Geçiş Hücreleri
Hücrelerin geçirilmesi veya alt kültürlenmesi, belirli bir kültürdeki hücrelerin yeni kültürlere bölündüğü veya "bölündüğü" ve daha fazla genişlemeyi kolaylaştırmak için taze ortamla beslendiği yaygın bir prosedürdür. Konseptin kendisi nispeten basit olsa da, bu videoda hücre hatlarının başarılı bir şekilde bakımı ve genişletilmesi için daha önemli adımlardan bazılarını tartışacağız.
Toksik metabolitler zamanla hücre kültürü ortamında birikir. Hücreleri genişletirken, hücre sağlığını korumak ve hücre büyümesinin aşırı büyümesini önlemek için hücre genişlemesini izlemek için ortamı düzenli olarak değiştirmek özellikle önemlidir.
Genel olarak, iki ana hücre türü alt kültürlenir: ölümsüzleştirilmiş hücre hatları ve kök hücre hatları
Ölümsüzleştirilmiş hücre hatları, hücre döngüsü düzenlemelerini etkileyen ve süresiz olarak çoğalmalarına izin veren bir tür mutasyon yaşamış çok hücreli organizmalardan türetilen hücrelerdir. Belki de en ünlü ölümsüzleştirilmiş hücre hattı, 1951'de Bayan Henrietta Lacks'ten alınan bir biyopside bulunan bir rahim ağzı kanseri lezyonundan türetilen HeLa hücre hattıdır.
Kanser tarafından ölümsüzleştirilen hücre dizilerinin aksine, kök hücre dizileri hem yetişkin hem de embriyonik dokulardan çeşitli dokulardan kendi kendini yenileyen ve multipotent hücrelerin izole edilmesiyle üretilir. Doğru koşullar altında bu hücreler, burada gördüğünüz insan embriyonik kök hücreleri gibi, kültürde süresiz olarak muhafaza edilebilir.
Hücreler ya kandan izole edilen ölümsüzleştirilmiş hücreler gibi süspansiyon halinde optimal bir şekilde kültürlenir ya da birçok doku türevli hücrede olduğu gibi bir yüzeye yapıştıklarında en iyi şekilde büyürler.
Hücre sağlığını sağlamak için bu yapışık hücrelerin büyümesi yakından izlenmelidir. Hücre tipine bağlı olarak, çoğu yapışık hücrenin %70-90 birleşik olduklarında, yani kültür kabı yüzeyinin %70-90'ını kapladıklarında geçirilmesi gerekir.
Hücre hatlarının orijinal hücre kültürünün birçok özelliğini koruduğunu, ancak her ardışık geçişte genişletilmiş kültüre özgü özellikler kazanmaya başlayabileceklerini unutmayın. Bu nedenle, tek bir hücre kültürünü geçmeye devam etme sayınızı sınırlamayı düşünün.
Hücreleri geçirirken, steril teknik ve uygun reaktifler ve ekipman kullanmak önemlidir.
Hücre hattınızın en iyi şekilde büyümesi ve genişlemesi için uygun ortamı kullanmak çok önemlidir. Her hücre hattı, belirli bir büyüme takviyesi kokteyli gerektirecektir, ancak çoğu hücre hattı en azından aşağıdakilerle takviye gerektirir: Sığır tamamlayıcısını inaktive etmek için ısıl işleme tabi tutulması gereken ve hücreler için hayati büyüme faktörleri sağlayan Fetal Sığır Serumu gibi serum, kültürdeki kirletici büyümeyi sınırlamaya yardımcı olan penisilin ve streptomisin gibi antibiyotikler, ve hücre hatlarının büyümesini ve genişlemesini uzatmaya yardımcı olmak için fibroblast büyüme faktörü gibi diğer büyüme faktörleri. Takviye edilmiş veya "tam" hücre kültürü ortamını, kullanmadığınız zamanlarda 4 ° C'de saklayın.
İlk olarak, doku kültürü ortamının rengini not edin. Taze, hücre kültürü ortamı besinler açısından zengindir ve kısmen pH indikatörü fenol kırmızısının eklenmesi nedeniyle berrak, turuncu bir renk görünür.
Hücreler ortamdaki besinleri kullanmaya başladıkça, hücre kültüründe atık ve asit birikmeye başlar ve pH'ı düşürür. Bu nedenle, birçok doku kültürü ortamı, hücreler kültürü asidik hale getirdiğinde ortamı turuncudan sarıya çeviren fenol kırmızısı içerir. Medyayı bu renge dönmeden önce değiştirin!
Fenol kırmızısı ortamı pembemsi bir renge dönüştürdüğünde, pH'ın sağlıklı hücre büyümesi için çok temel hale geldiğini gösterir, CO2 tankınızı ve ortamınızı değiştirme zamanı gelmiş olabilir.
Yapışık hücre hatlarının çoğu, kaplanmamış plastiğe doğal olarak yapışır. Bu nedenle, petri kapları veya 6 oyuklu plakalar gibi plastik hücre kültürü plakaları, hücrelerin alt kültürlenmesi için sıklıkla kullanılır.
Plastik hücre kültürü şişeleri de kullanılır. Örneğin, T25 hücre kültürü şişesi, genellikle küçük hücre hattı popülasyonlarını genişletmek veya yavaş genişleyen bir hücre hattının büyümesini başlatmak için kullanılır. T75 kültür şişeleri, daha hızlı çoğalan hücre hatları için veya bir T25 şişesine sığabileceğinden daha fazla sayıda hücre oluşturmak için yaygın olarak kullanılır.
Yapışık hücreleri çıkarırken, hücreleri plastiğe bağlayan proteinlerin önce parçalanması gerekir. Bu amaçla sindirim enzimi tripsin sıklıkla kullanılmaktadır. Tripsin maruziyetini dikkatli bir şekilde zamanlamak önemlidir, çünkü çok uzun süre tedavi diğer hücre yüzey proteinlerine zarar verebilir.
Hücre kültürü ortamı tripsin nötrleştiricileri içerebilir. Bu nedenle, fosfat tamponlu salin veya PBS, tripsinizasyondan önce hücreleri yıkamak için sıklıkla kullanılır.
Bir kalsiyum şelatörü olan EDTA, bazen tripsinin proteolitik fonksiyonunu geliştirmek için de kullanılır.
Hücre kolonisinin genişlemesi için, yeni geçen hücreler daha sonra bu hücre hattına uygun koşullar altında, tipik olarak yaklaşık 37 C, %5 CO2 ve %95 nemde bir hücre kültürü inkübatöründe büyütülür.
Başlamadan önce, hücrelerinizin ne sıklıkta izlenmesi gerektiğini anlamak önemlidir, bu da hücrelerinizin ne kadar hızlı çoğaldığına bağlı olacaktır.
Artık ortamınız mutlu bir turuncu renk olduğuna göre, kültürün bulanık olup olmadığı gibi diğer kültür koşullarını gözlemleyin - muhtemelen kontaminasyonu gösterir - hücre kolonilerinin boyutu ve yoğunluğu ve hücrelerin genel kalitesi.
Hücreler yaklaşık% 90 birleşmeye ulaştıysa, doku kültürü ortamını çıkarın ve hücreleri kalsiyum ve magnezyum içermeyen PBS ile yıkayın.
Şimdi hücrelere tripsin ekleyin ve ardından 37 ° C'de inkübe edin. Yaklaşık 5 dakika sonra, hücrelerin ayrıldığını doğrulayın ve ardından taze doku kültürü ortamı ekleyerek proteolizi durdurun.
Hücre süspansiyonunu santrifüjleme için konik bir tüpe aktarın. Daha sonra, hücreleri döndürdükten sonra, peleti rahatsız etmeden süpernatanı dikkatlice çıkarın ve hücreleri taze ortamda yeniden süspanse edin. Kaç hücre topladığınızı sayın ve ardından hücreleri hemen veya daha sonra genişleme için uygun yoğunluğa göre tohumlayın.
Artık hücreleri nasıl geçireceğinizi bildiğinize göre, yöntemin bazı farklı uygulamalarına bakalım.
Daha önce de belirtildiği gibi, insan embriyonik kök hücreleri, pasajlanması gereken bir hücre türüdür. Tipik olarak, kök hücrelerin pluripotent durumlarını korumalarına yardımcı olan faktörler sağlayan fare embriyonik fibroblastları veya MEF'leri ile birlikte kültürlenirler.
Besleyici hücrelerde yetiştirilen kök hücre kolonilerinin, uygun gelişim aşamasına ulaştıklarında "toplanması" gerekir. Mikropipet ile veya bir cam toplama aletiyle nazikçe kazıyarak seçilebilir ve daha sonra genişleme için yeni bir kültürde kaplanabilirler.
Bazı hücre hatları enzimatik sindirime duyarlıdır veya o kadar sıkı yapışırlar ki tek başına tripsin tedavisi ile yeniden süspanse edilemezler. Hücreleri kültür plakasının altından nazikçe çıkarmak için bir hücre sıyırıcı kullanılabilir. Hücreler özellikle yapışmışsa, hücre kabının tabanını ortam veya başka bir uygun çözelti ile durularken serolojik bir pipeti sağlam bir kazıma hareketiyle hareket ettirmeyi deneyin. Bu yönteme dikkat edin, çünkü hassas hücreler bu mekanik ayrışma yöntemiyle zarar görebilir.
Hücrelerinizin genişlemesini tek katmanlı şişelerde elde edilebilenden daha hızlı ve tekrarlanabilir bir şekilde büyütmek için, hücre kültürlerini tek katmanlı şişelere kıyasla 3-5 kat genişletebilen çok katmanlı şişeler kullanılabilir.
Az önce JoVE'nin geçen hücrelere girişini izlediniz. Bu videoda bir hücre hattının ne olduğunu, bir hücre hattının nasıl alt kültürleneceğini ve geçen hücrelerin bazı farklı uygulamalarını inceledik. İzlediğiniz için teşekkürler ve medyanızı taze tutmayı unutmayın!
Hücre hatları, deneysel analiz için hücre tiplerinin hızlı bir şekilde kültürlenmesine ve genişletilmesine izin verdikleri için biyomedikal deneylerde…
Hücrelerin geçirilmesi veya alt kültürlenmesi, belirli bir kültürdeki hücrelerin yeni kültürlere bölündüğü veya "bölündüğü" ve daha fazla genişlemeyi kolaylaştırmak için taze ortamla beslendiği yaygın bir prosedürdür. Konseptin kendisi nispeten basit olsa da, bu videoda hücre hatlarının başarılı bir şekilde bakımı ve genişletilmesi için daha önemli adımlardan bazılarını tartışacağız.
Toksik metabolitler zamanla hücre kültürü ortamında birikir. Hücreleri genişletirken, hücre sağlığını korumak ve hücre büyümesinin aşırı büyümesini önlemek için hücre genişlemesini izlemek için ortamı düzenli olarak değiştirmek özellikle önemlidir.
Genel olarak, iki ana hücre türü alt kültürlenir: ölümsüzleştirilmiş hücre hatları ve kök hücre hatları
Ölümsüzleştirilmiş hücre hatları, hücre döngüsü düzenlemelerini etkileyen ve süresiz olarak çoğalmalarına izin veren bir tür mutasyon yaşamış çok hücreli organizmalardan türetilen hücrelerdir. Belki de en ünlü ölümsüzleştirilmiş hücre hattı, 1951'de Bayan Henrietta Lacks'ten alınan bir biyopside bulunan bir rahim ağzı kanseri lezyonundan türetilen HeLa hücre hattıdır.
Kanser tarafından ölümsüzleştirilen hücre dizilerinin aksine, kök hücre dizileri hem yetişkin hem de embriyonik dokulardan çeşitli dokulardan kendi kendini yenileyen ve multipotent hücrelerin izole edilmesiyle üretilir. Doğru koşullar altında bu hücreler, burada gördüğünüz insan embriyonik kök hücreleri gibi, kültürde süresiz olarak muhafaza edilebilir.
Hücreler ya kandan izole edilen ölümsüzleştirilmiş hücreler gibi süspansiyon halinde optimal bir şekilde kültürlenir ya da birçok doku türevli hücrede olduğu gibi bir yüzeye yapıştıklarında en iyi şekilde büyürler.
Hücre sağlığını sağlamak için bu yapışık hücrelerin büyümesi yakından izlenmelidir. Hücre tipine bağlı olarak, çoğu yapışık hücrenin %70-90 birleşik olduklarında, yani kültür kabı yüzeyinin %70-90'ını kapladıklarında geçirilmesi gerekir.
Hücre hatlarının orijinal hücre kültürünün birçok özelliğini koruduğunu, ancak her ardışık geçişte genişletilmiş kültüre özgü özellikler kazanmaya başlayabileceklerini unutmayın. Bu nedenle, tek bir hücre kültürünü geçmeye devam etme sayınızı sınırlamayı düşünün.
Hücreleri geçirirken, steril teknik ve uygun reaktifler ve ekipman kullanmak önemlidir.
Hücre hattınızın en iyi şekilde büyümesi ve genişlemesi için uygun ortamı kullanmak çok önemlidir. Her hücre hattı, belirli bir büyüme takviyesi kokteyli gerektirecektir, ancak çoğu hücre hattı en azından aşağıdakilerle takviye gerektirir: Sığır tamamlayıcısını inaktive etmek için ısıl işleme tabi tutulması gereken ve hücreler için hayati büyüme faktörleri sağlayan Fetal Sığır Serumu gibi serum, kültürdeki kirletici büyümeyi sınırlamaya yardımcı olan penisilin ve streptomisin gibi antibiyotikler, ve hücre hatlarının büyümesini ve genişlemesini uzatmaya yardımcı olmak için fibroblast büyüme faktörü gibi diğer büyüme faktörleri. Takviye edilmiş veya "tam" hücre kültürü ortamını, kullanmadığınız zamanlarda 4 ° C'de saklayın.
İlk olarak, doku kültürü ortamının rengini not edin. Taze, hücre kültürü ortamı besinler açısından zengindir ve kısmen pH indikatörü fenol kırmızısının eklenmesi nedeniyle berrak, turuncu bir renk görünür.
Hücreler ortamdaki besinleri kullanmaya başladıkça, hücre kültüründe atık ve asit birikmeye başlar ve pH'ı düşürür. Bu nedenle, birçok doku kültürü ortamı, hücreler kültürü asidik hale getirdiğinde ortamı turuncudan sarıya çeviren fenol kırmızısı içerir. Medyayı bu renge dönmeden önce değiştirin!
Fenol kırmızısı ortamı pembemsi bir renge dönüştürdüğünde, pH'ın sağlıklı hücre büyümesi için çok temel hale geldiğini gösterir, CO2 tankınızı ve ortamınızı değiştirme zamanı gelmiş olabilir.
Yapışık hücre hatlarının çoğu, kaplanmamış plastiğe doğal olarak yapışır. Bu nedenle, petri kapları veya 6 oyuklu plakalar gibi plastik hücre kültürü plakaları, hücrelerin alt kültürlenmesi için sıklıkla kullanılır.
Plastik hücre kültürü şişeleri de kullanılır. Örneğin, T25 hücre kültürü şişesi, genellikle küçük hücre hattı popülasyonlarını genişletmek veya yavaş genişleyen bir hücre hattının büyümesini başlatmak için kullanılır. T75 kültür şişeleri, daha hızlı çoğalan hücre hatları için veya bir T25 şişesine sığabileceğinden daha fazla sayıda hücre oluşturmak için yaygın olarak kullanılır.
Yapışık hücreleri çıkarırken, hücreleri plastiğe bağlayan proteinlerin önce parçalanması gerekir. Bu amaçla sindirim enzimi tripsin sıklıkla kullanılmaktadır. Tripsin maruziyetini dikkatli bir şekilde zamanlamak önemlidir, çünkü çok uzun süre tedavi diğer hücre yüzey proteinlerine zarar verebilir.
Hücre kültürü ortamı tripsin nötrleştiricileri içerebilir. Bu nedenle, fosfat tamponlu salin veya PBS, tripsinizasyondan önce hücreleri yıkamak için sıklıkla kullanılır.
Bir kalsiyum şelatörü olan EDTA, bazen tripsinin proteolitik fonksiyonunu geliştirmek için de kullanılır.
Hücre kolonisinin genişlemesi için, yeni geçen hücreler daha sonra bu hücre hattına uygun koşullar altında, tipik olarak yaklaşık 37 C, %5 CO2 ve %95 nemde bir hücre kültürü inkübatöründe büyütülür.
Başlamadan önce, hücrelerinizin ne sıklıkta izlenmesi gerektiğini anlamak önemlidir, bu da hücrelerinizin ne kadar hızlı çoğaldığına bağlı olacaktır.
Artık ortamınız mutlu bir turuncu renk olduğuna göre, kültürün bulanık olup olmadığı gibi diğer kültür koşullarını gözlemleyin - muhtemelen kontaminasyonu gösterir - hücre kolonilerinin boyutu ve yoğunluğu ve hücrelerin genel kalitesi.
Hücreler yaklaşık% 90 birleşmeye ulaştıysa, doku kültürü ortamını çıkarın ve hücreleri kalsiyum ve magnezyum içermeyen PBS ile yıkayın.
Şimdi hücrelere tripsin ekleyin ve ardından 37 ° C'de inkübe edin. Yaklaşık 5 dakika sonra, hücrelerin ayrıldığını doğrulayın ve ardından taze doku kültürü ortamı ekleyerek proteolizi durdurun.
Hücre süspansiyonunu santrifüjleme için konik bir tüpe aktarın. Daha sonra, hücreleri döndürdükten sonra, peleti rahatsız etmeden süpernatanı dikkatlice çıkarın ve hücreleri taze ortamda yeniden süspanse edin. Kaç hücre topladığınızı sayın ve ardından hücreleri hemen veya daha sonra genişleme için uygun yoğunluğa göre tohumlayın.
Artık hücreleri nasıl geçireceğinizi bildiğinize göre, yöntemin bazı farklı uygulamalarına bakalım.
Daha önce de belirtildiği gibi, insan embriyonik kök hücreleri, pasajlanması gereken bir hücre türüdür. Tipik olarak, kök hücrelerin pluripotent durumlarını korumalarına yardımcı olan faktörler sağlayan fare embriyonik fibroblastları veya MEF'leri ile birlikte kültürlenirler.
Besleyici hücrelerde yetiştirilen kök hücre kolonilerinin, uygun gelişim aşamasına ulaştıklarında "toplanması" gerekir. Mikropipet ile veya bir cam toplama aletiyle nazikçe kazıyarak seçilebilir ve daha sonra genişleme için yeni bir kültürde kaplanabilirler.
Bazı hücre hatları enzimatik sindirime duyarlıdır veya o kadar sıkı yapışırlar ki tek başına tripsin tedavisi ile yeniden süspanse edilemezler. Hücreleri kültür plakasının altından nazikçe çıkarmak için bir hücre sıyırıcı kullanılabilir. Hücreler özellikle yapışmışsa, hücre kabının tabanını ortam veya başka bir uygun çözelti ile durularken serolojik bir pipeti sağlam bir kazıma hareketiyle hareket ettirmeyi deneyin. Bu yönteme dikkat edin, çünkü hassas hücreler bu mekanik ayrışma yöntemiyle zarar görebilir.
Hücrelerinizin genişlemesini tek katmanlı şişelerde elde edilebilenden daha hızlı ve tekrarlanabilir bir şekilde büyütmek için, hücre kültürlerini tek katmanlı şişelere kıyasla 3-5 kat genişletebilen çok katmanlı şişeler kullanılabilir.
Az önce JoVE'nin geçen hücrelere girişini izlediniz. Bu videoda bir hücre hattının ne olduğunu, bir hücre hattının nasıl alt kültürleneceğini ve geçen hücrelerin bazı farklı uygulamalarını inceledik. İzlediğiniz için teşekkürler ve medyanızı taze tutmayı unutmayın!
Hücrelerin geçirilmesi veya alt kültürlenmesi, belirli bir kültürdeki hücrelerin yeni kültürlere bölündüğü veya "bölündüğü" ve daha fazla genişlemeyi kolaylaştırmak için taze ortamla beslendiği yaygın bir prosedürdür. Konseptin kendisi nispeten basit olsa da, bu videoda hücre hatlarının başarılı bir şekilde bakımı ve genişletilmesi için daha önemli adımlardan bazılarını tartışacağız.
Toksik metabolitler zamanla hücre kültürü ortamında birikir. Hücreleri genişletirken, hücre sağlığını korumak ve hücre büyümesinin aşırı büyümesini önlemek için hücre genişlemesini izlemek için ortamı düzenli olarak değiştirmek özellikle önemlidir.
Genel olarak, iki ana hücre türü alt kültürlenir: ölümsüzleştirilmiş hücre hatları ve kök hücre hatları
Ölümsüzleştirilmiş hücre hatları, hücre döngüsü düzenlemelerini etkileyen ve süresiz olarak çoğalmalarına izin veren bir tür mutasyon yaşamış çok hücreli organizmalardan türetilen hücrelerdir. Belki de en ünlü ölümsüzleştirilmiş hücre hattı, 1951'de Bayan Henrietta Lacks'ten alınan bir biyopside bulunan bir rahim ağzı kanseri lezyonundan türetilen HeLa hücre hattıdır.
Kanser tarafından ölümsüzleştirilen hücre dizilerinin aksine, kök hücre dizileri hem yetişkin hem de embriyonik dokulardan çeşitli dokulardan kendi kendini yenileyen ve multipotent hücrelerin izole edilmesiyle üretilir. Doğru koşullar altında bu hücreler, burada gördüğünüz insan embriyonik kök hücreleri gibi, kültürde süresiz olarak muhafaza edilebilir.
Hücreler ya kandan izole edilen ölümsüzleştirilmiş hücreler gibi süspansiyon halinde optimal bir şekilde kültürlenir ya da birçok doku türevli hücrede olduğu gibi bir yüzeye yapıştıklarında en iyi şekilde büyürler.
Hücre sağlığını sağlamak için bu yapışık hücrelerin büyümesi yakından izlenmelidir. Hücre tipine bağlı olarak, çoğu yapışık hücrenin %70-90 birleşik olduklarında, yani kültür kabı yüzeyinin %70-90'ını kapladıklarında geçirilmesi gerekir.
Hücre hatlarının orijinal hücre kültürünün birçok özelliğini koruduğunu, ancak her ardışık geçişte genişletilmiş kültüre özgü özellikler kazanmaya başlayabileceklerini unutmayın. Bu nedenle, tek bir hücre kültürünü geçmeye devam etme sayınızı sınırlamayı düşünün.
Hücreleri geçirirken, steril teknik ve uygun reaktifler ve ekipman kullanmak önemlidir.
Hücre hattınızın en iyi şekilde büyümesi ve genişlemesi için uygun ortamı kullanmak çok önemlidir. Her hücre hattı, belirli bir büyüme takviyesi kokteyli gerektirecektir, ancak çoğu hücre hattı en azından aşağıdakilerle takviye gerektirir: Sığır tamamlayıcısını inaktive etmek için ısıl işleme tabi tutulması gereken ve hücreler için hayati büyüme faktörleri sağlayan Fetal Sığır Serumu gibi serum, kültürdeki kirletici büyümeyi sınırlamaya yardımcı olan penisilin ve streptomisin gibi antibiyotikler, ve hücre hatlarının büyümesini ve genişlemesini uzatmaya yardımcı olmak için fibroblast büyüme faktörü gibi diğer büyüme faktörleri. Takviye edilmiş veya "tam" hücre kültürü ortamını, kullanmadığınız zamanlarda 4 ° C'de saklayın.
İlk olarak, doku kültürü ortamının rengini not edin. Taze, hücre kültürü ortamı besinler açısından zengindir ve kısmen pH indikatörü fenol kırmızısının eklenmesi nedeniyle berrak, turuncu bir renk görünür.
Hücreler ortamdaki besinleri kullanmaya başladıkça, hücre kültüründe atık ve asit birikmeye başlar ve pH'ı düşürür. Bu nedenle, birçok doku kültürü ortamı, hücreler kültürü asidik hale getirdiğinde ortamı turuncudan sarıya çeviren fenol kırmızısı içerir. Medyayı bu renge dönmeden önce değiştirin!
Fenol kırmızısı ortamı pembemsi bir renge dönüştürdüğünde, pH'ın sağlıklı hücre büyümesi için çok temel hale geldiğini gösterir, CO2 tankınızı ve ortamınızı değiştirme zamanı gelmiş olabilir.
Yapışık hücre hatlarının çoğu, kaplanmamış plastiğe doğal olarak yapışır. Bu nedenle, petri kapları veya 6 oyuklu plakalar gibi plastik hücre kültürü plakaları, hücrelerin alt kültürlenmesi için sıklıkla kullanılır.
Plastik hücre kültürü şişeleri de kullanılır. Örneğin, T25 hücre kültürü şişesi, genellikle küçük hücre hattı popülasyonlarını genişletmek veya yavaş genişleyen bir hücre hattının büyümesini başlatmak için kullanılır. T75 kültür şişeleri, daha hızlı çoğalan hücre hatları için veya bir T25 şişesine sığabileceğinden daha fazla sayıda hücre oluşturmak için yaygın olarak kullanılır.
Yapışık hücreleri çıkarırken, hücreleri plastiğe bağlayan proteinlerin önce parçalanması gerekir. Bu amaçla sindirim enzimi tripsin sıklıkla kullanılmaktadır. Tripsin maruziyetini dikkatli bir şekilde zamanlamak önemlidir, çünkü çok uzun süre tedavi diğer hücre yüzey proteinlerine zarar verebilir.
Hücre kültürü ortamı tripsin nötrleştiricileri içerebilir. Bu nedenle, fosfat tamponlu salin veya PBS, tripsinizasyondan önce hücreleri yıkamak için sıklıkla kullanılır.
Bir kalsiyum şelatörü olan EDTA, bazen tripsinin proteolitik fonksiyonunu geliştirmek için de kullanılır.
Hücre kolonisinin genişlemesi için, yeni geçen hücreler daha sonra bu hücre hattına uygun koşullar altında, tipik olarak yaklaşık 37 C, %5 CO2 ve %95 nemde bir hücre kültürü inkübatöründe büyütülür.
Başlamadan önce, hücrelerinizin ne sıklıkta izlenmesi gerektiğini anlamak önemlidir, bu da hücrelerinizin ne kadar hızlı çoğaldığına bağlı olacaktır.
Artık ortamınız mutlu bir turuncu renk olduğuna göre, kültürün bulanık olup olmadığı gibi diğer kültür koşullarını gözlemleyin - muhtemelen kontaminasyonu gösterir - hücre kolonilerinin boyutu ve yoğunluğu ve hücrelerin genel kalitesi.
Hücreler yaklaşık% 90 birleşmeye ulaştıysa, doku kültürü ortamını çıkarın ve hücreleri kalsiyum ve magnezyum içermeyen PBS ile yıkayın.
Şimdi hücrelere tripsin ekleyin ve ardından 37 ° C'de inkübe edin. Yaklaşık 5 dakika sonra, hücrelerin ayrıldığını doğrulayın ve ardından taze doku kültürü ortamı ekleyerek proteolizi durdurun.
Hücre süspansiyonunu santrifüjleme için konik bir tüpe aktarın. Daha sonra, hücreleri döndürdükten sonra, peleti rahatsız etmeden süpernatanı dikkatlice çıkarın ve hücreleri taze ortamda yeniden süspanse edin. Kaç hücre topladığınızı sayın ve ardından hücreleri hemen veya daha sonra genişleme için uygun yoğunluğa göre tohumlayın.
Artık hücreleri nasıl geçireceğinizi bildiğinize göre, yöntemin bazı farklı uygulamalarına bakalım.
Daha önce de belirtildiği gibi, insan embriyonik kök hücreleri, pasajlanması gereken bir hücre türüdür. Tipik olarak, kök hücrelerin pluripotent durumlarını korumalarına yardımcı olan faktörler sağlayan fare embriyonik fibroblastları veya MEF'leri ile birlikte kültürlenirler.
Besleyici hücrelerde yetiştirilen kök hücre kolonilerinin, uygun gelişim aşamasına ulaştıklarında "toplanması" gerekir. Mikropipet ile veya bir cam toplama aletiyle nazikçe kazıyarak seçilebilir ve daha sonra genişleme için yeni bir kültürde kaplanabilirler.
Bazı hücre hatları enzimatik sindirime duyarlıdır veya o kadar sıkı yapışırlar ki tek başına tripsin tedavisi ile yeniden süspanse edilemezler. Hücreleri kültür plakasının altından nazikçe çıkarmak için bir hücre sıyırıcı kullanılabilir. Hücreler özellikle yapışmışsa, hücre kabının tabanını ortam veya başka bir uygun çözelti ile durularken serolojik bir pipeti sağlam bir kazıma hareketiyle hareket ettirmeyi deneyin. Bu yönteme dikkat edin, çünkü hassas hücreler bu mekanik ayrışma yöntemiyle zarar görebilir.
Hücrelerinizin genişlemesini tek katmanlı şişelerde elde edilebilenden daha hızlı ve tekrarlanabilir bir şekilde büyütmek için, hücre kültürlerini tek katmanlı şişelere kıyasla 3-5 kat genişletebilen çok katmanlı şişeler kullanılabilir.
Az önce JoVE'nin geçen hücrelere girişini izlediniz. Bu videoda bir hücre hattının ne olduğunu, bir hücre hattının nasıl alt kültürleneceğini ve geçen hücrelerin bazı farklı uygulamalarını inceledik. İzlediğiniz için teşekkürler ve medyanızı taze tutmayı unutmayın!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What is the difference between immortalized cell lines and stem cell lines?
Immortalized cell lines derive from multicellular organisms with mutations affecting cell cycle regulation, allowing indefinite proliferation. Stem cell lines are generated by isolating self-renewing, multipotent cells from adult or embryonic tissues. Both can be maintained indefinitely in culture under appropriate conditions, but stem cells retain pluripotency while immortalized cells do not.
Q2: Why is it important to change cell culture media regularly?
Toxic metabolites accumulate in cell culture media over time, lowering pH and reducing nutrient availability. Fresh media maintains cell health and supports continued expansion. Media color indicators like phenol red signal when changes are needed—orange indicates fresh media, yellow indicates acidic conditions requiring immediate media change, and pink suggests pH is too basic.
Q3: What does 90% confluency mean and why does it matter for cell passaging?
Confluency refers to the percentage of culture container surface covered by cells. At 90% confluency, adherent cells cover most of the container bottom and must be passaged to prevent overgrowth and maintain cell health. Monitoring confluency ensures cells are split at the optimal time for expansion and prevents toxic metabolite accumulation.
Q4: What are the essential components of complete cell culture media?
Complete media requires serum such as heat-treated Fetal Bovine Serum for growth factors, antibiotics like penicillin and streptomycin to prevent contamination, and additional growth factors such as fibroblast growth factor to prolong expansion. Each cell line requires a specific growth supplement cocktail tailored to its needs. Store complete media at 4°C when not in use.
Q5: How is trypsin used to remove adherent cells from culture plates?
Trypsin is a digestive enzyme that cleaves proteins binding cells to plastic surfaces. Cells are first washed with calcium- and magnesium-free phosphate buffered saline, then trypsin is added and incubated at 37°C for approximately 5 minutes. Careful timing is critical to avoid damaging cell surface proteins. Fresh media is added to stop proteolysis before transferring cells to a conical tube for counting using hemacytometer methods and applications.
Q6: What are alternative methods for removing cells that are too adherent for standard trypsin treatment?
For cells sensitive to enzymatic digestion or extremely adherent to plates, a cell scraper can gently remove cells from the culture container bottom. Alternatively, a serological pipette can be used in a firm scraping motion while rinsing with media. Mechanical dissociation requires care, as delicate cells can be damaged by these methods.
Q7: How can cell cultures be expanded more rapidly than single-layer flasks allow?
Multilayer flasks expand cell cultures 3-5 fold compared to single-layer flasks, enabling faster and more reproducible scale-up of cell expansion. These specialized culture vessels provide increased surface area for cell growth, making them ideal for generating large numbers of cells efficiently while maintaining appropriate culture conditions.
Bu videodaki bölümler
0:00
Overview
0:40
Basic Principles of Subculturing Cells
2:59
Common Equipment/Reagents for Passaging Cells
6:36
How to Passage Cells
8:03
Applications
9:36
Summary