Hücresel ve Moleküler Biyolojide Temel Yöntemler

Birçok biyomedikal deney, doğru, tekrarlanabilir ve istatistiksel olarak anlamlı veriler elde etmek için bilinen miktarda hücrenin manipülasyonunu gerektirir. Bu nedenle, hücre sayımını öğrenmek, her başarılı biyomedikal bilim insanı için özellikle temel bir tekniktir. Hücre sayımı için en yaygın yöntem, basit bir ışık mikroskobu altında bir hücre aliquotunun sayılmasına yardımcı olan iki adet lazerle oyulmuş ızgaraya sahip bir cihaz olan hemositometre kullanmaktır. Bu veriler daha sonra...

Hücre hatları, deney analizleri için hücre tiplerinin hızlıca kültüre edilmesi ve çoğaltılmasına olanak tanıdıkları için biyomedikal deneylerde sıklıkla kullanılırlar. Hücre hatları, taze izole edilmiş veya primer hücrelerle karşılaştırıldığında benzer koşullar altında kültüre edilirler, ancak bazı temel ve önemli farklar vardır: (i) hücre hatları kendilerine özgü büyüme faktörü kokteyllerine ihtiyaç duyarlar ve (ii) süresiz büyümelerine olanak tanıyan mutasyonlar hızla aşırı büyümeye de yol...

Polimeraz zincir reaksiyonu veya PCR, sabit zaman aralıklarındaki sıcaklık değişim döngüleri olan termodöngü aracılığıyla DNA'yı çoğaltmak için kullanılan bir tekniktir. PCR, termostabil bir DNA polimeraz kullanarak dNTP olarak adlandırılan DNA yapı taşlarından çok sayıda DNA kopyası oluşturabilir. Mevcut PCR'nin üç adımı şunlardır: denatürasyon, bağlanma ve uzama. Denatürasyon, döngünün ilk adımıdır ve bazlar arasındaki hidrojen bağlarını kopararak DNA'nın erimesini sağlar, böylece tek...

DNA jel elektroforezi, DNA moleküllerinin tespiti ve ayrıştırılması için kullanılan bir tekniktir. Agarozdan oluşan bir jel matrisine elektrik alanı uygulanır ve jel içerisindeki yüklü parçacıklar boyutlarına göre göç ederek ayrışır. DNA omurgasındaki negatif yüklü fosfatlar, DNA fragmanlarının pozitif yüklü bir elektrot olan anoda doğru hareket etmesini sağlar. Video, DNA fragmanlarının agaroz jel üzerinde nasıl ayrıştırıldığının mekanizmasını açıklamakta; agaroz jellerin nasıl hazırlanacağı,...

Sodyum Dodesil Sülfat Poliakrilamid Jel Elektroforezi veya SDS-PAGE, protein karışımlarını yalnızca boyutlarına göre ayırmak için yaygın olarak kullanılan bir tekniktir. Anyonik bir deterjan olan SDS, lineer hale getirilmiş proteinlerin uzunluğu boyunca eşit bir yük oluşturmak için kullanılır. SDS ile kaplanmış proteinler, önce poliakrilamidden yapılmış bir jele yüklenip ardından jele bir elektrik alanı uygulanarak ayrıştırılır. Elektrik alanı, SDS kaplı proteinleri anoda doğru çeken itici güç...

Transformasyon, bir hücrenin çevresinden yabancı DNA aldığında meydana gelen süreçtir. Transformasyon, doğada belirli bakteri türlerinde gerçekleşebilir. Moleküler biyolojide transformasyon, bakteri hücre membranlarında gözenekler oluşturularak laboratuvar ortamında yapay olarak gerçekleştirilir. Çevreden DNA alabilen bakteri hücrelerine kompetan hücreler denir. Laboratuvarda, bakteri hücreleri kompetan hale getirilebilir ve ardından ısı şoku yöntemi adı verilen bir prosedürle DNA hücreye...

“Transformasyon” terimi, hücrenin dış DNA'yı bünyesine almasını ifade eder. Doğada transformasyon, belirli bakteri türlerinde meydana gelebilir. Ancak moleküler biyolojide transformasyon, bakteri hücre duvarlarında gözenekler oluşturularak yapay olarak indüklenir. Çevreden DNA alabilen bakteri hücrelerine kompetan hücreler denir. Elektrokompetan hücreler laboratuvarda üretilebilir ve bu hücrelerin transformasyonu, hücre duvarında DNA'nın geçebileceği gözenekler oluşturan bir elektrik alanının...

Bir enzim bağlı immunosorbent assay (ELISA), genellikle deneysel bir örnek içerisinde ilgilenilen bir hedef proteinin varlığını ve/veya miktarını tespit etmek için gerçekleştirilir. Hedef proteinin tespiti, ELISA'yı bir immünassay yapan antikorlar sayesinde mümkün olur. Bir dizi inkübasyon ve yıkama adımı aracılığıyla, sıklıkla bir enzime bağlı veya konjuge olan bu antikorlar, bir mikrotitre plakasındaki kuyucuğun tabanını kaplayan proteini tespit eder. Bir substrata maruz kaldığında, antikora...

Plazmit saflaştırma, plazmit DNA'sını genomik DNA'dan, proteinlerden, ribozomlardan ve bakteriyel hücre duvarından ayırmak ve saflaştırmak için kullanılan bir tekniktir. Plazmit, belirli DNA moleküllerinin taşıyıcısı olarak kullanılan küçük, dairesel ve çift sarmallı bir DNA'dır. Transformasyon yoluyla bir konak organizmaya aktarıldığında plazmit replike olur ve incelenen DNA fragmanının çok sayıda kopyasını oluşturur. Bu videoda, plazmit saflaştırmanın nasıl gerçekleştirileceğine dair adım...

Jel saflaştırma, elektroforetik ayrım sonrası DNA fragmanlarını geri kazanmak için kullanılır. Agaroz jelden DNA geri kazanımı üç temel adımı içerir: bağlanma, yıkama ve silika kolondan elüsyon. DNA'nın, yüksek tuz varlığında bir tuz köprüsü aracılığıyla silikaya bağlandığı düşünülmektedir. Bağlanmayı takiben DNA, safsızlıklardan arındırılmak için yıkanır ve bu etkileşimi bozan düşük tuz koşulları altında elüe edilir. Bu video; jelden bir bandın kesilip çıkarılması, jelin çözündürülmesi, silika...

Western Blotting, elektroforetik olarak ayrıştırılmış örneklerde belirli proteinlerin varlığını belirlemek için kullanılır. Sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezi veya SDS-PAGE olarak bilinen teknikle gerçekleştirilen ayrıştırmanın ardından, proteinlerin poliakrilamid jelden, onları bulundukları konumlarda tutan bir membran parçasına aktarılması için western transfer uygulanır. Daha sonra, immunoblotting adı verilen bir işlemle membranlar antikorlarla sorgulanır. Immunoblotting,...

Transfeksiyon, DNA ve çift sarmallı RNA gibi genetik materyallerin memeli hücrelerine yerleştirilmesi işlemidir. Hücreye DNA yerleştirilmesi, hücrenin kendi mekanizması kullanılarak proteinlerin ekspresyonuna veya üretimine olanak tanırken, hücreye RNA yerleştirilmesi, translasyonu durdurarak belirli bir proteinin üretimini aşağı regüle etmek için kullanılır. Transfekte edilen RNA'nın etki alanı sitoplazma iken, etkili bir transfeksiyon için DNA'nın çekirdeğe taşınması gerekir. Orada DNA, kısa...

Moleküler biyolojide ligasyon, iki DNA fragmanının bir fosfodiester bağı oluşumu aracılığıyla birleştirilmesi anlamına gelir. Ligaz olarak bilinen bir enzim, ligasyon reaksiyonunu katalize eder. Hücre içerisinde ligazlar, DNA replikasyonu sırasında meydana gelen tek ve çift zincir kırılmalarını onarır. Laboratuvarda DNA ligaz, moleküler klonlama sırasında insert DNA fragmanlarını vektörlerle –hedef fragmanları konak organizmalarda replike edecek taşıyıcı DNA molekülleriyle– birleştirmek için...

Restriksiyon enzimleri veya endonükleazlar, DNA'yı spesifik bir diziden tanır ve keser. Bu enzimler, bakterilerde bakteriyofajlara -bakterileri enfekte eden virüslere- karşı bir savunma mekanizması olarak doğal olarak bulunur. Bakteriyel restriksiyon enzimleri, metil gruplarının eklenmesi sayesinde bakteriyel genomik DNA'ya zarar vermeden, istilacı bakteriyofaj DNA'sını keser. Bu video, restriksiyon enzimlerinin nasıl adlandırıldığını, mevcut tanıma bölgelerini ve çıkıntı türlerini içeren temel...

Moleküler klonlama, rekombinant DNA'yı bir vektöre - rekombinant DNA fragmanlarını konak organizmalarda replike edecek olan bir DNA molekülü taşıyıcısına - yerleştirmek için kullanılan bir dizi yöntemdir. Bir gen olabilen DNA fragmanı, prokaryotik veya ökaryotik bir örnekten izole edilebilir. İlgilenilen fragmanın veya insertin izolasyonunun ardından, hem vektör hem de insert restriksiyon enzimleri ile kesilmeli ve saflaştırılmalıdır. Saflaştırılan parçalar, ligasyon adı verilen bir teknikle...