Flybar: Sineklerin için Alkol yönetme

Bu prosedürün genel amacı, lisans düzeyindeki araştırmalar veya sirkadiyen çalışmalara yeni başlayan araştırmacılar için uygun, düşük maliyetli ve kolayca kurulabilen bir düzenek kullanarak Drosophila'da alkol kaynaklı davranışları ölçmektir. Bu işlem, öncelikle birden fazla sinek grubunun eş zamanlı olarak karşılaştırılmasına olanak tanıyan sinek barının kurulmasıyla gerçekleştirilir.

Prosedürün bir sonraki adımı, drosophila'yı belirtilen ışık-karanlık döngüleri altında kültüre etmek ve deney için yaşları eşleştirilmiş sinekler toplamaktır. Ardından sinekler, tanımlanmış alkol buharı konsantrasyonlarına maruz bırakılır ve veriler toplanır. Sonuç olarak, yazma refleksindeki kaybın veya sedasyonun ölçülmesi, günün saatine veya genetiğe bağlı olarak gruplar arasındaki alkol duyarlılığı farklarını gösterebilir.

Bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritik öneme sahiptir; çünkü davranışların gözlemlenmesindeki zorluklar ve loş kırmızı ışık nedeniyle gözlem basamaklarını öğrenmek ve hangi sineklerin yazı refleksini kaybettiğini, hangilerinin kaybetmediğini belirlemek güçtür. Öncelikle sinek barını monte edin. Hava akışının kurulumuyla başlayın.

Hava akışı sağlamak için kısa bir esnek silikon hortumu ya bina hava musluğuna ya da bir akvaryum hava motoruna bağlayın. Hava akışını bir Y konnektörü ile ikiye ayırın. İlk kolu bir regülatöre bağlayın.

Sistemden geçen toplam hava miktarını kontrol edecektir. İkinci kolu bir hızlı konnektöre bağlayın. Bu, kalibre edilmiş hava akışını etkilemeden Airstream'in gerektiğinde kesintiye uğratılmasını sağlayacaktır.

Bir Y konnektörü ekleyin ve her bir branşman tüpünü bir hava akış regülatörüne bağlayın. Ardından, her regülatörü bir hava akış ölçere bağlayın. Şimdi bir mililitrelik cam pipetleri bölümlere ayırın ve her bölüme sağ açılı bir kıvrım oluşturacak şekilde ısıtarak şekil verin.

Bunlar, düzenekte sert dirsek borular olarak görev yapacaktır. Hava girişi için düz cam pipeti bir delikten içeri yerleştirin ve sıvı içinde tabanın 1 cm üzerine kadar uzatın. Diğer delikten ise camın bir dirsek bölümünü, şişeye yeni girecek şekilde yerleştirin.

Her bir şişeden gelen hava akışını bir Y konnektöründe birleştirmek için bu çıkışları kullanın. Esnek borular kullanarak, hava akış metrelerini bir pipetin düz bölümüne bağlayın. Bunlar, iki çözelti şişesine giren hava girişleri olarak hizmet edecektir.

Su veya alkol için, her iki çözelti şişesini de ortam hava sıcaklığından iki derece daha yüksek bir sıcaklığa ayarlanmış su banyosunda tutun. Şişeleri, silikon tüplerin takılı olduğu iki delikli kauçuk tıpalarla kapatın. Y şeklindeki bağlantının diğer ucunu, iki delikli kauçuk tıpası olan bir şişeye bağlayın.

Bu karıştırma balonundan çıkan hava akımı, gözlem tüplerine buharlaşmış alkol ve su iletecektir. Her bir gözlem tüpü için bir adet olmak üzere, dört veya sekiz daha küçük hava akımı elde etmek için karıştırma balonundan çıkan çıkış hava akımını iki veya üç kez bölün.

Silikon boru kullanmaya devam edin. Gözlem tüpleri, alkol buharı için bir giriş ve bir çıkış içeren iki delikli kauçuk tıpayla sızdırmaz hale getirilmiş boş Drosophila tüpleridir. Cam tüpler tıpa deliklerine uygundur.

Cam tüplerin uçlarını ağ ile kapatın. Ağı, küçük bir parça esnek plastik tüp kullanarak yerinde tutun. Bu tüpü, vial uzunluğunun yaklaşık yarısına ulaşana kadar birinci delikten içeri itin.

Gerektiğinde, sıkı bir geçme sağlamak için Teflon bant kullanın. Ağ içeren ikinci cam tüpü, kauçuk tıpanın iç kenarıyla hizalanana kadar yerleştirin. Alkol veya su üzerinden kabarcık şeklinde geçirilen iki Hava Akışının uygun fraksiyonlarını karıştırın.

Karıştırma şişesindeki alkol ve su buharı karışımını istenen seviyede tutmak için hava basıncını sürekli izleyin ve gerektiğinde ayarlamalar yapın. Bu tür deneylerde, odanın yeterince havalandırıldığından her zaman emin olun. Tekrarlar arasındaki varyasyonu en aza indirmek için sineklerin yetiştirilme koşullarına azami dikkat gösterilmelidir.

Sinekler, aynı yaş ve kohorttaki sineklerin birbirlerine karşı test edilebilmesi için, çok sıkı bir senkronizasyonla düşük yoğunluklu koşullar altında kültürlenmelidir. Sinekler alacakaranlıkta toplanır. Yeni çıkmış hayvanlar toplanır ve aynı anda, az miktarda yüksek agar konsantrasyonlu besiyeri içeren tutma tüplerinde 24 saat boyunca saklanır.

Ertesi gün, toplanan sinekleri bir aspiratör kullanarak yaklaşık 30'ar sineklik kohortlara ayırın ve davranışın sirkadiyen modülasyonunu test etmek için kohortları taze flakonlara aktarın. Test gününde, sirkadiyen modülasyon davranışını test etmek için her koşulu eşit aralıklı altı zaman noktasında test edebilecek kadar kohort hazırlayın. Ayrıca, sinekleri testten önceki iki gün boyunca 25 degrees Celsius sıcaklıkta, sürekli karanlık altında tutun.

Deneysel tasarımdan bağımsız olarak, davranışsal analizden en az bir saat önce sinekleri yalnızca loş kırmızı ışıkla aydınlatılmış deneysel davranış odasına taşıyın. Foto-stimülasyonun sonuçları etkilememesi için deneyleri loş kırmızı ışık altında gerçekleştirin. Deneye başlamadan önce sistemden en az 10 dakika boyunca hava geçirin ve hava akışlarını kalibre edin.

Gözlem tüplerinin altına, ek kontrast sağlayarak sineklerin görünürlüğünü artırmak için bir parça beyaz kağıt yerleştirin. Hava akışı stabilize olduğunda, hızlı bırakma aparatını ayırın ve her bir gözlem tüpüne 30 sineklik bir kohort yükleyin.

Sinek çubuğunun her çalışması sırasında her deneysel koşulu test edin. Bu, deneyin sağlamlığını artıracak ve günlük varyasyonların etkisini en aza indirecektir. Tüm gözlem tüpleri yüklendikten sonra hava akışını yeniden bağlayın ve zamanlayıcıları başlatın.

Toplam alkol maruziyet süresini takip etmek için bir zamanlayıcı, deney boyunca beş dakikalık aralıkları saymak için ise diğer zamanlayıcıyı kullanın. Hava akışlarını izleyin ve sabit kalmaları için gerekli ayarlamaları yapın. Genel olarak hava akışları, kırmızı bir ışık lambası kullanılarak her beş dakikada bir stabilize edilir.

Yazma refleksini kaybetmiş sineklerin sayısını belirleyin. Lambayı şişelerden en az 12 inç uzakta tutun. Şişeye sertçe vurun ve yaklaşık dört saniye içinde yazma davranışını sergileyemeyen sineklerin sayısını belirleyin.

Bu sinekler bacaklarını ve kanatlarını hâlâ hareket ettirebilirler ancak kendilerini dik konuma getiremezler. Eğer sinek hiçbir uzvunu hareket ettirmiyorsa, tamamen sedate edilmiştir. Bu durum, yazma refleksinin yokluğundan farklı bir kriter olarak değerlendirilebilir.

Oturum yaklaşık bir saat sürecektir; sonunda, açıklanan protokolü kullanarak her dosyadaki toplam sinek sayısını sayın. Alkol duyarlılığında sirkadiyen bir modülasyon ölçülmüştür. Canton S'de, karanlığın ikinci gününde altı farklı zaman noktasında yazı refleksinin yokluğu ölçülmüş olup günün saatinin süre üzerinde anlamlı bir etkisi olduğu saptanmıştır.

Sineklerin yarısı kendi kendine yazmayı başaramadı. %30 alkol ile 40 dakika sonra sedatize edilen Kanton sineklerinin yüzdesi ölçüldü. Buhar, CT beş subjektif gündüz ve CT 17 gece şeklinde ölçüldü.

Sübjektif gündüz vaktinde, geceye kıyasla anlamlı derecede daha az sineğin sedate olduğu tespit edilmiştir. Bir zaman serisi kullanımı, Canton S sinekleri ile white 1 1 1 8 mutasyonu taşıyan sinekler karşılaştırıldığında, yazma refleksi ve sedasyonla ilgili farklılıkları ortaya koymuştur. Canton S arka planında, white 1 1 1 8 sinekleri etanol buharına yanıt olarak Canton S'ye göre daha iyi yazma refleksi göstermiştir. white 1 1 1 8 mutantları ile yabani tip sinekler arasında sedasyon hızında da farklılıklar olduğu saptanmıştır.

Bu fark, büyük olasılıkla white 1 1 1 8 mutasyonu ile değişen biyojenik düşman seviyelerinden kaynaklanmaktadır. Bu nedenle, birçok transgenik hatta mevcut olan white 1 1 1 8 mutasyonuna bağlı davranışsal yanıtların kontrol edilmesi gereklidir. Bu videoyu izledikten sonra, sinek ahırı (fly barn) kullanarak sineklere alkolün nasıl uygulanacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

Sineklerin sistematik bir şekilde toplanması ve loş kırmızı ışık altındaki gözlemlerin mümkün olduğunca standartlaştırılması esastır.