Işık mikroskobu için histolojik numune hazırlama
Histoloji, dokuların ve hücrelerin mikroskobik anatomisinin incelenmesini ifade eden bir terimdir. Doku örneklerinden kaliteli sonuçlar elde etmek için ışık mikroskobu için uygun histolojik örnek hazırlığı şarttır.
Neredeyse tüm histolojik prosedürlerde ortak olan 3 ana adım vardır. İlk olarak, dokuyu korumak ve doku bozulmasını yavaşlatmak için numune sabitlenir. Daha sonra numune, kendisine benzer mekanik özelliklere sahip bir malzemeye veya gömme ortama daldırılır. Gömüldükten sonra numune, mikrotom olarak bilinen hassas bir kesme aleti kullanılarak ince dilimler halinde bölümlere ayrılır veya kesilir. Bu videoda bu genel adımlar ve bunlarla ilgili bazı kavramlar açıklanmaktadır.
Doku fiksasyonu, hücre ve doku bileşenlerini koruyan ve yapılarını koruyan kritik bir adımdır. Hücre ölümünü takiben, doğal olarak oluşan enzimler hücresel organellerden salınır ve hücre ve hücre dışı matris boyunca proteinleri bozmaya başlar, böylece hücrenin yapısını tahrip eder. Fiksasyon, bu enzimlerin proteini sindirme yeteneğini doğrudan inhibe ederek ve enzim bölünme bölgelerini tanınmaz hale getirerek bu tür bir bozulmayı önler.
Fiksasyonun iki ana mekanizması çapraz bağlama ve pıhtılaşmadır. Çapraz bağlama, hem proteinler içinde hem de aralarında kovalent bağ oluşumunu içerir, bu da dokunun sertleşmesine ve dolayısıyla bozulmaya direnmesine neden olur. Pıhtılaşma, protein üçüncül yapısını deforme eden alkoller veya aseton kullanımı yoluyla proteinlerin dehidrasyonundan kaynaklanır, böylece hidrofobik veya sudan korkan bölgeler protein yüzeyini hareket ettirir. Pıhtılaştırıcı fiksasyon, parafin mumu gibi ortamların dokuya nüfuz etmesine yardımcı olabilir.
En yaygın kullanılan fiksatiflerden biri, bir suda çözünen formaldehit olan Formalin'dir. Fiksasyon sırasında formaldehit, methelen köprüsü adı verilen stabil bir çapraz bağ oluşturmak için lizin ve glutamin amino asitlerinin yan zincirlerinde bulunanlar gibi birincil aminlere bağlanır. Bu süreç doğası gereği yavaştır ve 1-2 gün kadar sürebilir.
Fiksasyondan önce birkaç husus göz önünde bulundurulmalıdır. İlk olarak, numunenin yayılımını göz önünde bulundurun. Fiksatifler, zamanın karekökü ile çarpılan fiksatif için difüzyon katsayısı ile ilgili bir oranda dokular boyunca bir mesafe yayacaktır. Numuneye 1 mm nüfuz etmesi 1 saat süren bir fiksatifin 5 mm'ye nüfuz etmesi 25 saat sürecektir. Formalin dokunun merkezine ulaştığında, çapraz bağlama reaksiyonu eşiğinin gerçekleşmesi gerekir. Bu nedenle, makul bir sürede kapsamlı sabitleme için numune boyutu 4 mm kalınlık ile sınırlandırılmalıdır.
İkinci olarak, fiksatifin hacmini ve pH'ını göz önünde bulundurun. Fiksatif/numune hacim oranı en az 40:1 olmalıdır, böylece reaktif zamanla kolayca tükenmez. Bazı fiksatifler asidik bir pH'ta çalışacak şekilde tasarlanırken, formalin, nötr bir pH'ı korumak için fosfat ile tamponlandığında en iyi sonucu verir, böylece fazla asit üretilmez, bu da dokuda artefaktlara neden olur.
Histolojik hazırlıktaki bir sonraki adım, numunenin kendisine benzer mekanik sertliğe sahip ortamda destekleyici numuneleri içeren gömmedir. Doğru gömme ortamını seçmek çok önemlidir, çünkü çok sert veya çok zayıfsa, kesitleme sırasında kusurlar meydana gelebilir. Şimdiye kadar, gömme için kullanılan en yaygın ortam parafin mumudur.
Parafin gömülmeden önce, numuneler, dokudaki suyun etanol ile değiştirilmesiyle, önce ksilenlerle, ardından ksilenler ve son olarak ısıtılmış parafin mumu ile kurutulmalıdır. Balmumu numuneye sızdıktan sonra, dikkatlice konumlandırılır ve bir blok oluşturmak için bir kalıp kullanılarak ek balmumu ile çevrelenir. Daha sonra, numuneler kesitleme için bir doku kasetine tutturulur.
Kesit alma, bir numunenin ince dilimlerini bir gömme bloğundan kesme işlemidir. Kesitler genellikle ışık mikroskobu ile kullanım için 4-10 μm kalınlığındadır.
Bölümleri kesmek için önce metal, cam veya elmas bir bıçak bir mikrotom üzerine sabitlenir. Numune daha sonra bir numune tutucuya yerleştirilir. Daha sonra, numune kesme yüzeyine ilerletilir ve istenen kalınlıkta bir dilim oluşturmak için bıçak boyunca çekilir. Bölümler, cam slaytlar üzerine yerleştirilebilecek ince şeritler halinde toplanacaktır.
Kesit alma işleminden sonra numuneler slaytlara yerleştirilir. Parafine gömülü numuneler için, dilimler önce ısıtılmış bir su banyosuna yerleştirilir ve daha sonra sudan kaydırağın üzerine kaldırılır ve kurumaya bırakılır.
Biyolojik dokunun çok az doğal kontrastı vardır, bu nedenle histolojiden sonra, slaytlar genellikle morfolojiyi veya spesifik proteinleri vurgulayan boyalar veya antikorlarla boyanır. Yapılan en yaygın boyama hematoksilen ve eozin veya H&E'dir. Çok yaygın olduğu için, çok sayıda bölümü H & E ile tekrarlanabilir bir şekilde boyamak için birçok otomatik makine yapılmıştır. Hematoksilen hücrelerin çekirdeklerini maviye boyar ve eozin sitoplazmayı pembe boyayarak dokuların hücresel morfolojisini ortaya çıkarır.
Fiksasyonun bir dezavantajı, proteinlerin çapraz bağlanmasının, antikorların bağlanma bölgelerini bulmak için etiketleme için daha fazla hale getirebilmesidir. Numuneleri korumak için fiksasyon kullanmak yerine, dokunun hızlı dondurulması veya ani dondurma kullanılabilir, bunu kriyoseksiyon
adı verilen bir kesit tekniği takip ederDoku numuneleri, OCT adı verilen özel bir dondurma ortamına veya optimum kesme sıcaklığı ortamına gömülür ve yönlendirilir ve ardından hızla dondurulur. Diğer gömme ortamları gibi, OCT de numunenin sertliğiyle eşleşir.
Donmuş bölümleri kesmek için bir kriyomikrotom veya kriyostat kullanılır ve bu cihaz, kesme bıçağını ve numuneleri serin tutmak için -20°C'lik bir iç sıcaklığı korur. Parafine gömülü bölümlerin aksine, donmuş bölümler, bölümlere ayrıldıktan hemen sonra pozitif yüklü bir cam slayt üzerine doğrudan kaldırılabilir.
Fiksasyonu önlemenin bir başka yolu, numunelerin taze hazırlanmış sıvı agaroz ile kaplandığı agar gömmedir. Agaroz soğudukça dokuyu yerine kilitler ve fazla agaroz kesilebilir.
Mikrotomun başka bir alternatifi olan vibrotomlar, agaroza gömülü numune boyunca titreşen ve hareket eden bir bıçağa sahiptir. Vibrotomlar, agaroz gömülü numunelerden 50-1000 μm mertebesinde kalın kesitler oluşturmak için kullanılır.
Numuneler tipik olarak boyamadan önce agarozdan çıkarılır ve daha sonra lamel numuneyi ezmesini önleyen vakumlu gres gibi bir madde ile çevrili bir slayt üzerine yerleştirilir. Her kalın bölümün yüksek çözünürlüklü görüntülerini elde etmek için en iyi şekilde konfokal mikroskopi kullanılarak görüntülenirler.
Az önce JoVE'nin ışık mikroskobu için histolojik numune hazırlama videosunu izlediniz.
Artık sizi bir doku parçasından lekelenebilir bir bölüme götürmek için numune hazırlama ile ilgili adımları anlamalısınız. Her zaman olduğu gibi, izlediğiniz için teşekkürler!
Histoloji, tipik olarak bir ışık mikroskobu kullanılarak desteklenen hücre ve dokuların incelenmesidir. Histolojik numunelerin hazırlanması, numuneler…
Histoloji, dokuların ve hücrelerin mikroskobik anatomisinin incelenmesini ifade eden bir terimdir. Doku örneklerinden kaliteli sonuçlar elde etmek için ışık mikroskobu için uygun histolojik örnek hazırlığı şarttır.
Neredeyse tüm histolojik prosedürlerde ortak olan 3 ana adım vardır. İlk olarak, dokuyu korumak ve doku bozulmasını yavaşlatmak için numune sabitlenir. Daha sonra numune, kendisine benzer mekanik özelliklere sahip bir malzemeye veya gömme ortama daldırılır. Gömüldükten sonra numune, mikrotom olarak bilinen hassas bir kesme aleti kullanılarak ince dilimler halinde bölümlere ayrılır veya kesilir. Bu videoda bu genel adımlar ve bunlarla ilgili bazı kavramlar açıklanmaktadır.
Doku fiksasyonu, hücre ve doku bileşenlerini koruyan ve yapılarını koruyan kritik bir adımdır. Hücre ölümünü takiben, doğal olarak oluşan enzimler hücresel organellerden salınır ve hücre ve hücre dışı matris boyunca proteinleri bozmaya başlar, böylece hücrenin yapısını tahrip eder. Fiksasyon, bu enzimlerin proteini sindirme yeteneğini doğrudan inhibe ederek ve enzim bölünme bölgelerini tanınmaz hale getirerek bu tür bir bozulmayı önler.
Fiksasyonun iki ana mekanizması çapraz bağlama ve pıhtılaşmadır. Çapraz bağlama, hem proteinler içinde hem de aralarında kovalent bağ oluşumunu içerir, bu da dokunun sertleşmesine ve dolayısıyla bozulmaya direnmesine neden olur. Pıhtılaşma, protein üçüncül yapısını deforme eden alkoller veya aseton kullanımı yoluyla proteinlerin dehidrasyonundan kaynaklanır, böylece hidrofobik veya sudan korkan bölgeler protein yüzeyini hareket ettirir. Pıhtılaştırıcı fiksasyon, parafin mumu gibi ortamların dokuya nüfuz etmesine yardımcı olabilir.
En yaygın kullanılan fiksatiflerden biri, bir suda çözünen formaldehit olan Formalin'dir. Fiksasyon sırasında formaldehit, methelen köprüsü adı verilen stabil bir çapraz bağ oluşturmak için lizin ve glutamin amino asitlerinin yan zincirlerinde bulunanlar gibi birincil aminlere bağlanır. Bu süreç doğası gereği yavaştır ve 1-2 gün kadar sürebilir.
Fiksasyondan önce birkaç husus göz önünde bulundurulmalıdır. İlk olarak, numunenin yayılımını göz önünde bulundurun. Fiksatifler, zamanın karekökü ile çarpılan fiksatif için difüzyon katsayısı ile ilgili bir oranda dokular boyunca bir mesafe yayacaktır. Numuneye 1 mm nüfuz etmesi 1 saat süren bir fiksatifin 5 mm'ye nüfuz etmesi 25 saat sürecektir. Formalin dokunun merkezine ulaştığında, çapraz bağlama reaksiyonu eşiğinin gerçekleşmesi gerekir. Bu nedenle, makul bir sürede kapsamlı sabitleme için numune boyutu 4 mm kalınlık ile sınırlandırılmalıdır.
İkinci olarak, fiksatifin hacmini ve pH'ını göz önünde bulundurun. Fiksatif/numune hacim oranı en az 40:1 olmalıdır, böylece reaktif zamanla kolayca tükenmez. Bazı fiksatifler asidik bir pH'ta çalışacak şekilde tasarlanırken, formalin, nötr bir pH'ı korumak için fosfat ile tamponlandığında en iyi sonucu verir, böylece fazla asit üretilmez, bu da dokuda artefaktlara neden olur.
Histolojik hazırlıktaki bir sonraki adım, numunenin kendisine benzer mekanik sertliğe sahip ortamda destekleyici numuneleri içeren gömmedir. Doğru gömme ortamını seçmek çok önemlidir, çünkü çok sert veya çok zayıfsa, kesitleme sırasında kusurlar meydana gelebilir. Şimdiye kadar, gömme için kullanılan en yaygın ortam parafin mumudur.
Parafin gömülmeden önce, numuneler, dokudaki suyun etanol ile değiştirilmesiyle, önce ksilenlerle, ardından ksilenler ve son olarak ısıtılmış parafin mumu ile kurutulmalıdır. Balmumu numuneye sızdıktan sonra, dikkatlice konumlandırılır ve bir blok oluşturmak için bir kalıp kullanılarak ek balmumu ile çevrelenir. Daha sonra, numuneler kesitleme için bir doku kasetine tutturulur.
Kesit alma, bir numunenin ince dilimlerini bir gömme bloğundan kesme işlemidir. Kesitler genellikle ışık mikroskobu ile kullanım için 4-10 μm kalınlığındadır.
Bölümleri kesmek için önce metal, cam veya elmas bir bıçak bir mikrotom üzerine sabitlenir. Numune daha sonra bir numune tutucuya yerleştirilir. Daha sonra, numune kesme yüzeyine ilerletilir ve istenen kalınlıkta bir dilim oluşturmak için bıçak boyunca çekilir. Bölümler, cam slaytlar üzerine yerleştirilebilecek ince şeritler halinde toplanacaktır.
Kesit alma işleminden sonra numuneler slaytlara yerleştirilir. Parafine gömülü numuneler için, dilimler önce ısıtılmış bir su banyosuna yerleştirilir ve daha sonra sudan kaydırağın üzerine kaldırılır ve kurumaya bırakılır.
Biyolojik dokunun çok az doğal kontrastı vardır, bu nedenle histolojiden sonra, slaytlar genellikle morfolojiyi veya spesifik proteinleri vurgulayan boyalar veya antikorlarla boyanır. Yapılan en yaygın boyama hematoksilen ve eozin veya H&E'dir. Çok yaygın olduğu için, çok sayıda bölümü H & E ile tekrarlanabilir bir şekilde boyamak için birçok otomatik makine yapılmıştır. Hematoksilen hücrelerin çekirdeklerini maviye boyar ve eozin sitoplazmayı pembe boyayarak dokuların hücresel morfolojisini ortaya çıkarır.
Fiksasyonun bir dezavantajı, proteinlerin çapraz bağlanmasının, antikorların bağlanma bölgelerini bulmak için etiketleme için daha fazla hale getirebilmesidir. Numuneleri korumak için fiksasyon kullanmak yerine, dokunun hızlı dondurulması veya ani dondurma kullanılabilir, bunu kriyoseksiyon
adı verilen bir kesit tekniği takip ederDoku numuneleri, OCT adı verilen özel bir dondurma ortamına veya optimum kesme sıcaklığı ortamına gömülür ve yönlendirilir ve ardından hızla dondurulur. Diğer gömme ortamları gibi, OCT de numunenin sertliğiyle eşleşir.
Donmuş bölümleri kesmek için bir kriyomikrotom veya kriyostat kullanılır ve bu cihaz, kesme bıçağını ve numuneleri serin tutmak için -20°C'lik bir iç sıcaklığı korur. Parafine gömülü bölümlerin aksine, donmuş bölümler, bölümlere ayrıldıktan hemen sonra pozitif yüklü bir cam slayt üzerine doğrudan kaldırılabilir.
Fiksasyonu önlemenin bir başka yolu, numunelerin taze hazırlanmış sıvı agaroz ile kaplandığı agar gömmedir. Agaroz soğudukça dokuyu yerine kilitler ve fazla agaroz kesilebilir.
Mikrotomun başka bir alternatifi olan vibrotomlar, agaroza gömülü numune boyunca titreşen ve hareket eden bir bıçağa sahiptir. Vibrotomlar, agaroz gömülü numunelerden 50-1000 μm mertebesinde kalın kesitler oluşturmak için kullanılır.
Numuneler tipik olarak boyamadan önce agarozdan çıkarılır ve daha sonra lamel numuneyi ezmesini önleyen vakumlu gres gibi bir madde ile çevrili bir slayt üzerine yerleştirilir. Her kalın bölümün yüksek çözünürlüklü görüntülerini elde etmek için en iyi şekilde konfokal mikroskopi kullanılarak görüntülenirler.
Az önce JoVE'nin ışık mikroskobu için histolojik numune hazırlama videosunu izlediniz.
Artık sizi bir doku parçasından lekelenebilir bir bölüme götürmek için numune hazırlama ile ilgili adımları anlamalısınız. Her zaman olduğu gibi, izlediğiniz için teşekkürler!
Histoloji, dokuların ve hücrelerin mikroskobik anatomisinin incelenmesini ifade eden bir terimdir. Doku örneklerinden kaliteli sonuçlar elde etmek için ışık mikroskobu için uygun histolojik örnek hazırlığı şarttır.
Neredeyse tüm histolojik prosedürlerde ortak olan 3 ana adım vardır. İlk olarak, dokuyu korumak ve doku bozulmasını yavaşlatmak için numune sabitlenir. Daha sonra numune, kendisine benzer mekanik özelliklere sahip bir malzemeye veya gömme ortama daldırılır. Gömüldükten sonra numune, mikrotom olarak bilinen hassas bir kesme aleti kullanılarak ince dilimler halinde bölümlere ayrılır veya kesilir. Bu videoda bu genel adımlar ve bunlarla ilgili bazı kavramlar açıklanmaktadır.
Doku fiksasyonu, hücre ve doku bileşenlerini koruyan ve yapılarını koruyan kritik bir adımdır. Hücre ölümünü takiben, doğal olarak oluşan enzimler hücresel organellerden salınır ve hücre ve hücre dışı matris boyunca proteinleri bozmaya başlar, böylece hücrenin yapısını tahrip eder. Fiksasyon, bu enzimlerin proteini sindirme yeteneğini doğrudan inhibe ederek ve enzim bölünme bölgelerini tanınmaz hale getirerek bu tür bir bozulmayı önler.
Fiksasyonun iki ana mekanizması çapraz bağlama ve pıhtılaşmadır. Çapraz bağlama, hem proteinler içinde hem de aralarında kovalent bağ oluşumunu içerir, bu da dokunun sertleşmesine ve dolayısıyla bozulmaya direnmesine neden olur. Pıhtılaşma, protein üçüncül yapısını deforme eden alkoller veya aseton kullanımı yoluyla proteinlerin dehidrasyonundan kaynaklanır, böylece hidrofobik veya sudan korkan bölgeler protein yüzeyini hareket ettirir. Pıhtılaştırıcı fiksasyon, parafin mumu gibi ortamların dokuya nüfuz etmesine yardımcı olabilir.
En yaygın kullanılan fiksatiflerden biri, bir suda çözünen formaldehit olan Formalin'dir. Fiksasyon sırasında formaldehit, methelen köprüsü adı verilen stabil bir çapraz bağ oluşturmak için lizin ve glutamin amino asitlerinin yan zincirlerinde bulunanlar gibi birincil aminlere bağlanır. Bu süreç doğası gereği yavaştır ve 1-2 gün kadar sürebilir.
Fiksasyondan önce birkaç husus göz önünde bulundurulmalıdır. İlk olarak, numunenin yayılımını göz önünde bulundurun. Fiksatifler, zamanın karekökü ile çarpılan fiksatif için difüzyon katsayısı ile ilgili bir oranda dokular boyunca bir mesafe yayacaktır. Numuneye 1 mm nüfuz etmesi 1 saat süren bir fiksatifin 5 mm'ye nüfuz etmesi 25 saat sürecektir. Formalin dokunun merkezine ulaştığında, çapraz bağlama reaksiyonu eşiğinin gerçekleşmesi gerekir. Bu nedenle, makul bir sürede kapsamlı sabitleme için numune boyutu 4 mm kalınlık ile sınırlandırılmalıdır.
İkinci olarak, fiksatifin hacmini ve pH'ını göz önünde bulundurun. Fiksatif/numune hacim oranı en az 40:1 olmalıdır, böylece reaktif zamanla kolayca tükenmez. Bazı fiksatifler asidik bir pH'ta çalışacak şekilde tasarlanırken, formalin, nötr bir pH'ı korumak için fosfat ile tamponlandığında en iyi sonucu verir, böylece fazla asit üretilmez, bu da dokuda artefaktlara neden olur.
Histolojik hazırlıktaki bir sonraki adım, numunenin kendisine benzer mekanik sertliğe sahip ortamda destekleyici numuneleri içeren gömmedir. Doğru gömme ortamını seçmek çok önemlidir, çünkü çok sert veya çok zayıfsa, kesitleme sırasında kusurlar meydana gelebilir. Şimdiye kadar, gömme için kullanılan en yaygın ortam parafin mumudur.
Parafin gömülmeden önce, numuneler, dokudaki suyun etanol ile değiştirilmesiyle, önce ksilenlerle, ardından ksilenler ve son olarak ısıtılmış parafin mumu ile kurutulmalıdır. Balmumu numuneye sızdıktan sonra, dikkatlice konumlandırılır ve bir blok oluşturmak için bir kalıp kullanılarak ek balmumu ile çevrelenir. Daha sonra, numuneler kesitleme için bir doku kasetine tutturulur.
Kesit alma, bir numunenin ince dilimlerini bir gömme bloğundan kesme işlemidir. Kesitler genellikle ışık mikroskobu ile kullanım için 4-10 μm kalınlığındadır.
Bölümleri kesmek için önce metal, cam veya elmas bir bıçak bir mikrotom üzerine sabitlenir. Numune daha sonra bir numune tutucuya yerleştirilir. Daha sonra, numune kesme yüzeyine ilerletilir ve istenen kalınlıkta bir dilim oluşturmak için bıçak boyunca çekilir. Bölümler, cam slaytlar üzerine yerleştirilebilecek ince şeritler halinde toplanacaktır.
Kesit alma işleminden sonra numuneler slaytlara yerleştirilir. Parafine gömülü numuneler için, dilimler önce ısıtılmış bir su banyosuna yerleştirilir ve daha sonra sudan kaydırağın üzerine kaldırılır ve kurumaya bırakılır.
Biyolojik dokunun çok az doğal kontrastı vardır, bu nedenle histolojiden sonra, slaytlar genellikle morfolojiyi veya spesifik proteinleri vurgulayan boyalar veya antikorlarla boyanır. Yapılan en yaygın boyama hematoksilen ve eozin veya H&E'dir. Çok yaygın olduğu için, çok sayıda bölümü H & E ile tekrarlanabilir bir şekilde boyamak için birçok otomatik makine yapılmıştır. Hematoksilen hücrelerin çekirdeklerini maviye boyar ve eozin sitoplazmayı pembe boyayarak dokuların hücresel morfolojisini ortaya çıkarır.
Fiksasyonun bir dezavantajı, proteinlerin çapraz bağlanmasının, antikorların bağlanma bölgelerini bulmak için etiketleme için daha fazla hale getirebilmesidir. Numuneleri korumak için fiksasyon kullanmak yerine, dokunun hızlı dondurulması veya ani dondurma kullanılabilir, bunu kriyoseksiyon
adı verilen bir kesit tekniği takip ederDoku numuneleri, OCT adı verilen özel bir dondurma ortamına veya optimum kesme sıcaklığı ortamına gömülür ve yönlendirilir ve ardından hızla dondurulur. Diğer gömme ortamları gibi, OCT de numunenin sertliğiyle eşleşir.
Donmuş bölümleri kesmek için bir kriyomikrotom veya kriyostat kullanılır ve bu cihaz, kesme bıçağını ve numuneleri serin tutmak için -20°C'lik bir iç sıcaklığı korur. Parafine gömülü bölümlerin aksine, donmuş bölümler, bölümlere ayrıldıktan hemen sonra pozitif yüklü bir cam slayt üzerine doğrudan kaldırılabilir.
Fiksasyonu önlemenin bir başka yolu, numunelerin taze hazırlanmış sıvı agaroz ile kaplandığı agar gömmedir. Agaroz soğudukça dokuyu yerine kilitler ve fazla agaroz kesilebilir.
Mikrotomun başka bir alternatifi olan vibrotomlar, agaroza gömülü numune boyunca titreşen ve hareket eden bir bıçağa sahiptir. Vibrotomlar, agaroz gömülü numunelerden 50-1000 μm mertebesinde kalın kesitler oluşturmak için kullanılır.
Numuneler tipik olarak boyamadan önce agarozdan çıkarılır ve daha sonra lamel numuneyi ezmesini önleyen vakumlu gres gibi bir madde ile çevrili bir slayt üzerine yerleştirilir. Her kalın bölümün yüksek çözünürlüklü görüntülerini elde etmek için en iyi şekilde konfokal mikroskopi kullanılarak görüntülenirler.
Az önce JoVE'nin ışık mikroskobu için histolojik numune hazırlama videosunu izlediniz.
Artık sizi bir doku parçasından lekelenebilir bir bölüme götürmek için numune hazırlama ile ilgili adımları anlamalısınız. Her zaman olduğu gibi, izlediğiniz için teşekkürler!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: Why is tissue fixation necessary in histological sample preparation?
Tissue fixation preserves cell and tissue structure by preventing degradation caused by naturally occurring enzymes released after cell death. Fixation inhibits enzyme activity and makes protein cleavage sites unrecognizable. The two main mechanisms are cross-linking, which forms covalent bonds to stiffen tissue, and coagulation, which dehydrates proteins using alcohols or acetone to deform their structure.
Q2: What are the two main mechanisms of tissue fixation?
Cross-linking involves covalent bond formation within and between proteins, causing tissue to stiffen and resist degradation. Coagulation dehydrates proteins through alcohols or acetone, deforming their tertiary structure so hydrophobic regions move to the protein surface. Coagulative fixation helps embedding media like paraffin wax penetrate tissue more effectively.
Q3: How does formalin work as a fixative in tissue preparation?
Formalin, formaldehyde dissolved in water, attaches to primary amines on amino acid side chains like lysine and glutamine, forming stable crosslinks called methylene bridges. This cross-linking process is inherently slow, requiring 1-2 days for completion. Formalin works best when buffered with phosphate to maintain neutral pH and prevent tissue artifacts.
Q4: What factors should be considered before tissue fixation begins?
Consider sample diffusivity: fixatives penetrate tissue at rates related to diffusion coefficient and time, so samples should be limited to 4 mm thickness for thorough fixation. Also consider fixative volume and pH. The fixative-to-sample ratio should be at least 40:1 to prevent reagent depletion. Formalin should be buffered with phosphate to maintain neutral pH and avoid tissue artifacts.
Q5: What is the purpose of embedding media in histological preparation?
Embedding media supports specimens with mechanical rigidity similar to the tissue itself. Paraffin wax is the most common embedding medium. Choosing appropriate embedding media is critical because media that is too stiff or too weak causes sectioning defects. Prior to paraffin embedding, samples must be dehydrated by replacing water with ethanol, then xylenes, and finally warmed paraffin wax.
Q6: How does cryosectioning differ from traditional paraffin-embedded sectioning?
Cryosectioning avoids fixation by rapidly freezing tissue in OCT (optimal cutting temperature) medium, then sectioning with a cryomicrotome maintained at -20°C. Unlike paraffin sections that require water bath treatment, frozen sections are directly lifted onto positively charged glass slides immediately after sectioning. This method preserves protein structure better for antibody labeling since cross-linking does not occur.
Q7: What are alternative embedding methods to paraffin wax?
Agar embedding covers samples with freshly prepared liquid agarose that locks tissue in place as it cools. Vibrotomes with vibrating blades cut thick sections of 50-1000 µm from agarose-embedded samples. Samples are typically removed from agarose before staining and mounted on slides with vacuum grease. Thick agarose sections are best viewed using light microscopy principle instrumentation and applications for high-resolution imaging.
Bu videodaki bölümler
0:00
Overview
1:05
Fixation of Tissue Samples
4:19
Embedding and Sectioning
6:12
Applications
9:01
Summary