Name: Hücre Tek katmanlar mekanik uyarılması bağlı Kalsiyum Dalga Yayılım: Sığır Kornea Endotel Hücreleri Örneği (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-16T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 46 s
Description: Öğrenin mekanik uyarılma ile kalsiyum dalga yayılımını sığır kornea endotel hücrelerinde konfokal mikroskopi kullanarak incelemeyi. Bu yöntem hücreler arası iletişimi basit ve invaziv olmayan şekilde çalışmak için güvenilir bir sistem sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Laboratuvarda yapılan araştırma Araştırma Vakfı hibe tarafından desteklenmiştir - Flanders (FWO; hibe numaraları G.0545.08 ve G.0298.11), Üniversitelerarası Atraksiyon Polonyalılar Programı (Belçika Bilim Politikası; hibe sayısı P6/28 ve P7/13) ve FWO destekli araştırma topluluğu yerleştirilmiştir. Flanders (FWO) - CDH Araştırma Vakfı bir doktora sonrası adam olduğunu. Yazarlar çok Moleküler ve Hücresel Sinyal (KU Leuven), Dr SP Srinivas (Optometri Indiana Üniversitesi, ABD), Dr Leybaert en laboratuvar (Ghent Üniversitesi) Laboratuvarı tüm mevcut ve eski üyelerine minnettar ve vardır yararlı tartışmalar sağlanan Dr Vinken (VUB), prosedürler optimize veya konneksin hemichannels çalışma için araçlar geliştirilmesi dahil edildi.

1. Kornea Endotel Hücre İzolasyonu Başlamadan önce: göz enucleating sonra yerel bir mezbaha, en kısa zamanda elde edilen taze gözlerle, gelen hücreleri izole edin. Göz maksimum 18 aylık, beş dakika ölüm sonrası ve Earle Dengeli Tuz Çözüm korunmuş bir inek olarak çıkarıldı emin olun - 4% 1 iyot çözeltisi laboratuvara taşınması için ° C. <ol><li> Earle Dengeli Tuz Çözeltisi dışında göz atın - 1% iyot çözeltisi ve bir Petri kabı (100 x 20 mm) yerleştirin. </li><li> % 70 etanol ihtiva eden bir çözelti ile göz sterilize ve% 1 iyot içeren Earle Dengeli Tuz Çözeltisi ile durulayın. </li><li> Bu adım, steril bir kaput çalışır. Dikkatlice gözden kornea incelemek ve yukarı gelecek şekilde epitel hücre tabakası ile Earle Dengeli Tuz Çözeltisi içeren bir Petri kabı (35 x 10 mm), yerleştirin. Dikkatlice kalan iris dokusu sti kaldırmakGerekirse kornea bağlanmış ll. </li><li> Yukarı endotel hücre tabakası ile petri içeren başka bir Earle Dengeli Tuz Çözeltisi için kornea aktarın ve Earle Dengeli Tuz Çözeltisi ile iki kez yıkayın. </li><li> Bir fincan şeklinde yemektir bir kum saati, yukarı bakacak şekilde endotel tabakası ile kornea aktarın ve büyüme ortamı ile örtün. Büyüme ortamı, 25 mM glukoz,% 10 fetal sığır serumu,% 6.6 L-glutamin, 2.5 ug / ml amfoterisin B ve% 1 antibiyotik-antimikotik karışım 10,000 birim ihtiva / ml penisilin, 10,000 ug içeren Dulbecco&#39;nun Modifiye Edilmiş Eagle Ortamı oluşmaktadır streptomisin / ml ve 25 ug / ml amfoterisin B </li><li> Bir emme pipet ile ortam çıkarın. </li><li> Korneanın endotel tabakası (tripsin içeren tüm adımları aynı konsantrasyon ile yapılan) bir tripsin solüsyonu (0.5 g / L) 300 ul uygulayın. </li><li> Kapalı bir Petri kabındaki kornea içeren kum saati yerleştirin ve inc koydum37, 30 dakika boyunca ubator ° C ve% 5 CO2. </li><li> Yavaşça steril bir başlık bir yangın cilalı kanca şeklindeki cam Pasteur pipeti ile kornea uzak endotel hücreleri kazıyın. </li><li> Endotel hücreleri ihtiva eden çözelti emmek ve kültür ortamı 4 ml&#39;lik kültür şişeleri (25 cm2) ekleyin. </li><li> Kornea büyüme ortamı 300 ul uygulayın ve kazıma tekrar ve kültürü şişesi endotel hücreleri içeren çözeltisi ekleyin. </li><li> Bir kez daha bu son adım (1.11) tekrarlayın. </li><li> Kültür yerleştirin 37 inkübatör büyüme ortamı ° C ve% 5 CO2 &#39;de endotel hücreleri içeren şişeler. </li><li> İki gün sonra, kültür ortamı içinde 6 ml eklenir. </li><li> Iki günde bir büyüme ortamı yenileyin. </li></ol> 2. Hücre Kültürü <ol><li> Kültür ortamı çıkarın ve ulaşıldığında konfluent Earle Dengeli Tuz Çözeltisi (Abou içinde olan hücreler iki kez yıkayınizolasyon sonra t 10 gün). </li><li> Bunları ayırmak ve inkübatör şişesi yerleştirmek için hücrelere 1.5 ml tripsin çözeltisi ekleyin (37 ° C,% 5 CO2) 3-4 dakika karıştırıldı. </li><li> Büyüme ortamı 12 ml ilave edilir. Hücreleri dağıtmak ve hücreleri saymak için içinde ve dışında orta üç kez pipetle. </li><li> Hücre yoğunluğu ve inkübatör koyun bağlı olarak değişken bir kısmı ile tohum hücreleri. 165.000 hücre hücre sayısı (cm 2 başına hücre yoğunluğu 39.286) ile iki iyi odacıklı slaytlar (4.2 cm 2 bir alana sahip) hazırlayın. Cm2 başına 6250 bir yoğunlukta yeni bir pasaj boyunca 80 cm2 kültürü şişeleri hazırlayın ve 25 ml&#39;lik bir toplam hacme taze kültür ortamı ile toplayın. </li><li> Her iki günde orta yenileyin. </li><li> Hücre tabakası birleşene 3-4 gün sonra ulaşılır. Deneyler için hücreler kullanır. </li><li> Şişeler, hücre tabakasının konfluent ulaşıldığında, 2.6 &#39;dan 2.1 adımları tekrarlayın. 2 pasaj kadar hücre kültürleri kullanılan f edilebilirveya deneyler. </li></ol> 3. Indükleyen Kalsiyum Wave için mekanik Uyarım <ol><li> 10 uM Fluo-4 ile odacıklı slayt hücreleri yük AM 37, 30 dakika boyunca fosfat tamponlu tuz ° C&#39;de hafifçe çalkalandı. </li><li> Fluo-4 AM çözeltisi çıkarın, fosfat tamponlu tuz ile hücreler beş defa yıkanır, fosfat tamponlu tuz ile hücre inkübasyon ve ölçümden önce, oda sıcaklığında en az 5 dakika boyunca hücreler bırakın. </li><li> Argon lazer ve kullanım ışın ayırıcı HFT 488 ile 488 nm de Excite, bir uzun geçiş emisyon filtresi LP 505 ile 530 nm floresan emisyon toplamak en azından iğne deliği ayarlayın. Bir yağ daldırma 40X objektif (Hava, 1.2 NA) kullanın. ARL-67156 ile deneylerde, bir 10X objektif kullanın (Hava, 0.3 NA). </li><li> Hücreleri konfokal mikroskop birleşik olduğu bir alan arayın. </li><li> Pozisyon, 45 odacıklı slayta açıdan ° ve-hücre membranı dokunmadan üstünde olacak şekilde pipet.Tek bir hücreye kısa (≈ 1 sn) mekanik stimülasyon kışkırtmak. Mekanik uyarma kısa olan bir amplifikatör aracılığıyla çalıştırılabilir bir piezoelektrik kristal nanopositioner birleştirilmiş bir cam mikropipet (uç çapı &lt;1 mm) ile, hücre zarının% 1&#39;den daha az dokunarak hücre akut, kısa süreli bir etkiye deformasyon oluşmaktadır bir mikro-manipülatör monte. Cam mikropipet çekici bir mikroelektrot ile yapılır. Nanopositioner mekanik uyarılması sırasında 0,2 ve 1,5 V arasında bir gerilim tarafından işletilen olduğundan emin olun. 1,5 V daha bir gerilim yüksek hücre hasarına neden olabilir. Her hücre tipi ve durumu için, hücre zarar vermeden mekanik uyarılması için en uygun voltaj dikkatli yüksek (1,5 V) gerilimi (0,2 V) düşük başlayarak gerilim bir dizi uygulanarak belirlenmelidir. Bu voltaj, hücre zarı uygulanan mekanik stres ve gerginlik belirlediği için gerilim uyarım kuvveti için bir ölçüdür.Mekanik uyarı kuvveti alanı ile mekanik strese çarpılarak hesaplanabilir. Alanı (&lt;3.14 mikron 2) ve mekanik gerilme hem de çok düşük olduğu için, mekanik uyarma gücü düşüktür. (Bir hücre hasar görmesi durumunda, hücre ve hücre dışına floresan sızıntıları karanlık döner unutmayın.) </li><li> Mekansal değişiklikleri ölçmek [Ca 2 +] konfokal mikroskop ile mekanik stimülasyon takip i. </li><li> Görüntü toplama ve depolama. </li><li> Konfokal mikroskop yazılımı kullanarak duyarlı hücreleri (aktif alan, AA) toplam yüzey alanı tanımlamak için ilgi bir çokgen bölge çizin. </li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Bu yazıda, bir mikropipet kullanarak lokalize ve kontrollü mekanik stimülasyon sağlayarak birincil sığır kornea endotel hücrelerinin tek katmanlarını içinde hücreler arası Ca 2 +-dalga yayılımı ölçmek için basit bir yöntem tarif. Mekanik olarak uyarılmış hücreleri +, her ikisi de arası Ca 2 + dalga yayılımının 11,67 sürücü gerekli hücre içi sinyal molekülleri, hücre içi IP 3 ve Ca 2 yerel bir artış ile yanıt verir. Ca 2 + hemichannels açılması ...

Hücreler arası iletişim ve sinyal doku ve tüm organ düzeyinde 1,2 de hücre dışı agonistler yanıt olarak fizyolojik süreçlerin koordinasyonu için gereklidir. Hücreler arası iletişimin en doğrudan yolu boşluğu kavşak oluşumu tarafından oluşturulur. Gap junction 3,4 komşu hücrelerin iki konneksin (Cx) hemichannels (Şekil 1) başkanı kafaya yerleştirme ile oluşan protein kanalları gap junction kanalları plaklar vardır. Ara bağlantılar neden olan ve modüle Ca2 komşu hücreler 6 (Şekil 2) arasında hücre içi mağazalarından +-serbest bırakma., Ca2 + veya IP 3 5 de dahil olmak üzere, en az 1.5 kDa arasında bir moleküler ağırlığa sahip küçük sinyal moleküllerinin geçişine izin Boşluk birleşme kanalları sıkıca redoks modifikasyon ve benzeri gibi, intra-ve intermoleküler protein etkileşimleri ile ve hücresel sinyal süreçler ile düzenlenirfosforilasyon 7. Gjs böylece kimyasal ve elektriksel syncytium olarak hareket eden, bağlı hücrelerin koordine cevabı sağlar. Örneğin, atriyal ve ventriküler kalp miyositleri arasında hareket potansiyelinin yayılmasını Cx-tabanlı GJ kanal 85 aracılığıyla gerçekleşir. Cxs sadece gap junction kanalları olarak rol değil, aynı zamanda eşleşmemiş hemichannels oluşturmak, böylece düzenli iyon kanalları 8-10 (Şekil 1) benzer zarlarında kanalları olarak çalışmıyor. Hemichannels hücre içi ve dışı çevre arasındaki iyon ve sinyal molekülleri değişimini kontrol ederek komşu hücreler arasında parakrin sinyal katılmak. Bir çok hücre tipinde (epitel hücreleri, osteoblastik hücrelerin, astrositlerin, endotelyal hücreler, vb gibi) ve organların (beyin, karaciğer, retina, koklea ve damarsal gibi), hücreler arası Ca 2 + dalgalar hücreli yanıtların koordinasyonu için temel olan <sus&gt; 11. Belirli bir hücrede hücre içi Ca 2 + düzeylerinde artış bu hücre ile sınırlı, ama böylece bir hücreler arası Ca 2 +-dalga 12,13 kurulması, çevredeki komşu hücrelere yaymak değildir. Bu hücreler arası Ca 2 + dalgaları syncytium ve düzensizliği patofizyolojik işlemleri 11 ile ilişkili olduğu gibi hücre katmanları fizyolojik düzenlenmesi için önemlidir. Kornea endotel ve epitel, kendi 25-33 gibi farklı grupları 14-24, hücreler arası iletişim mekanizmaları ve rolleri okudu. Olmayan uyarılabilir hücrelerde, kornea endotel hücreleri gibi, hücreler arası iletişim iki ayrı modu 28,29, yani boşluk kavşak arası iletişim ve parakrin hücreler arası iletişim ortaya çıkar. Gap kavşak arası iletişim boşluğu kavşak 7 ile sinyal molekülleri doğrudan bir değişimi içerir. Gap junctional arası iletişim, doku dengesini korumak hücre çoğalması kontrol ve hücre dışı stres 10,34,35 bir senkronize cevap kurmak için önemlidir. Patolojiler bir dizi, gap junction bağlantı nedeniyle hatalı CXS düşürüldü, ve burada boşluk kavşak arası iletişim 36 etkiliyor. Bu çok hücreli organizmalarda boşluğu kavşak arası iletişimin önemini ve etkisini vurgular. Bu yayılabilir dışı haberciler (Şekil 2) sürümü içerdiğinden boşluğu kavşak arası iletişim aksine, parakrin hücreler arası iletişim, hücre-hücre apozisyon bağlı değildir. Sinyal moleküllerinin farklı hücre sinyalizasyon hücre dışı boşlukta serbest bırakılır. Molekül daha sonra belirli bir reseptör proteini ile tespit edilir, hedef hücreye taşınır. Daha sonra reseptör sinyal kompleksi olan bir hücresel yanıtı indüklersinyal, ya da etkisiz hale duyarsızlaştırma çıkarılması ile sonlandırılır. Çıkış lipofilik hücre dışı sinyal haberciler membran nüfuz ve hücre içi reseptörleri üzerinde hareket ederler. Buna karşılık, hidrofilik haberciler yanıt hücrenin plazma zarı çapraz değil, ama sonra hücre içi çevreye sinyal röle yüzey ifade reseptör proteinler, bağlanan bir ligand olarak hareket ederler. Iyon-kanalı-bağlantılı, enzim-bağlı ve G-protein-bağlantılı: hücre yüzeyi reseptör proteinlerinin üç önemli aile bu süreçte yer alırlar. Serbest haberci molekül yakın (parakrin) hedef hücreleri üzerinde, aynı hücre (otokrin) reseptörleri üzerinde hareket edebilir, ya da dolaşım sistemi (endokrin) gerektiren uzak hedef hücreler üzerinde. Kornea endotel 28,29 dahil olmak üzere birçok hücre tipi içinde, hücre içi ATP Ca 2 + dalgalar 37-40 yayılma sürücü büyük hidrofilik, parakrin faktörlerden biridir. DurÇeşitli maddeler olarak kaldırılması ile mekanik deformasyon, hipoksi, inflamasyon veya stimülasyon, ATP kayma gerilmesi, çekme ya da ozmotik 44,45 şişme tepki olarak 41-44 sağlıklı hücrelerden serbest bırakılabilir. Farklı ATP-serbest bırakma mekanizmaları veziküler ekzositozu 44 ve bu, ATP-bağlayıcı kaset (ABC), taşıyıcılar, plasmalemmal voltaj bağımlı anyon kanalları 46, P2X7 reseptör kanalı 47,48 yanı sıra, ayrıca nakil mekanizması, bir bolluk da dahil olmak üzere, öne sürülmüştür konneksin hemichannels 49-52 ve pannexin hemichannels 43,49,53. Hücre dışı ATP ADP, AMP hızla hidrolize olması ve hücre dışı ortamda mevcut ectonucleotidases ile 54,55 adenozin olabilir. Ekstraselüler serbest ATP ve metaboliti ADP 56 difüzyon yoluyla yayılacak. Komşu hücrelerde purinerjik reseptörleri ile bu nükleotidlerin işlemler daha sonra p rolü de ortaya konmuşturarası Ca 2 +-dalgaları 28,37,51 bir ropagation. Purinerjik reseptörlerinin iki farklı sınıflar mevcut: Her iki pürin (ATP, ADP) ve pirimidin (UTP, UDP) nükleotidler en P2-purinoceptors 57 hareket ise adenozin, P1-purinoceptors için başlıca doğal ligand olduğunu. Hücreler arası iletişim gibi kazıma yükleme, boya transferi, IP 3 ve Ca 2 +, mekanik uyaran, vb gibi agonistlerin yerel uncaging gibi farklı yöntemlerle incelenebilir. Burada + dalga yayılımı, tek bir hücrenin mekanik uyarılar ile ortaya çıkarılan Ca 2 çalışma açıklar. Mekanik olarak uyarılmasıyla, Ca 2 +-dalga yayılımı eğitim avantajı + dalga zamanla Ca 2 yayılmasını ölçmek için kolay bir araç sağlar ve kantitatif olarak farklı hücre ön işlemleri karşılaştırarak izin vermektedir. Kornea endotel, bu hücreler arası Ca 2 +-dalgaları eş izintek tabaka gelen koordine yanıt, burada göz içi ameliyat sırasında hücre dışı zorlamalara dayanıklı endotel yardımcı olmayan rejeneratif kornea endotel olası bir savunma mekanizması olarak hareket, ya da bağışıklık ret veya üveit 58,59 sırasında inflamatuvar mediatörlerin maruz üzerine.

<table><tbody><tr><td>Earle'ün Dengeli Tuz Çözeltisi (EBSS)</td><td>Invitrogen-Gibco-Moleküler Problar (Karlsruhe, Almanya)</td><td>14155-048</td><td></td></tr><tr><td>İyot</td><td>Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Almanya)</td><td>38060-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM)</td><td>Invitrojen-Gibko-Moleküler Problar (Karlsruhe, Almanya)</td><td>11960-044</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamin (Glutamax)</td><td>Invitrogen-Gibco-Moleküler Problar (Karlsruhe, Almanya)</td><td>35050-038</td><td></td></tr><tr><td>Amfoterisin-B</td><td>Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Almanya)</td><td>A2942</td><td></td></tr><tr><td>Antibiyotik-antimikotik karışımı</td><td>Invitrogen-Gibco-Moleküler Problar (Karlsruhe, Almanya)</td><td>15240-096</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin</td><td>Invitrogen-Gibco-Moleküler Problar (Karlsruhe, Almanya)</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>DulbeccoPBS</td><td>Invitrogen-Gibco-Moleküler Probları (Karlsruhe, Almanya)</td><td>14190-091</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4</td><td>Invitrogen-Gibco-Moleküler Problar (Karlsruhe, Almanya)</td><td>F14217</td><td></td></tr><tr><td>ARL-67156 (6-N,N-Dietil-b,g-dibromometilen-D-ATP) </td><td>Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Almanya)</td><td>A265</td><td></td></tr><tr><td>Apyrase VI</td><td>Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Almanya)</td><td>A6410</td><td></td></tr><tr><td>Apyrase VII</td><td>Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Almanya)</td><td>A6535</td><td></td></tr><tr><td>Gap26 (VCYDKSFPISHVR)</td><td>Özel peptit sentezi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gap27 (SRPTEKTIFII)</td><td>Özel peptit sentezi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kontrol Peptit (SRGGEKNVFIV)</td><td>Özel peptit sentezi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>siRNA1 Cx43 (anlamlı: 5'GAAGGAGGAGGAACU-CAAAdTdT) </td><td>Tavlanmış siRNA şu adresten satın alındı: Eurogentec (Luik, Belçika)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>siRNA2 Cx43 (anlamlı: 5'CAAUUCUUCCUGCCGCAAUdTdT) </td><td>Tavlanmış siRNA, Eurogentec'ten (Luik, Belçika) satın alındı)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>siRNA karıştırma: siCx43-1'in şifreli dizisi (anlamlı: 5'GGUAAACG-GAACGAGAAGAdTdT) </td><td>Tavlanmış siRNA, Eurogentec'ten (Luik, Belçika)</td><td></td><td></td> satın alındı</tr>)<tr><td>TAT-L2 (TAT- DGANVDMHLKQIEIKKFKYGIEEHGK)</td><td>Termo Elektron (Ulm, Almanya)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TAT-L2-H126K/I130N (TAT-DGANVDMKLKQNEIKKFKYGIEEHGK) </td><td>Thermo Electron (Ulm, Almanya)</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>İki odacıklı cam slaytlar</td><td>Laboratory-Tek Nunc (Roskilde, Danimarka)</td><td>155380</td><td></td></tr><tr><td>Konfokal mikroskop </td><td>Carl Zeiss Meditec (Jena, Almanya)</td><td>LSM510</td><td></td></tr><tr><td>Piez&#8211; lectric crystal nanopositioner (Piezo Flexure NanoPositioner)</td><td>PI Polytech (Karlsruhe, Almanya)</td><td>P-280</td><td></td></tr><tr><td>HVPZT-amplifikatör</td><td>PI Polytech (Karlsruhe, Almanya)</td><td>E463 HVPZT-amplifikatör</td><td></td></tr><tr><td>Cam tüpler (cam değiştirme 3.5 nanolitre)</td><td>World Precision Instruments, Inc. Sarasota, Florida, ABD</td><td>4878</td><td></td></tr><tr><td>Micr&#8211; lektrode çektirme </td><td>Zeitz Instrumente (München, Almanya)</td><td>WZ DMZ-Üniversal çektirme</td><td></td></tr></tbody></table>

hücre tek katmanlar mekanik uyarılması bağlı kalsiyum dalga yayılım: sığır kornea endotel hücreleri Örneği

Mechanical Stimulation-induced Calcium Wave Propagation in Cell Monolayers: The Example of Bovine Corneal Endothelial Cells

Hücreler arası iletişim, beyin, karaciğer, retina, koklea ve damarsal içeren organlar ve dokular, çeşitli hücreler arasında fizyolojik süreçlerin koordinasyonu için gereklidir. Deneysel ayarlarında, hücreler arası Ca 2 +-dalgaları tek bir hücreye mekanik bir uyaran uygulanarak elde edebilir. Bu hücre içi sinyal IP molekülleri 3 ve Ca 2 serbest bırakılması yol açar + komşu hücrelere mekanik uyarılmış hücreden + dalga eş Ca 2 yayılma başlatmasını. Arası Ca 2 +-dalga yayılımı kontrol ana moleküler yollar IP 3 doğrudan transferi yoluyla ve ATP serbest bırakılması ile hemichannels tarafından gap junction kanalları tarafından sağlanmaktadır. Özellikleri ve farklı konneksin ve boşluk kavşak kanalları ve hemichannels olarak pannexin izoformlarının düzenlenmesi belirlenmesi ve karakterizasyonu quantificatio izin verdiğin arası Ca 2 +-dalga siRNA ve boşluk kavşak kanalları ve hemichannels inhibitörlerinin kullanımının yayılması. Burada, bir sonucu olarak hücreler arası Ca2 hücre akut, kısa süreli bir etkiye deformasyonu ile oluşturulan bir kontrollü ve lokalize mekanik uyarıcıya tepki olarak Fluo4-AM yüklendi primer endotel hücrelerinin mono tabakaları + dalga ölçmek için bir yöntem tarif az 1 mikron bir ipucu çaplı bir micromanipulator kontrollü cam mikropipet ile hücre zarının dokunmadan. Ayrıca birincil sığır kornea endotel hücreleri ve + dalgaları ATP serbest bırakılması ile arası Ca 2 için tahrik güç olarak Cx43-hemichannel aktivite değerlendirmek için model sistem olarak kullanımı izolasyonu açıklar. Son olarak, kullanımı, avantajları, sınırlamalar ve boşluk kavşak kanal ve hemichannel araştırma bağlamında bu yöntemin alternatifleri tartışmak.

Tüm deneyler ilgili tüm kurallar, düzenlemeler ve düzenleyici kurumlar uygun olarak yürütülür ve ortaya olan protokol KU Leuven hayvan bakımı ve kullanımı komitesi rehberlik ve onay altında yapılır. Sığır kornea endotel hücreleri (BCEC) olarak, fonksiyonel gap junction ifade ve boşluk kavşak arası iletişim ve parakrin hücreler arası iletişim hem de interaktif bir şekilde hücreler arası iletişim önemli katkı, ancak ana yol aracılık parakrin hücreler arası iletişim yolu olduğu gösterilmiştir v...

Hücreler arası Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt;-Dalgaları gap junction kanalları ve hemichannels tarafından tahrik edilmektedir. Burada, hücreler arası Ca ölçmek için bir yöntem açıklanmaktadır<sup&gt; 2 +</sup&gt;-Dalgaları yerel bir tek hücreli mekanik uyaran ve özellikleri ve boşluk kavşak kanalları ve hemichannels düzenlenmesi araştırmak için uygulama yanıt olarak hücre mono tabakaları içinde.

Hücre Tek katmanlar mekanik uyarılması bağlı Kalsiyum Dalga Yayılım: Sığır Kornea Endotel Hücreleri Örneği

Intercellular communication is essential for the coordination of physiological processes between cells in a variety of organs and tissues, including the ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, primer kornea endotel hücre monotabakalarında mekanik stimülasyonla tetiklenen hücreler arası kalsiyum dalgasının yayılımının kantifikasyonu yoluyla, gap junction kanalları ve HEMİ kanallar aracılığıyla gerçekleşen hücreler arası iletişimi incelemektir. Bu işlem, öncelikle taze sığır gözlerinden primer kornea endotel hücrelerinin izole edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım olarak, hücrelerin bölmeli lamellere ekilmesinden iki ila üç gün sonra, konfluen hücre monotabakası floresan kalsiyum duyarlı boya flu O 4:00 AM ile yüklenir. Ardından, konfokal mikroskop altında görselleştirilen bir hücreler arası kalsiyum dalgasını tetiklemek amacıyla, monotabakadaki tek bir hücreye kontrollü ve lokalize bir mekanik stimülasyon uygulanır.Sonuçlar, hücreler arası kalsiyum dalgası yayılımının yayılımını göstermektedir. Nihayetinde, gap junction kanallarının ve HEMI kanallarının inhibisyonu; gap junction kanallarını ve HEMI kanallarını oluşturan farklı Conex ve panex izoformlarının özelliklerini ve düzenlenmesini aydınlatmak için kullanılır. Mekanik stimülasyonla indüklenen hücreler arası kalsiyum dalgası yayılımının temel avantajı, bağlantı ve aksing kanallarının katkısını ve özelliklerini invaziv olmayan bir yöntemle incelemek için basit ve güvenilir bir yöntem sağlamasıdır.Ayrıca, yöntem incelenen hücresel sistemlerde bulunan fizyolojik sinyal moleküllerine ve kaskadlara dayanmaktadır. Son olarak, primer hücreler ve belirli konneksin veya PanIN izoformlarını ektopik olarak eksprese eden hücre modelleri dahil olmak üzere çeşitli hücre sistemlerine kolayca uyarlanabilir. Bu yöntemler, endojen konneksin veya panik izoformlarının siRNA aracılı nakavtı ve gap junction kanallarının ve HEMI kanallarının seçici inhibitörlerinin kullanımıyla, konneksin ve PanIN tabanlı gap junction kanallarının ve HEMI kanallarının fonksiyonu ve dinamik regülasyonu hakkında bilgi sağlayabilir.Bu sistem kesinlikle sadece kornea endotel hücreleri ile sınırlı değildir. Hemen hemen her hücre tipine ve ayrıca daha kompleks dokulara uyarlanabilir. Bu prosedürde, 18 aydan büyük olmayan bir ineğin, ölüm sonrası beş dakikayı geçmemiş, taze olarak nukleat edilmiş gözü kullanılır.Örnek, Earl dengeli tuz çözeltisi ve %1 iyot çözeltisi içerisinde dört derece Celsius'ta laboratuvara taşındı. İlk olarak, gözü 100 milimetreye 20 milimetrelik bir Petri kabına aktarın. Ardından, gözü %1 iyot içeren EBSS ile durulayın.Ardından, bu noktadan itibaren %70 etanol içeren bir solüsyonla sterilize edin. Steril bir kabin içerisinde çalışın. Korneayı gözden dikkatlice ayırın ve epitel hücre tabakası yukarı bakacak şekilde, EBSS içeren 35 milimetre x 10 milimetrelik bir Petri kabına yerleştirin.Korneaya hâlâ yapışık olan tüm iris dokularını dikkatlice temizleyin. Gerekirse korneayı, endotel hücre tabakası yukarı bakacak şekilde başka bir EBSS kabına aktarın ve ardından EBSS ile iki kez durulayın. Sonrasında korneayı, endotel tabakası yukarıya bakacak şekilde bir kum saatine yerleştirin ve büyüme ortamı ile kaplayın.Durulamak için, besiyerini bir vakum pipeti ile uzaklaştırın. Korneanın endotel tabakasına 300 µL 0,5 g/L tripsin çözeltisi uygulayın. Kornea içeren kum saatini kapalı bir Petri kabına yerleştirin ve 37 °C ve %5 CO2 koşullarında 30 dakika boyunca inkübatöre aktarın.Kum saatini geri aldıktan sonra, korneadaki endotel hücrelerini ateşle cilalanmış kanca şeklinde bir cam pastör pipetiyle nazikçe sıyırın. Endotel hücrelerini içeren solüsyonu aspire edin ve dört mililitre kültür ortamı içeren 25 santimetrekarelik bir kültür flaskına ekleyin. Ardından, korneaya 300 µL büyüme ortamı uygulayın.Sıyırma işlemini tekrarlayın ve endotel hücrelerini içeren çözeltiyi kültür balonuna ekleyin. Bu adımı bir kez daha tekrarlayın, ardından kornea endotel hücrelerini içeren kültür balonlarını büyüme ortamı ile birlikte 37 °C ve %5 karbondioksit içeren inkübatöre yerleştirin. İki gün sonra altı mililitre kültür ortamı ekleyin ve büyüme ortamını her iki günde bir yenileyin.Hücreler, izolasyondan pasajlama aşamasına kadar yedi ila 10 gün içinde konfluent hale gelmelidir. Öncelikle kültür ortamını aspire edin ve ardından iki kez EBSS ile durulayın. Sonra hücrelerin üzerine iki mililitre tripsin solüsyonu ekleyin ve flaskı üç ila dört dakika boyunca inkübatöre yerleştirin.Ardından 12 milliliters büyüme besiyeri ekleyin ve hücreleri dağıtmak için besiyerini üç kez pipetle çekip boşaltın. Daha sonra hücreleri bir hemositometre veya otomatik hücre sayıcı kullanarak sayın. İki kuyucuklu kültür lamlarına 165,000 hücre ekleyin.Ardından, yeni bir pasaj için 75 santimetrekarelik kare kültür flasklarını santimetrekare başına 6.250 hücre yoğunluğunda hazırlayın, toplam hacim 25 mililitre olacak şekilde taze kültür ortamı ekleyin ve flasklar ile chamber slide'ları inkübatöre yerleştirin. Besiyeri her iki günde bir tazelenir ve hücre tabakasının konfluensine üç ila dört gün içinde ulaşılmalıdır. İlk olarak, chamber slide içindeki hücreleri, 37 °C'de 30 dakika boyunca hafifçe çalkalayarak fosfat tamponlu salin içindeki 10 µM Fluo-4 AM ile yükleyin; hücreler Fluo-4 AM ile inkübe edilirken, uç çapı 1 µm'den küçük olan bir cam mikropipeti bir piezoelektrik nanopozisyonere bağlayın ve mikromanipülatöre monte edilmiş bir amplifikatöre bağlayın.Nano konumlandırıcının voltajını 0.2 ile 1.5 volt arasına ayarlayın. 4:00 AM çözeltisinin akışını durdurun. Ardından hücreleri beş kez fosfat tamponlu salin ile yıkayın ve ölçümden önce hücreleri oda sıcaklığında en az beş dakika boyunca PBS ile inkübe edin.Argon lazer ile 488 nanometre dalga boyunda uyarım yapın ve HFT 48 ışın ayırıcıyı kullanın. Pinhole minimuma ayarlanmışken, LP 5 0 5 uzun geçiren emisyon filtresini kullanarak 530 nanometredeki floresan emisyonu toplayın; burada 40 x yağlı immersiyon objektif kullanılır. Hazne lamını konfokal mikroskobun tablasına yerleştirin ve konfluens hücrelerin bulunduğu bir alan bulun.Ardından, cam mikro pipetin hücre membranına 45 derecelik bir açıyla temas etmesini sağlamak için mikro manipülatörü hareket ettirin. Tek bir hücre membranının %1'inden daha az bir kısmına cam mikro pipetle kısa süreliğine dokunmak ve hücreye bir saniyelik mekanik stimülasyon uygulamak için mikro manipülatörü çalıştırın. Daha sonra, mekanik stimülasyonu takiben kalsiyum iyon konsantrasyonundaki uzamsal değişimleri konfokal mikroskop ile ölçün, görüntüleri toplayın ve kaydedin.Son olarak, konfokal mikroskobun yazılımını kullanarak yanıt veren hücrelerin toplam yüzey alanını tanımlamak için çokgen bir ilgi alanı çizin. Sığır kornea endotel hücrelerinde, kontrol koşulları altında mekanik stimülasyonla indüklenen kalsiyum geçişleri, farklı zaman noktalarında temsilci yalancı renkli floresan görüntülerle gösterilmiştir; stimülasyon öncesindeki floresan yoğunlukları ilk görüntüde yer almaktadır. İkinci görüntüdeki beyaz ok, mekanik olarak stimüle edilen hücreyi belirtmektedir.Kalsiyum dalgası komşu altı hücre tabakasına yayılmakta olup, dalganın ulaştığı toplam hücre alanı 62.870 µm²'lik bir aktif alan oluşturmaktadır. Çizgi grafik, ms olarak işaretlenen mekanik olarak stimüle edilmiş hücredeki normalize floresan değerinin (NF) zaman seyrini ve grafikte MB1'den MB5'e kadar işaretlenen bir ila beş arasındaki komşu hücre tabakalarındaki ortalama NF değerini göstermektedir. Bu görüntüler, soldaki grafikte eksojen nükleotidlerle tedavi sonrası ve sağdaki grafikte ekto nükleotidaz inhibitörleri ile tedavi sonrası hücreler arası kalsiyum dalgalarının yayılımındaki belirgin değişiklikleri göstermektedir; daha detaylı olarak, soldaki grafik, sığır kornea endotel hücrelerinin, ATP ve ADP'yi hidrolize ederek perikrin hücreler arası iletişim yolunu inhibe eden eksojen Aras Aase6 ve Aase7 ile tedavisi sonrası aktif alanda meydana gelen belirgin azalmayı göstermektedir.Yıldız işareti, ace varlığında ve yokluğunda P değerinin 0,001'den küçük olduğunu belirtmektedir. Sağdaki grafik, BCEC'lerin seçici bir ekto nükleotid inhibitörü olan A RL 6 7 1 56 ile işlem görmesinden sonra aktif alanda anlamlı bir artış olduğunu ve böylece perikrin hücreler arası iletişim yolunun güçlendiğini göstermektedir. Yıldız işareti, a RL varlığında ve yokluğunda P değerinin 0,001'den küçük olduğunu belirtmektedir. Bir kez uzmanlaşıldığında.Bu teknik, doğru şekilde uygulandığında tek bir koşuldaki tek bir deney için beş ila 10 dakikada tamamlanabilir. Farklı koşulların karşılaştırılabileceği bir dizi deneyin tamamlanması ve istatistiksel sonuçların çıkarılması bir gün sürer. Farklı günlerde ve izole edilmiş hücrelerin farklı partilerinden gerçekleştirilen bağımsız deneyler kullanılmalıdır.Hücre içi kalsiyum dalgası yayılımının ölçülmesi ve nicelendirilməsi, gap junction kanalları ve hemikanallar gibi farklı konneksin ve ine izoformlarının hücre biyolojik regülasyonunun tanımlanmasına ve karakterizasyonuna olanak tanır. Ayrıca, bu yöntemin tek başına yeterli olmadığını, diyet transferinden TP salınımına ve elektrofizyolojiye kadar uzanan diğer moleküler ve fonksiyonel yaklaşımlarla tamamlanması gerektiğini vurgulamak isterim.

mechanical-stimulation-induced-calcium-wave-propagation-cell

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu makale, kültürlenmiş HL-1 atriyal hücre tek katmanlarında çift kanallı optik haritalama gerçekleştirmek için kullanılan tekniği açıklamaktadır. Bu benzersiz protokol, kültür tek katmanlarının elektrofizyolojik özelliklerinin ayrıntılı tespiti ve analizi için aynı alanda hem kalsiyum (Ca) hem de voltaj (Vm) aktivitesinin aynı anda görselleştirilmesine olanak tanır.

Kültürlü HL-1 Atriyal miyositlerdeki Monolayer Gerilim ve Kalsiyum Çift Kanal Optik Haritalama

Yüksek çözünürlüklü diferansiyel girişim kontrast (DIC) mikroskopi kullanılarak, fare beyin ventriküller içinde yer alan hareketli ependim kirpikler dayak bir ex vivo gözlem canlı görüntüleme ile gösterilmiştir. teknik, özel bir siliyer atan frekansının kayıt ve dayak açısı aynı zamanda bunların hücre içi kalsiyum salınım ilerleme hızı özellikleri sağlar.

Fare Beyin lateral ventrikül Ependimal Cilia Canlı Görüntüleme

Bakteriyel mechanosensitive kanallar biyomoleküler cihazlarda mekanoelektriksel dönüştürücüler olarak kullanılabilir. Damlacık arayüz bilayers (Dıb'leri), bu tür cihazlara hücre ilham yapı blokları, birleştirmek ve mechanosensitive kanallar teşvik etmek, yeni platformlar temsil etmektedir. Burada, biz, Dıb'leri oluşturan mekanik stimülasyonu altında mechanosensitive kanalların çalışma izin yeni bir mikropipet tabanlı bir yöntem göstermektedir.

Çok fonksiyonlu, Damlacık Arayüz Bilayers Bakteriyel Mechanosensitive İyon Kanallarının Kuruluş Ve Uyarım için Yöntemi Mikropipet tabanlı

sığır endotel hücrelerinin ana bir kültürü kornea endotelial-mezenkimal geçiş mekanizmasını araştırmak için kullanıldı. Ayrıca, bir fare endotel cryoinjury modeli in vivo olarak endotel-mezenkimal geçiş göstermek için kullanılmıştır.

Vitro ve in vivo Modelleri Kornea Endotel-mezenkimal Geçiş Çalışması için

Burada gösterdi (1) taze olduğu gibi beyin endotel "boru" ve endotel kalsiyum ve membran endotel kaynaklı hyperpolarization sırasında potansiyel (2) eşzamanlı ölçümler sorunlarının yalıtılması iletişim kurallarıdır. Ayrıca, bu yöntemler farmakolojik endotel hücre kalsiyum ve bireysel veya etkileşimli deneysel değişkenler olarak elektrik sinyali ayarlamak için izin verir.

Hücre içi kalsiyum ve taze izole ve olduğu gibi fare serebral endotel membran potansiyeli eşzamanlı ölçümler

Burada kornea endotel hücrelerinin (MSK) neodimyum kullanarak Descemet zarından (DM) ayrılması için bir protokol sunuyoruz:YAG (Nd:YAG) lazer, büllöz keratopati (BK) için eksvivo hastalık modeli olarak.

Kornea Endotel Hücre Kaybının Noninvaziv, Lazer Destekli Deneysel Modelinin Geliştirilmesi

Bu protokol, insan veya koyun dokusu eksbitkilerinden kornea endotel hücre kültürleri kurmak ve büyümek için gerekli kritik adımları açıklar. Membranöz biyomalzemeler üzerinde kornea endotel hücrelerinin subculturing için bir yöntem de sunulmaktadır.

Biyomalzeme Membranlar Üzerinde İnsan ve Koyun Korneal Endotel Hücre Tabakalarının Büyümesi

Bu protokol, hücre içi optik biyo-modülasyonu için basit ve kolay bir yöntemde silikon nanotellerin kullanımını açıklamaktadır. Bu teknik, çeşitli hücre tiplerine son derece uyarlanabilir ve in vitro ve in vivo uygulamaları için de kullanılabilir.

Silikon Nanowires ve Optik Stimülasyon İç-ve Hücrelerarası Elektrik Kaplin İncelemeler için

Retina protezleri görsel algı oluşturma özelliğine sahiptir. Yeni protezlerin geliştirilmesini ilerletmek için, implantasyondan önce cihazları test etmek için ex vivo yöntemlere ihtiyaç vardır. Bu makale, elektriksel stimülasyona maruz kaldığında retinal ganglion hücre tabakasındaki kalsiyum aktivitesini incelemek için kapsamlı bir protokol sunmaktadır.

Elektrikle Uyarılan Düz Monte Retinalarda Kalsiyum Görüntüleme

Bu makale, Fura-2/boyası ile tek hücreli Ca2+ görüntüleme kullanılarak hücrelerde kalsiyum iyonu (Ca 2+) konsantrasyonlarının gerçek zamanlı, kantitatif izlenmesi için bir yöntem sunmaktadır. Bu teknik, floresan yoğunluk oranları aracılığıyla verimli boya yüklemesi ve Ca2+ seviyelerinin doğru bir şekilde hesaplanmasını sağlayarak araştırma uygulamaları için basit ve hızlı bir yaklaşım haline getirir.

Kalsiyum iyon kanallarının aktivasyonunu incelemek için tek hücreli kalsiyum görüntüleme

Kardiyak hücreleri ve dokuyu kontrol etmek için ışığın kullanılması, temassız stimülasyonu mümkün kılar, böylece hücrelerin doğal durumunu ve işlevini korur, bu da onu hem temel araştırma hem de terapötik uygulamalar için değerli bir yaklaşım haline getirir.

Genetik Olmayan Optik Stimülasyon Yoluyla Ca2+ Yayılımını İncelemek için Kardiyak Mikrofizyolojik Bir Sistem

Öğrenin mekanik uyarılma ile kalsiyum dalga yayılımını sığır kornea endotel hücrelerinde konfokal mikroskopi kullanarak incelemeyi. Bu yöntem hücreler arası iletişimi basit ve invaziv olmayan şekilde çalışmak için güvenilir bir sistem sunar.

Hücre Tek katmanlar mekanik uyarılması bağlı Kalsiyum Dalga Yayılım: Sığır Kornea Endotel Hücreleri Örneği

Daha fazla video keşfet