Name: Elektrofizyoloji ve yüksek çözünürlüklü İki foton Mikroskopi için Fare Vestibüler Duyu epiteli bir İzole Yarı sağlam Hazırlık (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 52 s
Description: Öğrenin fare vestibüler duyu epitelinin yarı sağlam hazırlanması yöntemini. Elektrofizyoloji ve iki foton mikroskopi ile saç hücrelerinin zar özelliklerini ve kalsiyum sinyallerini inceleyin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu iş için finansman R. Lim ve AJ Camp bir Garnett Passe ve Rodney Williams Memorial Foundation Projesi hibe tarafından sağlandı.

1. Hayvanlar <ol><li> Fareler Avustralya Kemirgen Merkezi (ARC, Perth, Avustralya) elde edildi ve çevresel zenginleştirme ile normal 12 saatlik aydınlık / karanlık döngüsü Sidney Bosch Hayvan Tesisi Üniversitesi&#39;nde düzenledi. Tanımlanan tüm deneyler Sidney Hayvan Etik Kurul Üniversitesi tarafından onaylanmıştır. </li><li> Erkek ve dişi fareler (C57/BL6) bu gerginlik yaygın genetik manipülasyon için arka planı olarak kullanılır çünkü tüm deneyler için kullanıldı ve 8-9 vahşi-tipe eşdeğer kabul edilebilir. </li></ol> 2. Doku Hazırlanması <ol><li> 26 NaHCO3, 11 glukoz, 250, gliserol, 2,5 KCl, 1.2 NaH 2 PO 4, 1.2, MgCl2, ve 2.5 CaCI2: oluşan bir gliserol bazlı yapay beyin omurilik sıvısı (ACSF) (mM olarak) 300 ml hazırlayın. CaCl2 ilavesinden önce, karbojen gazı (% 95 O2 ve% 5 CO2) ile çözüm AP kurmak7.4 H ve önlemek kalsiyum yağış (bulutluluk). Bir buz bulamaç oluşmuştur, böylece, 45 dakika boyunca -80 ° C dondurucu içinde çözelti dondurun. </li><li> Derin bir içi-periton enjeksiyon yoluyla ketamin (100 mg / kg) (Parnell, İskenderiye, Avustralya) ile fareler uyuşturan. </li><li> Bir kez arka-bacak tutam refleksleri keskin paslanmaz çelik makas kullanarak yok başını kesmek fareler ve kafatası ortaya çıkarmak için bir jilet (# 22 yuvarlak) kullanarak sagital cilt kesi yapmak. Bu noktada ve adımları 2,3-2,8 boyunca kafatası, beyin, ve temel vestibüler cihaz doku üzerinde buz ACSF düzenli uygulama mümkün olduğunca serin tutulmalıdır. </li><li> Standart desen makas sivri kolu (FST, Kuzey Vancouver, Kanada) kullanılarak Lambda de kafatasında küçük bir kesi yapmak ve sagital sütür boyunca kesilir. Beynin bu adımı sırasında kesme bıçağı ile &quot;sürüklenen&quot; olmadığından emin olun. </li><li> Dikkatlice yanal parietal kemik ve oksipital kemik postero kabuğurly sığ viraj Pearson rongeurs (FST) kullanarak. </li><li> Küçük bir paslanmaz çelik spatula yavaşça orta ve posterior kranial fossa yüzeyinden beyin kaldırmak için kullanılan ve maruz vestibulocochlea sinir (CNVIII) iç kulak ve ince iris bir makas ile beyin sapı arasında yarı yolda kesilir. Bu sinir kesme saç hücreleri ile birincil afferentleri ve bağlantılarının akson üzerinde aşırı gerginlik en aza indirir. </li><li> CN VIII transeksiyonu takiben beyin toto uzaklaştırılmaktadır. </li><li> Vestibüler labirent koklea anteromediale işaret ile, şimdi orta kranial fossada açıkça görülebilir. Hafifçe ön semisirküler kanal kavrama ve yanal çekerek eksize önce vestibüler labirent her iki tarafında RONGEUR. </li><li> Bölüm 2.1 &#39;de açıklanan buz gibi, sürekli gaz verilerek ACSF içeren bir diseksiyon çanak çıkarıldı labirentler (Şekil 1) bırakın. Bir stereomikroskopta altında, labirent tutunkoklea kavrayarak çanak taban. Ön semisirküler kanal ampulla örten kemik uzakta kazımak için ince forseps kullanın. Kemik küçük bir delik elde uzak bir kez Ampulla gelen kemik fiske başlar. Dikkat Bu temel membranöz labirent ve duyusal epitel zarar verebilir gibi kemik ile forseps itmek için değil alınmalıdır. Ön ve komşu yatay yarım daire membran kanalları ve ampullae hem (Şekil 2) maruz kalan kadar bu işleme devam edin. </li></ol><img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/50471/50471fig1.jpg" /> Şekil 1. İzole fare vestibüler labirent. A. Sol panel) izole fare vestibüler labirent şematik. Vestibüler duyu epitel erişim için referans önemli noktaları, salyangoz, ön ve yatay semisirküler kanallar laboratuarıeLED. Yıldız vestibüler duyu epitel içeren semisirküler kanal ampulla göstermektedir. B. 1 aylık fareden izole vestibüler labirent sağ panel) photomicrograph. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/50471/50471fig2.jpg" /> Şekil 2. Membranöz vestibüler labirent maruz kalması. Anterior ve yatay semisirküler kanal ampullae örten kemik siyah / kahverengi benekli membranöz ampullae ve ilgili ampuller sinirler (CNVIII) ortaya çıkarmak için çizilmiş. Alt panelinde şematik fotomikrografisine vurgulanan bölgedeki yapıların temsil eder ve ampullae ve CNVIII için semisirküler kanal kanalların ilişkiyi gösterir. <ol start="10"><li> Ince forseps kullanarak, yavaşça sağlanması, kemik labirent uzak ampullae ve ilgili kırbacık kaldırdıklarını ampullae merkez bölgesi (contaduyusal epitel) ining zarar değildir. Bazı durumlarda yarım daire membranöz kanal proksimalinde kemikten ampullae serbest bırakmak için iris makası ile kesmek gerekebilir. </li><li> Leibovitz L-15 kültür ortamı (Sigma-Aldrich, St Louis, MO) ile dolu bir Petri kabı içine iki ampullae ve kırbacık içeren üçlü aktarın. &quot;Arka&quot; dokuya optik bir fiber kullanın. Bu ampullae içinde duyusal epitel içeren kristanın açık görselleştirme sağlar. </li><li> Dikkatlice ince iris makas ile kırbacık en benekli &quot;çatı&quot; bir kesi yapmak. Ön çatısı ve daha sonra yatay ampülleri ile bu kesi devam edin. Bu (Şekil 3A) irtibat kurmadan mümkün olduğunca duyu epitel kenarına yakın kesi yapmak. Duyusal epitel örten zarın hiçbir parça (Şekil 3B) olmadığından emin olun </li><li> Küçük bir cam ile izole yarı sağlam hazırlanması aktarmas dipli kayıt odasına L-15 medya ile dolu. Düzleştirilmiş bir U-şekilli platin tel (Şekil 3B) sabitlenmiş ince naylon liflerden oluşan bir ızgara kullanarak hazırlanması aşağı tartılır. İdeal olarak, kılavuz teller duyusal epitel örter gerekir, ancak daha yüksek stabilite gerekli olduğu bazı durumlarda, belki de tercih duyu epitel kesilmesiyle tek bir fiber. </li></ol><img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/50471/50471fig3.jpg" /> Şekil 3,. Yarı sağlam hazırlık ve elektrot yapılandırma vestibüler duyu epitel. A. şematik temsil izole yarı sağlam hazırlık. Crista örten ampulla duyusal epitel (yeşil) yüzeyine ortaya çıkarmak için &quot;de-çatılı&quot; olmuştur. Anterior (AC) ve yatay (hc) crista (kırbacık gösteren yarı sağlam &#39;üçlü&#39; hazırlık B. photomicrograph olmak gizlenmiş) ac arka. Kayıt odasının tabanına hazırlanması sabitlemek için kullanılan naylon elyaf edin. Ölçek çubuğu:. 100 mikron C. bireysel vestibüler saç hücre yerleştirilmiş bir kayıt elektrot. Ölçek çubuğu: 15 mikron. 3. Elektrofizyoloji <ol><li> Sürekli oksijenli L-15 ortamı ile yarı sağlam hazırlanması serpmek. Medya kayıtları boyunca izlenmelidir ortamın pH göstergesi (fenol kırmızı) ve renk içerir. Oksijen ile pH 7.3-7.4 olacak ve kırmızı bir renk uygun olmalıdır. </li><li> Bir elde etmek için bir mikropipet çektirmesi (model PP-830 Narishige, Japonya,) üzerinde:,: iki aşamalı bir protokol (50 ve ısı adım 2 72 ısı adım 1) ile 1.5 mm (1.19 mm ID) borosilikat cam kayıt pipetler hazırlayın MQ 3-4 nihai empedansı. </li><li> MgCl2 (mM olarak) 110 KF, 12 KCI, 27 KOH, 1 NaCl, 10 HEPES, 10 mM EGTA, 1.8 içeren bir potasyum flüorür temelli bir iç çözelti 3-4 mm olan pipet şaft doldurun3. D-glikoz, ve 2 Na-ATP, KOH ile pH 7.4. </li><li> Kadar aşağı elektrot izole ve pipet kapasitans azaltmak için parafilm ince bir şerit ile mümkün olduğunca ucu pipet 2-3 kez sap sarın ve. </li><li> Dik bir mikroskop (Olympus BX51) düşük güç büyütme (5X) altında duyu epitel üzerinde pipet yerleştirin. Yüksek güç (40X) geçin ve bağlı bir CCD kamera ile tek tek vestibüler saç hücrelerinin görselleştirmek. </li><li> Bir micromanipulator (Sutter Instruments, California, ABD) kullanılarak bir görsel saç hücresi (Şekil 3C) ve membran pozisyon pipet. Bir gigaohm sızdırmazlık elde edilir, kopma pipet tutucu bir emiş ağzı yoluyla uygulanan bir negatif basınç küçük bir miktarı ile hücre zarı. </li><li> Standart teknikler kullanılarak 8-9 tam hücre voltaj sıkıştırma kayıtları yapın. </li></ol> 4. İki foton Mikroskopi <ol><li> 5 mM Oregon Yeşil içeren% 0.9 serum fizyolojik hazırlayın488 BAPTA-1 (OGB-1; hexapotassium bir tuzu; Invitrogen, Almanya). </li><li> Duyusal epitel yukarıdan engelsiz sağlamak; hala batık ise, filtre kağıdı küçük bir parça (Millipore, Almanya 4X4 mm, kalın 0.8 mikron) üzerine &quot;de çatılı&quot; yarı-sağlam üçlü hazırlık yerleştirin. </li><li> Sentetik kalsiyum 5 mM&#39;lik bir çözeltisi bir başka 5 ul ile filtre kağıdı ve hazırlık bir puls jeneratörü ve bir geniş-bant amplifikatörünün kombinasyonundan oluşan bir Electroporator arasında tuzlu su kaplı taban platin elektrot (7 ul) üzerine ve kapağın aktarma Gösterge boya Oregon Yeşil 488 BAPTA-1 (Şekil 4). </li></ol><img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/50471/50471fig4.jpg" /> Şekil 4. Toplu elektroporasyon. A. elektroporasyon yapılandırmasının şematik bir enine kesitini göstermektedir. Yarı sağlam hazırlanması (*) kalsiyum DY batırılır filtre kağıdına yerleştirilirE (Oregon Green 488 BAPTA-1) ve akım 2 platin elektrot arasında uygulanmaktadır. Briggman ve Euler 2011 10 uyarlanmıştır. <ol start="4"><li> Oregon Yeşil 488 BAPTA-1 çözümü yapılır ile irtibata geçtiğinizde hazırlanması yönünü bozmak için dikkatli olmak, yaklaşık 2 mm bir mesafede taban elektrot ile üst platin elektrot paralel getirin. </li><li> 10-11; hazırlanması (+13 V, 10 msn darbe genişliği, 1 Hz frekans, 10 kare dalga darbe akım için Parametreler) arasında kısa bir akım darbe Min. </li><li> L-15 ortamı ile doldurulmuş bir dipli cam kayıt odasının alt kısmında, yine duyu epitel yukarıda engelsiz olması sağlanmış, bunun üzerine silikon yağı ve pozisyon yarı sağlam hazırlanması küçük bir dab yerleştirin. (Noktası 2.13 bakınız) yukarıda açıklandığı gibi görüntüleme boyunca istikrarı sağlamak için, hazırlanması üzerinde naylon ızgara değiştirin. </li><li> Iki foton mikroskop kullanılarak spontan optik kayıt yapmakstandart görüntüleme protokolleri 10-11 kullanarak duyusal epitel (Şekil 7) neous kalsiyum aktivite. </li></ol>

<ol><li>Dulon, D., Safieddine, S., Jones, S. M., Petit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Otoferlin+is+critical+for+a+highly+sensitive+and+linear+calcium-dependent+exocytosis+at+vestibular+hair+cell+ribbon+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Otoferlin is critical for a highly sensitive and linear calcium-dependent exocytosis at vestibular hair cell ribbon synapses.</a> J. Neurosci. 29, 10474-10487 (2009).</li>
<li>Simultaneous pre- and post-synaptic recording from the peripheral vestibular calyx and its included type I hair cell. Highstein, S., Art, J., Holstein, G., Rabbitt, R. 32nd Mid Winter Research Meeting: Association for Research in Otolaryngology, Baltimore, MD, , (2009).</li>
<li>Voltage dependent currents in type I and II hair cell and calyx terminals of primary afferents in an intact in vitro mouse vestibular crista preparation. Kindig, A. E., Lim, R., Callister, R. J., Brichta, A. M. 32nd Mid Winter Research Meeting: Association for Research in Otolaryngology, Baltimore, MD, , (2009).</li>
<li>Chatlani, S., Goldberg, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-cell+recordings+from+calyx+endings+in+the+turtle+posterior+crista%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Whole-cell recordings from calyx endings in the turtle posterior crista.</a> 33rd Mid Winter Research Meeting: Association for Research in Otolaryngology, Anaheim, , (2010).</li>
<li>Songer, J. E., Eatock, R. A. Transduction in the mammalian saccule. 33rd Mid Winter Research Meeting: Association for Research in Otolaryngology, Anaheim, , (2010).</li>
<li>Lee, H. Y., Camp, A. J., Callister, R. J., Brichta, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vestibular+primary+afferent+activity+in+an+in+vitro+preparation+of+the+mouse+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Vestibular primary afferent activity in an in vitro preparation of the mouse inner ear.</a> J. Neurosci. Methods. 145, 73-87 (2005).</li>
<li>Lim, R., Kindig, A. E., Donne, S. W., Callister, R. J., Brichta, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potassium+accumulation+between+type+I+hair+cells+and+calyx+terminals+in+mouse+crista%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Potassium accumulation between type I hair cells and calyx terminals in mouse crista.</a> Exp. Brain Res. 210, 607-621 (2011).</li>
<li>Camp, A. J., Callister, R. J., Brichta, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitory+synaptic+transmission+differs+in+mouse+type+A+and+B+medial+vestibular+nucleus+neurons+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Inhibitory synaptic transmission differs in mouse type A and B medial vestibular nucleus neurons in vitro.</a> J. Neurophysiol. 95, 3208-3218 (2006).</li>
<li>Camp, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attenuated+glycine+receptor+function+reduces+excitability+of+mouse+medial+vestibular+nucleus+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Attenuated glycine receptor function reduces excitability of mouse medial vestibular nucleus neurons.</a> Neuroscience. 170, 348-360 (2010).</li>
<li>Briggman, K. L., Euler, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bulk+electroporation+and+population+calcium+imaging+in+the+adult+mammalian+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Bulk electroporation and population calcium imaging in the adult mammalian retina.</a> J. Neurophysiol. 105, 2601-2609 (2011).</li>
<li>Briggman, K. L., Helmstaedter, M., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wiring+specificity+in+the+direction-selectivity+circuit+of+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Wiring specificity in the direction-selectivity circuit of the retina.</a> Nature. 471, 183-188 (2011).</li>
<li>Rennie, K. J., Streeter, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage-dependent+currents+in+isolated+vestibular+afferent+calyx+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Voltage-dependent currents in isolated vestibular afferent calyx terminals.</a> J. Neurophysiol. 95, 26-32 (2006).</li>
<li>Hudspeth, A. J., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+analysis+of+voltage-+and+ion-dependent+conductances+in+saccular+hair+cells+of+the+bull-frog%2C+Rana+catesbeiana%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Kinetic analysis of voltage- and ion-dependent conductances in saccular hair cells of the bull-frog, Rana catesbeiana.</a> J. Physiol. 400, 237-274 (1988).</li>
<li>Rennie, K. J., Ashmore, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ionic+currents+in+isolated+vestibular+hair+cells+from+the+guinea-pig+crista+ampullaris%5BTitle%5D)+AND+%22Hear.+Res%22%5BJournal%5D)">Ionic currents in isolated vestibular hair cells from the guinea-pig crista ampullaris.</a> Hear. Res. 51, 279-291 (1991).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.

Denge duygumuzu altında yatan mekanizmaları diğer duyu sistemleri ile karşılaştırıldığında sınırlı dikkat aldık, görsel ve işitsel sistemleri gibi. Vestibüler veya denge fonksiyonu değişiklikleri araştırdık çalışmaların, en denge-vestibüler saç hücrelerinin kendilerini temel yapı taşlarından eksik bilgi ile, vestibülookuler refleks dahil olmak üzere davranışsal tedbirler odaklanmıştır. Kendi ana ortamdan kaldırılır akut izole saç hücreleri kullanarak bunu saç hücreleri üzerinde yoğunlaşmıştır bu çalışmaların he...

Günlük hayatımıza vestibüler sistemin önemli bir katkı rağmen, yaşla birlikte vestibüler fonksiyonunda gözlenen düşüş sorumlu süreçlerin net bir anlayış zor kalır. Bu bilgi eksikliği bir nedeni vestibüler fonksiyonu bu düşüş neredeyse sadece vestibülookuler refleks (VOR), dışsal vestibüler fonksiyonun kesin bir gösterge dahil davranış testleri kullanılarak incelenmiştir, ancak içsel bileşenlerinin değişiklikleri içine sınırlı bilgiler sağlar . Bu sağlık, hastalık, ya da yaşlanma vestibüler saç hücre fonksiyonlarını daha iyi anlayabilmemiz için önemli bir engeldir. Bireysel vestibüler saç hücrelerinin birçok çalışma varken, büyük bir eksiklik saç hücreleri ve hatta çanak afferent terminaller mekanik ve / veya enzimatik tedavi ile normal ortamdan kaldırılır akut saç hücresi hazırlıkları, üzerinde güven olmuştur. Bu tür yaklaşımlar kaçınılmazkızak kesici saç hücresi ve çanak ve saç hücre ve destekleyici hücre arasındaki hassas mikromimarisini bozabilir. Yarı sağlam hazırlıkları 1-5, ve izole bir fare labirent hazırlık 6 gelişmesiyle birlikte, daha yakından in vivo benzeyen bu koşullar altında sinaptik iletişim çeşitli şekillerde incelemek için bir fırsat şimdi var. Gerçekten de, Lim ve ark. (2011) I vestibüler saç hücreleri neuroepithelium içinde gömülü kaldığını kıyasla akut izole türünden kaydedilen tüm hücre akımları belirgin farklılıklar gösterdi. Özellikle, potasyum saç hücresi ve afferent çanak arasında, hücreler arası boşlukta birikir düşünülmektedir, ve önemli ölçüde saç hücresi yanıtı 7 değiştirebilir. Bu tür bilgiler burada açıklanan vestibüler duyusal epitelin yarı sağlam hazırlık olmadan elde etmek mümkün olacaktır. Biz fare krista 3 yarı sağlam hazırlık göstermekVe tam hücreli yama elektrofizyoloji elde edilen temsilcisi sonuçları ve iki foton kalsiyum görüntüleme göstermektedir.

<table><tbody><tr><td colspan="4">REAGENTS</td></tr><tr><td>Leibovitz medium L-15</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L4386-10X1L</td><td></td></tr><tr><td>BAPTA-1-oregon yeşil</td><td>Invitrogen</td><td>O6806</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">EQUIPMENT </td></tr><tr><td>Stereo mikroskop</td><td>Leica Microsystems</td><td>A60S</td><td></td></tr><tr><td>Dik mikroskop</td><td>Olympus</td><td>BX51WI</td><td></td></tr><tr><td>İki foton mikroskobu</td><td>Olympus/La Vision</td><td>BX51WI/ TriMScope II</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 SF Forseps</td><td>FST</td><td>11252-00</td><td></td></tr><tr><td>Friedman-Pearson Rongeurs</td><td>FST</td><td>16221-14</td><td></td></tr><tr><td>Standart Desen Makası</td><td>FST</td><td>14001-12</td><td></td></tr><tr><td>InstraTECH A-D dönüştürücü</td><td>HEKA</td><td>ITC-18</td><td></td></tr><tr><td>Sutter Mikromanipülatör</td><td>Sutter</td><td>MP-225/M</td><td></td></tr><tr><td>multiclamp amplifikatör</td><td>Axon Instruments</td><td>700B</td><td></td></tr><tr><td>Veri toplama yazılımı (elektrofizyoloji)</td><td>Axograph</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Imspector Veri toplama yazılımı (iki foton)</td><td>Max Planck yeniliği</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

elektrofizyoloji ve yüksek çözünürlüklü İki foton mikroskopi için fare vestibüler duyu epiteli bir İzole yarı sağlam hazırlık

An Isolated Semi-intact Preparation of the Mouse Vestibular Sensory Epithelium for Electrophysiology and High-resolution Two-photon Microscopy

Anlamak vestibüler saç hücreleri normal koşullar altında işlev, ya da ne kadar travma, hastalık, ve bu fonksiyon bozabilir yaşlanma önleyici yaklaşımlar ve / veya yeni tedavi stratejilerinin geliştirilmesi hayati bir adımdır. Ancak, anormal vestibüler fonksiyon bakarak çalışmaların çoğunluğu hücresel düzeyde olmuştur ama esas olarak yürüyüş analizleri ve vestibülookuler refleks performans olarak vestibüler fonksiyon bozukluğu davranış testleri odaklı değil. Bu iş terslik ne olur hakkında değerli bilgiler vermiştir olsa da, çok az bilgi disfonksiyon nedenleri ile ilgili toplanan edilir. Vestibüler fonksiyonu altında yatan hücresel ve hücre içi süreçleri odaklanmak çalışmaların, çoğu sinaptik bağlantıları ve destekleyici hücre çevre yoksun akut izole saç hücreleri, yararlanmıştır. Bu nedenle, büyük bir teknik meydan okuma bir hazırlık içinde zarif duyarlı vestibüler saç hücrelerinin erişimi olmuşturaration en fizyolojik, bozulur bu. Burada saç hücre / primer afferent kompleksleri dahil olmak üzere yerel mikro-çevre korur fare vestibüler duyu epitel bir yarı-sağlam hazırlık göstermektedir.

Vestibüler saç hücrelerinin elektrofizyolojik özellikleri onlar 7 gömülü olduğu dahilinde kompleksin mikromimarisine bağlıdır. Yarı sağlam vestibüler epitel hazırlanması türü arasında ayırt etmek için kullanılabilir, Şekil 5&#39;te de görüldüğü gibi bir saç hücreleri (Şekil 5A), tip II saç hücreleri (Şekil 5B) ve çanak birincil aferent (Şekil 5C) karakteristik tam hücre iletkenlikleri dayanmaktadır. Bu özellikler bir depolarizasyon sırasında ...

Vestibüler saç hücre fonksiyonu analizi kafatası, petröz temporal kemiğin en zor kısmı içinde derin konumlarına göre karmaşıktır. En işlevsel saç hücre çalışmaları akut izole saç hücrelerinin kullandık. Burada elektrofizyolojik ve iki-fotonlu mikroskop çalışmaları için fare vestibüler epitelyum bir yarı sağlam hazırlanması açıklanmaktadır.

Elektrofizyoloji ve yüksek çözünürlüklü İki foton Mikroskopi için Fare Vestibüler Duyu epiteli bir İzole Yarı sağlam Hazırlık

Understanding vestibular hair cells function  under normal conditions, or how trauma, disease, and aging disrupt this  function is a vital step in the ...

Bu prosedürün genel amacı, vestibüler tüy hücrelerinin temel hücresel ve alt hücresel süreçlerini incelemek için kullanılabilecek, fare vestibüler duyusal epitelinin normale yakın bir preparasyonunu elde etmektir. Bu işlem, öncelikle kemikli vestibüler labirentin kranial kubbeden izole edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, membranöz labirenti kemik kılıfından tamamen çıkarmadan önce, alttaki membranöz labirenti açığa çıkarmak için ince pensetlerle kemikli labirentin dikkatlice kazınmasıdır.Ardından, üstteki zar ince iris makasları ile kesilerek uzaklaştırılır ve vestibüler duyusal epitel açığa çıkarılır. Son adım, yarı-intakt duyusal epitel preparatının cam tabanlı bir hazneye yerleştirilmesi ve ağırlıklı bir naylon ağ ile sabitlenmesidir. Nihayetinde, her bir vestibüler tüy hücresi ve/veya primer nöronun sırasıyla intrinsik membran özelliklerini ve kalsiyum sinyalizasyon profilini karakterize etmek için patch clamp elektrofizyolojisi ve iki foton mikroskopisi kullanılır.Bu tekniğin, izole tüy hücresi preparasyonları da dahil olmak üzere mevcut yöntemlere göre temel avantajı, tüy hücrelerinin ve bunların primer afferent nöronlarının düzenini mümkün olduğunca normal koşullara yakın şekilde koruyabilmemizdir. Bu durum, ölçümleri fizyolojik koşullara yakın şartlarda ve eş zamanlı olarak yapabileceğimiz anlamına gelir. Bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritiktir; çünkü dissection işlemi öğrenmesi oldukça zor bir işlemdir; bunun temel sebebi vestibüler aparatın kafatasının temporal kemiğinin derinliklerinde yer alması ve ayrıca duyusal epitelyumun kendisinin çok küçük olması ve dissection sırasında kolayca hasar görmesidir.Elektroporasyon ve iki foton prosedürlerini, laboratuvarımda çalışan meslektaşım Stefano DeMarcole göstereceğiz. Yerel kurum ve hükümet yönergelerine uygun olarak bir C 57 black six faresini derinlemesine anestezi altına alıp kafasını kestikten sonra kafatasını açın. Kafatasının Lambda bölgesinde küçük bir insizyon yapın ve sagital sütür boyunca kesin. Beynin makas bıçağıyla sürüklenmediğinden emin olun.Bu adım sırasında, dokuyu soğutmak için beyne buz gibi soğuk A CSF uygulayın ve ardından sığ eğimli Pearson pensleri kullanarak parietal kemikleri lateral olarak ve oksipital kemiği posterior olarak dikkatlice soyun; tekrar buz gibi soğuk A CSF uygulayın. Daha sonra, beyni orta ve posterior kranial fossa yüzeyinden nazikçe kaldırmak için küçük bir paslanmaz çelik spatula kullanın. Vestibüler labirent, kokleanın işaret ettiği orta kranial fossa içinde artık net bir şekilde görünür durumdadır.Buz gibi A CSF ekleyerek vestibüler labirentin her iki yanını rahatlatın. Ardından, anterior semisirküler kanalı kavrayıp lateral yöne çekerek vestibüler labirenti nazikçe çıkarın. Çıkarılan labirentleri, buz gibi çözelti içeren bir diseksiyon kabına daldırın.Sürekli olarak gazlanan A CSF stereo mikroskop altına yerleştirilir. Bu diyagram, eksize edilmiş labirenti detaylı bir şekilde göstermektedir. Ardından, stereo mikroskop altında çalışırken, kokleayı ince pensle kavrayın ve labirenti kabın tabanına sabitleyin.Anterior semisirküler kanal ampullasının üzerindeki kemiği kazımak için ikinci bir pens kullanın. Kemikte küçük bir delik açıldığında, kemik parçalarını ampulladan uzaklaştıracak şekilde hafifçe vurun. Pensi kemiğin içinden itmemeye dikkat edin, çünkü bu durum alttaki membranöz labirent ve duyusal epitelde hasara yol açabilir.Hem anterior hem de komşu horizontal semisirküler membranlar, kanallar ve papulae burada gösterildiği gibi açığa çıkana kadar bu prosedüre devam edin. Şimdi ince pensler kullanarak, papulayı ve ilişkili utrikulü kemik labirentten nazikçe kaldırın ve sensoryum epitelini içeren papulae merkez bölgesinin zarar görmediğinden emin olun. İki papula ve utrikuldan oluşan üçlüyü Lebovitz L 15 kültür ortamı ile doldurulmuş bir Petri kabına aktarın.Pul içindeki duyusal epitelyumu içeren Krista'nın net bir şekilde görselleştirilmesini sağlamak için dokuya arkadan aydınlatma yapmak üzere bir fiber optik kullanın. Şimdi, amp ampullasının benekli tavanına dikkatlice bir insizyon yapmak için ince iris makaslarını kullanın. İnsizyonu, duyusal epitelyuma temas etmeden mümkün olduğunca kenarına yakın bir yerden yapın.Burada gösterildiği gibi, duyusal epitelin üzerinde herhangi bir membran parçası kalmadığından emin olun. Bu şema, nihai preparatın şeklini ve kayıt elektrodunun yerleşimini göstermektedir; izole edilmiş yarı sağlam preparatı L 15 medyum ile doldurulmuş küçük, cam tabanlı bir kayıt odasına aktarın. Yassılaştırılmış U şeklinde bir platin tele sabitlenmiş ince naylon fiberlerden oluşan bir ızgara kullanarak preparatı aşağı indirin. Doku artık elektrofizyolojik kayıtlar için hazırdır.Yarı sağlam preparasyonu sürekli oksijenlendirilmiş L 15 besiyeri ile perfüze edin. Oksijenle birlikte pH değerinin 7.3 ile 7.4 arasında olduğunu belirtmek için besiyerinin kırmızı kaldığından emin olun. Prosedür boyunca, 1.5 milimetre ve 1.19 milimetre iç çaplı kayıt pipetleri hazırlayın.Üç ila dört mega nihai empedans elde etmek için, bir mikro pipet çekicide iki adımlı bir protokol kullanarak silikat camı çekin. Pipetin gövdesini üç ila dört milimetre potasyum florür bazlı iç çözelti ile doldurun. Ardından, elektrodu izole etmek ve pipet kapasitansını azaltmak için pipetin gövdesini, uç kısmına mümkün olduğunca yakın olacak şekilde, ince bir parafilm şeridi ile iki ila üç kez sarın.Dik bir mikroskop altında, 5x düşük büyütmede pipeti duyusal epitelin üzerine konumlandırın. 40x yüksek büyütmeye geçiş yapın ve bağlı bir CCD kamera ile tekil vestibüler tüy hücrelerini görselleştirin. Mikromanipülatörü kullanarak pipeti, görselleştirilen bir tüy hücresinin membranı üzerine konumlandırın.Gigaohm sızdırmazlık sağlandıktan sonra, pipet tutucudaki vakum portu aracılığıyla uygulanan küçük bir miktarda negatif basınç ile hücre membranını yırtın ve iki foton mikroskobisi için standart teknikleri kullanarak tüm hücre voltaj klemp kayıtları yapın. Tavanı açılmış bölgeyi yarı bütün halde tutun. Hazırlığı daldırın ve küçük bir filtre kağıdı parçasına aktarın.Sensör epitelyumunun üst kısmının açık olduğundan emin olun. Filtre kağıdını ve preparatı, bir elektropor cihazının salinle kaplı taban platin elektrodunun üzerine yerleştirin. Preparatın yönünü bozmamaya dikkat ederek, üst platin elektrodu taban elektroduna paralel ve yaklaşık iki milimetre mesafeye getirin.Oregon Green 4 88 bafta ile temas sağlandığında, bu görüntüde görüldüğü gibi bir çözelti hazırlanır. Preparasyondan kısa bir akım darbesi geçirin. L 15 ortamı ile doldurulmuş, cam tabanlı bir kayıt odasının tabanına küçük bir miktar silikon yağı sürün.Ardından, duyusal epitelin üst kısmının açık olduğundan emin olarak yarı sağlam preparatı tekrar üzerine yerleştirin. Görüntüleme boyunca stabiliteyi sağlamak için naylon ızgarayı preparatın üzerine tekrar kapatın. Daha sonra, standart görüntüleme protokollerini kullanarak iki fotonlu mikroskop aracılığıyla duyusal epiteldeki spontan kalsiyum aktivitesinin optik kayıtlarını yapın.Bu görüntü, burada okla belirtilen büyük çöken kuyruk akımları ile karakterize edilen tip bir vestibüler tüy hücresinden kaydedilen tüm hücre akımlarını göstermektedir. Tüm hücre akımları, tip iki vestibüler tüy hücresinden kaydedilmiştir. Kuyruk akımlarının yokluğuna dikkat ediniz.Bu görüntü, negatif 120 milivoltluk negatif bir dinlenme potansiyelinden sonraki depolarizasyonun ardından, okla belirtilen geçici sodyum aracılı akımlar ile karakterize edilen bir calyx primer afferentinden yapılan tüm hücre kaydını göstermektedir. Tüm hücreler negatif 60 milivoltta tutulmuştur. Bu şekil, artan depolarizasyon süresine yanıt olarak genç ve yaşlı farelerden kaydedilen tip iki tüy hücreleri için IV ilişkilerini göstermektedir.Bu histogramlar, 100 milisaniyelik IV eğrilerine dayanarak genç ve yaşlı farelerdeki tip iki tüy hücrelerinin ortalama iletkenliğini ve aktivasyon oranını göstermektedir. Bu iki foton mikrografları, üst panelde normal L 15 PERFU eight'e veya alt panelde 100 milimolar potasyum klorür içeren L 15'e yanıt olarak meydana gelen BAFTA one Oregon green kalsiyum aktivasyonunu göstermektedir. Oklar, potasyum klorür eklenmesi öncesindeki ve sonrasındaki aynı bireysel tüy hücresini işaret etmektedir.Bu grafik, önceki görüntüde okla belirtilen tek bir hücrenin kalsiyum floresan profilini göstermektedir. Duyusal epitelin bu iki fotonlu mikrografı, tekil tüy hücrelerinin Oregon Green 4 88 bta one yüklemesini göstermektedir. Küçük resim, kalsiyumun okla belirtilen tip 1 tüy hücresi sitoplazmasındaki veya çift okla belirtilen tip 1 tüy hücresini çevreleyen kaliks primer aferentindeki hücre altı lokalizasyonunu göstermektedir.Bu işlemde uzmanlaşıldığında, diseksiyon 10 dakikadan kısa sürebilir. Bu videoyu izledikten sonra, vestibüler duyusal epitelin nasıl izole edileceği, bütünlüğünün nasıl korunacağı ve elektrofizyolojik kayıtlar ile iki fotonlu kalsiyum görüntüleme için canlılığının nasıl sürdürüleceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

an-isolated-semi-intact-preparation-mouse-vestibular-sensory

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu prosedür ya da spiral limbus ve spiral ganglion nöronlar Corti fare organ izolasyonu ve kültürü için bir yöntem açıklanır. Ayrıca elektroporasyon Corti eksplant organ dışsal bir muhabir gen ifadesi için bir yöntem göstermektedir.

İlköğretim Kültür ve Corti murin Organ Plazmid Elektroporasyon.

Bu video, bir fare vomeronazal organının (VNO) izolasyonunu ve vibratom kesiti için doku hazırlığını özetlemektedir. Bölümler, belirli bir duyusal nöron grubunun biyofiziksel ve fizyolojik özelliklerini karakterize etmek için kullanılır.

Vibratom kesiti için fare vomeronazal organının hazırlanması

Bu video, düz montajlı bir fare retinasından elektrofizyolojik kayıt için tam hücre yama kelepçesi tekniğini göstermektedir. Retina içindeki yıldız patlaması amakrin hücrelerine (SAC'ler) yaklaşmak için elektrotlu ince bir cam pipet kullanılır. Bir conta oluşturduktan sonra, zarı yırtmak ve tüm hücre yama-kelepçe konfigürasyonunu oluşturmak için emme uygulanır. Son olarak, iyonların SAC sinaptik reseptörlerinden akışı konfigürasyon kullanılarak ölçülür.

Düz Montajlı Bir Fare Retinasından Elektrofizyolojik Kayıt için Tam Hücre Yama Kelepçesi Oluşturma

Kaynak: Van Wonterghem, E.,  et al. Fare Koroid Pleksusunun Mikrodiseksiyonu ve Tam Montajlı Taramalı Elektron Mikroskobu Görselleştirmesi. J. Vis. Uzm. (2022)Bu video, taramalı elektron mikroskobu (SEM) kullanılarak bir fare beyninden alınan koroid pleksus dokusunun hazırlanmasını ve görüntülenmesini göstermektedir. İşlem, numuneyi stabilize etmek ve görüntülemeye hazırlamak için doku fiksasyonu, dehidrasyon ve iletken bir platin tabaka ile kaplamayı içerir. SEM, mikrovilluslu epitel...

Taramalı Elektron Mikroskobu Kullanılarak Bir Fare Beyin Koroid Pleksusunun Görselleştirilmesi

8 gün yaşlı bir fare Sinir retina% 4 jelatin bloğunun üstünde olduğunu. Vibratome ile fotoreseptör tabakası (200 um), izole edildikten sonra, fotoreseptör kültür mekanik ve enzimatik ayrışma sonrasında tohumlanır. fotoreseptör moleküler ve biyokimyasal analizler ya da transplantasyon için kullanılabilir.

Vibratome Kesit Fare Retina fotoreseptör Kültürler hazırlayın

Koku alma duyusal nöronlarının kirpikleri, sinyal iletim kaskadının proteinlerini içerir, ancak kriyoseksiyonlarda dağılımlarının ayrıntılı bir uzamsal analizi zordur. Burada, siliyer proteinlerin tüm montaj etiketlemesi ve yüz görselleştirmesi için optimize edilmiş bir yaklaşımı açıklıyoruz.

Fareler Ana Koku Sistemde Cilia Whole Dağı Etiketleme

Koku alma duyusal nöronlarının fizyolojik özelliklerini analiz etmek hala teknik sınırlamalarla karşı karşıyadır. Burada, gen hedefli farelerde koku alma epitelinin sağlam bir preparasyonu içinde delikli yama klempi yoluyla kaydediyoruz. Bu teknik, membran özelliklerinin karakterizasyonuna ve tanımlanmış koku alma reseptörlerini eksprese eden nöronların spesifik ligandlarına verilen yanıtlara izin verir.

Bozulmamış neuroepithelium Fare Koku Duyu Nöronlar Delikli Patch-kelepçe Kayıt: Bir Belirlenen Odorant Reseptör ifade Nöronlar Fonksiyonel Analiz

Biz retina yüzeyine paralel kesit düzlemi ile erişkin memeli retina yatay dilim hazırlık geliştirdi. nonradially odaklı retinal nöronların dendritik alanları patch-kelepçe ve görüntüleme teknikleri ile sinyal işleme çalışma izin kesilmiş değil.

Elektrofizyolojik Çalışmalar Yetişkin Fare Retina Yatay Dilimleri hazırlanması

Bu makalede, yetişkin fare kokleae immünohistokimya için 10 mm yuvarlak kapak fişleri koklear epitel parçaları yapıştırmak için bir hücre ve doku yapıştırıcı kullanımı ve kireçlenme gerektiren değiştirilmiş bir koklear yüzey hazırlama yöntemi sunar.

Yetişkin Farede Koklear Yüzey Hazırlama

Stria vascularis, endokoklear potansiyelin oluşumu için hayati öneme sahiptir. Burada, yetişkin fare stria vascularis'in tek çekirdekli dizileme veya immün boyama için diseksiyonu sunulmuştur.

Tek çekirdekli dizileme veya immün boyama için yetişkin fare stria vascularis'in diseksiyonu

Bu makale, tek çekirdekli RNA dizilimi amacıyla murin koku alma epitelinin diseksiyonu ve dissosiyasyonu için kolaylaştırılmış bir protokol sağlar.

Tek çekirdekli süspansiyonlar için fare koku alma epitelinin hızlı diseksiyonu ve ayrışması

Öğrenin fare vestibüler duyu epitelinin yarı sağlam hazırlanması yöntemini. Elektrofizyoloji ve iki foton mikroskopi ile saç hücrelerinin zar özelliklerini ve kalsiyum sinyallerini inceleyin.

Elektrofizyoloji ve yüksek çözünürlüklü İki foton Mikroskopi için Fare Vestibüler Duyu epiteli bir İzole Yarı sağlam Hazırlık

Daha fazla video keşfet