Hücre Tek katmanlar mekanik uyarılması bağlı Kalsiyum Dalga Yayılım: Sığır Kornea Endotel Hücreleri Örneği

Aşağıdaki deneyin genel amacı, primer kornea endotel hücre monotabakalarında mekanik stimülasyonla tetiklenen hücreler arası kalsiyum dalgasının yayılımının kantifikasyonu yoluyla, gap junction kanalları ve HEMİ kanallar aracılığıyla gerçekleşen hücreler arası iletişimi incelemektir. Bu işlem, öncelikle taze sığır gözlerinden primer kornea endotel hücrelerinin izole edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım olarak, hücrelerin bölmeli lamellere ekilmesinden iki ila üç gün sonra, konfluen hücre monotabakası floresan kalsiyum duyarlı boya flu O 4:00 AM ile yüklenir. Ardından, konfokal mikroskop altında görselleştirilen bir hücreler arası kalsiyum dalgasını tetiklemek amacıyla, monotabakadaki tek bir hücreye kontrollü ve lokalize bir mekanik stimülasyon uygulanır.

Sonuçlar, hücreler arası kalsiyum dalgası yayılımının yayılımını göstermektedir. Nihayetinde, gap junction kanallarının ve HEMI kanallarının inhibisyonu; gap junction kanallarını ve HEMI kanallarını oluşturan farklı Conex ve panex izoformlarının özelliklerini ve düzenlenmesini aydınlatmak için kullanılır. Mekanik stimülasyonla indüklenen hücreler arası kalsiyum dalgası yayılımının temel avantajı, bağlantı ve aksing kanallarının katkısını ve özelliklerini invaziv olmayan bir yöntemle incelemek için basit ve güvenilir bir yöntem sağlamasıdır.

Ayrıca, yöntem incelenen hücresel sistemlerde bulunan fizyolojik sinyal moleküllerine ve kaskadlara dayanmaktadır. Son olarak, primer hücreler ve belirli konneksin veya PanIN izoformlarını ektopik olarak eksprese eden hücre modelleri dahil olmak üzere çeşitli hücre sistemlerine kolayca uyarlanabilir. Bu yöntemler, endojen konneksin veya panik izoformlarının siRNA aracılı nakavtı ve gap junction kanallarının ve HEMI kanallarının seçici inhibitörlerinin kullanımıyla, konneksin ve PanIN tabanlı gap junction kanallarının ve HEMI kanallarının fonksiyonu ve dinamik regülasyonu hakkında bilgi sağlayabilir.

Bu sistem kesinlikle sadece kornea endotel hücreleri ile sınırlı değildir. Hemen hemen her hücre tipine ve ayrıca daha kompleks dokulara uyarlanabilir. Bu prosedürde, 18 aydan büyük olmayan bir ineğin, ölüm sonrası beş dakikayı geçmemiş, taze olarak nukleat edilmiş gözü kullanılır.

Örnek, Earl dengeli tuz çözeltisi ve %1 iyot çözeltisi içerisinde dört derece Celsius'ta laboratuvara taşındı. İlk olarak, gözü 100 milimetreye 20 milimetrelik bir Petri kabına aktarın. Ardından, gözü %1 iyot içeren EBSS ile durulayın.

Ardından, bu noktadan itibaren %70 etanol içeren bir solüsyonla sterilize edin. Steril bir kabin içerisinde çalışın. Korneayı gözden dikkatlice ayırın ve epitel hücre tabakası yukarı bakacak şekilde, EBSS içeren 35 milimetre x 10 milimetrelik bir Petri kabına yerleştirin.

Korneaya hâlâ yapışık olan tüm iris dokularını dikkatlice temizleyin. Gerekirse korneayı, endotel hücre tabakası yukarı bakacak şekilde başka bir EBSS kabına aktarın ve ardından EBSS ile iki kez durulayın. Sonrasında korneayı, endotel tabakası yukarıya bakacak şekilde bir kum saatine yerleştirin ve büyüme ortamı ile kaplayın.

Durulamak için, besiyerini bir vakum pipeti ile uzaklaştırın. Korneanın endotel tabakasına 300 µL 0,5 g/L tripsin çözeltisi uygulayın. Kornea içeren kum saatini kapalı bir Petri kabına yerleştirin ve 37 °C ve %5 CO2 koşullarında 30 dakika boyunca inkübatöre aktarın.

Kum saatini geri aldıktan sonra, korneadaki endotel hücrelerini ateşle cilalanmış kanca şeklinde bir cam pastör pipetiyle nazikçe sıyırın. Endotel hücrelerini içeren solüsyonu aspire edin ve dört mililitre kültür ortamı içeren 25 santimetrekarelik bir kültür flaskına ekleyin. Ardından, korneaya 300 µL büyüme ortamı uygulayın.

Sıyırma işlemini tekrarlayın ve endotel hücrelerini içeren çözeltiyi kültür balonuna ekleyin. Bu adımı bir kez daha tekrarlayın, ardından kornea endotel hücrelerini içeren kültür balonlarını büyüme ortamı ile birlikte 37 °C ve %5 karbondioksit içeren inkübatöre yerleştirin. İki gün sonra altı mililitre kültür ortamı ekleyin ve büyüme ortamını her iki günde bir yenileyin.

Hücreler, izolasyondan pasajlama aşamasına kadar yedi ila 10 gün içinde konfluent hale gelmelidir. Öncelikle kültür ortamını aspire edin ve ardından iki kez EBSS ile durulayın. Sonra hücrelerin üzerine iki mililitre tripsin solüsyonu ekleyin ve flaskı üç ila dört dakika boyunca inkübatöre yerleştirin.

Ardından 12 milliliters büyüme besiyeri ekleyin ve hücreleri dağıtmak için besiyerini üç kez pipetle çekip boşaltın. Daha sonra hücreleri bir hemositometre veya otomatik hücre sayıcı kullanarak sayın. İki kuyucuklu kültür lamlarına 165,000 hücre ekleyin.

Ardından, yeni bir pasaj için 75 santimetrekarelik kare kültür flasklarını santimetrekare başına 6.250 hücre yoğunluğunda hazırlayın, toplam hacim 25 mililitre olacak şekilde taze kültür ortamı ekleyin ve flasklar ile chamber slide'ları inkübatöre yerleştirin. Besiyeri her iki günde bir tazelenir ve hücre tabakasının konfluensine üç ila dört gün içinde ulaşılmalıdır. İlk olarak, chamber slide içindeki hücreleri, 37 °C'de 30 dakika boyunca hafifçe çalkalayarak fosfat tamponlu salin içindeki 10 µM Fluo-4 AM ile yükleyin; hücreler Fluo-4 AM ile inkübe edilirken, uç çapı 1 µm'den küçük olan bir cam mikropipeti bir piezoelektrik nanopozisyonere bağlayın ve mikromanipülatöre monte edilmiş bir amplifikatöre bağlayın.

Nano konumlandırıcının voltajını 0.2 ile 1.5 volt arasına ayarlayın. 4:00 AM çözeltisinin akışını durdurun. Ardından hücreleri beş kez fosfat tamponlu salin ile yıkayın ve ölçümden önce hücreleri oda sıcaklığında en az beş dakika boyunca PBS ile inkübe edin.

Argon lazer ile 488 nanometre dalga boyunda uyarım yapın ve HFT 48 ışın ayırıcıyı kullanın. Pinhole minimuma ayarlanmışken, LP 5 0 5 uzun geçiren emisyon filtresini kullanarak 530 nanometredeki floresan emisyonu toplayın; burada 40 x yağlı immersiyon objektif kullanılır. Hazne lamını konfokal mikroskobun tablasına yerleştirin ve konfluens hücrelerin bulunduğu bir alan bulun.

Ardından, cam mikro pipetin hücre membranına 45 derecelik bir açıyla temas etmesini sağlamak için mikro manipülatörü hareket ettirin. Tek bir hücre membranının %1'inden daha az bir kısmına cam mikro pipetle kısa süreliğine dokunmak ve hücreye bir saniyelik mekanik stimülasyon uygulamak için mikro manipülatörü çalıştırın. Daha sonra, mekanik stimülasyonu takiben kalsiyum iyon konsantrasyonundaki uzamsal değişimleri konfokal mikroskop ile ölçün, görüntüleri toplayın ve kaydedin.

Son olarak, konfokal mikroskobun yazılımını kullanarak yanıt veren hücrelerin toplam yüzey alanını tanımlamak için çokgen bir ilgi alanı çizin. Sığır kornea endotel hücrelerinde, kontrol koşulları altında mekanik stimülasyonla indüklenen kalsiyum geçişleri, farklı zaman noktalarında temsilci yalancı renkli floresan görüntülerle gösterilmiştir; stimülasyon öncesindeki floresan yoğunlukları ilk görüntüde yer almaktadır. İkinci görüntüdeki beyaz ok, mekanik olarak stimüle edilen hücreyi belirtmektedir.

Kalsiyum dalgası komşu altı hücre tabakasına yayılmakta olup, dalganın ulaştığı toplam hücre alanı 62.870 µm²'lik bir aktif alan oluşturmaktadır. Çizgi grafik, ms olarak işaretlenen mekanik olarak stimüle edilmiş hücredeki normalize floresan değerinin (NF) zaman seyrini ve grafikte MB1'den MB5'e kadar işaretlenen bir ila beş arasındaki komşu hücre tabakalarındaki ortalama NF değerini göstermektedir. Bu görüntüler, soldaki grafikte eksojen nükleotidlerle tedavi sonrası ve sağdaki grafikte ekto nükleotidaz inhibitörleri ile tedavi sonrası hücreler arası kalsiyum dalgalarının yayılımındaki belirgin değişiklikleri göstermektedir; daha detaylı olarak, soldaki grafik, sığır kornea endotel hücrelerinin, ATP ve ADP'yi hidrolize ederek perikrin hücreler arası iletişim yolunu inhibe eden eksojen Aras Aase6 ve Aase7 ile tedavisi sonrası aktif alanda meydana gelen belirgin azalmayı göstermektedir.

Yıldız işareti, ace varlığında ve yokluğunda P değerinin 0,001'den küçük olduğunu belirtmektedir. Sağdaki grafik, BCEC'lerin seçici bir ekto nükleotid inhibitörü olan A RL 6 7 1 56 ile işlem görmesinden sonra aktif alanda anlamlı bir artış olduğunu ve böylece perikrin hücreler arası iletişim yolunun güçlendiğini göstermektedir. Yıldız işareti, a RL varlığında ve yokluğunda P değerinin 0,001'den küçük olduğunu belirtmektedir. Bir kez uzmanlaşıldığında.

Bu teknik, doğru şekilde uygulandığında tek bir koşuldaki tek bir deney için beş ila 10 dakikada tamamlanabilir. Farklı koşulların karşılaştırılabileceği bir dizi deneyin tamamlanması ve istatistiksel sonuçların çıkarılması bir gün sürer. Farklı günlerde ve izole edilmiş hücrelerin farklı partilerinden gerçekleştirilen bağımsız deneyler kullanılmalıdır.

Hücre içi kalsiyum dalgası yayılımının ölçülmesi ve nicelendirilməsi, gap junction kanalları ve hemikanallar gibi farklı konneksin ve ine izoformlarının hücre biyolojik regülasyonunun tanımlanmasına ve karakterizasyonuna olanak tanır. Ayrıca, bu yöntemin tek başına yeterli olmadığını, diyet transferinden TP salınımına ve elektrofizyolojiye kadar uzanan diğer moleküler ve fonksiyonel yaklaşımlarla tamamlanması gerektiğini vurgulamak isterim.