındaki kesin ve güvenilir korelasyonun, karga elektron tomografisinin başarılı bir şekilde elde edilmesi için kritik olduğunu hatırlamak önemlidir. Bu prosedürün açıklanan veriler, hücre biyolojisinde hücre sinyalizasyonu, yüzey reseptörü içselleştirmesi gibi dinamik hücresel süreçleri içeren çok sayıda uygulama için faydalı olacaktır.