Germ benzeri hücreler içine Yenidoğan Fare Cilt Türetilmiş Kök Hücre Farklılaşma

Aşağıdaki deneyin genel amacı, somatik deri kaynaklı kök hücreleri kullanarak oosit benzeri hücreler oluşturmaktır. Bu, yeni doğmuş fare derisinden elde edilen temiz, farklılaşmamış kök hücreler kullanılarak gerçekleştirilir. İkinci bir adım olarak, kök hücreler farklılaşmaya hazırlanmak amacıyla dissosiye edilir.

Ardından, kök hücreler tanımlı farklılaşma ortamına ekilir. Germ hücresi oluşumunu indüklemek amacıyla, yarı nicel gerçek zamanlı PCR'a dayalı olarak oosit spesifik belirteçlerin ekspresyonunu gösteren sonuçlar elde edilir. Bu yöntem, reprodüktif biyoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

Germ hücresi, eSight oluşumu ve gelişimini incelemek için kapalı bir sistem sağlayarak, protokol için gerekli tüm besiyerleri kullanımdan iki ila üç saat önce hazırlanmalı ve deneyin gerçekleştirileceği hücre kültürü inkübatörüne kapakları gevşetilmiş şekilde yerleştirilmelidir. Burada kullanılan iki besiyeri; D-M-A-M-F 12'den oluşan, B 27 BFGF ve EGF ile desteklenmiş kök hücre besiyeri ile M1 99'dan oluşan, FSH LH B-S-A-I-T-S, sodyum piruvat, tuin ve EGF ile desteklenmiş germ hücresi diferansiyasyon besiyeridir. Yeni doğmuş fareden izole edilen kök hücreler.

Yavrular, ikinci ila dördüncü pasajlar arasında in vitro germ hücresi farklılaşması için kullanılır. Sitoloji benzeri hücrelerin veya OLC oluşumunun verimliliği, başlangıç kök hücrelerinin kalitesiyle doğrudan ilişkili olduğundan, farklılaştırmaya popülasyon temiz ve sağlıklı göründüğü anda, genellikle pasaj 2 civarında başlamak en iyisidir; farklılaştırmayı başlatmadan 48 saat önce kök hücreleri serolojik pipet kullanarak alt kültüre alın, kültür kabındaki tüm süspanse küresel hücre agregatlarını ve kullanılmış medyumu uzaklaştırıp 15 mililitrelik bir tüpe yerleştirin. Sadece süspanse haldeki küresel hücre agregatlarını toplamak ve kabın tabanına yapışmış, kendiliğinden farklılaşan hücreleri toplamamak önemlidir.

Hücreleri 500 ×g'de beş dakika boyunca santrifüjleyerek çöktürün, süpernatanı uzaklaştırın ve hücreleri 500 µL taze kök hücre medyumunda yeniden süspanse edin. 37 °C'ye ısıtın. Hücreleri kısmen ayrıştırmak için agregatları nazikçe pipetleyin.

Hücre canlılığını azaltacağı için hücreleri agresif bir şekilde pipetlemeyin. Kısmen ayrıştırılmış hücreleri, düşük yapışma özellikli 10 santimetrelik bir hücre kültürü kabında 9,5 mililitre taze ön ısıtılmış kök hücre besiyeri ile yıkayın. Hücreleri 48 saat boyunca 37 °C %5CO2 hücre kültürü inkübatörüne geri yerleştirin.

OLC diferansiyasyonu prosedürüne başlamak için, kök hücreleri kültür kabından almak üzere bir serolojik pipet kullanın ve hücreleri 15 mililitrelik bir tüpe aktarın. Yapışık olan hücreleri bırakın. Hücreleri 500 ×g'de beş dakika boyunca pelletleyin, süpernatantı atın ve hücreleri 500 µL steril PBS içinde yeniden süspande edin; hücreleri geniş ağızlı 1000 µL'lik bir uç kullanarak, 10 ila 20 hücreden daha büyük olmayan kümeler oluşturacak şekilde kuvvetlice pipetleyin.

Bu protokolün başarısı için, disosyasyon sırasında doğru düzeyin elde edildiğinden emin olmak amacıyla disosyasyon seviyesini düzenli olarak kontrol etmek kritik öneme sahiptir. Periyodik olarak az miktarda hücre alarak beyaz ışık mikroskobunda inceleyin ve agregasyon gösteren hücrelerin 10 ila 20 bireysel hücreden oluşan kümeler halinde olduğunu doğrulayın. Hücreleri aşırı disose etmeyin, çünkü bu durum hücre canlılığının azalmasına neden olacaktır.

Ardından, ayrıştırılmış hücrelere 9,5 milliliters PBS ekleyin ve hücre sayımı için bu hücre süspansiyonundan 15 microliters miktarını bir hemositometreye aktarın. Hücreleri 500 times G hızında beş dakika boyunca santrifüjleyerek çöktürün. Süpernatantı attıktan sonra, hücreleri 1,32 times 10 to the sixth cells per milliliter konsantrasyona ulaşacak şekilde diferansiyasyon medyumunda yeniden süspande edin.

Düz tabanlı 24 kuyucuklu süspansiyon plağının her bir kuyucuğuna 500 µL ekleyerek hücreleri ekin. 24 kuyucuklu plağı, 37 °C sıcaklıkta ve %5 CO2 içeren bir hücre kültürü inkübatöründe 48 saat boyunca bekletin. 48 saat sonra, her kuyucuktan 250 µL besiyeri çekin ve bunları uygun şekilde etiketlenmiş 1,5 mL'lik tüplere aktarın.

Her bir kuyucuğa 250 µL taze diferansiyasyon medyumu ekleyin; harcanmış medyumu 500 ×g'de beş dakika boyunca santrifüj edin, süpernatantı uzaklaştırın ve çöken hücreleri 50 µL taze diferansiyasyon medyumu içinde yeniden süspande edin. Hücre süspansiyonunu diferansiyasyon plakasındaki ilgili kültür kuyucuğuna geri aktarın. Diferansiyasyonun 12. gününe kadar her 48 saatte bir, medyumun yarısını aynı yöntemle değiştirin.

Erken evre farklılaşma sırasında, hücreler kültür kabının tabanına tutunacak ve yayılacaktır. Bu temsilci görüntü, farklılaşmanın 42 ila 72. saatlerindeki OCT four pozitif hücreleri göstermektedir. Farklılaşmamış kök hücrelerin bir markörü yeşil ile belirtilmiş, çekirdekler ise hirst ile karşıt boyanmış ve mavi ile gösterilmiştir.

Diferansiyasyon ilerledikçe, bazı hücre agregatlarının yeşil ile işaretlenmiş OCT four pozitif hücreler içerdiği ve bunların OCT four negatif hücrelerle çevrili olduğu görülecektir. Bu görüntü için ölçek çubuğu 100 mikrondur. Bu şekil, kültür yüzeyinden ayrılma sonrası folikül benzeri bir yapının beyaz ışık görüntüsünü göstermektedir; ölçek çubuğu 40 mikronu temsil etmektedir.

Kültür devam ettirildiğinde, LCS çapı yaklaşık 45 mikrona ulaşana kadar büyüyecektir. Bu görüntüdeki ölçek çubuğu 10 mikronu temsil etmektedir. Büyük OCT dört pozitif lcs'ler, ya hücrelerle çevrili halde ya da kültür içerisinde tekil olarak görülebilir.

Diğer hücrelerin yapışmadığı LCS'leri elde etmek için bu LCS'ler destek hücreleri ile toplanabilir veya tripsinize edilebilir. LCS'lerin doğal OO bölgeleriyle benzer transkriptler eksprese ettiğini doğrulamak amacıyla, LCS'ler toplanmış ve Z-P-C-S-C-P three CMOs, T four BMP 15 ve vasa gibi ortak OO bölgesi markerlarının ekspresyonu açısından test edilmiştir. Bu şekil, 10 yeni doğmuş fare oositine kıyasla 10 LCS'deki bu markerların transkript seviyelerini göstermektedir.

Sonuçlar, LCS'lerin cytes'lere göre daha az ZPC eksprese ettiğini göstermektedir. ZPC, CYTE'ye özgü zop lucidum membran yapısının bir bileşeni olduğundan, bu durum lcs'lerin kırılgan doğasını ve daha ince zita membranını açıklayabilir. Meiyoz SCP üç ekspresyonu, doğal cytes'lerle karşılaştırıldığında LCS'lerde daha yüksektir.

Buna karşın, farklı bir mayoz markörü olan CMOs daha düşük düzeyde eksprese edilmektedir. Ekspresyon düzeylerindeki bu tutarsızlık, LCS'nin mayozu tamamlamadaki mevcut başarısızlığını kısmen açıklayabilir. BMP 15 ve vasa gibi diğer markörler ise LCS ve O bölgeleri arasında anlamlı bir farklılık göstermemektedir.

Bu prosedür uygulanırken, başlangıç kök hücre popülasyonunun sağlığının başarısı için kritik olduğunun hatırlanması önemlidir.