1.13: Işık Mikroskobuna Giriş

Işık mikroskobu, araştırma örneklerini büyütmek için kullanılan bir araçtır. Işık mikroskopları, bilimsel araştırmacıların nesneleri orijinal boyutlarının 1000 katı şekilde görüntülemelerine izin verme potansiyeline sahip paha biçilmez bir analitik araçtır. Göreceğiniz gibi, ışık mikroskobu bazı çok temel prensiplerle çalışır, ancak laboratuvarda numuneleri görselleştirmek için neredeyse sınırsız uygulamaya sahiptir.

Adından da anlaşılacağı gibi, ışık mikroskobu, bir kondansatör merceği tarafından numune üzerine odaklanabilen ışık üreten bir ışık kaynağına ihtiyaç duyar.

Numuneyi aydınlatan ışık, objektif mercek olarak bilinen bir merceğe ulaşır ve bu mercek, ters çevrilmiş veya ters çevrilmiş büyütülmüş bir görüntü oluşturur. Göz merceği veya oküler lens, gözün daha sonra aldığı görüntüyü daha da büyütür. Gözün görüntüyü doğru yönde görmesi için görüntüyü düzeltmek için ışık yoluna ek optik elemanlar eklenebilir. Burada gördüğünüz gibi birden fazla lens kullanan mikroskoplara bileşik mikroskoplar denir.

Bileşik bir mikroskopta, toplam büyütme, objektif merceğin büyütmesinin oküler merceğin veya göz merceğinin büyütmesi ile çarpılmasıyla hesaplanır. 40X objektif lens ve 10X oküler lens ile toplam büyütme 400X'tir.

Mikroskop altındaki nesnelerin boyutunu tahmin etmeye yardımcı olmak için, bir mercek retikülü, görüntünün üzerine yansıtılan bir ölçek kullanılabilir. Daha yüksek büyütmede, mercek retikülündeki onay işaretleri, daha düşük büyütmelerde görüntülenenden daha küçük mesafeleri temsil edecektir.

Büyütmeye ek olarak, mikroskop optiğinin bir başka yönü de çözünürlüktür. Çözünürlük, kapsam altındaki iki nesne arasındaki en kısa çözümlenebilir mesafeyi ifade eder. Bu karakterlerin kafaları gittikçe daha net hale geldikçe ve çözünürlük arttıkça, aralarındaki en kısa gözlemlenebilir mesafe azalır.

Işık mikroskobunun ana bileşenleri arasında objektifler, göz mercekleri, numune aşaması ve numune tutucu, ışık kaynağı, alan diyaframı, kondansatör ve diyafram açıklığı ve kaba ve ince odak düğmeleri bulunur.

Objektifler, mikroskobun büyütülmesinin ve çözünürlüğünün çoğundan sorumludur. Dönen bir burunluk üzerine, hedefler değiştikçe odak düzlemi aynı kalacak şekilde monte edilirler - parafokalite olarak adlandırılan bir özellik. Bir objektif, büyütme, sayısal açıklık veya NA, gereken daldırma ortamının türü, numuneleri monte ederken kullanılması gereken lamel kalınlığı ve çalışma mesafesi - lens elemanının ucundan numunedeki odak düzlemine olan mesafe ile işaretlenebilir.

Yine NA olarak tanımlanan sayısal açıklık, bir mikroskop objektifinin ışığı ne kadar iyi toplayabileceğinin bir ölçüsüdür. Yüksek N.A. objektifler eğik açılardaki ışığın geçmesine izin verirken, düşük N.A. objektifler daha doğrudan ışık gerektirir. Bir nesnenin çözünürlüğü, ışığın dalga boyu göz önüne alındığında sayısal açıklıktan hesaplanabilir.

Işık kaynağı, alan diyaframı, diyafram açıklığı ve kondansatörün tümü ışığı üretmekten ve numuneye iletmekten sorumludur.

Işık kaynağı tipik olarak, ışık yoğunluğunu kontrol etmek için ayarlanabilen düşük voltajlı bir halojen ampuldür.

Işık daha sonra çeşitli filtrelerden geçer ve numunenin aydınlatılacak alanını kontrol eden alan diyaframına geçer.

Sonraki, numuneye parlak, ışığa odaklanan kondansatördür, numunenin etrafındaki aydınlatma konisi kondansatör tarafından kontrol edilir ve kullanılan hedefe bağlı olarak ayarlanması gerekir.

Işık mikroskobunu kullanmaya başlamak için, ilgilenilen bölgeyi içeren bir numuneyi mikroskop tablasına yerleştirin, doğrudan objektifin üzerine ortalayın ve tabla klipslerini kullanarak yerine sabitleyin.

Ardından, ışık kaynağını açın ve en düşük güçlü hedefe geçin.

Ardından, kaba ayar düğmesinin ilk ayarını kullanarak z yönünde hareket ettirerek ve ardından nesneyi keskin bir odağa getirmek için ince ayar düğmelerini çevirerek düşük güçlü objektifi odaklayın. Lense zarar verebileceği için slayta veya sahneye objektifle çarpmamaya dikkat edin.

Ardından, slaytı x ve y yönlerinde hareket ettirmek için düğmeleri ayarlarken göz merceklerine bakarak ilgilenilen alanı bulun. Düşük büyütmeden daha yüksek büyütmeye geçtiğinizde görüş alanının boyutu büyük ölçüde azalacaktır.

Daha yüksek güce geçmeden önce en düşük güçlü hedefi ilgilenilen alana ortalamak, istenen numuneyi bulma şansını büyük ölçüde artırır.

Örnek düşük güçte bulunduktan ve netlendikten sonra, görüntüleri elde etmek için kullanılacak daha yüksek güç hedefine geçin.

Önce alan diyaframını, diyaframın kendisi görüş alanının hemen dışında olacak şekilde ayarlayarak aydınlatmanın kalitesini optimize edin.

Ardından, kondansatör diyaframını, ayarlar kullanılan objektifin sayısal açıklığıyla eşleşecek şekilde ayarlayın.

Son olarak, odağı tekrar ayarlayın. Bu sefer sadece ince ayar düğmesini kullanarak.

Artık numunenizin resimlerini çekmeye hazırsınız.

Işık mikroskobu, çok çeşitli numuneleri görselleştirme potansiyeline sahiptir ve bileşik mikroskobun çeşitli konfigürasyonları, birçok farklı uygulamaya uyacak şekilde mevcuttur.

Burada, cerrahi mikroskop altında çalışmaya hazırlanan bir araştırmacı görüyorsunuz. Bu mikroskoplar genellikle hareketli bir kol üzerine asılır ve stereoskopiktir, yani ışığın izleyiciye ve ayrıca mikroskop üzerine monte edilmiş bir kameraya geçmesine izin verirler. Bu cerrahi mikroskop, farelerde böbrek nakli prosedüründe kullanılmaktadır.

Bu klipte, nöromüsküler kavşağın incelenebilmesi için vücut duvarı kaslarını ortaya çıkarmak için daha fazla diseksiyon için mükemmel drosophila larvalarını seçerken, diseksiyon mikroskobundan bakan bir araştırmacı görüyorsunuz.

Burada, sahnenin altında bir objektifi olan ters çevrilmiş bir bileşik mikroskobun mikroenjeksiyon tekniği için hazırlandığını görebilirsiniz. Somatik hücre nükleer transferi olarak bilinen bu prosedür, transgenik hayvanlar üretmek ve klonlar oluşturmak için önemli bir yöntemdir.

JoVE'nin Işık Mikroskobu ile tanışmasını az önce izlediniz.

Bu videoda inceledik: mikroskobun ne olduğu ve nasıl çalıştığı, birçok bileşeni, bunlarda nasıl ayarlamalar yapılacağı ve kaliteli görüntülerin nasıl elde edileceği. İzlediğiniz için teşekkürler!