Işık Mikroskobisine Giriş

Işık mikroskobu, araştırma örneklerini büyütmek için kullanılan bir cihazdır. Işık mikroskopları, bilimsel araştırmacıların nesneleri orijinal boyutlarının 1000 katı büyüklükte görmelerini sağlama potansiyeline sahip, paha biçilemez bir analitik araçtır. Göreceğiniz üzere, ışık mikroskobu oldukça temel prensiplerle çalışır ancak laboratuvardaki örneklerin görselleştirilmesinde neredeyse sınırsız uygulama alanına sahiptir.

Adından da anlaşılacağı üzere, ışık mikroskobu, bir kondansatör lens aracılığıyla numune üzerine odaklanabilen ışık üreten bir ışık kaynağı gerektirir.

Numuneyi aydınlatan ışık, objektif lens olarak bilinen lense ulaşır ve burada ters çevrilmiş, yani baş aşağı duran büyütülmüş bir görüntü oluşturur. Gözün algıladığı bu görüntü, oküler lens veya göz merceği tarafından daha da büyütülür. Görüntüyü düzeltmek ve gözün onu doğru yönelimde görmesini sağlamak için ışık yoluna ek optik elemanlar yerleştirilebilir. Burada gördüğünüz gibi birden fazla lens kullanan mikroskoplara bileşik mikroskoplar denir.

Bir bileşik mikroskopta toplam büyütme, objektif lensin büyütme oranı ile oküler lensin veya göz merceğinin büyütme oranının çarpılmasıyla hesaplanır. 40X objektif lens ve 10X oküler lens ile toplam büyütme 400X'tir.

Mikroskop altındaki nesnelerin boyutunu tahmin etmeye yardımcı olmak için, görüntü üzerine yansıtılan bir ölçek olan oküler retikül kullanılabilir. Daha yüksek büyütmelerde, oküler retiküldeki işaretler, düşük büyütmelerde göründüklerinden daha küçük mesafeleri temsil eder.

Büyütmenin yanı sıra, mikroskop optiğinin bir diğer yönü de çözünürlüktür. Çözünürlük, mikroskop altındaki iki nesne arasında ayırt edilebilen en kısa mesafeyi ifade eder. Bu karakterlerin başları giderek daha net hale geldikçe ve çözünürlük arttıkça, aralarındaki gözlemlenebilir en kısa mesafe azalır.

Işık mikroskobunun ana bileşenleri arasında objektifler, okülerler, numune tablası ve numune tutucu, ışık kaynağı, alan diyaframı, kondansatör ve apertür ile kaba ve ince odaklama düğmeleri yer alır.

Objektifler, mikroskobun büyütme ve çözünürlüğünün büyük bir kısmından sorumludur. Objektifler, dönen bir burulun üzerine, objektifler değiştirildiğinde odak düzlemi aynı kalacak şekilde monte edilmiştir; bu özelliğe parafokalite denir. Bir objektif üzerinde büyütme oranı, sayısal açıklık veya N.A., gerekli olan daldırma ortamının türü, numuneler monte edilirken kullanılması gereken lamel kalınlığı ve lens elemanının ucundan numunedeki odak düzlemine kadar olan mesafe olan çalışma mesafesi belirtilebilir.

Yine N.A. olarak tanımlanan sayısal açıklık, bir mikroskop objektifinin ışığı ne kadar iyi toplayabildiğinin bir ölçüsüdür. Yüksek N.A. değerli objektifler eğik açılı ışığın geçmesine izin verirken, düşük N.A. değerli objektifler daha doğrudan ışık gerektirir. Bir objektifin çözünürlüğü, ışığın dalga boyu verildiğinde sayısal açıklıktan hesaplanabilir.

Işık kaynağı, alan diyaframı, apertür ve kondansatörün tamamı, ışığın üretilmesinden ve numuneye iletilmesinden sorumludur.

Işık kaynağı tipik olarak, ışık yoğunluğunu kontrol etmek için ayarlanabilen düşük voltajlı bir halojen ampuldür.

Işık daha sonra çeşitli filtrelerden geçer ve numunenin aydınlatılacak alanını kontrol eden alan diyaframına girer.

Ardından, numune üzerine parlak ışığı odaklayan kondansatör gelir; numune etrafındaki aydınlatma konisi kondansatör tarafından kontrol edilir ve kullanılan objektife bağlı olarak ayarlanmalıdır.

Işık mikroskobunu kullanmaya başlamak için, ilgile ve basılan bölgeyi içeren örneği mikroskop tablasına yerleştirin, objektifin tam üzerine ortalayın ve tabla klipslerini kullanarak sabitleyin.

Ardından, ışık kaynağını açın ve en düşük büyütmeli objektife geçiş yapın.

Daha sonra, önce kaba ayar düğmesini kullanarak z-yönünde hareket ettirip düşük büyütmeli objektifi odaklayın ve ardından nesneyi netleştirmek için ince ayar düğmelerini çevirin. Objektifin lam veya tablaya çarpmamasına dikkat edin, çünkü bu durum lense zarar verebilir.

Ardından, lamı x ve y yönlerinde hareket ettirmek için düğmeleri ayarlarken okülerlerden bakarak ilgilenilen alanı bulun. Düşük büyütmeden yüksek büyütmeye geçtikçe görüş alanı boyutu önemli ölçüde azalacaktır.

Yüksek büyütmeli objektife geçmeden önce, en düşük büyütmeli objektifi ilgi alanına ortalamak, istenen örneği bulma şansını büyük ölçüde artırır.

Örnek düşük büyütmede bulunduğunda ve odaklandığında, görüntüleme için kullanılacak olan daha yüksek büyütmeli objektife geçin.

Öncelikle alan diyaframını, diyaframın kendisi görüş alanının hemen dışında kalacak şekilde ayarlayarak aydınlatma kalitesini optimize edin.

Ardından, kondansatör diyaframını, ayarlar kullanılan objektifin sayısal açıklığına uygun olacak şekilde ayarlayın.

Son olarak, odağı tekrar ayarlayın. Bu kez yalnızca ince ayar düğmesini kullanın.

Artık örneğinizin görüntülerini almaya hazırsınız.

Işık mikroskobu, geniş bir numune yelpazesini görselleştirme potansiyeline sahiptir ve birçok farklı uygulamaya uygun çeşitli bileşik mikroskop konfigürasyonları mevcuttur.

Burada, cerrahi bir mikroskop altında çalışmaya hazırlanan bir araştırmacı görüyorsunuz. Bu mikroskoplar genellikle hareketli bir kola asılıdır ve stereoskopiktir; yani ışığın hem gözlemciye hem de mikroskoba monte edilmiş bir kameraya geçmesine olanak tanırlar. Bu cerrahi mikroskop, farelerde gerçekleştirilen bir böbrek transplantasyonu prosedüründe kullanılmaktadır.

Bu klipte, nöromüsküler kavşağın incelenebilmesi için vücut duvarı kaslarını açmak amacıyla, daha sonraki diseksiyon için uygun drosophila larvalarını seçerken bir diseksiyon mikroskobundan bakan bir araştırmacı görüyorsunuz.

Burada, objektifi sahnenin altında bulunan ve bir mikroenjeksiyon tekniği için hazırlanan ters çevrilmiş bir bileşik mikroskop görebilirsiniz. Somatik hücre çekirdek transferi olarak bilinen bu prosedür, transgenik hayvanlar üretmek ve klonlar oluşturmak için önemli bir yöntemdir.

JoVE'nin Işık Mikroskopisi'ne giriş videosunu izlediniz.

Bu videoda şunları inceledik: mikroskobun ne olduğu ve nasıl çalıştığı, birçok bileşeni, bu bileşenlerin nasıl ayarlandığı ve kaliteli görüntülerin nasıl elde edileceği. İzlediğiniz için teşekkürler!