Name: Tomurcuklanma Maya Floresan Time-lapse Filmler Kazanılması ve GREFTLERİ kullanarak Tek hücreli Dynamics analiz (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 17 min 1 s
Description: Öğrenin, maya hücrelerinde floresan time-lapse görüntüleme ve tek hücreli dinamik analizi için GREFT yazılımı kullanarak transkripsiyon değişikliklerini incelemeyi. Bu yöntem hücre döngüsü ve gen regülasyonu çalışmalarında kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz yazılım yapılan yorumlar için Emily Jackson, Joshua Zeidman ve Nicholas Wren teşekkür ederim. Bu çalışma GM95733 (NM için), BBBE 103316 ve MIT başlangıç ​​fonları (NM için) tarafından finanse edildi.

<ol><li>Locke, J. C. W., Elowitz, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+movies+to+analyse+gene+circuit+dynamics+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Using movies to analyse gene circuit dynamics in single cells.</a> Nature Reviews. Microbiology. 7 (5), 383-392 (2009).</li>
<li>Rosenfeld, N., Young, J. W., Alon, U., Swain, P. S., Elowitz, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Regulation+at+the+Single-Cell+Level%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Gene Regulation at the Single-Cell Level.</a> Science. 307 (5717), 1962-1965 (2005).</li>
<li>Colman-Lerner, A., Gordon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulated+cell-to-cell+variation+in+a+cell-fate+decision+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Regulated cell-to-cell variation in a cell-fate decision system.</a> Nature. 437 (7059), 699-706 (2005).</li>
<li>Vega, N. M., Allison, K. R., Khalil, A. S., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling-mediated+bacterial+persister+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Signaling-mediated bacterial persister formation.</a> Nature Chemical Biology. 8 (5), 431-433 (2012).</li>
<li>Larson, D. R., Zenklusen, D., Wu, B., Chao, J. A., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-Time+Observation+of+Transcription+Initiation+and+Elongation+on+an+Endogenous+Yeast+Gene%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Real-Time Observation of Transcription Initiation and Elongation on an Endogenous Yeast Gene.</a> Science. 332 (6028), 475-478 (2011).</li>
<li>Golding, I., Paulsson, J., Zawilski, S., Cox, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+kinetics+of+gene+activity+in+individual+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Real-time kinetics of gene activity in individual bacteria.</a> Cell. 123 (6), 1025-1061 (2005).</li>
<li>Suter, D. M., Molina, N., Gatfield, D., Schneider, K., Schibler, U., Naef, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+Genes+Are+Transcribed+with+Widely+Different+Bursting+Kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mammalian Genes Are Transcribed with Widely Different Bursting Kinetics.</a> Science. 332 (6028), 472-474 (2011).</li>
<li>Cookson, N. A., Cookson, S. W., Tsimring, L. S., Hasty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle-dependent+variations+in+protein+concentration%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Cell cycle-dependent variations in protein concentration.</a> Nucleic Acids Research. 38 (8), 2676-2681 (2010).</li>
<li>Zopf, C. J., Quinn, K., Zeidman, J., Maheshri, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-cycle+dependence+of+transcription+dominates+noise+in+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Cell-cycle dependence of transcription dominates noise in gene expression.</a> , Submitted (2013).</li>
<li>Kaufmann, B. B., Yang, Q., Mettetal, J. T., Van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heritable+stochastic+switching+revealed+by+single-cell+genealogy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Heritable stochastic switching revealed by single-cell genealogy.</a> PLoS Biology. 5 (9), e239(2007).</li>
<li>Cookson, S., Ostroff, N., Pang, W. L., Volfson, D., Hasty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+dynamics+of+single-cell+gene+expression+over+multiple+cell+cycles%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">Monitoring dynamics of single-cell gene expression over multiple cell cycles.</a> Molecular Systems Biology. 1 (1), 2005.0024(2005).</li>
<li>Paliwal, S., Iglesias, P. A., Campbell, K., Hilioti, Z., Groisman, A., Levchenko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAPK-mediated+bimodal+gene+expression+and+adaptive+gradient+sensing+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">MAPK-mediated bimodal gene expression and adaptive gradient sensing in yeast.</a> Nature. 446 (7131), 46-51 (2007).</li>
<li>Charvin, G., Cross, F. R., Siggia, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+device+for+temporally+controlled+gene+expression+and+long-term+fluorescent+imaging+in+unperturbed+dividing+yeast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">A microfluidic device for temporally controlled gene expression and long-term fluorescent imaging in unperturbed dividing yeast cells.</a> PloS One. 3 (1), e1468(2008).</li>
<li>Gordon, A., Colman-Lerner, A., Chin, T. E., Benjamin, K. R., Yu, R. C., Brent, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+quantification+of+molecules+and+rates+using+open-source+microscope-based+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Meth%22%5BJournal%5D)">Single-cell quantification of molecules and rates using open-source microscope-based cytometry.</a> Nat. Meth. 4 (2), 175-181 (2007).</li>
<li>Otsu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Threshold+Selection+Method+from+Gray-Level+Histograms%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans.+Sys.+Man.+Cyber%22%5BJournal%5D)">A Threshold Selection Method from Gray-Level Histograms.</a> IEEE Trans. Sys. Man. Cyber. 9 (1), 62-66 (1979).</li>
<li>Goranov, A. I., Cook, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+rate+of+cell+growth+is+governed+by+cell+cycle+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">The rate of cell growth is governed by cell cycle stage.</a> Genes & Development. 23 (12), 1408-1422 (2009).</li>
<li>To, T. -L., Maheshri, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noise+Can+Induce+Bimodality+in+Positive+Transcriptional+Feedback+Loops+Without+Bistability%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Noise Can Induce Bimodality in Positive Transcriptional Feedback Loops Without Bistability.</a> Science. 327 (5969), 1142-1145 (2010).</li>
<li>O'Neill, E. M., Kaffman, A., Jolly, E. R., O'Shea, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+PHO4+nuclear+localization+by+the+PHO80-PHO85+cyclin-CDK+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Regulation of PHO4 nuclear localization by the PHO80-PHO85 cyclin-CDK complex.</a> Science. 271 (5246), 209-212 (1996).</li>
<li>Raser, J. M., O'Shea, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+stochasticity+in+eukaryotic+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Control of stochasticity in eukaryotic gene expression.</a> Science. 304 (5678), 1811-1814 (2004).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.

Yukarıdaki protokol Mikroakiskan veya yazılım geliştirme sınırlı deneyimi olan floresan zaman serisi verileri elde etmek ve analiz etmek için basit bir yöntem açıklanır. Bu tek bir maya hücrelerinin zaman sukut floresan film elde etmesini sağlar, papaz izleme ve soy atamaları,, ilgili hücre boyutu ve ifade ölçümleri ayıklamak ve bir ticari mikroakışkan kültür cihaz kullanarak zaman ve çok yönlü bir grafik kullanıcı üzerinde bütün hücrelerin davranışını analiz arayüzü (GUI). Deneysel, segmentasyon ve izleme adımları çeşi...

Gen Tek hücre analizi gen regülasyonu birçok açıdan bizim anlaşılmasını kolaylaştırdı. Akım sitometri veya mikroskopi kullanılarak floresan muhabiri ifade statik anlık tek hücreli ifade dağılımı hakkında yararlı bilgiler sağlar, ancak tarih ve doğrudan gen dinamikleri bilgilendirmek için gerekli zaman serisi verileri evrimi eksikliği. Floresan zaman atlamalı mikroskopi tek hücreli ölçümleri ve tarih hem de elde etmek için bir araç sunar. Çeşitli deneysel ve analitik teknikler böylece, hücre-hücre varyasyon 2,3, bakteriyel persister oluşumu 4, transkripsiyon gibi gen regülasyonu özellikleri içine anlayışlar (bir yorum için 1) aktarmanın, floresan muhabiri ifade film elde etmek ve ölçmek için geliştirilmiştir başlatılması ve uzama 5, 6,7 patlama transkripsiyonel, hücre döngüsü bağımlılık 8,9, ve kalıtım 10. Bununla birlikte, OBT&#39;ninAining kaliteli tek hücreli floresan zaman serisi kültür önemli teknik sorunlar kontrol edilebilir bir ortam ve elde edilen floresan filmleri yüksek verimli miktarının bir hücre tek tabaka içerir. Burada, S. floresan film elde etmek ve analiz etmek için bir prosedür tarif hücre kültürü cihaz üretiminde veya yazılım geliştirme hiç gerekli deneyimi (Şekil 1) ile cerevisiae. İlk olarak, ayrıntılı bir örnek protokolü bir veya daha fazla floresan gazetecilere ifade tomurcuklanan maya için floresan zaman serisi film oluşturmak için. Özel mikroakışkan kültür odaları inşa edilmiş ve başarılı bir şekilde daha önce 11-13 istihdam edilmiştir rağmen, biz CellAsic (Hayward, CA) bir ticari mikroakışkan cihazı kullanın. Sistem, tek tabaka sınırları büyüme hücreleri ve perfüzyon ortamının sürekli olarak kontrol edilmesini sağlar. Biz mevcut mikroskopi protokolü fluoresc elde etmek için basit bir araçtırence tomurcuklanan maya film, ancak herhangi bir değişiklik deney protokolünde (özelleştirilmiş bir kültür cihaz, alternatif medya koşulları, vb.) tek maya hücrelerinin benzer floresan film veri verimli ikame edilebilir. Sonra, zaman serisi veri ayıklamak için bir grafik kullanıcı arayüzü (GUI) tabanlı MATLAB yazılım paketi (Mathworks, Natick, MA), Floresans Zaman Serisi Hızlı Analizi (GREFTLERİ) için GUI adlandırılan, kullanarak filmlerin analizi anahat tek hücreler için. GREFTLERİ hücreleri segmentlere ve izleme ve floresan ve geometrik bilgileri ayıklamak en çok yönlü, açık kaynak yazılım paketi Hücre-ID 14 benzer özelliklere sahiptir. Ancak, GREFTLERİ önemli ek özellikler sağlar. İlk olarak, segmentasyon ve veri doğruluğunu, yerine analizden sonra aykırı bölge izleri sadece istatistiksel yolluk doğrulamak için izleme sonuçlarının kolay interaktif düzenleme sunmaktadır. Ayrıca, automaticall için analizi uzanıry adayı soy ve tomurcuklanan maya ilgi hücre döngüsü noktaları. Anne ve kızı iki bağımsız hücre bölge oluşturmak için bölmek zamanını belirleme tüm hücre (herhangi bir bağlı tomurcuk gibi anne) hücre döngüsü 8 boyunca ölçümleri belirlemek için çok önemlidir. Suite bu görevleri yerine getirmek için üç modülden oluşmaktadır. Odaklı ve odaklanmamış parlak bir alan görüntüler arasında kontrast dayanan ve ilk bölümleri hücre bölgeleri kullanıcı segmentasyonu parametrelerini tanımlamak ve görsel olarak test etmenizi sağlar. İkinci (. Mevcut Blair ve Crocker ve ark IDL rutin Dufresne&#39;nin MATLAB uygulaması kullanarak,: parça <a href="http://physics.georgetown.edu/matlab/" target="_blank">http://physics.georgetown.edu/MATLAB/</a> ) ve zaman içinde hücre bölgelerde önlemler; otomatik soy atar ve görsel denetim sağlar ve hata düzeltme. Basit bir komplo GUI sorgu tek hücreli özelliklerine dahildir. Üçüncü modül tomurcuk ortaya çıkması ve bölme ti bağlıyormes, ve tüm hücre zaman serisi verilerin yanı sıra ilk ve ikinci kez türevleri (as 9 ele) verir. Analiz modülü tercih istatistiksel yazılım sonraki çalışma için bir boşluk ayrılmış metin dosyası olarak veri verir. Böylece paketi kullanıcı bir grafik arayüz üzerinden yüksek kaliteli zaman serisi veri ayıklamak sağlar. Biz hücre döngüsü 9 bir fonksiyonu olarak tek tomurcuklanan maya hücreleri gerçek zamanlı transkripsiyon oranları tahmin etmek için bu yöntemi kullandık. Modüllerin tomurcuklanma maya, parametreleri veya için optimize edilmiş olsa da, gerekirse, serbestçe kullanılabilir kod diğer organizmalar ve resim tipleri için adapte edilebilir. Segmentasyon, izleme, ve soy atama algoritmaları atanan görüntüleme ve söz konusu organizmanın türlerine özgü olabilir. Mevcut algoritmaları yerine, ama yine de kullanıcı dostu görsel denetim ve segmentasyon düzeltme ve her zaman istediğimiz an izleme hataları sağlar GUI arayüzü korumak olabilirherhangi bir algoritma ile r.

<table><tbody><tr><td>Y04C Maya Perfüzyon Plakası</td><td>CellAsic</td><td>Y04C-02</td><td></td></tr><tr><td>ONIX Mikroakışkan Perfüzyon Platformu</td><td>CellAsic</td><td>EV-262</td><td></td></tr><tr><td>Axio Observer.Z1 Mikroskop</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plan-Apochromat 63x/1.40 Yağ DIC objektifi</td><td>Zeiss</td><td>440762-9904-000</td><td></td></tr><tr><td>Cascade II EMCCD kamera</td><td>Fotometri</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lümen 200 metal halojenür ark lambası</td><td>ÖNCEKİ Bilimsel Üçlü</td><td></td><td></td></tr><tr><td>bant geçişli dikroik filtre küpü ve uyarma ve emisyon filtre seti</td><td>Chroma Technology Corp</td><td>seti #89006</td><td>YFP (Venüs / Sitrin), CFP (Gök Mavisi), RFP (mCherry / tdTomato)</td></tr> <tr><td>MAC 5000 denetleyici ve filtre tekerlekleri</td> için kullanılır <td>Ludl Elektronik Ürünler</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB R2011a</td><td>Matematik İşleri</td><td></td><td>64 bit sürüm, büyük veri dosyalarını 32 bit'ten daha iyi işler</td></tr></tbody></table>

tomurcuklanma maya floresan time-lapse filmler kazanılması ve greftlerİ kullanarak tek hücreli dynamics analiz

Acquiring Fluorescence Time-lapse Movies of Budding Yeast and Analyzing Single-cell Dynamics using GRAFTS

Floresan zaman atlamalı mikroskopi tek hücre düzeyinde birçok biyolojik süreçlerin çalışmada güçlü bir araç haline gelmiştir. Özellikle, gen ifadesinin zamansal bağımlılığı gösteren film kendi düzenleme dinamikleri ilişkin bilgi sağlar, ancak tek hücre floresan film elde ve analiz için birçok teknik zorluklar vardır. Biz burada bu tür veri oluşturmak için ticari olarak satılan mikroakışkan kültür cihaz kullanarak basit bir protokol ve bir MATLAB tabanlı, grafik kullanıcı arayüzü (GUI) tabanlı yazılım paketi floresan görüntüleri ölçmek için açıklar. Yazılım bölümleri ve parça hücreleri kullanıcı görsel veri hataları barındırmalarına sağlar, ve otomatik olarak soy ve bölme kez atar. GUI daha bütün bir hücre izleri yanı sıra birinci ve ikinci zaman türevleri üretmek için zaman serisi analiz eder. Yazılım S. tasarlanmış iken cerevisiae, modülerlik ve çok yönlü t izin vermelidirbirkaç değişiklik ile diğer hücre tipleri eğitim için bir platform olarak hizmet o.

Bir başarılı bir performans ve analiz deney gerçekçi atanan tomurcuk ortaya çıkması ve bölme kez tek bir bütün hücreler için daha çok sürekli zaman serisi verecektir. Örnek olarak, büyüme ve genel ifadesi tek bir hücre içinde süresi (Tablo 4, Y47 içinde değişebilir nasıl gözlemlemek için yapısal ADH1 promoteri tarafından tahrik Shibuya floresan protein bütünleşmiş bir kopyası (CFP) ifade eden bir maya suşu ile haploid Yukarıdaki protokol gerçekleştirilir .) Biz zaman içinde (Şe...

Biz floresan büyüyen maya hücreleri mikroskop film ve tek hücreli zaman serisi veri ayıklamak için bir GUI tabanlı yazılım paketi elde etmek için basit protokol mevcut. Analizi otomatik soy ve görsel denetim ve izlenen verileri manuel küratörlüğü ile entegre bölümü zaman atama içerir.

Tomurcuklanma Maya Floresan Time-lapse Filmler Kazanılması ve GREFTLERİ kullanarak Tek hücreli Dynamics analiz

Fluorescence time-lapse microscopy has become a powerful tool in the study of many biological processes at the single-cell level. In particular, movies ...

Bu prosedürün genel amacı, büyüyen tekil maya hücrelerinin floresan videolarını elde etmek ve her bir hücre için raporlayıcı ekspresyon zaman serilerini çıkarmaktır. Bu işlem, öncelikle mikroakışkan bir bölmede hücrelerin tek tabaka halinde kültüre edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım ise bir veya daha fazla raporlayıcı için zaman ayarlı floresan mikroskopisi yapmaktır.Ardından, hücrelerin zaman içindeki takibini yapmak ve ölçümlerini gerçekleştirmek için filmler graft yazılım paketi kullanılarak işlenir. Son adım, hücre ölçümlerinin ve soy ağacı atamalarının analiz edilmesi ve her bir tam hücre için raporlayıcı ekspresyon zaman serilerinin dışa aktarılmasıdır. Nihayetinde, ekspresyon zaman serilerinden çıkarılan anlık transkripsiyon hızı, hem hücre döngüsü boyunca hem de değişen transkripsiyon faktörü seviyelerine yanıt olarak transkripsiyondaki değişimleri göstermek için kullanılır.Bu yöntem, aktif bir transkripsiyon faktörünün ani eklenmesine veya eksiltilmesine farklı promotörlerin ne kadar hızlı yanıt verdiği gibi, gen regülasyonu alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu yanıt bir hücre popülasyonu genelinde ne kadar değişkendir ve morfoloji ile hücre döngüsü evresi dahil olmak üzere farklı hücresel özellikler yanıtı nasıl etkiler? Dahası, bu yöntem, aktif bir transkripsiyon faktörünün birden fazla kez eklenmesinin ve eksiltilmesinin gen ekspresyonu üzerindeki etkilerini inceleyebilir.Metin protokolünde açıklandığı üzere, besin açısından zengin, kararlı bir durumda büyüyen maya hücrelerini mikroakışkan cihaza yüklemeye uygun bir yoğunlukta hazırlayın. Ardından, taşıma solüsyonunun uzaklaştırılmasının ardından kuyucukları steril suyla durulayarak cell ASIC'ten bir Y zero four C mikroakışkan kültür plakası hazırlayın; kanalları temizlemek için onyx perfüzyon sistemini kullanarak bir ile altı arasındaki kuyucuklardan beş dakika boyunca 6 PSI basınçta su akıtın, ardından yükleme kuyucuğu sekizden 10 saniye boyunca 6 PSI basınçta akış sağlayın. Tüm kuyucuklardaki suyu uzaklaştırın ve bir ile altı arasındaki giriş kuyucuklarına 250 µL SC medyum, hücre yükleme kısmına ise hazırlanan hücre kültüründen 50 µL ekleyin.Sekizinci kuyucukla oniks manifoldu plakaya mühürleyin ve birden altıya kadar olan giriş kuyucuklarından 6 PSI basınçla iki dakika boyunca akış sağlayarak kanalları ve kültür odasını hazırlamaya başlayın. Bunu, yalnızca başlangıç medyasını içeren giriş kuyucuğundan en az beş dakika boyunca akış sağlayarak takip edin. Mikroskop adımına kadar bu akışı 6 PSI'da sürekli olarak sürdürün; veri analizi sırasında hücre takibini iyileştirmek amacıyla, deney boyunca kaymasını önlemek için plakayı sahne montajına bantlayın. Metin protokolünde açıklandığı şekilde mikroskobun hazırlığının ardından, objektife birkaç damla immersiyon sıvısı damlatın ve mikroakışkan cihazı güvenli bir şekilde monte edin.Ters mikroskobun tablasında, gömülü konum işaretçilerinden birini kullanarak ilk kültür odasının en sol üçte birlik kısmına odaklanın. Besiyeri giriş kuyusundan gelen akışı ve hücre yükleme kuyusu sekizden gelen akışı, 6 PSI basınçta beş saniyelik kısa aralıklarla kapatın. Hücreleri aramak için tablayı kültür odası çevresinde hareket ettirin.İstenen hücre yoğunluğu sağlanana kadar yükleme akış süresini ve basıncını artırın, ancak taze medyanın hazneye girdiği en soldaki bariyerin aşırı yüklenmesini ve tıkanmasını önleyin. Başlangıç medyasını içeren medya giriş kuyucuğundan altı PSI basınçla akışı başlatın. Metamorph veya diğer mikroskopi otomasyon ve kontrol yazılımlarında.Zaman içinde birden fazla sahne konumunda çok sayıda görüntü almak için çok boyutlu bir veri toplama işlemi kurun. Zaman noktası sayısını ve bunlar arasındaki aralığı belirleyin. Ardından, her birinde yaklaşık 10 hücre bulunan birkaç sahne konumu seçin.Her bir sahne konumunda ve her zaman noktasında, programın Metamorphs'un yerleşik otofokus yöntemini kullanarak iletilmiş ışık brightfield görüntüsüne odaklanmasını sağlayacak şekilde veri toplama ayarlarını yapın; otofokus işlemini her sahnenin başlangıcında özel olarak yazılmış bir jurnal şeklinde uygulayın. Pozisyonlama, odak hassasiyeti üzerinde daha fazla kontrol sağlar. Ayrıca programı, odak düzleminin artı 1 µm değerinde bir brightfield görüntüsü ve odak düzleminin eksi 4 µm değerinde bir odak dışı brightfield görüntüsü alacak şekilde ayarlayın.Görüntüler arasında gerektiğinde odak noktasını değiştirmek için özel yazılmış günlükleri kullanın. Son olarak, programı ayarlayın. Odak düzlemindeki her bir floresan raporcu için bir gri tonlamalı görüntü edinin.Minimum fotobleaching ile hızlı görüntüleme için optimize edilmiş ayarları kullanın. Deney için akış programını Onyx kontrol yazılımında hazırlayın. Ardından, Metamorph'taki görüntüleme programını ve Onyx kontrol yazılımındaki akış programını eş zamanlı olarak başlatın.Veri giriş grafik kullanıcı arayüzünü veya GUI'yi açmak için MATLAB'da format data M dosyasını çalıştırın. Üst kısımda, veri dizinini ayarlamak için görüntü dosyalarının bulunduğu klasörü belirtin veya gözatın ve ardından deneyde kaydedilen veri türlerini ve görüntü dosyalarını belirlemek için GUI'yi kullanın. Metin protokolünde açıklandığı şekilde segmentasyon parametrelerini seçme işlemine geçin.Brightfield görüntülerinin segmentasyonu için uygun parametrelerin seçilmesi zor olabilir ve sonuçlanan zaman serisi veri kalitesi üzerinde önemli bir etkiye sahiptir. Bölgelerin eksik segmente edilmesindense fazla segmente edilmesine öncelik vererek tüm hücre bölgelerinin belirlenmesine odaklanıyoruz. Görsel veri incelemesi sırasında, fazla segmente edilmiş bölgeler birleştirilerek tam hücre bölgeleri oluşturulabilir, ancak eksik segmente edilmiş bölgeler daha sonra ayrılamaz.Farklı segmentasyon parametrelerini ayarlayın ve "test Successfully" seçeneğine tıklayarak segmentasyon kalitesini test edin. Segmentlere ayrılmış bölgeler, macenta kenarlıklara sahip yeşil renkli görünecektir. Segmentasyon tatmin edici olduğunda, filmdeki birden fazla zaman noktasını kontrol etmek için kaydırıcıyı kullandığınızdan emin olun.Segmentasyon parametrelerini format veri arayüzüne döndürmek için "done" seçeneğini seçin. Metinde açıklandığı şekilde renk parametrelerini seçtikten sonra, eşiği otomatik olarak belirlemek için "auto threshold" düğmesine basın. Tzu yöntemi kullanılarak, görüntü eşik değerinin üzerinde kalan bölgeleri vurgulayacaktır.Eşik değeri, düzenleme kutusu kullanılarak manuel olarak ayarlanabilir. Eşik değerinin tüm zaman noktaları için uygun olduğunu doğrulamak için kaydırma çubuğunu kullanın. İşlem tamamlandığında, bitti düğmesine basın.Eşiği format data gui ekranına geri döndürmek için add ve segment düğmelerine basın. Renk maskesini oluşturmak için, görüntü dosyalarını okumak, verileri işlemek ve belirtilen klasörde bir dot mat dosyası oluşturmak üzere format data düğmesine basın. Bu dosya, process time series gui için girdi görevi görecektir.Takip GUI'sini açmak için MATLAB'da process time series M dosyasını çalıştırın. GUI açıldıktan sonra önce oda yüksekliğini ayarlayın. Bu, hücrelerin hapsedildiği odanın yüksekliğini belirtir.Hücre bölgesinin majör ve minör eksenlerine dayanarak hücre hacmini 3 boyutlu bir elipsoid olarak tahmin etmede bir kısıt olarak kullanılır. Ardından piksel başına mikrometre değeri ayarlanır. Bu, görüntülerdeki piksel-mikrometre mesafesini kalibre etmek için kullanılan dönüşüm faktörüdür; böylece kesit alanı ve hacim sırasıyla kare mikrometre ve kübik mikrometre cinsinden kalibre edilebilir.Ardından, maskedeki gereksiz bölgeleri ayıklamak için minimum ve maksimum parametreleri ayarlamak üzere filtreler panelini kullanın. Alan, pikseller cinsinden bölge alanıdır. ECC, değer sıfıra yaklaştıkça daha dairesel olan eksantriklik faktörüdür.Burada SF, değeri bire yaklaştıkça daha dairesel olan şekil faktörüdür; dosya giriş çıkış panelindeki yüklü görüntülere tıklayın ve format veri GUI'si tarafından oluşturulan ilgili dot mat veri dosyasını seçin. Bölge maskesi her renk kanalına uygulanacak ve bir dizi farklı ölçüm yapılacaktır. Ardından, metinde açıklandığı şekilde hücreleri izle (track cells) parametresi seçildikten sonra veri dosyası kaydedilir.Yeni ortaya çıkan tomurcuklar için soyağaçlarını atamak amacıyla bölge OID'lerini kullanarak bir kareden diğerine bölge takibi yapmak için takip hücrelerine tıklayın ve verileri kaydetmek için açılır pencerelerdeki parametreleri gerektiği şekilde değiştirin. Soyağaçları, varsayılan tomurcuklar ile potansiyel ana hücreler arasındaki mesafeler minimize edilerek her karede otomatik olarak atanır.Seçili hücre bilgi panelinin üzerindeki düğmeye tıklayın ve verileri uygun şekilde düzenlemek için metin protokolünde açıklanan çeşitli gooey araçlarını veya kısayol tuşlarını kullanarak hatalı bölütlenmiş bölgeleri, ID veya soy hattı atamalarındaki hataları düzeltin. Aşırı bölütlenmiş bölgeleri birleştirin, hücrenin tamamını kapsamadığı bölgeleri silin ve ana hücre-tomurcuk ilişkilerinin doğru şekilde atandığından emin olun. Ayrıca, bölgeleri birleştirerek yeşil ID'leri ortadan kaldırın.ID'nin düzeltilmesi, bölgenin bir anneye atanması, hiçbir anne atanmaması veya bölgenin silinmesi. Tomurcuk verileri, nihai analiz sırasında anneye ekleneceği için, bir tomurcuk bölgesini annesiyle birleştirmeyin.İlgilenilen son zamana kadar her kare için verileri görsel olarak inceleyin. Tüm zaman serisinin incelenmesi gerekli değildir. Eğer sonraki kareler kullanılmayacaksa, tüm hücre bölgeleri ilgilenilen zaman aralığı boyunca incelendiğinde, tüm floresan kanalları için veriler ve bunların zamanla nasıl değiştiği çıktıya hazır olduğunda değişiklikleri kaydettiğinizden emin olun.Tüm hücreler için zaman serilerini analiz etmek üzere zaman serisi analizini başlatın. Hücre döngüsü bilgilerini hesaplayın ve türevlerini alın. İlgilenilen ölçümlerin seçilmesine ve analiz parametrelerinin girilmesine olanak tanıyan bir pencere açılacaktır. Arayüzde düzenlenmiş olan son zaman noktasını girin.Varsayılan yumuşatma ve hücre döngüsü atama parametreleri, beş dakikalık aralıklarla görüntülenen haplo ve diploid suşlar için iyi çalışır; ancak en iyi sonuçlar için bunların değiştirilmesi gerekebilir. Tüm parametreler ayarlandığında, metin protokolünde açıklandığı üzere tek hücreli zaman serisi verilerini dışa aktarmak için analiz seçeneğini seçin. Başarıyla gerçekleştirilen ve analiz edilen bir deney, konstitütif bir DH1 promotörü tarafından yönlendirilen entegre bir GFP veya CFP kopyası eksprese eden bir halo maya suşu için, gerçekçi şekilde atanmış ortaya çıkış ve bölünme zamanlarına sahip, çoğunlukla sürekli tek tam hücre zaman serileri sağlayacaktır. Zaman içindeki tam hücre ölçümleri, zaman serisi analizinden elde edilmiştir.Brightfield görüntüler, segmente edilmiş ana hücreyi mavi ve tomurcuklarını yeşil renkte göstermektedir. Bitişik tüm hücrenin kırmızı ile çevrelenmesiyle, hem hacim hem de ekspresyon için hücre döngüsüne bağlı bir durum ortaya çıkmaktadır. Burada, taralı bölgeler hücrenin G2 M evresinde olduğunu ve bir tomurcuğa sahip olduğunu; beyazdan griye geçiş ise G1'den S evresine geçişte tomurcuklanmanın başladığını göstermektedir.Gölgelendirme ve hücre bölünmesi, tomurcuk oluşumundan sonra gri gölgelendirmeden beyaz gölgelendirmeye geçişle birlikte M'den G1 fazına geçişte gerçekleşir. Toplam birleşik hacim öncekine göre daha hızlı artar, ancak protein konsantrasyonu veya ortalama yoğunluk hafifçe azalırken ortaya çıkış gerçekleşir. Birleşik entegre protein artışı da, sadece ana hücre bölgesiyle karşılaştırıldığında tomurcuklanmadan sonra hızlanır.Bu sonuçlar, tomurcuk katkılarının tüm hücre ölçümüne uygun şekilde dahil edilmesinin önemini kanıtlamakta ve uygun tomurcuk oluşumu ve bölünme zamanı atamalarına olan ihtiyacı vurgulamaktadır. Farklılaştırılmış zaman serileri, her ikisi de tomurcuklanmadan sonra artan anlık göreceli mRNA seviyesini ve transkripsiyon hızını hesaplamak için kullanılabilir ve stabil zaman oluşturma kapasitesi sağlar. Ölçüm zaman serilerinin türevleri, metin protokolünde açıklanan değiştirilebilir ekspresyon sistemini kullanan kinetik çalışmalara da fayda sağlar.Bir zaman serisi analizi, transkripsiyon faktörünün ne zaman çekirdeğe yerleştiğini ve hedef genin ne zaman başlayıp durduğunu göstermektedir. Burada gösterilen transkripsiyonlar, değiştirilebilir YFP ile kaynaştırılmış PHO dört Tet R trans aktivatöre sahip bir hücre için belirtilen dört farklı görüntüleme kanalından alınan mikrograflardır. Trans aktivatör, düşük fosfat yanıtı olarak RFP ile işaretlenmiş çekirdeğe yerleşir ve yedi X Tet O promoter CFP raporerinin ekspresyonunu yönlendirir.Çıkarımlanan transkripsiyon hızı, ortalama olarak ve tek hücre düzeyinde lokalizasyona bağlı olarak değişir. Bu prosedürün ardından, ifadenin popülasyon genelinde zamanla nasıl değiştiği ve dışsal dalgalanmaların etkilerinin birden fazla nesil boyunca aktarılıp aktarılmadığı gibi ek soruları yanıtlamak amacıyla, tek hücreli çok boyutlu zaman serisi verileri üzerinde diğer analizler gerçekleştirilebilir.Gen aktivasyon kinetiği yeniden aktivasyon sonrası değişir mi? Hücre döngüsü bir rol oynar mı ve tek hücrelerin gen ekspresyon büyüme ve soy hatları trajektoryalarını gerektiren diğer birçok soru.

acquiring-fluorescence-time-lapse-movies-budding-yeast-analyzing

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Gen silme ve protein aşırı ekspresyonu proteinlerin işlevleri çalışmak için sık kullanılan yöntemlerdir. Bu makalede, bir nüfus protein konsantrasyonu fonksiyonu ve tek hücreli düzeylerde fenotip gelişimi analiz için bir...

Geliştirici Maya Protein Konsantrasyonu bir işlev olarak Morfolojik Fenotip Kalkınma Analizi

Fisyon Maya Kantitatif Canlı Hücre Floresan mikroskopi Analizi

Fisyon mayası cinsel yaşam döngüsünün uzun süreli mikroskobu için tekrarlanabilir bir temel yöntem sunuyoruz. Açıklanan küçük ayarlamalarla, sunulan protokol, araştırmanın üreme sürecinin farklı adımlarına odaklanmasına izin verir.

Bölünme Maya Cinsel Yaşam Döngüsü Mikroskopi

Veziküler kaçakçılık olaylarının doğru bir şekilde ölçülmesi, genellikle belirli proteinlerin rolleri ve mutasyonların etkileri hakkında önemli bilgiler sağlar. Bu makale, kantitatif floresan mikroskobu ve akış sitometrisi kullanılarak canlı hücrelerde endositik olayların nicelleştirilmesi için bir araç olarak pH'a duyarlı bir GFP varyantı olan süperekliptik pHluorin'i kullanma yöntemlerini sunmaktadır.

Budding Maya endositozun kantitatif, kinetik ve Yüksek verim Analizi pHluorin Uygulamaları

Bu makalede, mikro akışkan cips üretim ve kullanım ömrü ve tek bir maya hücrelerinin hücresel fenotipleri ölçmek için mikro-akışkan deney kurulumu için optimize edilmiş bir protokol sunulur.

Mikroakışkan Aygıtlar Kullanma Tek Budding Maya Hücreleri ömrü ve Hücresel fenotipleri Ölçmek için

Maya tomurcuklanan nedeniyle güçlü genetik ve mikrotübül hücre iskeletinin basitliği için in vivo olarak mikrotübül dinamiklerinin çalışmak için avantajlı bir modeldir. Aşağıdaki protokol dönüşümü ve kültür maya hücreleri eş odaklı mikroskopi görüntü elde ve kantitatif maya hücrelerini canlı mikrotübül dinamiklerini analiz etmek açıklamaktadır.

Yüksek çözünürlüklü görüntüleme ve Bireysel Astral Mikrotubul Dynamics Analizi Budding Maya

Bu protokol, çok renkli 4d (zaman atlama 3D) Konfokal mikroskobu kullanarak mantar tomurcuklanan içinde floresan etiketli hücre içi bölmeler Analizi açıklanmaktadır. Görüntüleme parametreleri, fotodamat kısıtlarken yeterli sinyalleri yakalamak için seçilir. Özel ımagej eklentileri etiketlenmiş yapıların izlenmesini ve niceli olarak analiz edilmesini sağlar.

Maya 4D mikroskopisi

Burada, araştırmacıların mitoz ve Meiosis sırasında yaşayan fisyon Maya hücrelerinde protein davranışları ve nükleer dinamikleri incelemesini sağlayan toksik olmayan bir mikroskopi yöntemi olan canlı hücreli görüntüleme sunuyoruz.

Floresans canlı hücre mikroskobu ile mitotik ve meiotic Fission Maya nükleer dinamiklerinin incelenmesi

Fisyon mayası burada, polimerizasyonlarını görselleştirmek için GFP ile translasyonel füzyon proteinleri olarak FtsZ ve MreB gibi bakteriyel hücre iskeleti proteinlerini eksprese etmek için heterolog bir konakçı olarak kullanılır. Ayrıca, polimerizasyonu etkileyen bileşikler, bir floresan mikroskobu kullanılarak görüntüleme ile tanımlanır.

Bakteriyel hücre iskeleti proteinlerini hedef alan antibakteriyel ilaç taramaları için bir platform olarak fisyon mayası

Bu protokol, maya hücresi döngüsü durdurma ve isteğe bağlı salım için iki yöntemi detaylandırır ve hücre döngüsüne bağlı süreçleri incelemek için floresan mikroskobunun kullanımını detaylandırır.

Tomurcuklanan mayada hücre döngüsüne bağlı süreçlerin manipülasyonu ve analizi

Öğrenin, maya hücrelerinde floresan time-lapse görüntüleme ve tek hücreli dinamik analizi için GREFT yazılımı kullanarak transkripsiyon değişikliklerini incelemeyi. Bu yöntem hücre döngüsü ve gen regülasyonu çalışmalarında kullanılır.

Tomurcuklanma Maya Floresan Time-lapse Filmler Kazanılması ve GREFTLERİ kullanarak Tek hücreli Dynamics analiz

Daha fazla video keşfet