Name: Atomik Kuvvet Mikroskobu kullanarak Yaşam Hücrelerinin Mekanik Özellikleri Ölçme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: Öğrenin yaşam hücrelerinin mekanik özelliklerini Atomik Kuvvet Mikroskobu ile ölçme yöntemini. AFM kuvvet spektroskopisi ve Hertz modeli kullanılarak elastik modül belirlenir ve hücre sertliğinin 2D haritası oluşturulur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar bu çalışmada kullanılan hücre hatları sağlamak için Pennsylvania Üniversitesi&#39;nden Dr Paul Janmey teşekkür ederim. QW da AFM teknikleri üzerine anlayışlı tartışmalar için JF Byfield ve Evan Anderson kabul.

1. Konsol ve Bahar Sabit kalibre <ol><li> Üreticinin talimatlarına göre AFM konsol içine yerleştirin. Bu, herhangi bir deney önce etanol ile konsol tutucu temizlenmesi gereklidir. Bu AFM ölçümleri sırasında kültüre bakteriyel kontaminasyon sınırı yardımcı olacaktır. </li><li> InvOLS (Ters Optik Kol Hassasiyet) kalibre edin. Bu parametre konsol sapma nanometre başına fotodiyot yanıt (Volt) miktarını açıklar. </li><li> Örnek sahneye temiz bir cam slayt yükleyin ve sonra üreticinin talimatlarına göre AFM baş yüklemek ve lazer ışını ve hizalama ayarlayın. Cam slayt AFM ucu meşgul. </li><li> Piezo geri ile, -2 bir fotodiyot okuma ayna yeniden düzenlemek V. +2 tetik nokta (maksimum fotodiyot tepki) ile bir kuvvet spektroskopi ölçüm yapın V. </li><li> Piezo geri ile, -2 bir fotodiyot okuma ayna yeniden düzenlemek V. fo gerçekleştirin+2 V. Not bir tetik nokta (maksimum fotodiyot tepki) ile rce spektroskopisi ölçümü: Burada gerilim değerleri Sığınma AFM özgüdür. Bu değer üretici tarafından sağlanan teknik özelliklere göre ayarlanmalıdır. Veri toplama işlemi tamamlandıktan sonra, kuvvet eğrisinin firma temas bölgesi yakınlaştırmak. V / nm olacak eğim, bulmak için bu bölgeye doğrusal bir uyum gerçekleştirin. Bu değerin karşılıklı konsol-fotodiyot topluluk optik hassasiyeti açıklar. </li><li> 0 ücretsiz bir sapma için ayna uyum sıfırlayın V. </li><li> Konsol yay sabiti kalibre edin. Bir ısı ayar yöntemi konsol 28 yay sabitesi olduğu da tespit etmek için kullanılır. </li><li> InvOLS ayarladıktan sonra ucu ve örnek arasında etkileşim olduğunu bu örnek aşamasından tarayıcı uzak yükseltmek. </li><li> Termal veri yakalama başlayın. Bu işlem sırasında, bir kirişin termal titreşim recorde olduğud. AFM yazılım böyle bir termal titreşim ve bir veri pencerede araziler bunun bir güç spektrumu analiz eder. </li><li> Veri toplama bir kaç saniye sonra, yay sabiti belirlemek için düşük frekanslı (temel rezonans) zirvesinde merkezli veri kesimi için bir uyum gerçekleştirin. </li></ol> 2. Örnek yükleme <ol><li> AFM sahnede Bulaşık Isıtıcı aksesuar yükleyin, zaten varsa değil. </li><li> 37 ° C&#39;ye kadar sıcaklık ayarlama ve istikrarlı bir termal dengeye ulaşmak için sistem 20 dakika boyunca bekleyin. </li><li> AFM sahnede kültür çanak yerleştirin ve çanak ısıtıcı ile sağlanan kelepçe kullanarak sabitleyin. Bu inkübatör çanak çıkarılması ve hücreler, travma önlemek için, sahne üzerine yerleştirerek arasındaki zamanı en aza indirmek için önemlidir. 30 dakika daha uzun bir ölçüm yapmak için, CO2 bağımsız ortamı, normal kültür ortamı değiştirmek için kullanılmalıdır. </li><li> T ucuna 37 ° C kültür ortamı küçük bir damla uygulayıno AFM konsol ve ucu sadece sıvı batık kadar AFM baş indirin. </li><li> Üst-view CCD kamera kullanarak, konsol (sıvı içinde uyum nedeniyle ortamın kırılma endeksi değişim, havada daha farklı olacaktır) üzerine lazer ışını yeniden hizalayın. </li><li> Kültür çanak temiz bir alan üzerinde AFM ucu meşgul. </li><li> Sıvı bir ortamda konsol hassasiyet için, yukarıda tarif edildiği gibi InvOLS kalibrasyonu yapın. </li></ol> Not: hücreler hidrojeller üzerinde kültive edildiğinde, a) Eğer InvOLS arasında kalibrasyon hücre kültürü ortamı ile doldurulmuş bir kültür kabı alt yüzeyine karşı önceden yapılmalıdır. Hücre örnekleri geçiş yaparken, özel dikkat konsol ile lazer ışını hizalama değişmez ödenecek vardır. b) InvOLS lazer hizalama bir değişiklik olduğu takdirde tekrar kalibre edilmesi gerekir. c) Ayrıca çeşitli kalibrasyon eğrileri, s değerinin ortalaması olarak InvOLS almak tavsiye edilirher kalibrasyon farklı bir InvOLS oluşturur ince. InvOLS farklılaĢma ortalama değeri ile karşılaştırarak, ancak, küçüktür. Örneğin, 100 kat 0.06 Yok sıvı / m sabit yaylı bir Bruker DNP-10 konsol kalibre sadece 0.5 nm / standart sapma ile, 66.3 nm / V ortalama InvOLS değer üreten V. 3. Hücre Girinti Kuvvet Eğrileri Toplama <ol><li> Girinti için bir hücre seçin. Optik mikroskop yardımı ile, ucu, peri-çekirdek bölgesinde yer alır, böylece hücrenin üstündeki konsol konumlandırmak için sahne hareket eder. Konsol konumunun hassas ayarı X ve Y tarayıcılar için uzaklıklar uygulayarak gerçekleştirilebilir. Not: AFM konsol bir hedef hücre seçmek için örnek sahne hareket ederken numune yüzeyinden geri gerekir. Örnek yüzeyi düz olmayabilir çünkü bu, örnek içine vurma gelen konsol korur. </li><li> Spektroskopisi modu Kuvvet geçin. Girinti ayarlayınhidrodinamik etkileri önlemek için yeterince düşük 1-10 mm / sn aralığında hızı. </li><li> Hücrelere zarar vermemek için azami girinti kuvvetini sınırlandırır sapma tetik nokta, ayarlayın. Sapma sinyali herhangi bir sürüklenme için düzeltecektir Bağıl tetikleme seçeneği seçin. 2 nN en fazla gücü en örnekleri için iyi bir başlangıç ​​noktasıdır. Bu değer, ancak, Örnek sertlik göre ayarlanmalıdır. Yumuşak örnekleri için daha düşük bir değere örnek aşırı girinti önlemek için kullanılmalıdır. Sert örnekleri için yüksek bir değer ölçülebilir girinti oluşturmak için kullanılmalıdır. </li><li> Ucu tam kuvvet ölçümleri arasındaki hücre ayrılmış olacak sağlamak için yeterince büyük kuvvet mesafeyi ayarlayın. Genellikle, kuvvet mesafe 5 mikron olarak belirlenmiştir. </li><li> Tek bir güç eğrisi almak için AFM komut. </li><li> Her hücrenin peri-çekirdek bölgesinde farklı yerlerde en az üç kuvvet eğrileri toplayın. Birden fazla çekmek için yararlı olmakla birlikteçok fazla güç eğrileri alarak güvenilir istatistiki veriler için her hücre üzerinde eğriler, AFM prob alacaklar strese hücre sertlik değişikliklere yol açabilir. </li><li> Veri toplama tamamlandığında, ucu geri ve belirli bir örnek koşul altında hücre sertliği üzerinde iyi istatistiki veriler için gerektiği kadar tekrar kadar hücreler için 3.1-3.6 adımları. Genellikle, 30 hücreleri her bir durum için ölçülür. </li></ol> Tek bir hücre içinde sertlik dağılımını karakterize için, zorla harita modu uygulanır. Kuvvet-Harita modunda, ilgi bölgeye dahil etmek için bir tarama boyutunu ayarlamak; uygun bir çözünürlük ayarlamak; tek bir güç eğrileri için seçilen gibi girinti parametrelerini ayarlamak, AFM sonra tanımlanan örnek alan üzerinde raster ve tek bir güç eğrileri almak Örnek bölgedeki her bir pikselde. 4. Veri Analizi Kaydedilen kuvvet eğrileri hücre sertliği hesaplamak için özel bir MATLAB prosedürü kullanılarak analiz edilmektedir. Aşağıdaki MATLAB prosedürün kısa bir açıklaması: <ol><li> . MATLAB programı temas noktası Lin ve arkadaşları tarafından yayınlanan bir yöntemi kabul bir algoritma 29 kullanılarak (bkz. Şekil 1) z0 ve d0 koordine tanımlar: </li><li> Kadar ayarlamak için, kuvvet eğrisi her veri noktası için, ilgi noktasının solunda verilerin doğrusal bir uyum gerçekleştirmek ve Hertz modeli doğru (temas başlangıç ​​noktası olarak seçilen noktasını kullanarak) için uygun maksimum girinti (200-300 nm önerilir). </li><li> Her nokta için, her iki uyan göreli RMS hata hesaplamak ve bu değerleri toplamı. </li><li> Minimum toplam montaj hatası elde ediyor Nokta ilk noktası olarak seçilir. Not: Hesaplama zaman yerine doğrusal tüm güç eğrisi tarama daha altın bölüm arama uygulayarak azaltılabilir. </li><li> Örnek deformasyon δ ve kuvvet F girinti olarak hesaplanır: <img alt="Denklem 1"fo: içerik width = &quot;3.073in&quot; fo: src = &quot;/ files/ftp_upload/50497/50497eq1highres.jpg&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/50497/50497eq1.jpg&quot; /&gt; </li><li> En küçük kareler uydurma vs F uyacak şekilde uygulanır sonrası temas bölgesinde δ veri, z ≥ z 0, en Young modülü, hücrenin E ayıklamak için Hertz modeli için: <img alt="Denklem 2" fo:content-width="2.773in" fo:src="/files/ftp_upload/50497/50497eq2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50497/50497eq2.jpg" /> , V Poisson oranıdır. Not: δ numune kalınlığının (hücre yükseklik)% 10&#39;dan fazla olduğunda, ölçülen hücre sertliği tabaka sertliği ile etkilenir. Peri-nükleer bölgenin kalınlığı genellikle birkaç mikrometre civarındadır. Bu nedenle, F-δ eğrisinin sadece ilk 200-300 nm Hertz modeline uygundur. </li></ol>

<ol><li>Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+cells+feel+and+respond+to+the+stiffness+of+their+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate.</a> Science. 310, 1139-1143 (2005).</li>
<li>Wagner, O. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Softness%2C+strength+and+self-repair+in+intermediate+filament+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Softness, strength and self-repair in intermediate filament networks.</a> Exp. Cell Res. 313, 2228-2235 (2007).</li>
<li>Wang, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+behavior+in+living+cells+consistent+with+the+tensegrity+model%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Mechanical behavior in living cells consistent with the tensegrity model.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 7765-7770 (2001).</li>
<li>Wang, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+prestress.+I.+Stiffness+and+prestress+are+closely+associated+in+adherent+contractile+cells%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Cell prestress. I. Stiffness and prestress are closely associated in adherent contractile cells.</a> American Journal of Physiology. Cell Physiology. 282, 606-616 (2002).</li>
<li>Kasza, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Filamin+A+is+essential+for+active+cell+stiffening+but+not+passive+stiffening+under+external+force%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Filamin A is essential for active cell stiffening but not passive stiffening under external force.</a> Biophysical Journal. 96, 4326-4335 (2009).</li>
<li>Elson, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+mechanics+as+an+indicator+of+cytoskeletal+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biophysics+and+Biophysical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Cellular mechanics as an indicator of cytoskeletal structure and function.</a> Annual Review of Biophysics and Biophysical Chemistry. 17, 397-430 (1988).</li>
<li>Schafer, A., Radmacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+myosin+II+activity+on+stiffness+of+fibroblast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Influence of myosin II activity on stiffness of fibroblast cells.</a> Acta Biomaterialia. 1, 273-280 (2005).</li>
<li>Guck, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+deformability+as+an+inherent+cell+marker+for+testing+malignant+transformation+and+metastatic+competence%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Optical deformability as an inherent cell marker for testing malignant transformation and metastatic competence.</a> Biophysical Journal. 88, 3689-3698 (2005).</li>
<li>Cross, S. E., Jin, Y. S., Rao, J., Gimzewski, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanomechanical+analysis+of+cells+from+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Nanomechanical analysis of cells from cancer patients.</a> Nature Nanotechnology. 2, 780-783 (2007).</li>
<li>Plodinec, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nanomechanical+signature+of+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">The nanomechanical signature of breast cancer.</a> Nature Nanotechnology. 7, 757-765 (2012).</li>
<li>Rotsch, C., Radmacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug-induced+changes+of+cytoskeletal+structure+and+mechanics+in+fibroblasts%3A+an+atomic+force+microscopy+study%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Drug-induced changes of cytoskeletal structure and mechanics in fibroblasts: an atomic force microscopy study.</a> Biophysical Journal. 78 (00), 520-535 (2000).</li>
<li>Cross, S. E., Jin, Y. S., Lu, Q. Y., Rao, J., Gimzewski, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green+tea+extract+selectively+targets+nanomechanics+of+live+metastatic+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Green tea extract selectively targets nanomechanics of live metastatic cancer cells.</a> Nanotechnology. 22, 215101(2011).</li>
<li>Hoffman, B. D., Crocker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+mechanics%3A+dissecting+the+physical+responses+of+cells+to+force%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Cell mechanics: dissecting the physical responses of cells to force.</a> Annual Review of Biomedical Engineering. 11, 259-288 (2009).</li>
<li>Hoffman, B. D., Massiera, G., Van Citters, K. M., Crocker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+consensus+mechanics+of+cultured+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The consensus mechanics of cultured mammalian cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 10259-10264 (2006).</li>
<li>Lau, A. W., Hoffman, B. D., Davies, A., Crocker, J. C., Lubensky, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microrheology%2C+stress+fluctuations%2C+and+active+behavior+of+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+Letters%22%5BJournal%5D)">Microrheology, stress fluctuations, and active behavior of living cells.</a> Physical Review Letters. 91, 198101(1981).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microrheology+probes+length+scale+dependent+rheology%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+Letters%22%5BJournal%5D)">Microrheology probes length scale dependent rheology.</a> Physical Review Letters. 96, 118104(2006).</li>
<li>Deng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+slow+dynamics+of+the+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Fast and slow dynamics of the cytoskeleton.</a> Nature Materials. 5, 636-640 (2006).</li>
<li>Oh, M. J., Kuhr, F., Byfield, F., Levitan, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micropipette+Aspiration+of+Substrate-attached+Cells+to+Estimate+Cell+Stiffness%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Micropipette Aspiration of Substrate-attached Cells to Estimate Cell Stiffness.</a> J. Vis. Exp. (67), e3886(2012).</li>
<li>Hochmuth, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micropipette+aspiration+of+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanics%22%5BJournal%5D)">Micropipette aspiration of living cells.</a> Journal of Biomechanics. 33, 15-22 (2000).</li>
<li>Levental, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+indentation+device+for+measuring+micrometer-scale+tissue+stiffness%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys-Condens.+Mat%22%5BJournal%5D)">A simple indentation device for measuring micrometer-scale tissue stiffness.</a> J. Phys-Condens. Mat. 22, (2010).</li>
<li>Mahaffy, R. E., Park, S., Gerde, E., Kas, J., Shih, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+the+viscoelastic+properties+of+thin+regions+of+fibroblasts+using+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of the viscoelastic properties of thin regions of fibroblasts using atomic force microscopy.</a> Biophysical Journal. 86, 1777-1793 (2004).</li>
<li>Radmacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+the+elastic+properties+of+biological+samples+with+the+AFM%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Engineering+in+Medicine+and+Biology+Magazine%3A+The+Quarterly+Magazine+of+the+Engineering+in+Medicine+%26+Biology+Society%22%5BJournal%5D)">Measuring the elastic properties of biological samples with the AFM.</a> IEEE Engineering in Medicine and Biology Magazine: The Quarterly Magazine of the Engineering in Medicine & Biology Society. 16, 47-57 (1997).</li>
<li>Crocker, J. C., Hoffman, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple-particle+tracking+and+two-point+microrheology+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Multiple-particle tracking and two-point microrheology in cells.</a> Methods in Cell Biology. 83, 141-178 (2007).</li>
<li>Liu, F., Tschumperlin, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-mechanical+characterization+of+lung+tissue+using+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Micro-mechanical characterization of lung tissue using atomic force microscopy.</a> J. Vis. Exp. (54), e2911(2011).</li>
<li>Solon, J., Levental, I., Sengupta, K., Georges, P. C., Janmey, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+adaptation+and+stiffness+matching+to+soft+elastic+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Fibroblast adaptation and stiffness matching to soft elastic substrates.</a> Biophysical Journal. 93, 4453-4461 (2007).</li>
<li>Wu, H. W., Kuhn, T., Moy, V. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+properties+of+l929+cells+measured+by+atomic+force+microscopy%3A+Effects+of+anticytoskeletal+drugs+and+membrane+crosslinking%5BTitle%5D)+AND+%22Scanning%22%5BJournal%5D)">Mechanical properties of l929 cells measured by atomic force microscopy: Effects of anticytoskeletal drugs and membrane crosslinking.</a> Scanning. 20, 389-397 (1998).</li>
<li>Radmacher, M., Fritz, M., Kacher, C. M., Cleveland, J. P., Hansma, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+the+viscoelastic+properties+of+human+platelets+with+the+atomic+force+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Measuring the viscoelastic properties of human platelets with the atomic force microscope.</a> Biophysical Journal. 70, 556-567 (1996).</li>
<li>Levy, R., Maaloum, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+the+spring+constant+of+atomic+force+microscope+cantilevers%3A+thermal+fluctuations+and+other+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Measuring the spring constant of atomic force microscope cantilevers: thermal fluctuations and other methods.</a> Nanotechnology. 13, 33-37 (2002).</li>
<li>Lin, D. C., Dimitriadis, E. K., Horkay, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+strategies+for+automated+AFM+force+curve+analysis--I.+Non-adhesive+indentation+of+soft%2C+inhomogeneous+materials%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Robust strategies for automated AFM force curve analysis--I. Non-adhesive indentation of soft, inhomogeneous materials.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 129, 430-440 (2007).</li>
<li>Davis, J. T., Wen, Q., Janmey, P. A., Otteson, D. C., Foster, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muller+cell+expression+of+genes+implicated+in+proliferative+vitreoretinopathy+is+influenced+by+substrate+elastic+modulus%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Muller cell expression of genes implicated in proliferative vitreoretinopathy is influenced by substrate elastic modulus.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53, 3014-3019 (2012).</li>
<li>Engler, A. J., Rehfeldt, F., Sen, S., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtissue+elasticity%3A+Measurements+by+atomic+force+microscopy+and+its+influence+on+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Method+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Microtissue elasticity: Measurements by atomic force microscopy and its influence on cell differentiation.</a> Method Cell Biol. 83, 521-545 (2007).</li>
<li>Lele, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tools+to+study+cell+mechanics+and+mechanotransduction%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Tools to study cell mechanics and mechanotransduction.</a> Methods in Cell Biology. 83 (07), 443-472 (2007).</li>
<li>A-Hassan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relative+microelastic+mapping+of+living+cells+by+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Relative microelastic mapping of living cells by atomic force microscopy.</a> Biophysical Journal. 74, 1564-1578 (1998).</li>
<li>Costa, K. D., Sim, A. J., Yin, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-Hertzian+approach+to+analyzing+mechanical+properties+of+endothelial+cells+probed+by+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Non-Hertzian approach to analyzing mechanical properties of endothelial cells probed by atomic force microscopy.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 128, 176-184 (2006).</li>
<li>Xiong, Y., Lee, A. C., Suter, D. M., Lee, G. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topography+and+nanomechanics+of+live+neuronal+growth+cones+analyzed+by+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Topography and nanomechanics of live neuronal growth cones analyzed by atomic force microscopy.</a> Biophysical Journal. 96, 5060-5072 (2009).</li>
<li>Byfield, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absence+of+filamin+A+prevents+cells+from+responding+to+stiffness+gradients+on+gels+coated+with+collagen+but+not+fibronectin%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Absence of filamin A prevents cells from responding to stiffness gradients on gels coated with collagen but not fibronectin.</a> Biophysical Journal. 96, 5095-5102 (2009).</li>
<li>Cross, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AFM-based+analysis+of+human+metastatic+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">AFM-based analysis of human metastatic cancer cells.</a> Nanotechnology. 19, 384003(2008).</li>
<li>Storm, C., Pastore, J. J., MacKintosh, F. C., Lubensky, T. C., Janmey, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonlinear+elasticity+in+biological+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Nonlinear elasticity in biological gels.</a> Nature. 435, 191-194 (2005).</li>
<li>Wen, Q., Janmey, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymer+physics+of+the+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Solid+State+%26+Materials+Science%22%5BJournal%5D)">Polymer physics of the cytoskeleton.</a> Current Opinion in Solid State & Materials Science. 15, 177-182 (2011).</li>
<li>Dimitriadis, E. K., Horkay, F., Maresca, J., Kachar, B., Chadwick, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+elastic+moduli+of+thin+layers+of+soft+material+using+the+atomic+force+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Determination of elastic moduli of thin layers of soft material using the atomic force microscope.</a> Biophysical Journal. 82 (02), 2798-2810 (2002).</li>
<li>Trache, A., Lim, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+cell+response+to+mechanical+stimulation+studied+by+integrated+optical+and+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Live cell response to mechanical stimulation studied by integrated optical and atomic force microscopy.</a> J. Vis. Exp. (44), e2072(2010).</li>
<li>Lim, S. M., Kreipe, B. A., Trzeciakowski, J., Dangott, L., Trache, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+effect+on+RhoA+signaling+modulation+in+vascular+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix effect on RhoA signaling modulation in vascular smooth muscle cells.</a> Exp. Cell Res. 316, 2833-2848 (2010).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

AFM girinti yöntemi canlı hücrelerin mekanik özelliklerini karakterize etmek için avantajları vardır. Piconewton düzeyinde 32 kuvvetleri ölçebilirsiniz manyetik büküm sitometri ve optik cımbız, daha az hassas olsa, AFM kuvvet aralığı ile karşılaştırılabilir pico-Newton onlarca nano-Newton yüzlerce kadar örnekleri, gelen direnç kuvveti algılayabilir Mikropipet 19 kullanarak hücrelere uygulanabilir. Kuvvet Bu dizi hücre 19 her türlü ölçülebilir deformasyonlar oluşturmak için ihtiyaçlarına ...

Tek tek hücrelerin kendi çevre hücre dışı matris mekanik özellikleri, özellikle sertlik, (ECM), hücre büyümesi, motilite, bölünmesi, farklılaşma ve doku homeostazında de dahil olmak üzere birçok biyolojik süreçleri için kritiktir. 1 Bu hücre mekanik sertliği esas olarak kararlı olduğu kanıtlanmıştır Aktin ve arafilamentlerin in vitro şebekelerinde üzerinde mekanik testlerden iskeleti, aktin ve ara filamentler ve onlarla ilişkili diğer proteinlerden, özellikle ağ. 2 Sonuç hücre mekanik iskelet yapısı ve ön-stres büyük ölçüde bağlı olduğunu düşündürmektedir hücre iskeleti. canlı hücrelerin 3-5 Sertlik sonra iskelet yapısı 6, miyozin aktivite 7 ve diğer birçok hücresel süreçleri değerlendirmek için bir dizin olarak kabul edilir. Daha da önemlisi, hücre mekanik özelliklerinde değişiklikler de genellikle yakından ilişkili olduğu bulunmuşturtümör oluşumu ve metastaz gibi çeşitli hastalık koşulları ile ated 8-10 İzleme canlı hücrelerin mekanik sertliği dolayısıyla hücre fizyolojisi izlemek için yeni bir yol sağlayabilir,. tespit etmek ve hastalıkları 8 teşhis etmek,. ve ilaç tedavilerinin etkinliğini değerlendirmek için 11 , 12 Parçacık izleme microrheology, 13-16 manyetik büküm sitometri, 17 mikropipet aspirasyon 18,19 ve microindentation 20-22 dahil olmak üzere birden çok yöntem hücrelerin esnekliğini ölçmek için geliştirilmiştir. Parçacık izleme microrheology hücre iskeleti içindeki hücreler ya da indirgeme işaretleri enjekte mikrondan küçük floresan parçacıkların birinin termal vibrasyonlar izler. Hücreler 23 elastik ve yapışkan özelliklerini salınım-kayıp teoremi kullanılarak ölçülen partikül değiştirmeler hesaplanır. 14,23 Bu yöntem sağlar: yerel eş zamanlı ölçümleriniBir hücrede farklı yerlerde yüksek uzaysal çözünürlüğü ile mekanik özellikleri. Bununla birlikte, parçacıkların hücre içine floresan enjekte hücresel işlevde değişikliği, hücre iskeletinin yapısı, ve bu nedenle hücre mekanik yol açabilir. Mikropipet aspirasyon yöntemi pipet içine hücre zarı küçük bir parça emmek için 1 ila 5 mikron arasında değişen çaplı bir mikropipet negatif basınç uygular. Hücre sertliği uygulanan negatif basınç, hücre membranı ve deformasyonu. 18 Bu yöntem ile hesaplanır, ancak, hücre boyunca sertliğinin heterojen dağılımı tespit edemez. Manyetik büküm sitometri (MTC) hücre zarı bağlı süper paramanyetik boncuk tork üretmek için manyetik alan uygulanır. 17 Hücre sertliği uygulanan tork ve hücre zarının büküm deformasyon arasındaki ilişki bu yöntemde elde edilir. Bu MTC yöntemde manyetik boncuk yerini kontrol etmek zordur, ve aynı zamanda bir challengiyüksek çözünürlüklü büküm deformasyon karakterize etmek ng. Microindentation hücre içine yumruk iyi tanımlanmış geometri ile bir delici geçerlidir. Girinti kuvvet ve hücrelerde ortaya çıkan girinti genellikle Hertz modelinin tahmin izleyin. Hücre Young modülü Hertz modeli onları takarak kuvvet girinti eğrileri hesaplanabilir. Bu yöntem yaygın olarak temas noktası belirleme, Hertz modelin uygulanabilirliği ve fiziksel olarak hücrelere zarar potansiyeline belirsizlik olarak sınırlamalar rağmen doku ve hücrelerin mekanik özelliklerini test etmek için uygulanmıştır. Microindentaion 20 için birçok cihaz arasında, bir atomik kuvvet mikroskobu (AFM), ticari olarak mevcuttur ve yaygın olarak canlı hücreler ve dokuların 21,24-27 mekanik özelliklerini karakterize etmek için uygulanmıştır. Bu kağıt hücre mekaniği karakterize bir Sığınma MFP3D-Bio AFM kullanarak prosedürü göstermektedir. AFM değil üzerindely hücrelerin yüksek çözünürlüklü topografya sağlar ama aynı zamanda yaygın doku hücrelerinin mekanik özelliklerini karakterize etmek için uygulanmıştır. AFM girinti çalışma prensibi Şekil 1 &#39;de gösterilmiştir. AFM konsol üzerinde birkaç mikrometre hücre yaklaşımlar, hücre ile temas, girintiler hücre konsol sapma önceden seçilmiş bir ayar noktasına ulaşacak şekilde ve uzak hücreden çeker. Şekil 1 &#39;de gösterildiği gibi, bu süreç sırasında dirsekli bükülme konumu bir fonksiyonu olarak kaydedilmektedir. Hücre ile temas etmeden önce, konsol belirgin bir sapma olmadan ortamda hareket eder. Hücre, konsol virajlı ve sapma sinyali artar girinti zaman. Çıkma kendi saptırma hücreye tatbik edilen kuvvet ile orantılıdır, böylece elastik kirişler olarak modellenmiştir. En fazla konsol sapma ayarlayarak, örnek uygulanan kuvvetin maksimum büyüklüğü d önlemek için sınırlıdırhücrelere ermeden. Hücre içine ucu girintiler, hücre sertliği ayıklamak için hertz modele uygundur Şekil 1, c noktadan noktaya b kuvvet eğrisinin kısmı. <img src="/files/ftp_upload/50497/50497fig1.jpg" alt="Şekil 1" fo:content-width="4.75in" fo:src="/files/ftp_upload/50497/50497fig1highres.jpg"/> Şekil 1. AFM microindentation ve kuvvet eğrisinin yorumlanması İllüstrasyon. Üst paneli piezo tarayıcı tarafından tahrik AFM konsol hareketini gösterir. Konsol, z ve konsol sapma sinyalini d dikey konumu işlemi sırasında kaydedilir. Konsol noktası, hücrenin üstündeki birkaç mikrometre başlar. Hücre yaklaşırken iken uç hücre ile temas alanına, b ulaşıncaya kadar, örnek girinti δ sıfır olarak kalır. Arsa nokta b koordinatları kritik değerlerdirveri analizi için, (z 0, d 0&gt;) ile gösterilir. B c, hücre içine konsol girintiler konsol sapma hedeflenen maksimum girinti gücü ve sürekli konsol bahar arasındaki oran olarak ayarlanmış bir ayar noktası, ulaşana kadar. Sapma sinyali önceden ayarlanmış maksimum değeri ulaştığında, konsol sonra, hücreden genellikle uç-örnek yapışma nedeniyle aşağıya çekilebilir noktası d, çekilmiş hücre ve döner e onun ilk konuma ayırır edilir. Sağ panel girinti ve kaydedilen z ve d sinyal arasındaki ilişkiyi göstermektedir. Sol alt panelde bulunan yay sabiti m / 0.07N olarak ölçüldüğü bir temsilcisi kuvveti eğrisi, bir konsol en fazla girinti, bir çizimidir fazla girinti kuvvet uygulanır ve böylece 17 nm olarak ayarlanmıştır Örnek 1.2 nN olduğunu. Girinti sırasında önemli yerlerde işaretlenmiştir.

<table><tbody><tr><td>Atomik Kuvvet Mikroskobu </td><td>İltica Araştırması</td><td>MFP3D-BIO</td><td></td></tr></tbody></table>

atomik kuvvet mikroskobu kullanarak yaşam hücrelerinin mekanik Özellikleri Ölçme

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Hücre ve hücre dışı matriks (ECM) mekanik özellikleri kök hücre farklılaşması, tümör oluşumu ve yara iyileşmesi gibi birçok biyolojik süreçlerde önemli rol oynar. Hücreler ve ECM sertliği değişiklikler genellikle hücre fizyolojisi veya doku hastalıklarında değişim işaretleri vardır. Bu nedenle, hücre sertlik hücre kültürlerinin durumunu değerlendirmek için bir endekstir. Hücre ve dokuların sertlik ölçmek için uygulanan yöntemler çok sayıda arasında, bir atomik kuvvet mikroskobu (AFM) kullanarak mikro girinti güvenilir canlı hücrelerin sertliği ölçmek için bir yol sağlar. Bu yöntem, yaygın olarak metal yüzeyler yumuşak biyolojik dokular ve hücreler arasında değişen çeşitli malzemeler için mikro ölçekli sertliği karakterize etmek için uygulanmıştır. Bu yöntemin temel prensibi seçilen bir geometri AFM ucu olan bir hücre girinti ve AFM dirsekli bükme ile uygulanan kuvvet ölçmektir. Hertz moduna kuvvet girinti eğrisi takılmasıilgili uç geometrisi l malzeme sertliği kantitatif ölçümler verebilir. Bu kağıt AFM kullanarak canlı hücrelerin sertliği karakterize etmek için prosedürü göstermektedir. Bir MATLAB rutin kullanarak AFM kalibrasyon süreci, kuvvet eğrisi satın alma ve veri analizi de dahil olmak üzere önemli adımlar gösterilmektedir. Bu yöntemin sınırlamaları da tartışılmıştır.

Şekil 2a sırasıyla plastik yüzey, Young modülü 3000 Pa ve 17.000 Pa poliakrilamid jel, kültüre 3T3 fibroblast alınan üç temsilcisi güç eğrilerini gösterir. Dikkatlice eğrileri temas noktaları tespit edilmesinden sonra, hücre deformasyon fonksiyonu olarak girinti kuvvet Şekil 2b&#39;de çizilir. 0.3 nN, 3 kPa poliakrilamid jel üzerinde kültüre bir hücreye bir piramit şekli ucu girintiler 3 mikrometre daha küçük büyüklükte bir kuvvet altında. Buna karşılık, bir güç fazla 1.6 nN aynı ucunu ...

Bu kağıt bir atomik kuvvet mikroskobu (AFM) kullanarak microindentation ile canlı hücrelerin mekanik özelliklerini karakterize etmek için bir protokol göstermektedir.

Atomik Kuvvet Mikroskobu kullanarak Yaşam Hücrelerinin Mekanik Özellikleri Ölçme

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, yaşayan hücrelerin elastik modülünü bir atomik kuvvet mikroskobu kullanarak ölçmektir. Bu, öncelikle hücre üzerindeki çeşitli konumlarda FM kuvvet spektroskopi ölçümleri gerçekleştirilerek sağlanır. İkinci adım olarak, AFM ucunun hücreyle ilk temas kurduğu noktayı belirlemek için her bir kuvvet-mesafe eğrisi analiz edilir.Ardından, temas noktasından başlayarak, girintileme verilerinin ilk 200 ila 300 nanometresi hertz modeline uydurulur. Elastik modülü elde etmek için sonuçlar, her bir pikselin tek bir kuvvet-mesafe eğrisini temsil ettiği kuvvet haritalama modu kullanılarak elde edilen hücre sertliğinin 2B haritasını sunar. Prosedürü laboratuvarımdan lisansüstü öğrencisi Guen Thomas gösterecektir. Bu prosedüre başlamak için, kantilever tutucuyu %70 etanol ile temizleyin ve kurumasını bekleyin.Ardından, üretici talimatlarına uygun olarak AFM'ye bir bru DNP 10 konsantre yükleyin. Sonrasında, ters optik kaldıraç hassasiyetini kalibre edin. Bu parametre, konsantre sapmasının nanometre başına volt cinsinden fotodiyot yanıt miktarını tanımlar.Bunu gerçekleştirmek için öncelikle temiz bir lamı numune tablasına yerleştirin. Bir AFM başlığı takın ve lazer ışını ile hizalamayı üretici talimatlarına göre ayarlayın. Hizalama tamamlandığında, P8O geri çekilmiş durumdayken AFM ucunu cam lamla temas ettirin.Aynayı, fotodiyot okuması negatif iki volt olacak şekilde yeniden hizalayın. Ardından, maksimum fotodiyot yanıtı veya tetikleme noktası pozitif iki volt olacak şekilde bir kuvvet spektroskopisi ölçümü gerçekleştirin. Veri toplama işlemi tamamlandıktan sonra, kuvvet eğrisinin sıkı temas bölgesine yakınlaşın ve bu bölgeye doğrusal bir uyum uygulayın.Volt başına nanometre cinsinden eğimi bulmak için, ardından ayna hizalamasını sıfır voltluk bir serbest sapmaya sıfırlayın. Sonrasında, Levy ve Malam tarafından tanımlanan termal ayar yöntemiyle kantilever yay sabitini kalibre edin. Başlamak için, uç ile numune arasında hiçbir etkileşim olmayacak şekilde tarayıcıyı numune tablasından uzaklaştırın.Ardından, konsol kirişin termal titreşimini kaydederek termal verileri yakalayın. AFM yazılımı, bu tür bir termal titreşimin güç spektrumunu analiz eder ve bunu bir veri penceresinde grafikler. Daha sonra, yay sabitini belirlemek için temel rezonans piki olarak da bilinen en düşük frekans merkezli veri segmentine bir uydurma işlemi uygulayın.Kültür plakaları için a FM hazırlamak amacıyla, a FM tablasına bir kap ısıtıcı aksesuarı takın ve sıcaklığı 37 °C olarak ayarlayın. Sistemin stabil bir termal dengeye ulaşması için 20 dakika bekleyin. Ön ısıtma tamamlandığında, a FM tablasına bir kültür kabı yerleştirin ve 30 dakikadan uzun sürecek ölçümler için kabı ısıtıcı ile birlikte verilen klips yardımıyla sabitleyin; normal kültür besiyerinin yerine karbondioksit bağımsız besiyeri kullanılmalıdır.Ardından, AFM konsolunun ucuna 37 °C kültür ortamından küçük bir damla uygulayın ve uç sıvının içine hafifçe gömülene kadar AFM başlığını indirin. Üstten görünümlü bir CCD kamera kullanarak lazer ışınını konsol üzerinde yeniden hizalayın. Ortamın kırılma indisindeki değişim nedeniyle sıvı içerisindeki hizalama, havadakinden farklı olacaktır.Hizalama tamamlandıktan sonra, AFM ucunu kültür kabının hücre içermeyen bir alanına yerleştirin ve sıvı ortamda ters optik kol hassasiyetinin kalibrasyonunu gerçekleştirin. Hücrelerin mekanik özellik ölçümlerine başlamak için, bir optik mikroskop yardımıyla kantilever ucunu bir hücrenin perle göz bölgesinin üzerine konumlandırın. Kantilever konumunun hassas ayarları, X ve Y tarayıcılarına ofset değerleri uygulanarak gerçekleştirilir.Ardından FM'yi dört spektroskopi moduna geçirin ve hidrodinamik etkileri önlemek adına yeterince düşük bir değer olan saniyede beş mikrometre indentation hızını ayarlayın. Sonra, sapma tetikleme noktasını iki nano newton olarak belirleyin. Hücrelerin zarar görmesini önlemek için bu değeri numune sertliğine göre ayarlayın.Ek olarak, sapma sinyalindeki herhangi bir kaymayı düzeltecek olan göreceli tetikleme seçeneğini seçin. Ardından, kuvvet ölçümleri arasında ucun hücreden tamamen ayrılmasını sağlamak için kuvvet mesafesini beş mikrometreye ayarlayın. Her bir koşul için, en az 30 hücrenin çekirdek bölgesindeki farklı konumlardan üç kuvvet eğrisi toplayın.Her hücreden birden fazla eğri almak faydalı olsa da, güvenilir istatistiksel veriler için çok fazla eğri almak, AFM probunun neden olduğu stres sebebiyle hücre sertliğinde değişikliklere yol açabilir. Kuvvet haritalama modu kullanarak tek bir hücredeki mekanik özelliklerin dağılımını daha detaylı karakterize edin.Kuvvet haritalama modunda, tarama boyutunu 30 micrometers, çözünürlüğü 32 by 32 olarak ayarlayın; batma parametreleri ise tekil kuvvet eğrileri için seçilenlerle aynıdır. A FM, ardından örnek bölgesindeki her pikselde tekil kuvvet eğrileri çıkaracak ve tüm bölgenin bir sertlik haritasını sağlayacaktır. Sonrasında, hücre sertliğini hesaplamak için kaydedilen kuvvet eğrilerini MATLAB kullanarak analiz edin.Lynette Al tarafından ilk kez yayınlanan ve Matlab kullanarak her noktadan hem doğrusal hem de hertz uyumu hesaplayan bir algoritma benimseyerek başlayın. Her iki uyumun göreli RMS hatasını hesaplayın ve bu değerleri her noktada toplayın. Minimum toplam uyum hatasına ulaşan nokta, ilk temas noktası olarak seçilir; bu noktanın belirlenmesi, hücrelerin Young modülünün doğru ölçümü için kritik öneme sahiptir.Ardından, numune deformasyon deltasını hesaplayın. Hücre teması öncesinde, Z'nin Z sıfırdan küçük olduğu durumda deformasyonun sıfıra eşit olduğu; temas noktası sonrası ise cantilever sapması D ile toplam mesafe Z arasındaki farka eşit olduğu aşağıdaki denklemleri kullanın. Daha sonra, hücre teması öncesinde Z'nin Z sıfırdan küçük olduğu durumda kuvvetin sıfıra eşit olduğu; temas noktası sonrası ise cantilever'ın yay sabiti K ile temas noktası sonrası cantilever sapmasının çarpımına eşit olduğu aşağıdaki denklemleri kullanarak batırma kuvveti F'yi hesaplayın.Ardından, kullanılan uç ucun şekline dayanarak hücrenin Young modülünü belirlemek amacıyla, Elise kare uyumu, Hertz modelinin temas sonrası bölgesindeki örnek deformasyon ile bastırma kuvveti verilerine uygulanır. Burada, üç farklı yüzeyde kültüre edilmiş üç farklı fibroblast hücreden alınan temsili kuvvet eğrileri yer almaktadır. Burada görebileceğiniz üzere, farklı yüzeyler hücre sitoiskeletinin sertliğini önemli ölçüde etkileyebilmektedir.Sert plastik yüzeyde kültüre edilen hücrelerin ortalama deformasyonu kırmızı ile gösterilmiştir. Sert poliakrilamid jel üzerinde büyütülenler mor ile, elastik poliakrilamid jel üzerinde büyütülenler ise mavi ile gösterilmiştir. Eğrilerdeki temas noktaları dikkatle belirlendikten sonra, hücre deformasyonunun bir fonksiyonu olarak girinti kuvvetleri doğru bir şekilde gösterilebilir.Ayrıca, Young modülleri, temas sonrası ilk 300 nanometrelik girintiden doğru bir şekilde hesaplanabilir. Burada, bir ara filament türü olan ve yeşil floresan protein etiketli menton ile transfekte edilmiş bir fibroblast gösterilmektedir. Görüntü ne kadar parlaksa, o bölgede o kadar fazla menton var demektir.Bu durum, hücre iskeletinin sertliği ile ilişkili olabilir. Burada sunulan AFM kuvvet haritalama tekniği kullanılarak, her bir pikselin 2,5 by 2,5 mikronluk hücre yüzey alanını temsil ettiği, 32 by 32 piksel çözünürlüğünde bir fibroblastın benzer bir sertlik haritasını göstermek mümkündür. Bu videoyu izledikten sonra, canlı doku hücrelerinin elastikiyetini ölçmek için atomik kuvvet mikroskobunun nasıl kullanılacağı konusunda iyi bir fikir sahibi olunacaktır.

measuring-mechanical-properties-living-cells-using-atomic-force

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Bu kağıt kültürü canlı hücreleri mekanik uyarılması için entegre bir atom operasyon okuyucu kuvvet optik görüntüleme mikroskop öğretmeyi hedefliyor. Bir adım-adım protokol sunulmuştur. Mekanik stimülasyonu canlı hücre yanıtı gösteren bir temsilci veri seti sunulmaktadır.

Tümleşik Optik ve Atomik Kuvvet Mikroskobu eğitimi Mekanik Uyarım Canlı Hücre Tepki

Burada, podosomes uyumlu bir filmde filmin topografik görüntülerin otomatik Analize hazırlanması uygulamak çıkıntı kuvvetleri değerlendirmek için kullanılan Deneysel teknikler ayrıntılı.

Çıkıntı kuvvet mikroskobu: Hücre çıkıntılar tarafından geliştirilen kuvvetleri ölçmek için bir yöntem

Bu protokol için doğrudan bir yaşam Hücre çekirdeğinde kontrollü bir kuvvet uygulamak için micropipette yöntemi açıklanmaktadır. Bu tahlil sorgulama yaşayan, yapisan hücredeki nükleer mekanik özellikleri sağlar.

Çekirdek ve sitoiskeleti mekanik bütünleşmesi ölçmek için bir doğrudan kuvvet sonda

Burada, bir protokol Förster rezonans eşzamanlı kullanımı için protein yük ve floresan kurtarma kuvvet duyarlı ölçüm etkinleştirme protein dynamics ölçmek için photobleaching sonra ölçmek için enerji transferi tabanlı gerilim sensörler mevcut canlı hücreler içinde protein dinamiği.

Kuvvet duyarlı Protein Dynamics floresan teknikleri bir arada kullanarak canlı hücrelerdeki ölçümü

Biz immunolojik çalışmalar için tek bir T hücresi ve boncuk parçacık ile Atomic Force mikroskop (AFM) konsol functionalize bir protokol sunuyoruz. AFM tarafından tek çifti T hücreli dendritik hücre bağlayıcılığı araştırması ve makrofajların gerçek zamanlı hücresel tepkisi ile AFM tarafından floresans görüntüleme ile tek bir katı parçacığın izlenmesi için prosedürler gösterilmektedir.

Tek-T hücreleri veya tek parçacık Immünolojik tek hücreli kuvvet spektroskopisi ile Atomic Force mikroskop Cantilevers functionalization

Burada, hücre ve dokularda nano ve mikro girinti aracı olarak işletilen atomik kuvvet mikroskobu (AFM) sunuyoruz. Cihaz, numunenin 3D yüzey topografisini ve hücre duvarı Young 'ın modüllerinin yanı sıra Turgor basıncını da içeren mekanik özelliklerini eşzamanlı olarak satın almayı sağlar.

Santral hücreleri ve bitki dokularının mekanik özelliklerini ve Turgor basıncını ölçmek için Atomic Force Microkopi kullanımı

Bu protokol, yüzlerce mikrobiyal hücre üzerinde AFM ölçümlerini otomatikleştirmeyi amaçlamaktadır. İlk olarak, mikroplar PDMS damga mikroyaplarına hareketsiz hale getirilir ve daha sonra yüzlerce hareketsiz hücre üzerinde kuvvet spektroskopisi ölçümleri otomatik olarak yapılır.

Yüzlerce C. albicans Hücresinde Biyo-Atomik Kuvvet Mikroskop Ölçümlerinin Otomasyonu

Burada konfokal ve atomik kuvvet mikroskobu tek bir enstrüman platformu nda birleştiren Conpokal tekniğinin protokolü sunulmuştur. Conpokal aynı hücre, aynı bölge, eşzamanlı konfokal görüntüleme ve canlı biyolojik örneklerin mekanik karakterizasyonu yakın sağlar.

Canlı Hücrelerde Eşzamanlı Lazer Tarama Konfokal ve Atomik Kuvvet Mikroskobu (Conpokal) Yakınında

Burada, izole embriyonik zebra balığı hücrelerinin hücre içi mekanik özelliklerini optik bir tuzakla doğrudan kuvvet ölçümü ile üç boyutlu hapsetmede araştırmak için bir protokol sunuyoruz.

Optik Cımbız Kullanarak Hapsetmede Hücre Altı Mekaniğinin Doğrudan Kuvvet Ölçümleri

Hücre duvarı biyomekaniği çalışmaları, bitki büyümesini ve morfogenezini anlamak için gereklidir. Aşağıdaki protokol, atomik kuvvet mikroskobu kullanılarak genç bitki organlarının iç dokularındaki ince primer hücre duvarlarının araştırılması için önerilmiştir.

Canlı Bitki Organlarında Primer Hücre Duvarının Mekanik Özelliklerinin Atomik Kuvvet Mikroskobu Kullanılarak Karakterize Edilmesi

Bir atomik kuvvet mikroskobu (AFM) prob ucu tarafından bir numune yüzeyine uygulanan temas alanının ve kuvvetin ölçülmesi, nano ölçekli mekanik özellik belirlemeyi mümkün kılar. Elastik modülü veya diğer nanomekanik özellikleri ölçmek için yumuşak ve sert numunelerde havada veya sıvıda AFM konsol bazlı nanogirinti uygulamak için en iyi uygulamalar tartışılmaktadır.

Atomik Kuvvet Mikroskobu Konsol Tabanlı Nanogirinti: Hava ve Sıvıda Nanoölçekte Mekanik Özellik Ölçümleri

Öğrenin yaşam hücrelerinin mekanik özelliklerini Atomik Kuvvet Mikroskobu ile ölçme yöntemini. AFM kuvvet spektroskopisi ve Hertz modeli kullanılarak elastik modül belirlenir ve hücre sertliğinin 2D haritası oluşturulur.

Atomik Kuvvet Mikroskobu kullanarak Yaşam Hücrelerinin Mekanik Özellikleri Ölçme

Daha fazla video keşfet