Atomik Kuvvet Mikroskobu kullanarak Yaşam Hücrelerinin Mekanik Özellikleri Ölçme
27 Haziran 2013
Bu kağıt bir atomik kuvvet mikroskobu (AFM) kullanarak microindentation ile canlı hücrelerin mekanik özelliklerini karakterize etmek için bir protokol göstermektedir.
Aşağıdaki deneyin genel amacı, bir atomik kuvvet mikroskobu kullanarak canlı hücrelerin elastik modülünü ölçmektir. Bu, önce hücre üzerinde çeşitli yerlerde bir FM kuvvet spektroskopisi ölçümleri gerçekleştirilerek elde edilir. İkinci adım olarak, A FM ucunun hücre ile ilk temas ettiği noktayı belirlemek için her zorlanmış mesafe eğrisi analiz edilir.
Daha sonra, temas noktasından başlayarak, ilk 200 ila 300 nanometre girinti verisi hertz modeline takılır. Elastik modülü çıkarmak için, sonuçlar, her pikselin tek bir zorlanmış mesafe eğrisini temsil ettiği kuvvet haritalama modu kullanılarak elde edilen hücre sertliğinin 2 boyutlu bir haritasını verir Prosedürü göstermek, laboratuvarımdan bir yüksek lisans öğrencisi olan Guen Thomas olacaktır. Bu işleme başlamak için konsol tutucuyu %70 etanol ile temizleyin ve kurumasını bekleyin.
Ardından, üreticinin talimatlarına göre A FM'ye bir bru DNP 10 konsol yükleyin. Ardından, ters optik kol hassasiyetini kalibre edin. Bu parametre, konsol sapmasının nanometresi başına volt cinsinden fotodiyot tepkisi miktarını tanımlar.
Bunu gerçekleştirmek için önce numune tablasına temiz bir cam sürgü yükleyin. Bir FM kafasını takın ve lazer ışınını ve hizalamasını üreticinin talimatlarına göre ayarlayın. Hizalandıktan sonra, P eight O geri çekili durumda olacak şekilde A FM ucunu cam sürgüye geçirin.
Aynayı negatif iki voltluk bir foto diyot okumasına yeniden hizalayın. Ardından, maksimum foto diyot tepkisi veya pozitif iki voltluk tetik noktası ile bir kuvvet spektroskopisi ölçümü gerçekleştirin. Veri toplama işlemi tamamlandıktan sonra, kuvvet eğrisinin sıkı temas bölgesine yakınlaştırın ve bu bölgeye doğrusal bir uyum gerçekleştirin.
Eğimi nanometre başına volt cinsinden bulmak için, ayna hizalamasını sıfır voltluk serbest sapmaya sıfırlayın. Ardından, levy ve Malam tarafından açıklanan termal ayar yöntemini kullanarak konsol yay sabitini kalibre edin. Başlamak için, uç ile numune arasında herhangi bir etkileşim olmaması için tarayıcıyı numune aşamasından uzağa kaldırın.
Ardından, konsol kirişinin termal titreşimini kaydederek termal verileri yakalayın. A FM yazılımı, böyle bir termal titreşimin güç spektrumunu analiz eder ve bunu bir veri penceresinde çizer. Ardından, yay sabitini belirlemek için temel rezonans zirvesi olarak da bilinen en düşük frekansta ortalanmış veri segmentine bir uyum gerçekleştirin.
Bir FM'yi kültür plakalarına hazırlamak için, a FM aşamasına bir bulaşık ısıtıcı aksesuarı takın ve sıcaklığı 37 santigrat dereceye ayarlayın. Sistemin kararlı bir termal dengeye ulaşması için 20 dakika bekleyin. Önceden ısıtıldıktan sonra, a FM tablasına bir kültür kabı yerleştirin ve cl'yi kullanarak sabitleyinamp 30 dakikadan daha uzun ölçümler için bulaşık ısıtıcısıyla birlikte verilir, normal kültür ortamını değiştirmek için karbondioksitten bağımsız ortam kullanılmalıdır.
Ardından, A FM konsolunun ucuna 37 santigrat derece kültür ortamından küçük bir damla uygulayın ve uç sıvıya batırılana kadar a FM kafasını indirin. Üstten görünümlü bir CCD kamera kullanarak lazer ışınını konsol üzerinde yeniden hizalayın. Sıvıdaki hizalama, ortamın kırılma indisindeki değişiklik nedeniyle bir havadan farklı olacaktır.
Hizalandıktan sonra, A FM ucunu kültür kabının hücresiz bir alanına yerleştirin ve sıvı ortamda ters optik kol hassasiyetinin kalibrasyonunu gerçekleştirin. Hücrelerin mekanik özellik ölçümlerine başlamak için, konsol ucunu bir optik mikroskop yardımıyla bir hücrenin perle göz bölgesinin üzerine yerleştirin. Konsol konumunun hassas ayarları, X ve Y tarayıcılara ofsetler uygulanarak gerçekleştirilir.
Ardından a FM'yi dört spektroskopi moduna geçirin ve girinti oranını saniyede beş mikrometre olarak ayarlayın, bu da hidrodinamik etkilerden kaçınmak için yeterince düşüktür. Ardından, sapma tetik noktasını iki nano Newton'a ayarlayın. Hücrelere zarar vermemek için bu değeri numune sertliğine göre ayarlayın.
Ek olarak, sapma sinyalindeki herhangi bir sapmayı düzeltecek olan ilgili tetikleme seçeneğini seçin. Ardından, kuvvet ölçümleri arasında ucun hücreden tamamen ayrılmasını sağlamak için kuvvet mesafesini beş mikrometre olarak ayarlayın. Her koşul için en az 30 hücrenin çekirdek bölgesindeki farklı konumlarda üç kuvvet eğrisi toplayın.
Her ne kadar her hücrede birden fazla eğri almak faydalı olsa da. Güvenilir istatistiksel veriler için, çok fazla almak, A FM probundan kaynaklanan sıkıntıya kadar hücre sertliğinde değişikliklere yol açabilir. Kuvvet haritası modunu kullanarak mekanik özelliklerin tek bir hücre boyunca dağılımını daha da karakterize edin.
Kuvvet haritası modunda, tarama boyutunu 30 mikrometreye, çözünürlüğü 32'ye 32'ye ayarlayın ve girinti parametreleri, tek kuvvet eğrileri için seçilenlerle aynıdır. A FM daha sonra numune bölgesindeki her pikselde tek kuvvet eğrileri alacak ve tüm bölgenin bir sertlik haritasını sağlayacaktır. Ardından, hücre sertliğini hesaplamak için MATLAB kullanarak kaydedilen kuvvet eğrilerini analiz edin.
İlk olarak Lynette Al tarafından yayınlanan ve matlab kullanarak her noktadan hem doğrusal bir uyum hem de hertz uyumu hesaplayan bir algoritmayı benimseyerek başlayın. Her iki uyumun göreli RMS hatasını hesaplayın ve her noktada bu değerleri toplayın. Minimum toplam montaj hatasına ulaşan nokta, ilk temas noktası olarak seçilir ve bu noktanın yerleştirilmesi, hücrelerin genç modülünün doğru ölçümü için çok önemlidir.
Ardından, örnek deformasyon deltasını hesaplayın. Aşağıdaki denklemleri kullanarak, deformasyon hücre temasından önce sıfıra eşittir, burada Z, Z, sıfırdan küçüktür ve konsol sapması D ile temas noktasını geçen toplam Z mesafesi arasındaki farka eşittir. Ardından, hücre temasından önce kuvvetin sıfıra eşit olduğu aşağıdaki denklemleri kullanarak girinti kuvvetini F hesaplayın, burada Z, sıfırdan küçüktür ve konsolun yay sabiti K'ye eşittir, burada konsol sapması ile çarpılır temas noktasını geçer.
Elise karesinin uyumu daha sonra, gösterilen kullanılan ucun şekline dayalı olarak hücrenin Young modülünü çıkarmak için hertz modelinin temas sonrası bölgesindeki girinti kuvveti verilerine karşı numune deformasyonuna uygulanır. İşte üç farklı yüzeyde kültürlenmiş üç T üç fiberblast hücresinden alınan temsili kuvvet eğrileri. Burada görebileceğiniz gibi, farklı yüzeyler hücre hücre iskeletinin sertliğini büyük ölçüde etkileyebilir.
Sert plastik bir yüzey üzerinde kültürlenen hücrelerin ortalama deformasyonu kırmızı ile gösterilmiştir. Sert bir poli akrilamid jel üzerinde yetiştirilenler mor renkte, elastik bir poli akrilamid jel üzerinde yetiştirilenler ise mavi renkte gösterilir. Eğrilerdeki temas noktalarını dikkatlice belirledikten sonra, hücre deformasyonunun bir fonksiyonu olarak girinti kuvvetleri doğru bir şekilde gösterilebilir.
Ek olarak, Young'ın modüler, temastan sonraki ilk 300 nanometre girintiden doğru bir şekilde hesaplanabilir. Burada, bir tür ara filament olan menton etiketli yeşil floresan proteini ile transfekte edilmiş bir fibroblast gösterilmektedir. Görüntü ne kadar parlaksa, o bölgede o kadar fazla menton vardır.
Bu, hücre hücre iskeletinin sertliği ile ilgili olabilir. Burada sunulan A FM kuvvet haritalama tekniğini kullanarak, her pikselin 2,5 x 2,5 mikron hücre yüzey alanını temsil ettiği 32 x 32 piksel çözünürlüğe sahip bir fiberblastın benzer bir sertlik haritasını göstermek mümkündür. Bu videoyu izledikten sonra, canlı doku hücrelerinin elastikiyetini ölçmek için atomik kuvvet mikroskobunun nasıl kullanılacağı konusunda iyi bir fikre sahip olacaktır.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu çalışma, bir Atomik Kuvvet Mikroskobu (AFM) kullanarak mikroindantasyon yoluyla canlı hücrelerin mekanik özelliklerini karakterize etmek için bir protokol sunmaktadır. Çalışma, kuvvet spektroskopisi ve veri analizi yoluyla canlı hücrelerin elastik modülünün ölçülmesine odaklanmaktadır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Hücre Mekaniği
- Biyofizik
- Atomik Kuvvet Mikroskobu
Arka Plan
- Hücrelerin mekanik özelliklerini anlamak, çeşitli biyolojik uygulamalar için kritik öneme sahiptir.
- Atomik Kuvvet Mikroskobu (AFM), hücre sertliğinin yüksek çözünürlüklü ölçümlerini sağlar.
- Elastik modül, hücre mekanik özelliklerini değerlendirmede önemli bir parametredir.
- Kuvvet haritalaması, hücre sertliğinin mekansal varyasyonu hakkında ayrıntılı bilgiler sağlayabilir.
Çalışmanın Amacı
- AFM kullanarak canlı hücrelerin elastik modülünü ölçmek.
- Hücre mekanik özelliklerini karakterize etmek için bir protokol geliştirmek.
- Kuvvet haritalama verilerine dayalı olarak hücre sertliğinin 2D haritasını oluşturmak.
Kullanılan Yöntemler
- Hücre üzerindeki çeşitli noktalarda FM kuvvet spektroskopisi ölçümleri.
- Temas noktalarını belirlemek için zorla mesafe eğrilerinin analizi.
- Elastik modül çıkarmak için indentasyon verilerinin Hertz modeline uyarlanması.
- Hücrenin 2D sertliği haritasını oluşturmak için kuvvet haritalama modu.
Ana Sonuçlar
- Canlı hücrelerin elastik modülünün başarılı bir şekilde ölçülmesi.
- Hücre sertliğindeki varyasyonları gösteren detaylı bir 2D haritanın oluşturulması.
- Lisansüstü öğrenci tarafından protokolün gösterilmesi.
- Hücre mekanik özelliklerini karakterize etmek için güvenilir bir yöntemin kurulması.
Sonuçlar
- Protokol, hücre mekaniğini inceleyen araştırmacılar için değerli bir araç sağlar.
- AFM tabanlı ölçümler, hücresel davranışın anlaşılmasında katkı sağlayabilir.
- Gelecekteki uygulamalar, hastalık durumlarını ve hücresel tepkileri incelemeyi içerebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Quantitative measurement of cell mechanical properties using atomic force microscopy (AFM) enables biopharma teams to assess cellular responses to microenvironmental changes, supporting early discovery and target validation. Reliable stiffness mapping informs mechanistic de-risking and predictive confidence in disease-relevant systems, directly impacting portfolio triage and translational research. Integrating AFM-based elasticity measurements strengthens decision-making at key inflection points in the discovery pipeline.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct quantification of cell stiffness as a functional biomarker for physiological or pathological states.
- Supports mechanistic de-risking by correlating cytoskeletal changes with disease models or compound effects.
- Facilitates hypothesis testing regarding cellular responses to substrate or genetic perturbations.
- Provides quantitative endpoints for target validation in cell-based assays.
Screening & Assay Development
- Delivers reproducible, quantitative force curves and stiffness maps for assay standardization.
- Enables high-content screening of mechanical phenotypes across multiple cell conditions.
- Supports development of robust, scalable assays for compound evaluation targeting cell mechanics.
- Improves assay readiness by integrating force mapping with automated data analysis workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns mechanical property measurements with disease-relevant phenotypes for translational biomarker development.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation by linking cell mechanics to functional outcomes.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on quantitative, physiologically relevant data.
- Supports predictive de-risking in preclinical models by mapping mechanical heterogeneity.
Pipeline & Workflow Integration
AFM-based cell stiffness measurement fits within the early discovery to preclinical continuum, providing a bridge between mechanistic studies and translational research.
- Discovery Biology: Quantitative force mapping clarifies cellular responses and de-risks biological hypotheses.
- Screening: Standardized force spectroscopy outputs enable reproducible comparison across conditions and compounds.
- Analytics: MATLAB-based analysis yields quantitative Young's modulus values and spatial stiffness maps for robust data interpretation.
- Translational Research: Mechanical phenotyping aligns with disease models and supports biomarker continuity.
- Enterprise Reuse: AFM protocols and analysis routines are adaptable across cell types and experimental systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in cell-based models.
- Operational Value: Standardizes mechanical property measurement and enhances reproducibility across teams.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and improves capital efficiency by providing robust quantitative endpoints.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of discovery programs based on functional cell phenotypes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in AFM operation, force spectroscopy, and quantitative data analysis.
- Demands access to calibrated AFM instrumentation and compatible analysis software (e.g., MATLAB routines).
- Necessitates cross-team standardization of calibration, measurement, and analysis protocols.
- Adaptable to various cell types and substrates with careful adjustment of indentation parameters.
- Potential limitations include probe-induced cell stress and the need for careful contact point identification.
