Name: Fare Retina Ganglion Hücreleri Synaptic ve Yapay iletkenlikleri Dinamik Kelepçe Uygulama (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 46 s
Description: Öğrenin fare retina ganglion hücrelerinde dinamik kelepçe yöntemiyle sinaptik iletkenlikleri ve nöronal ateşleme aktivitesini nasıl inceleyeceğinizi. Bu teknik görsel işleme devrelerini anlamak için güçlü bir araçtır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma Biyomedikal Bilim Disiplin gelen Avustralya Araştırma Konseyi (ARC DP0988227) ve Biyomedikal Bilim Araştırma Girişimi Grant, Sydney Üniversitesi tarafından desteklenmektedir. Ekipman Patch Kelepçe Amplifikatör EPC 8 Biyomedikal Bilim, Sydney Üniversitesi Disiplin gelen Başlangıç ​​Fonu tarafından finanse edildi. Ekipman InstruTECH LIH 8 +8 Veri Toplama Sistemi Rebecca L. Cooper Vakfı ve Biyomedikal Bilim, Sydney Üniversitesi Disiplin gelen Başlangıç ​​Fonu&#39;ndan para ile satın alındı. Biz onların anlayışlı öneriler ve yorumlar için anonim teşekkür etmek istiyorum.

1. Genel Kurma ve Doku Hazırlama <ol><li> 30 dakika (kendi stres düzeyini azaltmak amacı) için karanlıkta fare tutun. Beklerken, hücre dışı çözelti 1 L hazırlar. Üretim Milli-Q su içinde yarım litre sodyum bikarbonat ve 1.9 g çözülür. PH değeri% 95 O2 ve% 5 CO2 ile kabarcıklar ile 7.4 &#39;de muhafaza edilmektedir. Beş dakika sonra, Milli-Q su ile 1 L&#39;ye kadar iyi, sodyum bikarbonat çözeltisine ilave edildi, Milli-Q su içinde, 100 ml Ames Orta 8.8 g çözülür ve iyice karıştırın. Deney geri kalanı için carboxygenated bu çözüm tutun. </li><li> Carboxygenated Ames Orta 250 ml alın ve elektrofizyolojik olarak sıvı reperfüzyon sistem set-up kurmak. Çözüm carboxygenated tutun. </li><li> Düzgün smear perfüzyon odasının alt üzerine vakum gres ince bir tabaka. Bir kapak kayma ile Seal ve hava geçirmez olduğundan emin olun. Yağ (çapı yaklaşık 2 mm), küçük bir miktar alın ve üstüne yerleştirmek vealt odasının biter. Bu toplar yerine ızgara (platin çerçeve diş ipi ile sinirli) tutun ve retina çok sert basarak önleyecektir. Platformun üzerine odası düzeltmek ve her iki açıklıklar hizalayın. </li><li> Hayvan servikal dislokasyon ile sakrifiye sonra 2 dakika ve için İsofluranın ilk anestezi olduğunu. Hızlı bir şekilde küçük makas (eğik kanatlı) bir çift gözleri kaldırmak, carboxygenated hücre dışı sıvı ile dolu bir Petri kabındaki yerleştirin daha sonra küçük bir beher carboxygenated hücre dışı sıvı ile iyice yıkayın, ve. </li><li> Diseksiyon mikroskobu altında, 19 gauge iğne kullanılarak kornea bir ekleme delik (kenarından ~ 2 mm) yapmak. Diğer göz için tekrarlayın. Bu önemli bir adım hem retinae bir oksijen sağlamak için hızlı olmalıdır. Kenarından paralel keserek iris makası küçük bir çift ile bir kornea çıkarın. Daha sonra, ince forseps bir çift ile iris ve lens çıkarın. Diğer göz için tekrarlayın. Içeren bir beher içine bir göz fincan transferhücre-dışı çözelti carboxygenated. </li><li> Bir neşter bıçak ile, tüm montaj düzleştirmek ve retina başına iki tam bağlar elde edebilmek için, yarım içine bir göz fincan kesti. Bir künt diseksiyon prob kullanılarak pigment epitel veya hafifçe çekerek retina dikkatle ayırın. Bir kez müstakil, retina oldukça şeffaftır. Dışbükey yüzey fotoreseptör tarafı unutmayın. Içbükey yüzeyi ile ganglion hücrelerinde tarafı ve yapışkan vitreus mizah varlığı nedeniyle kendisini yapışabilir. </li><li> Ince forseps bir çift, ora serrata için müstakil retina dokusunun yakın kenarında tutun ve ince forseps başka bir çift ile ora serrata kapmak, retinanın merkezine doğru çekin. Bu hassas bir süreçtir ve birkaç girişimleri alabilir. Eğer başarılı olursa, ora serrata, siliyer cisim ve vitreus mizah bu işlem tarafından kaldırılır ve retinanın eğrilik (yani düz) azalır. </li><li> Kesme kenarları, ve daha sonra başına aktarmakyukarı bakacak şekilde ganglion hücrelerinin ile füzyon odası. Yağ topları üzerine ızgara yerleştirerek yerinde doku tutun. Daha sonra kullanmak için diğer göz fincan kalan doku yerleştirin. Retina diseksiyon için benzer prosedürler Middleton ve Protti 16 ve Pottek ark tarif edilmiştir. 17. </li><li> Dik bir mikroskop altında kayıt odasına monte edin. 5 ml / dak - hemen 3 oranında carboxygenated ekstrasellüler çözüm (35.5 ° C) ile retina sürekli perfüzyon kurmak. Topraklama elektrot yerinde olduğundan emin olun. </li><li> Mikroskop bağlı doku görselleştirme sağlayan bir dijital fotoğraf makinesi. Tüm kurulum bir hava tablosu (darbe emme) üzerinde ve bir Faraday kafesi (blok dış statik ve statik olmayan elektrik alanları) içinde oturur. </li><li> Işık kaynağı (kızılötesi,&gt; 850 nm) ve bir 40X objektif ile açın, ganglion hücrelerinin hücre gövdeleri üzerine odağını getirmek. Recor için tüm montaj orta bölgesinde bulding. </li><li> Defrost K Dondurulmuş bir şişe + tabanlı hücre içi çözelti (300 ul, pH değeri = 7.4) ihtiva eden (mM olarak), K-glukonat: 140, HEPES asit: 10, MgCl2: 4,6, ATP-Na +: 4, GTP-Na + : 0.4 ve EGTA: 10. Tüm reaktifler, Sigma-Aldrich&#39;ten satın alınmıştır. </li></ol> 2. Retina Ganglion Hücre yama Hücre Organları <ol><li> İlk ateş borosilikat kılcal cam boru ucunda lehçe, daha sonra iki ısıtma adım (: - MQ 8 5 direnci) ile bir cam Mikroelektrod Çektirme ile çekin. </li><li> Hücre içi çözelti Lucifer sarının 3 ul (nihai konsantrasyon% 0.2) ekleyin, iyice karıştırın ve santrifüjlenir. Sonra, bir 30 G yeniden hipodermik iğne, sonra, 1 ml&#39;lik bir şırınga içine çözelti üstüne% 85 aktarmak için 0.22 um f ilter ünitesine bağlanır. Buzdolabında. </li><li> Tutucuya, kayıtlar için kullanılan benzer uç boyutu, cam pipet düzeltmek ve bir micromanipula kullanarak mikroskop altında harekettor. Bu iç sınırlayıcı membranı yüzeyinde küçük bir çukur edinceye kadar 40X objektif altında, yavaş yavaş pipet düşürmektedir. Bu doku küçük bir miktar yakalar kadar dikkatlice ileri pipet ilerlemek ve sonra ganglion hücrelerinin hücre gövdeleri ortaya çıkarmak için küçük bir delik gözyaşı yukarı ve / veya yana doğru hareket ettirin. Daha küçük delik, yüksek retina ağın bütünlüğü derecesi muhafaza edilmektedir. Eğer arzu edilirse, sülforhodamin 101 (SR101, 0,5-1 uM), 15 floresan mikroskobu kullanılarak hasar görmüş nöronların etiketlemek için hücre dışı ortama ilave edilebilir. </li><li> Hücre içi çözüm 10 ul - 8 ile temiz bir pipet doldurun. Amplifikatör kafası aşamasına bağlı tutucu içine yerleştirin ve klorlu gümüş klorür elektrot altında olduğundan emin olun. Eğer kir ve / veya hava kabarcıkları olan / mevcut atın. </li><li> Tüm ekipmanları açın. Biz gerilim kelepçe con tam hücreli kayıtları elde etmek için PatchMaster tarafından kontrol edilen bir EPC 8 yama kelepçe amplifikatör kullanılırfigürasyon. Hızlı modunda mevcut kelepçe kayıtları sağlayan diğer amplifikatör de kullanılabilir unutmayın. Pipet çözüm pozitif basınç uygulayın ve korumak. Oldukça bir yerinden amacrine hücre veya glial hücre daha ganglion hücre bu yüzden büyük olasılıkla büyük bir hücre gövdesi ile bir hücre seçin. Yavaşça, membran yüzeyinde küçük bir çukur yapma böylece, pipet alt durdurma ve basınç serbest bırakın. 60 mV - derhal tutma potansiyeli düşük. Bir gigaseal (GΩ) aralarında elde sonra, hafifçe bir tam hücreli yama kelepçe yapılandırma elde etmek için membran kırmak için emmek. Bu işlem çok fazla negatif basınç uygulanırsa, o zaman bağlantı sızan olur, hassas bir adımdır, çok az ise, membran bozulmadan kalır. </li><li> Zamanla, Lucifer Sarı hücrenin morfolojisi görselleştirme sağlayan, hücre dolduracaktır. Kararlı, bu kurulum 30 dakika veya daha fazla sürmelidir. </li></ol> 3. Dynami kullanarak Ganglion Hücreleri kayıtlarıc Kelepçe <ol><li> İlk olarak, bir akım-gerilim testi (gelen - 75 + 35 mV her 10 mV) PatchMaster kullanılarak yürütülür. Büyük bir Na + akımı (&gt; 1 nA) mevcut olması halinde daha sonra testlere devam edin. Bir yerinden amacrine hücre yamalı nadir olarak, bu durumda, sonraki mevcut enjeksiyon için harekete potansiyelleri trenler ile cevap unutmayın. </li><li> Açık LabVIEW ve özel yazılmış Neuroakuma programı çalıştırmak, daha sonra çeşitli iletkenlik dalga yükleyin. 8 (- 8 istatistik amacıyla 6) için tekrar sayısını ayarlayın. Sırasıyla 75 mV - 0 ve de eksitatör ve inhibitör iletkenlikleri iptali potansiyelleri ayarlayın. Test için eksitatör ve inhibitör iletkenlikleri birini eşleşen çifti seçin. Eksitatör iletkenlik iz (yeşil) ve inhibitör iletkenlik iz (kırmızı) alt panelinde görünür. </li><li> Geri PatchMaster git, mevcut kelepçe modunu seçin, ve hemen &#39;CC + İletişim HIZLI&#39; mevcut kelepçe moduna amplifikatör geçin. Bu mod acc sağlarurately membran potansiyeli hızlı değişiklikleri takip edin. Membran ve pipet arasında iyi bir sızdırmazlık bakımı yapılırsa, az / hiçbir tazminat gereklidir, aksi halde, kayıt uzun sürmez. Neuroakuma olarak, &quot;kayıt&quot; düğmesine basın. Hücresel yanıt (genellikle aksiyon potansiyelleri bir fazik patlama, Şekil 1A ile) üst panelinde görünür. Az / cevap görülmektedir eğer sert tepki üretir kadar, küçük artışlarla artırmak, ilk iletkenlikleri düşük ölçeklendirme ile hücre içine akım enjekte edilir. Aşırı akım enjeksiyon hücre öldürebilir. Bir kez testleri tamamlandığında, iletkenlik dalga yeni bir çift seçin fizyolojik ve yapay iletkenlikleri tüm çiftleri için yukarıdaki tekrarlayın. Gerçek zamanlı olarak enjekte fizyolojik akımları (I) dayanmaktadır: I (t) = Hariç G (t) X (V m (t) - V hata) + G inh (t) X (V m (t) - V inh) </li></ol> Iletkenlik (nS G) sy olabilirnaptic ya da yapay. Eksitatör ve inhibitör sinaptik iletkenlik dalga (TTX, 1 mcM) kontrol koşulları farklı görsel uyaranlara yanıt olarak ve tetrodotoxin varlığında Protti, Di Marco, Huang, Vonhoff, Nguyen ve Solomon (yayınlanmamış) tarafından gerçekleştirilen önceki deneyler toplanmıştır . Yapay iletkenlik dalga bir alfa işlevi kullanılarak modellenmiştir. V m (mV), kaydedilen membran potansiyeldir. V hariç ve V inh sırasıyla eksitatör ve inhibitör iletkenlikleri en ters potansiyelleri temsil ederken G hariç ve G inh sırasıyla eksitatör ve inhibitör iletkenlikleri temsil eder. Zaman ms t. Örnekleme oranı 40 kHz. Ben s = I 0 (t / α) E-Ht olarak Yukarıdaki denklem bir alfa fonksiyonu (, akımın zirvesine 1 / α = zaman (sn -1) I 0 = maksimum akım) &#39;dir. Yükselme zamanı ve sinaptik çürüme süresiMevcut α 4 tarafından belirlenir. Inhibitör iletkenlik ve gecikme uyarma başlangıcı (Şekil 2B) göre kendi gecikme azaltarak, güncellenmiştir iken eksitatör iletkenlik değişmedi. <ol start="4"><li> Hücre gövdesi sağlam kalması için Kayıttan sonra, dikkatli bir pipet geri çekin. Hemen fosfat tamponu, 0.1 M, üç adet 10 dakika yıkama ve ardından 30 dakika boyunca% 4 paraformaldehid içinde doku çözmek. Buzdolabında ve ertesi gün ya da bir hafta içinde boyama antikor gerçekleştirin. </li></ol> 4. Lucifer Sarı Dolgulu Retina Ganglion Hücreleri Karşı Antikor Boyama <ol><li> İkincil keçi anti-tavşan IgG (seyreltme = 1:500 ile altıncı gününde, gece boyama; oda sıcaklığında Lucifer Sarı dolu ganglion hücrelerinin (beş gün boyunca birincil anti-Lucifer Sarı tavşan IgG (seyreltme = 1:10,000) karşı antikor boyama )). Floresan korunması Medya retina monte ıslatın. Tırnak p kayma ve mühür Kapakolish. </li><li> Leica Spec-II konfokal mikroskop (Şekil 1B) kullanarak hücre morfolojisinin konfokal fotoğraf çekmek. Bir akson varlığı ganglion hücrelerinin onay verir. </li></ol>

<ol><li>Robinson, H. P. C., Kawai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injection+of+digitally+synthesized+synaptic+conductance+transients+to+measure+the+integrative+properties+of+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Injection of digitally synthesized synaptic conductance transients to measure the integrative properties of neurons.</a> Journal of Neuroscience Methods. 49, 157-165 (1993).</li>
<li>Sharp, A. A., O'Neil, M. B., Abbott, L. F., Marder, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamic+clamp%3A+artificial+conductances+in+biological+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The dynamic clamp: artificial conductances in biological neurons.</a> Trends in Neuroscience. 16, 389-394 (1993).</li>
<li>Sharp, A. A., O'Neil, M. B., Abbott, L. F., Marder, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+clamp%3A+computer-generated+conductances+in+real+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Dynamic clamp: computer-generated conductances in real neurons.</a> Journal of Neurophysiology. 69, 992-995 (1993).</li>
<li>Johnson, D., Wu, S. M. -S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJohnson%2C+D+%22Foundations+of+cellular+neurophysiology%22">Foundations of cellular neurophysiology</a>. , The MIT Press. London. (1995).</li>
<li>Taylor, W. R., Vaney, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+synaptic+mechanisms+generate+direction+selectivity+in+the+rabbit+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Diverse synaptic mechanisms generate direction selectivity in the rabbit retina.</a> Journal of Neuroscience. 22 (17), 7712-7720 (2002).</li>
<li>Jurkat-Rott, K., Lehmann-Horn, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+patch+clamp+technique+in+ion+channel+research%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Pharmaceutical+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">The patch clamp technique in ion channel research.</a> Current Pharmaceutical Biotechnology. 4, 221-238 (2003).</li>
<li>Prinz, A. A., Abbott, L. F., Marder, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamic+clamp+comes+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The dynamic clamp comes of age.</a> Trends in Neuroscience. 27, 218-224 (2004).</li>
<li>Williams, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+compartmentalization+and+functional+impact+of+conductance+in+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Spatial compartmentalization and functional impact of conductance in pyramidal neurons.</a> Nature Neuroscience. 7 (9), 961-967 (2004).</li>
<li>Perkins, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-attached+voltage-clamp+and+current-clamp+recording+and+stimulation+techniques+in+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Cell-attached voltage-clamp and current-clamp recording and stimulation techniques in brain slices.</a> Journal of Neuroscience Methods. 154 (1-2), 1-18 (2006).</li>
<li>Feng, S. S., Jaeger, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+SK+calcium-dependent+potassium+currents+in+regulating+the+activity+of+deep+cerebellar+nucleus+neurons%3A+a+dynamic+clamp+study%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebellum%22%5BJournal%5D)">The role of SK calcium-dependent potassium currents in regulating the activity of deep cerebellar nucleus neurons: a dynamic clamp study.</a> Cerebellum. 7 (4), 542-546 (2008).</li>
<li>Butera, R., Lin, R. Key factors for improving dynamic clamp performance. In: Dynamic-Clamp From Principles to Applications Series. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aButera%2C+R+%22Dynamic-Clamp+From+Principles+to+Applications+Series%3A+Springer+Series+in+Computational+Neuroscience%22">Dynamic-Clamp From Principles to Applications Series: Springer Series in Computational Neuroscience</a>. Destexhe, A., Bal, T. 1, Springer. (2009).</li>
<li>Marco, S. D. i, Nguyen, V. A., Bisti, S., Protti, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permanent+functional+reorganization+of+retinal+circuits+induced+by+early+long-term+visual+deprivation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Permanent functional reorganization of retinal circuits induced by early long-term visual deprivation.</a> The Journal of Neuroscience. 29 (43), 13691-13701 (2009).</li>
<li>Zhao, Y., Inayat, S., Dikin, D. A., Singer, J. H., Ruoff, R. S., Troy, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch+clamp+technique%3A+review+of+the+current+state+of+the+art+and+potential+contributions+from+nanoengineering%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Institution+of+Mechanical+Engineers%2C+Part+N%3A+Journal+of+Nanoengineering+and+Nanosystems%22%5BJournal%5D)">Patch clamp technique: review of the current state of the art and potential contributions from nanoengineering.</a> Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part N: Journal of Nanoengineering and Nanosystems. 222 (1), 1-11 (2009).</li>
<li>Lobb, C. J., Paladini, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+a+NMDA+receptor+conductance+in+rat+midbrain+dopaminergic+neurons+using+the+dynamic+clamp+technique%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Application of a NMDA receptor conductance in rat midbrain dopaminergic neurons using the dynamic clamp technique.</a> J. Vis. Exp. (46), e2275(2010).</li>
<li>Briggman, K. L., Euler, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bulk+electroporation+and+population+calcium+imaging+in+the+adult+mammalian+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Bulk electroporation and population calcium imaging in the adult mammalian retina.</a> Journal of Neurophysiology. 105 (5), 2601-2609 (2011).</li>
<li>Middleton, T. P., Protti, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cannabinoids+modulate+spontaneous+synaptic+activity+in+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Visual+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Cannabinoids modulate spontaneous synaptic activity in retinal ganglion cells.</a> Visual Neuroscience. 28 (5), 393-402 (2011).</li>
<li>Pottek, M., Knop, G. C., Weiler, R., Dedek, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+characterization+of+GFP-expressing+cell+populations+in+the+intact+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological characterization of GFP-expressing cell populations in the intact retina.</a> J. Vis. Exp. (57), e3457(2011).</li>
</ol>

Tüm işlemler ilk Sydney Üniversitesi Hayvan Bakım Etik Kurulu tarafından onaylanmış ve Bilimsel Amaçlı Hayvan Bakımı ve Kullanımı için Uygulama Avustralya Kanunu&#39;nun kuralları (Ulusal Sağlık ve Avustralya Tıbbi Araştırma Konseyi uygun olarak yapıldı .)

Burada oranı ve uyarma ve retina ganglion hücre çıkış inhibe göreli zamanlama etkisini değerlendirmek için dinamik kelepçe kullanımını göstermektedir. Dinamik kelepçe yaşayan nöronların içine fizyolojik kaydedilmiş veya yapay sinaptik iletkenlikleri tanıtmak için bilgisayar simülasyonları kullanır. Bu metodoloji iletkenlikleri değiştirilmiş ve nöronal yanıtları üzerindeki etkilerini hesaplamak için nöronlar enjekte edilebilir hangi interaktif bir araçtır. İletkenlik dalga görsel uyaranlara kontrol şartlarında ve belirli...

Retina gözün arka astar yakın bir şeffaf sinir dokudur. Birçok çalışma, ilk görsel işleme adımları ve sinaptik sinyal mekanizmaları araştırmak için model olarak retina kullanın. Tüm montaj hazırlanmasında retina ağ diseksiyonu sonra bozulmadan kaldığı için, onun fizyolojik yanıtlar in vivo koşullarda çok benzer olarak sinaptik etkileşimleri çalışmak için ideal bir sistem temsil eder. Böylece, kendi nöronların özelliklerini yama kelepçe teknikleri (tekniği ile ilgili yorumlar için, 6,9,13 bakınız) kullanılarak incelenebilir izole bir retina kullanarak. Farmakolojik ajanlar çeşitli sitelerde hareket gibi özel devreler ve ganglion hücre yanıt nörotransmitterlerin tam katkısının belirlenmesi, ancak, genellikle engellenmektedir. Işık retina nöronların fizyolojik yanıtlar, doğal uyarıcı, hücre içi sıvı dolu cam pipetler ile kaydedilebilir. Yama cl kullanarakamp teknikleri, ışık uyarılması nöronal yanıtları membran potansiyeli dalgalanmaları (Güncel kelepçe) veya akım (voltaj kelepçe) olarak kaydedilebilir. Farklı gerilimlerde membran potansiyeli tutarak ve sonradan iletkenlik analizi uygulayarak, bu inhibitör ve eksitatör sinaptik girdi 5,12 izole etmek mümkündür. Bu tür deneyler normal bir banyo ortamı içinde ve farklı nörotransmitter ve nöronal yanıtları reseptörlerinin katkı yalıtmak için farklı farmakolojik ajanların varlığında gerçekleştirilebilir. Birçok laboratuarlardan çalışmaların bir zenginlik spike çıktı ve uyarıcı boyut gibi özellikleri, kontrast, mekansal ve zamansal frekansları, yön, yönlendirme ve diğer uyarıcı değişkenlere eksitatör ve inhibitör girdi bağımlılığı karakterize. Bu deneysel yaklaşımlar başak çıkışı ve uyarıcı özellikleri bir fonksiyonu olarak sinaptik girişleri arasındaki ilişki hakkında bilgi vermek olsa da,hücre uyarılma özgü hücre tipleri ve sinaptik girdi katkısı yorumlanması kolay değildir. Bu, tipik olarak uyarıcı ve inhibitör girişi uyarıcı özelliklerine bağlı olarak değişir ve bu nedenle, bu girişlerin her biri değişiklikler nöronal spike üzerinde sahip olduğu kesin etkisini değerlendirmek mümkün değildir olmasından kaynaklanmaktadır. Bu sınırlamalar aşmak için alternatif bir yaklaşım çıkış spike bireysel sinaptik girdi katkısı bir eleştirel değerlendirme izin dinamik kelepçe kayıtları üzerinden taşımaktır. Dinamik kelepçe tekniği hücreye akım direkt enjeksiyon sağlayan ve belirli bir zamanda mevcut enjekte miktarı o zaman 1,2,3 (inceleme için, 7,14 bakınız) kaydedilen membran potansiyeline bağlıdır. Bu modifiye edilmiş bir akım kelepçe set-up olduğu kayıt altında hücre ve özel donanıma oluşan donanım, yazılım arasında gerçek zamanlı, hızlı geri besleme etkileşimve bir bilgisayar elde edilir. Hücreye geçerli enjekte miktarı buna göre hesaplanır. Bu nedenle, bu yöntemin avantajı hücre iletkenlik dalga farklı kombinasyonları ile stimüle edilebilir, ve tepki sinaptik girdi aracılık reseptörlerinin aktivasyonu taklit edecek olmasıdır. Örneğin, küçük bir nokta için uyarıcı iletkenlik enjeksiyonu için tepki ile küçük bir nokta için eksitatör ve inhibitör iletkenlikleri enjeksiyonu yanıt karşılaştırılması sadece hücre yanıt inhibisyonu etkisi hakkında bilgi sağlar. Aynı şekilde, fizyolojik olarak kaydedilen iletkenlikleri diğer kombinasyonları başak çıkış nasıl etkilediğini uyarıcı bağımlı eksitatör ve / veya inhibitör iletkenlikleri değişiklikleri ortaya çıkarmak için birlikte enjekte edilebilir. Bizim çalışmamızda, dinamik klemp tekniği nispi genlik ve retinal ganglion hücreleri ateşleme özelliklerine sinaptik girdi zamanlamasının etkisini göstermek için kullanılır. Çeşitli iletkenlikleriKontrol koşullarında ya da farmakolojik ajanların mevcudiyetinde fizyolojik deneylerden elde edilen girdi olarak kullanılmıştır. Buna ek olarak, alfa fonksiyonları dayalı yapay iletkenlikleri de sinaptik girişleri nöronlar tarafından entegre nasıl araştırmak amacıyla kullanılmıştır. Bu nedenle, bu iletkenlik çeşitli farmakolojik olarak veya hesaplama aynı ganglion hücre içine enjekte edilmesi, ya da fizyolojik olarak oluşturulur, bu uçlara tepkilerin nedenle karşılaştırma yapılabilir sağlayan çok yönlü bir tekniktir.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagent</td></tr><tr><td>Isofluran İnhalasyon</td><td></td> L-Glutamat (Toz) Sigma-Aldrich Potasyum Glukonat İçeren Anestezik Pharmachem <td></td><td></td></tr><tr><td>Ames Ortamı</td><td></td>, Susuz Sigma-Aldrich HEPES Sodyum tuzu Sigma-Aldrich Magnezyum klorür çözeltisi (<td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 4.9 mol/l)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adenozin 5'-trifosfat (ATP) disodyum tuzu hidrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Guanozin 5'-trifosfat sodyum tuzu hidrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Etilen glikol-bis(2-amin&#8211; thylether)- N, N, N', N'-tetraasetik asit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit Tozu,% 95</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-Lucifer Sarı, Tavşan IgG Fraksiyonu (3 mg / ml)</td> <td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Keçi Anti-Tavşan IgG (H + L) 2 mg / ml</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Floresan Koruyucu Medya</td><td>BioFX Laboratuvarlar A.Ş.</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>Alev cilalı uçları olan kılcal cam boru (OD = 1,50 mm, ID = 0,86 mm, Uzunluk = 15 cm)</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0794</td><td></td></tr><tr><td>Tek Kademeli Cam Micr&#8211; lectrode Çektirme</td><td>Narishinge Japonya</td><td>Model PP-830</td><td></td></tr><tr><td>Minipuls 2</td><td>Gilson</td><td></td><td></td></tr> <tr><td> Millex-GV 0.22 & mu; m Filter</td><td>Ünitesi Millipore Corporation</td><td>SLGV004SL</td><td></td></tr><tr><td>Luer Lock Yeniden Kullanılabilir Hipodermik İğne: 30 G</td><td>Smith Nephew (Avustralya)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tek Sıralı Çözelti Isıtıcı</td><td>Warner Instruments Model</td><td>SH-27B</td><td></td></tr><tr><td>Çift Otomatik Sıcaklık Kontrol Cihazı</td><td>Warner Instruments</td><td>TC-344B</td><td></td></tr><tr><td>Olympus Stereomikroskop SZ61</td><td>Olympus Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Olympus Mikroskop BX50WI: 40X objektif ile</td><td>Olympus Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0-30 V 2.5 A DC Güç Kaynağı</td><td>Dick Smith Electronics</td><td>Q1770</td><td></td></tr><tr><td>Dijital Mikroskobik Kamera ProgResMF serin</td><td>Jenoptik</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipülatör MP-225</td><td>Sutter Enstrüman Şirketi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Yama Kelepçesi Amplifikatör EPC 8</td><td>HEKA Elektronik</td><td></td><td></td></tr><tr><td>InstruTECH LIH 8+8 Veri Toplama Sistemi</td><td>HEKA Elektronik</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bilgisayar: DELL</td><td>Dell Corporation</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

fare retina ganglion hücreleri synaptic ve yapay iletkenlikleri dinamik kelepçe uygulama

Implementing Dynamic Clamp with Synaptic and Artificial Conductances in Mouse Retinal Ganglion Cells

Ganglion hücrelerinin retinanın çıkış nöronlar ve faaliyetlerini belirli sinir devrelerinden kaynaklanan birden fazla sinaptik girdi entegrasyonu yansıtır. Voltaj-kıskaç ve akım kelepçe yapılandırmalarda yama kıskaç teknikleri, yaygın olarak nöronların fizyolojik özelliklerini incelemek için ve sinaptik girişleri karakterize etmek için kullanılır. Bu tekniklerin uygulanması son derece bilgilendirici olmasına rağmen, onlar çeşitli sınırlamalar oluşturmaktadır. Örneğin, eksitatör ve inhibitör girdi kesin etkileşimleri tepki çıkışı nasıl etkilediğini ölçmek zordur. Bu sorunu gidermek için, biz de iletkenlik kelepçe 1, 2, 3 olarak adlandırılan değiştirilmiş bir akım kelepçe tekniği, dinamik kelepçe, kullanılan ve sinirsel uyarıların üzerinde eksitatör ve inhibitör sinaptik girdi etkisini inceledi. Bu teknik, hücre içine akım enjeksiyon gerektirir ve o zaman onun membran potansiyelinin gerçek zamanlı geribildirim bağlıdır. Enjekted mevcut önceden belirlenmiş eksitatör ve inhibitör sinaptik iletkenlikleri, onların ters potansiyelleri ve hücrenin anlık membran potansiyeli hesaplanır. Deney prosedürleri ile ilgili ayrıntılar, dinamik sıkıştırma tekniğinin bir bütün hücre konfigürasyonu ve iş elde etmek için hücreleri sıkma yama Bu video makalede de gösterilmiştir. Burada, kumanda koşullarda ya da ilaç mevcudiyetinde fizyolojik deneylerden elde edilen çeşitli iletkenlik dalga fare retinal ganglion hücre sırasında olan tepkileri gösterir. Ayrıca, hücre yanıtları incelemektir alfa fonksiyonları kullanarak oluşturulan suni eksitatör ve inhibitör iletkenlikleri kullanılmasını gösterir.

Ganglion hücre yanıtları inhibitör girdi farklı kaynaklardan katkısı çeşitli iletkenlik dalga uygulaması ile gösterilmiştir. Bu dalga formları, normal koşullarda ve bloklar tesirinin inhibitör retina internöron bir alt potansiyel üretimi sağlar. Şekil 2A, enjeksiyon için temsili bir tepki gösterir TTX bir voltaj kapılı Na + kanal engelleyicisi varlığında, farklı parlaklık uyarıcı ile elde edilmiştir eksitatör ve inhibitör iletkenlik dalga normal şartlarda gri bir arka plan üzerinde küçük siya...

Bu video makalede hücre gövdeleri yama kurulum, usul ve nasıl tüm montaj fare retinae ganglion hücrelerinden dinamik kelepçe kayıtları uygulamaya göstermektedir. Bu teknik, eksitatör ve inhibitör sinaptik girdi kesin katkısının incelenmesi ve nöronal spike için göreceli büyüklüğü ve zamanlaması sağlar.

Fare Retina Ganglion Hücreleri Synaptic ve Yapay iletkenlikleri Dinamik Kelepçe Uygulama

Ganglion cells are the output neurons of the  retina and their activity reflects the integration of multiple synaptic inputs  arising from specific neural ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, model nöronlar olarak retinal ganglion hücreleri kullanılarak, eksitatör ve inhibitör sinaptik girdilerin oranındaki ve göreceli zamanlamasındaki değişikliklerin nöronların spike aktivitesi üzerindeki etkilerini incelemektir. Bu işlem, bütün halde bir retinadaki ganglion hücresinin hücre gövdesine; fizyolojik iyonik kompozisyona benzer bir hücre içi solüsyon ve hücre tipini morfolojik olarak tanımlamak için Lucifer yellow ile doldurulmuş bir cam pipet kullanılarak patch yapılmasıyla gerçekleştirilir. İkinci bir adım olarak, dinamik klempleme yöntemi kullanılarak hücre gövdesine bir dizi eksitatör ve inhibitör kondüktans dalga formu enjekte edilir ve bu işlem yanıt olarak membran potansiyelinde bir değişikliğe neden olur. Ardından, karşılık gelen nöronal yanıtları elde etmek amacıyla, kontrol koşullarında veya ilaçların varlığında gerçekleştirilen fizyolojik deneylerden elde edilen çeşitli kondüktans dalga formları hücre gövdesine enjekte edilir.Sonuçlar, dinamik klem kayıtları aracılığıyla eksitatör ve inhibitör kondüktanslardan oluşan akımların enjekte edilmesine dayanarak, eksitasyon ve inhibisyon oranındaki değişikliklerin retinal ganglion hücreler

implementing-dynamic-clamp-with-synaptic-artificial-conductances

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu video, sıçan beyin dilim tam hücre yapılandırması kaydedilen bir dopaminerjik nöron içine iletkenliği nasıl uygulanacağını göstermektedir. Bu teknik, dinamik kelepçe denir.

Dinamik Kelepçe Tekniği ile Sıçan orta beyin dopaminerjik nöronlar NMDA Reseptör İletkenlik Uygulama

Bu makale, fare izole retinal hazırlanması incelemek ve kaydetmek için nasıl bir açıklama sağlar. Özellikle, floresan etiketli ganglion hücre popülasyonu ışık yanıtlarını kaydetmek ve daha sonra belirlemek ve morfolojisi analiz nasıl açıklar.

Genetik Etiketli Retina Ganglion Hücreleri Işık Tepkisi Record İzole Retina Hazırlık

Bu video, düz montajlı bir fare retinasından elektrofizyolojik kayıt için tam hücre yama kelepçesi tekniğini göstermektedir. Retina içindeki yıldız patlaması amakrin hücrelerine (SAC'ler) yaklaşmak için elektrotlu ince bir cam pipet kullanılır. Bir conta oluşturduktan sonra, zarı yırtmak ve tüm hücre yama-kelepçe konfigürasyonunu oluşturmak için emme uygulanır. Son olarak, iyonların SAC sinaptik reseptörlerinden akışı konfigürasyon kullanılarak ölçülür.

Düz Montajlı Bir Fare Retinasından Elektrofizyolojik Kayıt için Tam Hücre Yama Kelepçesi Oluşturma

Bu video, karanlığa uyarlanmış bir fare retina dokusu dilimi hazırlığında ışıkla uyarılan post-sinaptik yanıtların kaydını göstermektedir. Retina dilimi bir kayıt odasına yerleştirilir ve bir retinal ganglion hücresi ile elektriksel süreklilik sağlamak için bir kayıt pipeti kullanılır. Pipet tarafından kaydedilen ganglion hücrelerinde uyarıcı post-sinaptik potansiyeller oluşturmak için ışık darbeleri uygulanır.

Fare Retina Dilimlerinin Nöronlarında Işık Uyarılmış Postsinaptik Yanıtlar

Bu video, medial prefrontal korteks (mPFC) aksonlarını optogenetik olarak uyararak ve LEC'deki piramidal nöronların yanıtlarını kaydederek lateral entorinal kortekste (LEC) sinaptik verimliliği inceleme prosedürünü göstermektedir. Bu yöntem, sinaptik plastisiteyi incelemek için yama-kelepçe kayıtlarını ışık stimülasyonu ile sinaptik aktivasyon ile birleştirir.

Sıçan Beyin Dilimlerinde Sinaptik Olayların Optogenetik Stimülasyonu ve Elektrofizyolojik Kaydı

İmmünohistokimya protokolleri retinada, spesifik bir proteinin lokalizasyonu incelemek için kullanılır. Kalsiyum görüntüleme teknikleri retina ganglion hücrelerinin ve bunların akson kalsiyum dinamiklerini incelemek için istihdam edilmektedir.

Wholemount Sıçan Retina Immunohistochemical ve Kalsiyum Görüntüleme Yöntemleri

Kapalı döngü protokolleri günümüz elektrofizyolojisinde giderek yaygınlaşmaktadır. Kortikal piramidal nöronlarda in vitro olarak karmaşık elektrofizyolojik protokolleri gerçekleştirmenin basit, çok yönlü ve ucuz bir yolunu sunuyoruz.

Gerçek zamanlı Elektrofizyoloji: Probe Nöronal Dynamics ve Ötesi Kapalı çevrim Protokolleri Kullanma

Bu protokol, düz monte hazırlık retina nöronlar üzerinde tüm hücre yama kelepçe kayıt yapmak gösterilmiştir.

Deafferentated Fare Retina bir düz montaj Hazırlık patlaması amacrine hücreleri Yama Kelepçe Kaydı

Burada, lateral genikulat çekirdeğini içeren akut beyin dilimleri ve retinogeniculate ve kortikogeniculate sinenler fonksiyonunun elektrofizyolojik incelenmesi için protokoller sunuyoruz. Bu protokol, aynı akut beyin dilimleri içinde yüksek salınımı ve düşük salınımı olasılığı ile sinaps incelemek için etkili bir yol sağlar.

Retinogeniculate ve Kortikogeniculate SYNAPSE fonksiyonunun elektrofizyolojik Incelemeleri

Bir retinal nöronun elektriksel stimülasyona yanıt olarak davranışlarını hesaplamalı olarak modellemek için bir iş akışını özetliyoruz. Hesaplamalı model çok yönlüdür ve bir dizi fizyolojik senaryoyu simüle etmede ve gelecekteki in vivo / in vitro çalışmaların sonuçlarını tahmin etmede yararlı olan otomasyon adımlarını içerir.

Görsel Protez Araştırmaları için Retinal Nöronların Hesaplamalı Modellemesi - Temel Yaklaşımlar

Dinamik kelepçe elektrofizyolojisi, nöronal ateşleme eksiklikleri ile iyon kanalı disfonksiyonu arasında nedensel bağlantılar kurabilir. Fare serebellar Purkinje nöronlarında dinamik kelepçe yöntemlerini ve protokollerini açıklıyoruz, faydalı kaynaklara ve teknik hususlara dikkat çekiyoruz. Temsili bir çalışmada, tekrarlayan ateşlemeyi kurtarmak için Tsc1-/- Purkinje nöronlarına modellenmiş sodyum iletkenliği ekliyoruz.

Otizmle İlişkili Bozulmuş Nöronal Uyarılabilirliği Araştırmak için Dinamik Kelepçe Yöntemleri

Öğrenin fare retina ganglion hücrelerinde dinamik kelepçe yöntemiyle sinaptik iletkenlikleri ve nöronal ateşleme aktivitesini nasıl inceleyeceğinizi. Bu teknik görsel işleme devrelerini anlamak için güçlü bir araçtır.

Fare Retina Ganglion Hücreleri Synaptic ve Yapay iletkenlikleri Dinamik Kelepçe Uygulama

Daha fazla video keşfet