Fare Retina Ganglion Hücreleri Synaptic ve Yapay iletkenlikleri Dinamik Kelepçe Uygulama

Aşağıdaki deneyin genel amacı, model nöronlar olarak retinal ganglion hücreleri kullanılarak, eksitatör ve inhibitör sinaptik girdilerin oranındaki ve göreceli zamanlamasındaki değişikliklerin nöronların spike aktivitesi üzerindeki etkilerini incelemektir. Bu işlem, bütün halde bir retinadaki ganglion hücresinin hücre gövdesine; fizyolojik iyonik kompozisyona benzer bir hücre içi solüsyon ve hücre tipini morfolojik olarak tanımlamak için Lucifer yellow ile doldurulmuş bir cam pipet kullanılarak patch yapılmasıyla gerçekleştirilir. İkinci bir adım olarak, dinamik klempleme yöntemi kullanılarak hücre gövdesine bir dizi eksitatör ve inhibitör kondüktans dalga formu enjekte edilir ve bu işlem yanıt olarak membran potansiyelinde bir değişikliğe neden olur. Ardından, karşılık gelen nöronal yanıtları elde etmek amacıyla, kontrol koşullarında veya ilaçların varlığında gerçekleştirilen fizyolojik deneylerden elde edilen çeşitli kondüktans dalga formları hücre gövdesine enjekte edilir.

Sonuçlar, dinamik klem kayıtları aracılığıyla eksitatör ve inhibitör kondüktanslardan oluşan akımların enjekte edilmesine dayanarak, eksitasyon ve inhibisyon oranındaki değişikliklerin retinal ganglion hücrelerinin spike aktivitesi üzerindeki etkilerini göstermektedir. Bu tekniğin akım klemi veya voltaj klemi gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, hücresel yanıtlar üzerindeki etkiyi araştırmak amacıyla eksitatör ve inhibitör sinaptik kondüktansların oranının ve göreceli zamanlamasının nöronlara enjekte edilebildiği etkileşimli bir araç sunmasıdır. Bu metodoloji, retinal devrelerin yanı sıra merkezi sinir sistemindeki diğer tüm nöronal ağların işleyişine dair içgörüler sağlayabilir.

Bu prosedüre, elektrofizyolojik düzeneğe 250 mililitre karboksi oksijenle zenginleştirilmiş aims ortamı ile reperfüzyon sistemini kurarak başlayın. Ardından, perfüzyon haznesinin tabanına ince bir tabaka vakum gresini homojen bir şekilde sürün. Hazneyi bir lamel ile kapatın ve hava sızdırmaz olduğundan emin olun.

Ardından, odağının üst ve alt uçlarına az miktarda gres yağı sürün. Gres yağı, ızgarayı yerinde tutacak ve retinanın üzerine çok fazla baskı yapmasını önleyecektir. Şimdi odayı platforma sabitleyin ve ardından her iki açıklığı hizalayın.

İzofluran ile anestezi uygulandıktan sonra hayvanı servikal dislokasyon ile sakrifiye edin. Gözlerini küçük, kavisli bir makasla hızla çıkarın. Gözleri küçük bir beher içerisinde karbondioksitten arındırılmış hücre dışı sıvısı ile iyice yıkayın ve karbondioksitten arındırılmış hücre dışı sıvısı ile doldurulmuş bir Petri kabına yerleştirin.

Diseksiyon mikroskobu altında, her iki gözün korneasında kenardan yaklaşık iki milimetre uzaklıkta 19 gauge iğne kullanarak bir giriş deliği açın. Bu önemli adım, her iki rein a'nın oksijenlenmesine izin vermek için hızlıca gerçekleştirilmelidir. Ardından, kenarına paralel şekilde keserek küçük bir iris makası yardımıyla bir korneayı çıkarın.

Ardından, ince uçlu bir pensle irisi ve lensi çıkarın ve aynı işlemleri diğer göz için tekrarlayın. Bir göz çukurunu, karboksin oksijenlendirilmiş hücre dışı çözelti içeren bir behere aktarın. Bistüri ucuyla bir göz çukurunu ikiye bölün, ardından küt bir disseksiyon probu kullanarak veya hafifçe çekerek retinayı pigment epitelinden nazikçe ayırın.

Ardından, ayrılan retina dokusunun kenarını ince bir pensetle ora sertaya yakın tutun ve ora sertayı başka bir ince pensetle kavrayın. Onu retinanın merkezine doğru çekin. Bu hassas bir işlemdir ve birkaç deneme gerektirebilir.

İşlem başarılı olursa, siliyer cisim ve vitreus hümörü uzaklaştırılacak ve retinanın eğriliği azaltılacaktır. Ardından kenarları kesin ve retinayı, ganglion hücreleri yukarı bakacak şekilde perfüzyon kamarasına aktarın. Izgarayı gres toplarının üzerine yerleştirerek dokuyu sabit tutun.

Kalan dokuyu, daha sonra kullanmak üzere diğer göz kabı ile carbox oksijenlendirilmiş hücre dışı solüsyonda saklayın ve kayıt odasını dik bir mikroskobun altına yerleştirin. Retinanın carbox oksijenlendirilmiş hücre dışı solüsyon ile dakikada 3-5 mL hızda ve 35.5 °C sıcaklıkta sürekli perfüzyonunu derhal ayarlayın; topraklama elektrodunun yerinde olduğundan emin olun. Şimdi mikroskobun ışık kaynağını açın ve 40x objektif aracılığıyla odağı ganglion hücrelerinin gövdelerine getirin.

Kayıt için delik montajının merkezini belirleyin. Bu adımda, beş ila sekiz mega ohm değerinde bir cam pipeti tutucusuna sabitleyin ve 40 x objektif altında bir mikro manipülatör kullanarak mikroskobun altına taşıyın. Pipeti, iç sınırlayıcı membran yüzeyinde küçük bir çukur oluşturana kadar yavaşça indirin.

Pipeti, küçük bir miktar dokuyu yakalayana kadar dikkatlice ileri sürün ve ardından ganglion hücrelerinin hücre gövdelerini açığa çıkarmak için küçük bir delik açacak şekilde yukarı ve/veya yanlara doğru hareket ettirin. Şimdi temiz bir pipeti, Lucifer yellow içeren 8 ila 10 µL potasyum bazlı hücre içi çözelti ile doldurun. Pipeti, amplifikatörün kafa aşamasına bağlı tutucuya yerleştirin ve klorürlenmiş gümüş klorür elektrodun daldırılmış olduğundan emin olun.

Geniş bir hücre gövdesine sahip bir hücre seçin. Membran yüzeyinde küçük bir çukur oluşturmak için pipet ucunu pozitif basınçla yavaşça indirin. Ardından, bir giga seal elde etmek için basıncı durdurun ve serbest bırakın.

Giga seal sağlandıktan sonra, tüm hücre yama kenetleme (whole cell patch clamp) konfigürasyonuna ulaşmak için membranı kırmak amacıyla nazikçe negatif basınç uygulayın. Bu prosedür hassas bir adımdır. Çok fazla negatif basınç uygulanırsa, bağlantı sızdırmaya başlar.

Miktar çok az olursa, membran bozulmadan kalır. Zamanla, Lucifer yellow hücreyi dolduracak ve hücre stabilse morfolojisinin görüntülenmesine olanak sağlayacaktır. Bu düzenek 30 dakika veya daha fazla sürmelidir.

Şimdi Patch Master kullanarak -75 millivolt'tan +35 millivolt'a kadar her 10 millivolt'ta bir akım-voltaj testi gerçekleştirin ve sonraki testlere geçin. Bu işlem, yalnızca 1 nano amp'den daha büyük bir sodyum akımı mevcutsa yapılmalıdır. Ardından LabVIEW'u açın ve özel olarak yazılmış neuro acuma programını çalıştırın.

Tekrar sayısını sekiz olarak ayarlayın. Ardından, eksitatör ve inhibitör iletkenliklerin ters potansiyellerini sırasıyla sıfır ve eksi 75 milivolt olarak belirleyin. Test etmek için bir eşleşen eksitatör ve inhibitör iletkenlik çifti seçtiğinizde, alt panelde yeşil eksitatör iletkenlik izi ve kırmızı inhibitör iletkenlik izi görünecektir.

Ardından, patch master'a geri dönün ve akım kenetleme (current clamp) modunu seçin. Amplifikatörü NeuroAcuma üzerinden derhal akım kenetleme moduna geçirin. Kayıt düğmesine basın.

Afazik aksiyon potansiyeli patlamalarıyla karakterize hücresel yanıt üst panelde görünecektir. Ardından, düşük iletkenliğe sahip hücreye akım enjekte edin. İlk olarak, çok az yanıt gözlemlenirse veya hiç yanıt gözlemlenmezse, güçlü bir yanıt oluşana kadar akımı küçük artışlarla yükseltin.

Aşırı akım enjeksiyonu hücreyi öldürebilir. Testler tamamlandığında, yeni bir iletkenlik dalga formu çifti seçin ve tüm fizyolojik ve yapay iletkenlik çiftleri için prosedürleri tekrarlayın.

Kayıttan sonra, hücre gövdesinin bozulmaması için pipeti dikkatlice geri çekin. Ardından, dokuyu derhal %4 paraformaldehit ile 30 dakika boyunca sabitleyin ve bunu 0,1 molar fosfat tamponu ile yapılan üç adet 10 dakikalık yıkama ile takip edin; dokuyu soğutun ve antikor boyamasını ertesi gün veya hazır olduğunuzda bir hafta içinde gerçekleştirin. Lucifer yellow ile doldurulmuş ganglion hücrelerini, oda sıcaklığında, 1/10.000 dilüsyonunda primer anti-Lucifer yellow tavşan IgG ile beş gün boyunca boyayın.

Ardından altıncı günde, sekonder keçi anti-tavşan IgG ile gece boyu bekletip, 1:500 dilüsyonunda ekleme yapın. İşlem sonunda retinayı floresan koruyucu medyuma yerleştirerek yaş preparat hazırlayın. Lamelini kapatın ve oje ile mühürleyin. Leica SPECT two konfokal mikroskop kullanarak hücre morfolojisinin konfokal görüntülerini alın.

Burada, uyarıcı ve inhibitör iletkenlik dalga formlarının enjeksiyonuna karşı bir ganglion hücresinin yanıtları yer almaktadır; kontrol deneylerinden elde edilen dalga formları sırasıyla yeşil ve kırmızı ile belirtilmiştir. Burada ise tetrodotoksin banyo uygulamasından sonra kaydedilen iletkenlik dalga formlarının enjeksiyonuna verilen yanıtlar görülmektedir. Burada, başka bir ganglion hücresinin çeşitli iletkenlik dalga formu çiftlerine verdiği yanıtlar yer almaktadır.

Eksitatuar kondüktans ile inhibituar kondüktans arasındaki oranlar birden sıfıra ve birden ikiye değiştirilmiştir. İnhibisyon derecesi arttıkça hücrenin yanıtı azalmıştır; burada, inhibisyon başlangıcının değiştirildiği aynı eksitasyon seviyesine karşı bir ganglion hücresinin verdiği yanıtlar yer almaktadır. Delta T, inhibituar ve eksitatuar kondüktansların başlangıcı arasındaki zaman farkını temsil eder.

İnhibisyon gecikmesi azaldıkça, hücrenin yanıtı zayıfladı. Bu prosedür, nöronal çıktıyı oluşturan eksitatör ve inhibitör sinaptik girdiler arasındaki etkileşimlerin ortaya çıkarılmasına yardımcı olan güçlü bir tekniktir.