Name: Embriyonik Ventriküler Endotel Hücre İzolasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: Öğrenin, transgenik fare embriyolarından embriyonik ventriküler endotel hücre izolasyonu yöntemini. Bu teknik, kardiyovasküler gelişim ve damar biyolojisi araştırmalarında kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz kritik yazının okuma, zaman atlamalı görüntüleme ile yardım için UNC en Mikroskop Hizmet Laboratuvarı, ve finansman desteği için NIH (hibe # R01HL061656) için Andrea Portbury teşekkür etmek istiyorum.

1. Antikor-konjuge boncuk hazırlayın <ol><li> Diseksiyon önce bir gün, üreticinin talimatlarına göre, uygun Dynabeads (sıçan yükseltilmiş bir antikor örneğin fare IgG Dynabeads, 4 x 10 8 boncuk / ml), seçilen antikor bir araya getirir. BD sıçan anti-CD31 antikoru (0.5 mg / ml, endotel hücreleri izole etmek için kullanılan) için 3 ul antikor, bir son 1.5 mg anti-CD31 antikoru konsantrasyonu ve / 1 x 10 7 boncuklar için, her 25 ul boncuk ilave edilir 25 ul tampon. </li><li> 4 ° C&#39;de boncuk ve gece antikor inkübe </li></ol> 2. Kollajen Plaka hazırlanması <ol><li> Sadece bir kollajen kaplı plaka aksine bir kollajen jel üzerinde büyüdüğü zaman izole hücreler daha hızlı tübüller oluştururlar. 6&#39;da tarif edildiği gibi bu nedenle, kollajen jel, diseksiyon gece önce yapılır. Bir doku kültürü kaputu buz üzerinde, aşağıdaki reaktifler (yeterli 19 kuyu için) birleştirmek: 206,4 ul steril H &lt;alt&gt; 2, O, 140.4 ul kollajen tip I (4.08 mg / ml), 38.4 ul 10x M199 ve 1.15 ul 5 M NaOH. </li><li> , 384-çukurlu bir doku kültür plakasının deliklerine içine bu kollajen jel Pipet 20 ul. 30 dakika boyunca 37 ° C doku kültürü inkübatöründe plaka koyun. </li><li> Her kuyuya 80 ul DMEM ekleyin ve 37 ° C&#39;de 15 dakika inkübe ° C Kültür ortamı çıkarın ve iki kez daha tekrarlayın. </li><li> Son durulama sonra, iyi FBS / DMEM her 80 ul% 10 ekleyin ve 37 gece boyunca inkübe ° C İzole hücrelerin eklenmesinden önce, kültür ortamı çıkarın. </li></ol> 3. Vergi ve Kalp Digest <ol><li> Onaylanmış bir ötenazi tekniği kullanarak istenen embriyonik gün bir zamanlı hamile fare Euthanize. Tüm deneyler Chapel Hill&#39;deki North Carolina Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanmıştır. </li><li> Bir yatar pozisyonda fare ile, liberal önce% 70 etanol ile kadın ventral tarafı spreydiseksiyonu. Iç organların uzak alt karın cilt ve kas kaldırmak için forseps kullanarak, iç organları görselleştirmek için dişinin alt karın boşluğu açmak kesti. </li><li> Forseps ile serviks Holding, dikkatle forseps için kuyruk kesme ve karın boşluğundan uterin horn kaldırma başlar. Uterin boynuz kaldırırken, yerine boynuz tutan herhangi bir bağ dokusu kesip. Uterin boynuz eksize bitirmek için, rahim boynuz boşaltmak için yumurtalık ile rahim boynuzu kavşak kesti. </li><li> Soğuk 1x fosfat tamponlu salin (PBS) ve gerektiğinde durulama içeren bir Petri kabındaki uterin horn yerleştirin. Ekli embriyonik kesesi ortaya çıkarmak için orta hat üzerinden uterin horn açın kesin. </li><li> Embriyo kesme yanlışlıkla önlemek ve bir embriyo almak için plasentanın kavşakta bir embriyonik kese ve embriyo açın kesin. Soğuk PBS ile ikinci bir Petri tabağına yerleştirin embriyo. Buz rahim boynuz ile Petri kabı dönün. </li><li> Dgöğüs duvarı erişimi artırmak için embriyo ecapitate. Genotiplendirme gerekli ise, çıkarın ve buz üzerinde yerleştirilen bir Eppendorf tüp kaydetmek için kuyruk kesti. </li><li> Sırtında embriyo ile kalp ve akciğer görselleştirmek için göğüs duvarı açın kesti. Sonra, yavaşça yol göğüs duvarı yukarı çekin ve dışarı, kalp kesim önlemek için, kaburga alt kısmında yatay bir kesim tarafından izlenen bir ön ayakları yakın göğüs kafesinin sol tarafındaki dikey bir kesim, yapmak. Yaklaşık embriyonik gün 13.5 ile, göğüs duvarı görselleştirme yardım, şeffaftır. </li><li> Dikkatlice forseps kullanarak kalp kaldırın ve aşağıdaki damarları kesti. Daha sonra, kalp boşaltmak için büyük damarların üzerinde kesti. Akciğer damarları kesilmiş değilseniz, akciğer kalp ile kaldırılabilir. Gerekirse Böylece, akciğer gibi, yabancı dokuları çıkarın. </li><li> Ayırın ve ventriküllerden kulakçıklar ve büyük damarları atın. Makas kullanarak, küçük parçalar (yaklaşık 1 mm 3 &lt;içine ventrikül kıyma/&gt; Sup) ile yaklaşık 500 ul kolajenaz (steril PBS içinde 1 mg / ml) içinde bir yer. Tüm ventrikül kıyılmış ve kollajenaz yerleştirilmiştir kadar buz üzerinde örnekleri tutun. </li><li> Ventrikül ayrı bir Eppendorf tüp her kalp toplama, tüm embriyolardan eksize edilmiştir kadar önceki adımları tekrarlayın. Tüm embriyolar aynı genotip varsa, kalpleri tek bir Eppendorf tüp toplanmış olabilir. Tek bir seferde işlenen örneklerin sayısını izolasyonu için kullanılan mıknatıs dayalı sınırlı olabilir; DynaMag (123-21D) 16 Eppendorf tüpleri en fazla tutar Burada kullanılan. </li><li> 45 dakika süre ile sallanan ile 37 ° C de kıyılmış ventriküller yerleştirin. Her 15 dakika, hafifçe örnekleri çıkarın ve mekanik hücreleri ayırmak aşağı yukarı pipet ve. </li></ol> 4. Endotel Hücreleri İzolasyon <ol><li> Hücrelerin kalan kümeleri kaldırmak için filtre 70 mikron ile ventrikül-kollajenaz çözüm geçmek. </li><li> 10 dakika için 400 xg&#39;de hücreleri santrifüj. Iskartasüpernatant, DMEM yaklaşık 200 ul% 10 FBS ile değiştirin, ve hücreleri ayırmak aşağı yukarı pipet ve. </li><li> Bir kez bir önceki adımı yineleyin. Ikinci% 10 FBS / DMEM yıkamadan sonra 10 dakika için 400 xg&#39;de hücreleri santrifüj. 50 ul% 10 FBS / DMEM hücrelerin tekrar. </li><li> Son santrifüjleme basamağı sırasında, boncuklar hazırlar. <ol><li> 1 dakika boyunca bir mıknatıs üzerinde antikoru ve boncuklar içeren Eppendorf tüpüne koyun. </li><li> Mıknatıs üzerinde yerinde borusu ile süpernatantı. Mıknatıstan tüp çıkarın ve yaklaşık 100 ul% 10 FBS / DMEM ekleyin. </li><li> 1 dakika boyunca mıknatıs üzerinde tüp yerleştirin. Süpernatantı ve% 10 FBS / DMEM ile tekrar yıkayın. 3 yıkar toplam tekrarlayın. </li><li> Son yıkamadan sonra,% 10 FBS / DMEM-konjuge antikor boncuklar (numune başına 5 ul) tekrar süspansiyon haline getirin. </li></ol></li><li> Her bir hücre örneği için, antikor-konjuge boncuk 5 ul ekleyin. Sallanan gıda ile 4 ° C de boncuk hücre süspansiyonları yerleştirinr 30 dakika. </li><li> , Bir laminar akış başlığı içinde, 1 dakika için mıknatısla hücreleri ve antikor-konjuge boncuklar içeren Eppendorf tüpleri. Süpernatantı, mıknatıs gelen tüpleri çıkarın ve yaklaşık 100 ul% 10 FBS / DMEM ile yıkayın. 5 yıkama için tekrarlayın. </li><li> Son yıkamadan sonra, 1 dakika boyunca mıknatıs üzerinde tüpleri süpernatantı ve mıknatıs tüpleri çıkarın. Yaklaşık 100 ul DMEM ekleyin. </li><li> 1 dakika için mıknatıs üzerinde tüpler yerleştirin, süpernatant kaldırmak ve mıknatıs gelen tüpleri çıkarın. 100-200 ul ekle% 0.25 tripsin-EDTA ile önceden ılıtılır. 37 ° C&#39;de numunelerin ve 5 dakika boyunca% 5 CO2. </li><li> 2 dakika için mıknatıs tüpler yerleştirin. Taze Eppendorf tüplerine hücre içeren süpernatant dikkatlice aktarın. 400 x g hızında 5 dakika santrifüjlenir. </li><li> Süpernatantı. Beklenen verim bağlı olarak, ya da 384-iyi muamele kültür çanak - 80-100 ul büyüme ortamı ve plaka 96 hücrelerin tekrar süspansiyon(E14.5-E16.5 embriyoların ventrikül yaklaşık 450-600 hücreleri). Endotel hücreleri için, (aşağıda tanımlandığı gibi) endotelyal büyüme kültür ortamı kullanın. </li></ol>

<ol><li>Landecker, H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLandecker%2C+H+%22Culturing+Life%3A+How+Cells+Became+Technologies%22">Culturing Life: How Cells Became Technologies</a>. , Presidents and Fellows of Harvard College. (2007).</li>
<li>Kan, C. Y., Wen, V. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell+dysfunction+and+cytoskeletal+changes+associated+with+repression+of+p16%28INK4a%29+during+immortalization%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell dysfunction and cytoskeletal changes associated with repression of p16(INK4a) during immortalization.</a> Oncogene. , (2012).</li>
<li>Dyer, L. A., Patterson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+endothelium%3A+an+emphasis+on+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Thromb.+Hemost%22%5BJournal%5D)">Development of the endothelium: an emphasis on heterogeneity.</a> Semin. Thromb. Hemost. 36, 227-235 (2010).</li>
<li>Dong, Q. G., Bernasconi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+strategy+for+isolation+of+endothelial+cells+from+murine+tissues.+Characterization+of+two+endothelial+cell+lines+from+the+murine+lung+and+subcutaneous+sponge+implants%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">A general strategy for isolation of endothelial cells from murine tissues. Characterization of two endothelial cell lines from the murine lung and subcutaneous sponge implants.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 17, 1599-1604 (1997).</li>
<li>van Beijnum, J. R., Rousch, M., Castermans, K., vander Linden, E., Griffioen, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+endothelial+cells+from+fresh+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation of endothelial cells from fresh tissues.</a> Nat. Protoc. 3, 1085-1091 (2008).</li>
<li>Runyan, R. B., Markwald, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invasion+of+mesenchyme+into+three-dimensional+collagen+gels%3A+a+regional+and+temporal+analysis+of+interaction+in+embryonic+heart+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Invasion of mesenchyme into three-dimensional collagen gels: a regional and temporal analysis of interaction in embryonic heart tissue.</a> Dev. Biol. 95, 108-114 (1983).</li>
<li>Arnaoutova, I., Kleinman, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+angiogenesis%3A+endothelial+cell+tube+formation+on+gelled+basement+membrane+extract%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">In vitro angiogenesis: endothelial cell tube formation on gelled basement membrane extract.</a> Nat. Protoc. 5, 628-635 (2010).</li>
<li>Zeisberg, E. M., Potenta, S. E., Sugimoto, H., Zeisberg, M., Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblasts+in+kidney+fibrosis+emerge+via+endothelial-to-mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology+%3A+JASN%22%5BJournal%5D)">Fibroblasts in kidney fibrosis emerge via endothelial-to-mesenchymal transition.</a> Journal of the American Society of Nephrology : JASN. 19, 2282-2287 (2008).</li>
<li>Chang, L., Noseda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+vascular+smooth+muscle+cells+from+local+precursors+during+embryonic+and+adult+arteriogenesis+requires+Notch+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Differentiation of vascular smooth muscle cells from local precursors during embryonic and adult arteriogenesis requires Notch signaling.</a> PNAS. 109, 5993-6998 (2012).</li>
<li>Fehrenbach, M. L., Cao, G., Williams, J. T., Finklestein, J. M., DeLisser, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+murine+lung+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%3A+Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Isolation of murine lung endothelial cells.</a> American Journal of Physiology: Lung Cellular and Molecular Physiology. 296, L1095-L1103 (2009).</li>
<li>Frauli, M., Ludwig, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+fibroblast+proliferation+in+a+culture+of+human+endometrial+stromal+cells+using+a+medium+containing+D-valine%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Gynecology+and+Obstetrics%22%5BJournal%5D)">Inhibition of fibroblast proliferation in a culture of human endometrial stromal cells using a medium containing D-valine.</a> Archives of Gynecology and Obstetrics. , 241-96 (1987).</li>
<li>Lazzaro, V. A., Walker, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+fibroblast+proliferation+in+L-valine+reduced+selective+media%5BTitle%5D)+AND+%22Research+communications+in+chemical+pathology+and+pharmacology%22%5BJournal%5D)">Inhibition of fibroblast proliferation in L-valine reduced selective media.</a> Research communications in chemical pathology and pharmacology. 75, 39-48 (1992).</li>
<li>Arima, S., Nishiyama, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenic+morphogenesis+driven+by+dynamic+and+heterogeneous+collective+endothelial+cell+movement%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Angiogenic morphogenesis driven by dynamic and heterogeneous collective endothelial cell movement.</a> Development. 138, 4763-4776 (2011).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.

Primer embriyonik hücreler ile çalışma yeni deneyler geliştirme in vitro kritik adımda ele sağlar. Ancak, izolasyon prosedürü önemsiz değildir. Hücrelerin her türlü izole etmek için kritik adımlar hücreleri de onlar iyi yıkama adımları sırasında askıya alınır o zaman kollajenaz sindirim üzerine ayrılır ve olmasını sağlamak yer alıyor. Pipetleme mekanik diseksiyon ölçüde kolajenaz adımı sırasında hücrelerinin ayrılmasında yardımcı olur ve filtreleme adımı hücre kümeleri kaldırır. Bu adımlar, nüfusun saf...

Ölümsüzleştirdi hücre hatları gelişi temel hücre biyolojisi 1 devrim yarattı. Hali hazırda mevcut olan hücre hatları organların geniş elde edilen ve bütün büyük hücre tipleri kapsamaktadır edilir. Ancak, kurulan hücre hatları bazı sınırlamalar var. Ölümsüzleşme işlemi belli özel kullanım ömrü ve çoğalma ile ilgili olarak, hücre davranışını değiştirir, aynı zamanda, örneğin 2 sitoskeletal proteinler gibi beklenmedik proteinlerin ifade etkileyebilir. Pek çok farklı hücre hatları kullanılabilir olsa da buna ek olarak, bütün bir organizma içinde tek bir hücre türü arasında anlamlı bir farklılık yoktur. Özellikle gösteri çeşitli davranışlarda endotel hücreleri arter veya ven ve akış ne tür geminin 3 mevcut onlar hat olmasına göre. Gelişimsel olarak daha acil, ancak, (bakınız, örneğin, t mevcut hücre hatlarının büyük çoğunluğu yetişkin dokusundan elde edilen olmasıdırATCC ile kullanılabilir o toplama). Bu yetişkin hücre hatları büyük olasılıkla embriyonik öncüleri dinamik yapısı özetlemek yok. Gelişimi sırasında gözlenen hızla değişen uzaysal gen ifade desenleri belirli bir gelişim aşamasında bir organı bir endotel hücre farklı bir gelişim aşamasında aynı organdan bir endotel hücre ile aynı şekilde davranır değil olabileceğini düşündürmektedir. Ticari olarak temin edilebilen ölümsüzleştirilmiş hücre çizgileri kullanılarak bir alternatif olarak, primer hücrelerde ilgilenilen belirli bir dokusundan izole edilebilir. Bu tekniğin avantajı ise, bu birincil hücrelerde bile belirli bir organ ya da belirli bir gelişme aşamasında bir organ parçası izole edilebilir. Ayrıca, bu birincil hücreler gen nakavt ve bu transfeksiyon verimi gibi başka sorunlar kaçınarak Knock-in vitro çalışma sağlayan, mevcut transgenik hayvanların çeşitli izole edilebilir. Beklendiği gibi, pek çokteknikleri özel hücre tipleri 4,5 izole etmek için nasıl ayrıntılı yayınlanmıştır. Genel olarak, bu teknikler, hücreler, etiketleme ilgilenilen belirli bir hücre tipi, tutmuş ve daha fazla analiz için bu hücrelerin izole edilmesi, ilgili bölgenin toplama içerir. Koroner endotel hücrelerinin erken embriyonik nüfus incelemek için, daha küçük bir organı ile kullanmak için daha önce yayınlanmış teknik 4. küçültülmüş. Bu ölçekli aşağı prosedürü ile, özel embriyonik aşamalarında embriyonik kalp koroner endotel hücreleri izole olabilir. Bu hücreler daha sonra bu geçiş analizleri gibi geleneksel endotel deneyleri, de kullanılabilir. Erken evredeki embriyonik hücre hatları daha yaygın hale gelinceye kadar, birincil hücreler ile çalışan bir çok değerli bir tekniktir.

<table><tbody><tr><td colspan="4">REAGENTS</td></tr><tr><td>Timed-gebe fareler</td><td></td><td></td><td>İlgilenilen embriyonik aşamada diseke edilecek</td></tr><tr><td>Anti-fare CD31</td><td>BD Bioscience</td><td>553370</td><td></td></tr><tr><td>Sıçan IgG Dynabeads</td><td>Invitrogen</td><td>110-35</td><td></td></tr><tr><td>Kollajen</td><td>BD Bioscience</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>PBS (1x)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kollajenaz, tip I</td><td>Worthington Biyokimyasal</td><td>LS004196</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Cellgro</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2442</td><td></td></tr><tr><td>Endotel hücre büyüme ortamı</td> <td>(notlarda açıklandığı gibi laboratuvarda yapılmıştır)</td><td></td><td>% 20 FBS, 5 & içeren DMEM; M &#946;-mercapt&#8211; Thanol, 50 & mu; g/ml EKG ve 1x penisilin/streptomisin</td></tr><tr><td>&#946;-mercapt&#8211; thanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>EKGS Biyomedikal</td><td>Teknolojileri A.Ş.</td><td>BT-203</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin</td><td>Gibco</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300</td><td></td></tr><tr><td>384 oyuklu kültür plakası</td><td>Greiner</td><td>T-3037-6</td><td>Plakası, 6 çalışma yüzey alanı 10 mm 2Kollajen tip I BD'de tarif edildiği gibi ince bir kollajen jeli ile hazırlandı</td></tr> <tr><td></td><td></td><td>354236.</td><td>Finalde kullanın 1.5 mg / ml</td></tr><tr><td>M199 konsantrasyonu, 10x</td><td>Invitrogen</td><td>11825-015</td><td></td></tr><tr><td>Syto-16</td><td>Invitrogen</td><td>S7578</td><td>13 </td></tr><tr><td colspan = >< güçlü > < / ></td></tr><tr><td>streoskopik mikroskop</td><td>Nikon</td><td>SMZ645</td><td></td></tr><tr><td>Hücre kültürü inkübatörü</td><td>Thermo</td><td>3110</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag</td><td>Invitrogen</td><td>123-21D</td><td></td></tr><tr><td>Masa üstü santrifüj</td><td>Termo</td><td>75002430</td><td></td></tr></tbody></table>

embriyonik ventriküler endotel hücre İzolasyonu

Isolation of Embryonic Ventricular Endothelial Cells

Hücre kültürü büyük ölçüde sayısız kültür koşulları altında hücrelerin tek tek nüfus değerlendirmek için yeteneğimizi geliştirdi. Ölümsüzleştirilmiş hücre hatları ve bunların kullanım kolaylığı için önemli avantajlar sunmasına rağmen, bu hücre hatları tüm potansiyel hücre tipleri için kullanılamaz. Özellikle transgenik fare ilgi belirli bir bölgesinden birincil hücreleri, izole ederek, daha nüanslı çalışmalar yapılabilir. Temel teknik organ veya ilgi kısmi organı (kalp ve kalbin belirli bir bölge gibi) diseksiyon ve tek hücrelere organ dissociating içerir. Bu hücreler daha sonra ilgi hücre türünü tanıyan bir antikor ile konjuge manyetik boncukları ile inkübe edilir. İlgi hücreleri daha sonra, taneciklerden hücreleri ayırmasıyla kısa bir tripsin ile inkübasyon sonucunda, bir mıknatısın kullanılması ile izole edilebilir. Bu izole edilmiş hücreler daha sonra kültüre ve benzeri gibi arzu edilen analiz edilebilir. Bu teknik, aslında yetişkin fare organ için tasarlanmıştırs ancak kolayca burada gösterdiği gibi, embriyonik organları ile kullanım için küçültülmüş olabilir. Bizim ilgi gelişmekte olan koroner damar olduğu için, biz özel embriyonik aşamalarında hücrelerin bu nüfus okumak istedim. Bu nedenle, orijinal protokole embriyonik ventriküllerin küçük boyutu ve bu gelişim aşamalarında endotel hücrelerinin potansiyeli düşük verim ile uyumlu olacak şekilde modifiye edilmesi gerekiyordu. Bu ölçekli aşağıya bir yaklaşım kullanarak, biz transgenik embriyonik ventriküler endotel hücreleri koroner pleksus yeniden değerlendirilmiştir.

CD31 tanıyan bir endotel spesifik antikor kullanarak, endotel hücreleri embriyonik (E) 13.5 (Şekil 1A), 18.5 (Şekiller 1B-1D) embriyoların ventriküller izole edilmiştir. Işlenmemiş bir kültür çanak yetişen, bu hücreler yuvarlak kalır ve yakın birleşik (Şekil 1A), bir Arnavut kaldırımı deseni oluşturacak. Sulandırmak kollajen de kuyu kat için kullanılmıştır ve endotel hücreler (Şekil 1B) bağlı olurken, onlar daha az zincirleri oluşturmak zaman bir kollaj...

Primer hücre kültürü özellikle belirli gelişim aşamalarında transgenik fare embriyolardan, hücrelerin belirli nüfus analiz etmek için yararlı bir tekniktir. Burada, embriyonik ventriküller disseke ve ayrışmış ve antikor konjuge boncuk tanımak ve daha fazla analiz için endotel hücreleri ayırmak vardır.

Embriyonik Ventriküler Endotel Hücre İzolasyonu

Cell culture has greatly enhanced our ability to assess individual populations of cells under myriad culture conditions. While immortalized cell lines ...

Bu prosedürün genel amacı, embriyonik ventriküler endotel hücrelerini izole etmektir. Bu işlem, öncelikle diseksiyon için bir embriyonun alınmasıyla gerçekleştirilir. Ardından kalp eksize edilir.Atriyumlar uzaklaştırılır ve kıyılmış ventriküller bir kolajen çözeltisine aktarılır. Ardından, tek hücre süspansiyonu endotel hücrelerini tanıyan bir antikor ile inkübe edilir. Son olarak, antikora bağlı endotel hücrelerini izole etmek için bir mıknatıs kullanılır.Nihayetinde, parlak alan mikroskobu aracılığıyla endotel zincir oluşumunu gösteren sonuçlar elde edilebilir. Bu yöntem, koroner endotel migrasyonunu hangi faktörlerin teşvik ettiği gibi kardiyovasküler gelişim alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu yöntem endotel hücre davranışı hakkında içgörüler sağlayabilse de, miyositler ve fibroblastlar gibi diğer hücre tiplerine de uygulanabilir. Diseksiyonu gerçekleştirmeden bir gün önce, doku kültürü kabininde çalışarak, burada kullanılan rat anti CD 31 antikoru için üretici talimatlarını izleyerek seçilen antikoru uygun dyna bead'ler ile birleştirin.1,5 µg son konsantrasyonu sağlamak için 25 µL boncuğa üç µL antikor eklenir; boncuklar dört °C'de gece boyunca antikorda inkübe edilir. İzole hücrelerin hızlı tübül oluşumu için doku kültürü kabininde buz üzerinde kolajen jeller hazırlanır. Tip 1 kolajen, steril su, 10X M199 ve 5 M sodyum hidroksit birleştirilir. Metot protokolüne göre, 20 µL kolajen jel bir 384 kuyucuklu doku kültürü plağının kuyucuklarına pipetle aktarılır.Plakayı 30 dakika boyunca 37 °C'lik bir doku kültürü inkübatörüne yerleştirin. Her kuyucuğa 80 µL DMM ekleyin ve 37 °C'de 15 dakika boyunca inkübe edin. Kültür ortamını uzaklaştırın ve son durulamadan sonra yıkama işlemini iki kez daha tekrarlayın, ardından her kuyucuğa 80 µL %10 FBS DM ekleyin ve 37 °C'de gece boyunca inkübe edin.İstenen embriyonik günde, zamanlanmış gebe bir fare ötanize edildikten sonra; onaylanmış bir teknik kullanılarak ve metin protokolüne uygun olarak uterus boynuzu çıkarılır, bir XPBS içeren Petri kabına yerleştirilir ve durulanır. Plasenta ile embriyonun birleştiği noktadan yapılan orta hat insizyonu ile embriyonik keseler açığa çıkarıldığında, bir embriyonik kese kesilerek embriyo geri alınır.Embriyoyu soğuk PBS içeren ikinci bir Petri kabına yerleştirin ve göğüs duvarına erişimi kolaylaştırmak için uterus boynuzunu tekrar buza koyun; ardından embriyoyu desapite edin. Genotipleme yapılacaksa, kuyruğu kesin ve buz üzerinde bir tüpte saklayın. Embriyo sırt üstü pozisyondayken kesin.Kalbi kesmekten kaçınmak için kalp ve akciğerleri görüntülemek amacıyla göğüs duvarını açın. Bir uzvun yakınında, göğüs kafesinin yan tarafı boyunca dikey bir kesi yapın ve ardından kaburgaların alt kısmından yatay bir kesiyle devam edin. Daha sonra, yaklaşık embriyonik gün 13.5'e kadar göğüs duvarını nazikçe yukarı doğru çekerek kenara çekin.Göğüs duvarı şeffaftır ve bu durum görselleştirmeye yardımcı olur. Pens yardımıyla kalbi dikkatlice kaldırın ve alttaki damarları kesin. İstenirse, kalbi akciğerlerden ayırmak için temiz bir kaba aktarın ve büyük damarların üzerinden kesin.Ardından, atriya ve büyük damarları ventriküllerden ayırıp atın. Daha sonra makas kullanarak ventrikülleri küçük parçalar halinde doğrayın ve buz üzerinde yaklaşık 500 µL kollajenaz içerisine yerleştirin. Kalan embriyolardaki ventrikülleri çıkarıp işleyin ve her bir kalbi ayrı bir tüpte toplayın.İnce kıyılmış ventrikülleri 37 °C'de, sallayarak 45 dakika boyunca bekletin. Her 15 dakikada bir örnekleri nazikçe çıkarın ve hücreleri mekanik olarak ayrıştırmak için pipetle yukarı-aşağı çekme işlemi uygulayın. İnkübasyonun ardından, kalan hücre kümelerini uzaklaştırmak için ventrikül kollagenaz çözeltisini 70 µm'lik bir filtreden geçirin; hücreleri 400 ×g'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin, süpernatantı atın ve yerine yaklaşık 200 µL %10FBS içeren DMEM ekleyin. Hücreleri yeniden süspande etmek için pipetle yukarı-aşağı çekme işlemi uygulayın, hücreleri tekrar santrifüjleyin ve ikinci bir yıkama ve santrifüj işleminin ardından hücreleri 50 µL %10FBS içeren DMEM içinde yeniden süspande edin.Ardından, önce antikor ve boncukların bulunduğu tüpü bir dakika boyunca mıknatısa yerleştirip süpernatanı aspire ederek boncukları hazırlayın. Daha sonra tüpü mıknatıstan çıkarın ve yaklaşık 100 µL %10 FBS içeren dmm ekleyin. Tüpü bir dakika boyunca tekrar mıknatısa yerleştirin ve ardından süpernatanı uzaklaştırın.Son yıkamadan sonra yıkama işlemini toplam üç kez tekrarlayın. Antikor konjuge boncukları DMM içindeki %10 FBS ile resüspanse ederek her bir hücre örneğine beş mikrolitre antikor konjuge boncuk ekleyin. Boncuk-hücre süspansiyonlarını laminar akışlı kabin içerisinde, dört derece Celsius'ta 30 dakika boyunca sallayarak bekletin; ardından örnekleri bir dakika boyunca mıknatısa yerleştirin ve süpernatantı aspire edin.Tüpleri mıknatıstan çıkarın ve yaklaşık 100 µL %10 FPS ve dm ile yıkayın. Son yıkamadan sonra toplamda beş yıkama olacak şekilde işlemi tekrarlayın. Boncukları yaklaşık 100 µL DMEM içerisinde süspande edin.Tüpleri bir dakika boyunca mıknatıs üzerine yerleştirin. Besiyerini uzaklaştırın, ardından 100 ila 200 µL önceden ısıtılmış %0,25 tripsin EDTA ekleyin, numuneleri 37 °C'de ve %5 CO2 ortamında beş dakika inkübe edin. Tüpleri iki dakika boyunca mıknatıs üzerine yerleştirin.Ardından, süpernatant içeren hücreyi dikkatlice yeni tüplere aktarın ve 400 G'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Son olarak, süpernatantı uzaklaştırdıktan sonra hücreleri 80 ila 100 µL endotel büyüme ortamında süspansiyona getirin ve beklenen verime bağlı olarak 96 veya 384 kuyucuklu işlem görmüş bir kültür plağına ekimleyin. E 14.5 ile E 16.5 arası embriyolardan alınan her bir ventrikül çifti, burada CD 31'i tanıyan endotel spesifik bir antikor kullanılarak gösterildiği üzere tipik olarak 450 ila 600 hücre verimi sağlar. Endotel hücreleri, E 13.5 günündeki embriyoların ventriküllerinden izole edilmiştir.İşlem görmemiş bir kültür kabında büyütüldüklerinde, bu hücreler yuvarlak kalır ve konfluans seviyesine yaklaştıklarında Arnavut kaldırımı deseni oluştururlar. Hücreler seyreltik kollajen kaplı plakalara yapışabilse de, E 18.5 ventriküllerinden izole edilen bu hücreler, kollajen jel üzerinde kaplandıklarında olduğundan daha az zincir oluştururlar. Ek olarak, hücrelerin kimliğinin doğrulanması amacıyla, kollajen kaplı plakaya kıyasla kollajen jel üzerinde daha hızlı hücre-hücre etkileşimleri kurdukları ve zincirler oluşturdukları görülür.Bu şekildeki hücreler, endotelyal belirteç ISO selektin ile pozitif olarak işaretlenmiştir. Ayrıca, burada gösterildiği gibi, E 18.5 ventriküllerinden izole edilen endotel hücreleri, endotelyal belirteçler PAM ve flick one ile pozitif olarak işaretlenmiştir. Bu şekil, E 14.5 embriyosunun ventriküllerinden izole edilen ve endotel spesifik boya cyto ile işaretlenen endotel hücrelerini göstermektedir.16 izole hücre bir haftalık kültüre kadar hayatta kalır, ancak ization işlemine dirençlidirler ve bu nedenle terminal deneyler için en uygundurlar. Bu teknik bir kez kavrandıktan sonra, uygun şekilde gerçekleştirilirse yaklaşık üç buçuk saatte tamamlanabilir. Bu prosedürün ardından, bu izole hücrelerin in vitro ortamda nasıl davrandıklarını belirlemek için tüp oluşturma deneyleri ve transwell migrasyon deneyleri gibi diğer analizlar yapılabilir.

isolation-of-embryonic-ventricular-endothelial-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu video protokolü insan göbek kordonu, insan umbilikal ven endotel hücreleri (HUVEC) izolasyonu ve kültürü göstermektedir. Bir kere bu hücreler, in vitro Hughes laboratuvar gösterdiği Optimize Fibrin Jel Boncuk Testi gibi anjiyogenez tayinlerde için kullanılabilir izole edilmiştir.

İnsan umbilikal ven endotel hücreleri İzolasyon (HUVEC)

Yalıtma ve kalp kapakçığı endotel hücreleri (VEC) saf kültür popülasyonları için bir yöntem sağlar. VEC tüberkülü veya broşürün her iki taraftan da izole edilmiş ve hemen şu olabilir, altta yatan interstisyel hücre (VIC) izolasyonu basittir.

Kapak Endotel Hücreleri İzolasyon

Bu makale, izole etmek için bir yöntem ve kültür bıldırcın veya tavuk HH14...

Kuş Embriyonik Kapak Progenitör Hücreler izolasyonu ve Kültür

Burada, fare pulmoner endotel hücrelerin izolasyonu ve kültürü için bir protokol açıklar. Bu yöntem, mekanik ve enzimatik akciğer dokusunda ayrılma yanı sıra anti-PECAM-1 ve çoğunlukla mikrovasküler kökenli saf bir endotel hücre popülasyonu üreten manyetik boncuk, konjuge anti-ICAM-2 antikorları kullanarak 2-aşamalı bir arınma süreci kapsar.

Yenidoğan Fareler Pulmoner Endotel Hücreleri İzolasyon ve Kültür

Bu video 10-12 gün içinde embriyonik ön beyin endotel hücreleri saf kültürlerin hazırlanması için kolay ve güvenilir bir strateji gösterir ve serebral damar birçok açıdan odaklanmış araştırma için yararlı olacaktır.

Embriyonik ön beyin gelen Endotel Hücreleri İzolasyon ve Kültürü

Kalp kapakçığı endotel hücrelerini (VEC'ler) izole etme yeteneği, kapak gelişimi, bakımı ve hastalık mekanizmalarını anlamak için kritik öneme sahiptir.  Burada, VEC'lerin gelişimsel ve hastalık süreçlerine katkısını belirleyen çalışmalara izin verecek FACS kullanarak embriyonik ve yetişkin Tie2-GFP farelerinden VEC'lerin izolasyonunu açıklıyoruz.

Murin Vana Endotel Hücreleri İzolasyon

Hematopoetik kök ve progenitör hücreler (HSPC) henüz küçük bazı endotel hücreleri kan yapıcı olmaya belirtmek hangi işlemi hakkında bilinen, gelişim sırasında uzman (hemogenic) endotel hücreleri kaynaklanıyor. Bu fare embriyonik dokulardan hemogenic endotel hücreleri ve HSPC eşzamanlı izolasyonu sağlayan bir akış-sitometri göre bir yöntem ortaya koymaktadır.

Fare Embriyonik Hemogenic endotel hücrelerinin izolasyonu

Bu iletişim kuralının amacı göbek kordon kanı endotelyal progenitor hücrelerini izole etmektir. Bazı uygulamalar bu hücreler bir biyomarker hastaların kardiyovasküler riski ile iskemik hastalıklar, tedavi tanımlamak için kullanmayı içerir ve oluşturma doku Mühendisliği vasküler ve kalp kapak oluşturur.

Yalıtım endotelyal Progenitor Hücre insan göbek kordon kanı

Biz bir sindirim tampon ardışık doku sindirim yoluyla sıçan kalplerinden endokardiyal ve koroner endotel hücrelerinin izolasyon için bir protokol sunmak, tekrarlayan santrifüj döngüleri hücre toplama, ve anti-sıçan CD31 mikroboncuklar kullanarak hücre arıtma.

Endokardiyal ve Koroner Endotel Hücrelerinin Sıçan Kalbinin Ventriküler Serbest Duvarından İzolasyon

Bu protokol, elektrofizyolojik çalışmalar için uygun, yetişkin, genç, larval ve embriyonik zebra balıklarından (Danio rerio) canlı kardiyak ve vasküler düz kas hücrelerinin akut izolasyonunu tanımlamaktadır.

Kardiyak ve Vasküler Düz Kas Hücrelerinin Elektrofizyolojik Çalışmalar İçin Yetişkin, Genç, Larva ve Embriyonik Zebra Balıklarından İzolasyonu

Zor olmasına rağmen, pulmoner endotel hücrelerinin izolasyonu, akciğer iltihabı ile ilgili çalışmalar için gereklidir. Bu protokol, makrovasküler ve mikrovasküler endotel hücrelerinin yüksek verimli, yüksek saflıkta izolasyonu için bir prosedürü tanımlamaktadır.

Akciğer Kaynaklı Örneklerden Mikrovasküler ve Makrovasküler Endotel Hücre İzolasyonu ve Saflaştırma

Öğrenin, transgenik fare embriyolarından embriyonik ventriküler endotel hücre izolasyonu yöntemini. Bu teknik, kardiyovasküler gelişim ve damar biyolojisi araştırmalarında kullanılır.

Embriyonik Ventriküler Endotel Hücre İzolasyonu

Daha fazla video keşfet