Fare Retina Ganglion Hücreleri Synaptic ve Yapay iletkenlikleri Dinamik Kelepçe Uygulama

Aşağıdaki deneyin genel amacı, uyarıcı ve inhibe edici sinaptik girdilerin oranındaki ve göreceli zamanlamasındaki değişikliklerin, model nöronlar olarak retinal ganglion hücrelerini kullanarak nöronların ani aktivitesi üzerindeki etkilerini araştırmaktır. Bu, bir ganglion hücresinin hücre gövdesinin, fizyolojik iyonik bileşime benzeyen hücre içi bir çözelti ile doldurulmuş bir cam pipet ve hücre tipini morfolojik olarak tanımlamak için Lucifer sarısı kullanılarak bütün bir montaj retinasında yamalanmasıyla elde edilir. Dinamik kelepçe kullanarak, hücre gövdesine bir dizi uyarıcı ve inhibitör iletkenlik dalga formu enjekte edilir, bu da yanıt olarak zar potansiyelinde bir değişiklik üretir. Daha sonra, kontrol koşullarında veya ilaçların varlığında fizyolojik deneylerden elde edilen çeşitli iletkenlik dalga formları, karşılık gelen nöronal tepkileri elde etmek için hücre gövdesine enjekte edilir.

Sonuçlar, uyarma ve inhibisyon oranındaki değişikliklerin, dinamik klemp kayıtları yoluyla uyarıcı ve inhibitör iletkenliklerden oluşan akımların enjeksiyonuna dayalı olarak retinal ganglion hücrelerinin ani aktivitesi üzerindeki etkilerini göstermektedir. Bu tekniğin akım kelepçesi veya voltaj kelepçesi gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, uyarıcı ve inhibitör sinaptik iletkenliklerin oranının ve göreceli zamanlamasının, hücresel tepkiler üzerindeki etkiyi araştırmak için nöronlara enjekte edilebildiği etkileşimli bir araç sağlamasıdır. Bu metodoloji, retina devrelerinin yanı sıra merkezi sinir sistemindeki diğer nöronal ağların işlevi hakkında bilgi sağlayabilir.

Bu prosedüre, elektrofizyolojik kurulumda 250 mililitre karboksi oksijenli amaç ortamı ile reperfüzyon sistemini kurarak başlayın. Ardından, perfüzyon odasının dibine ince bir tabaka halinde vakumlu gres sürün. Bir kapak fişi ile kapatın ve hava geçirmez olduğundan emin olun.

Ardından, haznenin üst ve alt uçlarına az miktarda gres sürün. Gres, ızgarayı yerinde tutacak ve retinaya çok fazla bastırmasını önleyecektir. Şimdi hazneyi platforma sabitleyin ve bundan sonra her iki açıklığı da hizalayın.

Flor iziği ile uyuşturulduktan sonra servikal çıkık ile bir hayvanı kurban edin. Bir çift küçük kavisli makasla gözlerini hızla çıkarın. Bunları küçük bir beherde araba oksijenli hücre dışı sıvı ile iyice yıkayın ve araba oksijenli hücre dışı sıvı ile doldurulmuş bir Petri kabına yerleştirin.

Diseksiyon mikroskobu altında, her iki gözün kenarından yaklaşık iki milimetre korneada 19 gauge iğne kullanarak bir yerleştirme deliği açın. Bu önemli adım, her iki dizginin de oksijenlenmesine izin vermek için hızlı olmalıdır. Bundan sonra, bir korneayı küçük bir iris makasıyla kenarına paralel keserek çıkarın.

Ardından, irisi ve lensi bir çift ince forseps ile çıkarın ve diğer göz için prosedürleri tekrarlayın. Bir göz kabını, carbox oksijenli hücre dışı çözelti içeren bir behere aktarın. Neşter bıçağıyla, bir göz kabını ikiye bölün, künt bir diseksiyon probu kullanarak veya nazikçe çekerek retinayı pigment epitelinden nazikçe ayırın.

Daha sonra ayrılmış retina dokusunun kenarını bir çift ince forseps ile aura serta'ya yakın tutun ve aura serta'yı başka bir çift ince forseps ile tutun. Retinanın merkezine doğru çekin. Bu hassas bir süreçtir ve birkaç deneme gerektirebilir.

Başarılı olursa, aura Serta siliyer cisim ve vitreus mizahı ortadan kaldırılacak ve retina eğriliği azalacaktır. Daha sonra, kenarları kesin ve ardından retinayı ganglion hücreleri yukarı bakacak şekilde perfüzyon odasına aktarın. Izgarayı yağ toplarının üzerine yerleştirerek dokuyu yerinde tutun.

Kalan dokuyu diğer göz kabıyla birlikte daha sonra kullanmak üzere carbox oksijenli hücre dışı solüsyonda saklayın, kayıt odasını dik bir mikroskop altına monte edin. 35.5 santigrat derecede dakikada üç ila beş mililitre hızında, retinanın sürekli perfüzyonunu carbox oksijenli hücre dışı çözelti ile hemen ayarlayın, topraklama elektrodunun yerinde olduğundan emin olun. Şimdi mikroskobun ışık kaynağını açın ve odağını 40 x objektif aracılığıyla ganglion hücrelerinin hücre gövdelerine getirin.

Kayıt için delik montajının merkezini bulun. Bu adımda, beş ila sekiz mega ohm'luk bir cam pipeti tutucusuna sabitleyin ve 40 x objektif altında bir mikrom manipülatör kullanarak mikroskop altında hareket ettirin. Pipeti, iç sınırlayıcı zarın yüzeyinde küçük bir çukur oluşturana kadar yavaşça indirin.

Pipeti az miktarda doku yakalayana kadar dikkatlice ileri doğru ilerletin ve ardından ganglion hücrelerinin hücre gövdelerini ortaya çıkarmak için küçük bir delik açmak için yukarı ve/veya yanlara doğru hareket ettirin. Şimdi temiz bir pipeti sekiz ila 10 mikrolitre, potasyum bazlı bir hücre içi çözelti ile Lucifer sarısı ile doldurun. Amplifikatörün kafa aşamasına bağlı tutucuya yerleştirin ve klorlu gümüş klorür elektrodunun suya batırıldığından emin olun.

Büyük hücre gövdesine sahip bir hücre seçin. Membranın yüzeyinde küçük bir çukur oluşturmak için pipet ucunu pozitif basınçla yavaşça indirin. Ardından bir giga conta elde etmek için basıncı durdurun ve serbest bırakın.

Bir giga sızdırmazlık elde edildikten sonra, tam hücre yama kelepçesi konfigürasyonu elde etmek için zarı kırmak için hafifçe negatif basınç uygulayın. Bu prosedür hassas bir adımdır. Çok fazla negatif basınç uygulanırsa, bağlantı sızdırır.

Çok az ise, zar sağlam kalır. Zamanla, Lucifer sarısı hücreyi dolduracak ve kararlıysa hücrenin morfolojisinin görselleştirilmesine izin verecektir. Bu kurulum 30 dakika veya daha fazla sürmelidir.

Şimdi patch master kullanarak her 10 milivoltta bir eksi 75 milivolttan pozitif 35 milivolta kadar bir akım voltajı testi yapın ve sonraki testlere geçin. Sadece bir nano amperden daha büyük bir sodyum akımı varsa. Ardından, laboratuvar görünümünü açın ve özel olarak yazılmış nöro akuma programını çalıştırın.

Tekrarlama sayısını sekiz olarak ayarlayın. Ardından, uyarıcı ve inhibitör iletkenliklerin tersine çevirme potansiyellerini sırasıyla sıfır ve eksi 75 milivolt olarak ayarlayın. Test için eşleşen bir uyarıcı ve inhibitör iletkenlik çifti seçin ve yeşil uyarıcı iletkenlik izi ve kırmızı inhibitör iletkenlik izi alt panelde görünecektir.

Bundan sonra, yama ustasına geri dönün ve mevcut kelepçe modunu seçin. Amplifikatörü hemen akım kelepçesine getirin.ampneuro acuma'da mod. Kayıt düğmesine basın.

Afazik aksiyon potansiyelleri patlaması ile hücresel yanıt üst panelde görünecektir. Daha sonra düşük iletkenliğe sahip hücreye akım enjekte edin. İlk olarak, çok az yanıt gözlenirse veya hiç yanıt gözlenmezse, güçlü bir yanıt üretene kadar akımı küçük artışlarla artırın.

Aşırı akım enjeksiyonu hücreyi öldürebilir. Testler tamamlandıktan sonra. Yeni bir iletkenlik dalga formu çifti seçin ve tüm fizyolojik ve yapay iletkenlik çiftleri için prosedürleri tekrarlayın.

Kayıttan sonra, hücre gövdesinin sağlam kalması için pipeti dikkatlice geri çekin. Daha sonra, dokuyu ve% 4 para formaldehiti hemen 30 dakika boyunca sabitleyin, ardından 0.1 molar fosfat tamponu ile 10 dakikalık üç yıkama yapın, soğutun ve ertesi gün veya hazır olduğunda bir hafta içinde antikor boyama yapın. Beş gün boyunca bir ila 10.000 seyreltmede birincil bir anti Lucifer sarı tavşan IgG ile oda sıcaklığında Lucifer sarı dolu ganglion hücrelerine karşı boyayın.

Daha sonra altıncı günde, ikincil keçi anti tavşan IgG ile bir gece kalarak, bir ila 500 arasında bir seyreltme ekleyin, sonunda retinayı floresan koruyucu ortama ıslak monte edin. Kapak fişini yerleştirin ve oje ile kapatın. Leica SPECT iki konfokal mikroskop kullanarak hücre morfolojisinin konfokal görüntülerini alın.

İşte bir ganglion hücresinin uyarıcı ve inhibitör iletkenlik enjeksiyonuna verdiği tepkiler Kontrol deneylerinden elde edilen dalga formları sırasıyla yeşil ve kırmızı ile belirtilmiştir. Ve işte tetrodatoksinin banyo uygulamasından sonra kaydedilen iletkenlik dalga formlarının enjeksiyonuna verilen yanıtlar. İşte başka bir ganglion hücresinin çeşitli iletkenlik dalga formu kollarına verdiği tepkiler.

Uyarıcı iletkenlik ve inhibitör iletkenlik arasındaki oranlar bir ila sıfırdan bir ila iki arasında değiştirildi. İnhibisyon derecesi arttıkça, hücrenin tepkisi azaldı ve burada bir ganglion hücresinin, inhibisyon başlangıcının değiştiği aynı uyarma seviyesine verdiği tepkiler verilmiştir. Delta T, inhibitör ve uyarıcı iletkenliklerin başlangıcı arasındaki zaman farkını temsil eder.

İnhibisyon gecikmesi azaldıkça, hücrenin tepkisi zayıfladı. Bu prosedür, nöronal çıktı oluşturan exci three ve inhibitör sinap girişi arasındaki etkileşimleri ortaya çıkarmaya yardımcı olan güçlü bir tekniktir.