Atomik Kuvvet Mikroskobu kullanarak Yaşam Hücrelerinin Mekanik Özellikleri Ölçme

Aşağıdaki deneyin genel amacı, yaşayan hücrelerin elastik modülünü bir atomik kuvvet mikroskobu kullanarak ölçmektir. Bu, öncelikle hücre üzerindeki çeşitli konumlarda FM kuvvet spektroskopi ölçümleri gerçekleştirilerek sağlanır. İkinci adım olarak, AFM ucunun hücreyle ilk temas kurduğu noktayı belirlemek için her bir kuvvet-mesafe eğrisi analiz edilir.

Ardından, temas noktasından başlayarak, girintileme verilerinin ilk 200 ila 300 nanometresi hertz modeline uydurulur. Elastik modülü elde etmek için sonuçlar, her bir pikselin tek bir kuvvet-mesafe eğrisini temsil ettiği kuvvet haritalama modu kullanılarak elde edilen hücre sertliğinin 2B haritasını sunar. Prosedürü laboratuvarımdan lisansüstü öğrencisi Guen Thomas gösterecektir. Bu prosedüre başlamak için, kantilever tutucuyu %70 etanol ile temizleyin ve kurumasını bekleyin.

Ardından, üretici talimatlarına uygun olarak AFM'ye bir bru DNP 10 konsantre yükleyin. Sonrasında, ters optik kaldıraç hassasiyetini kalibre edin. Bu parametre, konsantre sapmasının nanometre başına volt cinsinden fotodiyot yanıt miktarını tanımlar.

Bunu gerçekleştirmek için öncelikle temiz bir lamı numune tablasına yerleştirin. Bir AFM başlığı takın ve lazer ışını ile hizalamayı üretici talimatlarına göre ayarlayın. Hizalama tamamlandığında, P8O geri çekilmiş durumdayken AFM ucunu cam lamla temas ettirin.

Aynayı, fotodiyot okuması negatif iki volt olacak şekilde yeniden hizalayın. Ardından, maksimum fotodiyot yanıtı veya tetikleme noktası pozitif iki volt olacak şekilde bir kuvvet spektroskopisi ölçümü gerçekleştirin. Veri toplama işlemi tamamlandıktan sonra, kuvvet eğrisinin sıkı temas bölgesine yakınlaşın ve bu bölgeye doğrusal bir uyum uygulayın.

Volt başına nanometre cinsinden eğimi bulmak için, ardından ayna hizalamasını sıfır voltluk bir serbest sapmaya sıfırlayın. Sonrasında, Levy ve Malam tarafından tanımlanan termal ayar yöntemiyle kantilever yay sabitini kalibre edin. Başlamak için, uç ile numune arasında hiçbir etkileşim olmayacak şekilde tarayıcıyı numune tablasından uzaklaştırın.

Ardından, konsol kirişin termal titreşimini kaydederek termal verileri yakalayın. AFM yazılımı, bu tür bir termal titreşimin güç spektrumunu analiz eder ve bunu bir veri penceresinde grafikler. Daha sonra, yay sabitini belirlemek için temel rezonans piki olarak da bilinen en düşük frekans merkezli veri segmentine bir uydurma işlemi uygulayın.

Kültür plakaları için a FM hazırlamak amacıyla, a FM tablasına bir kap ısıtıcı aksesuarı takın ve sıcaklığı 37 °C olarak ayarlayın. Sistemin stabil bir termal dengeye ulaşması için 20 dakika bekleyin. Ön ısıtma tamamlandığında, a FM tablasına bir kültür kabı yerleştirin ve 30 dakikadan uzun sürecek ölçümler için kabı ısıtıcı ile birlikte verilen klips yardımıyla sabitleyin; normal kültür besiyerinin yerine karbondioksit bağımsız besiyeri kullanılmalıdır.

Ardından, AFM konsolunun ucuna 37 °C kültür ortamından küçük bir damla uygulayın ve uç sıvının içine hafifçe gömülene kadar AFM başlığını indirin. Üstten görünümlü bir CCD kamera kullanarak lazer ışınını konsol üzerinde yeniden hizalayın. Ortamın kırılma indisindeki değişim nedeniyle sıvı içerisindeki hizalama, havadakinden farklı olacaktır.

Hizalama tamamlandıktan sonra, AFM ucunu kültür kabının hücre içermeyen bir alanına yerleştirin ve sıvı ortamda ters optik kol hassasiyetinin kalibrasyonunu gerçekleştirin. Hücrelerin mekanik özellik ölçümlerine başlamak için, bir optik mikroskop yardımıyla kantilever ucunu bir hücrenin perle göz bölgesinin üzerine konumlandırın. Kantilever konumunun hassas ayarları, X ve Y tarayıcılarına ofset değerleri uygulanarak gerçekleştirilir.

Ardından FM'yi dört spektroskopi moduna geçirin ve hidrodinamik etkileri önlemek adına yeterince düşük bir değer olan saniyede beş mikrometre indentation hızını ayarlayın. Sonra, sapma tetikleme noktasını iki nano newton olarak belirleyin. Hücrelerin zarar görmesini önlemek için bu değeri numune sertliğine göre ayarlayın.

Ek olarak, sapma sinyalindeki herhangi bir kaymayı düzeltecek olan göreceli tetikleme seçeneğini seçin. Ardından, kuvvet ölçümleri arasında ucun hücreden tamamen ayrılmasını sağlamak için kuvvet mesafesini beş mikrometreye ayarlayın. Her bir koşul için, en az 30 hücrenin çekirdek bölgesindeki farklı konumlardan üç kuvvet eğrisi toplayın.

Her hücreden birden fazla eğri almak faydalı olsa da, güvenilir istatistiksel veriler için çok fazla eğri almak, AFM probunun neden olduğu stres sebebiyle hücre sertliğinde değişikliklere yol açabilir. Kuvvet haritalama modu kullanarak tek bir hücredeki mekanik özelliklerin dağılımını daha detaylı karakterize edin.

Kuvvet haritalama modunda, tarama boyutunu 30 micrometers, çözünürlüğü 32 by 32 olarak ayarlayın; batma parametreleri ise tekil kuvvet eğrileri için seçilenlerle aynıdır. A FM, ardından örnek bölgesindeki her pikselde tekil kuvvet eğrileri çıkaracak ve tüm bölgenin bir sertlik haritasını sağlayacaktır. Sonrasında, hücre sertliğini hesaplamak için kaydedilen kuvvet eğrilerini MATLAB kullanarak analiz edin.

Lynette Al tarafından ilk kez yayınlanan ve Matlab kullanarak her noktadan hem doğrusal hem de hertz uyumu hesaplayan bir algoritma benimseyerek başlayın. Her iki uyumun göreli RMS hatasını hesaplayın ve bu değerleri her noktada toplayın. Minimum toplam uyum hatasına ulaşan nokta, ilk temas noktası olarak seçilir; bu noktanın belirlenmesi, hücrelerin Young modülünün doğru ölçümü için kritik öneme sahiptir.

Ardından, numune deformasyon deltasını hesaplayın. Hücre teması öncesinde, Z'nin Z sıfırdan küçük olduğu durumda deformasyonun sıfıra eşit olduğu; temas noktası sonrası ise cantilever sapması D ile toplam mesafe Z arasındaki farka eşit olduğu aşağıdaki denklemleri kullanın. Daha sonra, hücre teması öncesinde Z'nin Z sıfırdan küçük olduğu durumda kuvvetin sıfıra eşit olduğu; temas noktası sonrası ise cantilever'ın yay sabiti K ile temas noktası sonrası cantilever sapmasının çarpımına eşit olduğu aşağıdaki denklemleri kullanarak batırma kuvveti F'yi hesaplayın.

Ardından, kullanılan uç ucun şekline dayanarak hücrenin Young modülünü belirlemek amacıyla, Elise kare uyumu, Hertz modelinin temas sonrası bölgesindeki örnek deformasyon ile bastırma kuvveti verilerine uygulanır. Burada, üç farklı yüzeyde kültüre edilmiş üç farklı fibroblast hücreden alınan temsili kuvvet eğrileri yer almaktadır. Burada görebileceğiniz üzere, farklı yüzeyler hücre sitoiskeletinin sertliğini önemli ölçüde etkileyebilmektedir.

Sert plastik yüzeyde kültüre edilen hücrelerin ortalama deformasyonu kırmızı ile gösterilmiştir. Sert poliakrilamid jel üzerinde büyütülenler mor ile, elastik poliakrilamid jel üzerinde büyütülenler ise mavi ile gösterilmiştir. Eğrilerdeki temas noktaları dikkatle belirlendikten sonra, hücre deformasyonunun bir fonksiyonu olarak girinti kuvvetleri doğru bir şekilde gösterilebilir.

Ayrıca, Young modülleri, temas sonrası ilk 300 nanometrelik girintiden doğru bir şekilde hesaplanabilir. Burada, bir ara filament türü olan ve yeşil floresan protein etiketli menton ile transfekte edilmiş bir fibroblast gösterilmektedir. Görüntü ne kadar parlaksa, o bölgede o kadar fazla menton var demektir.

Bu durum, hücre iskeletinin sertliği ile ilişkili olabilir. Burada sunulan AFM kuvvet haritalama tekniği kullanılarak, her bir pikselin 2,5 by 2,5 mikronluk hücre yüzey alanını temsil ettiği, 32 by 32 piksel çözünürlüğünde bir fibroblastın benzer bir sertlik haritasını göstermek mümkündür. Bu videoyu izledikten sonra, canlı doku hücrelerinin elastikiyetini ölçmek için atomik kuvvet mikroskobunun nasıl kullanılacağı konusunda iyi bir fikir sahibi olunacaktır.