Rekombinant Proteinlerin Yüksek-düzey Geçici İfade için Bitkiler Verimli Agroinfiltration

Bu deneysel sistem, yüksek düzeylerde rekombinant protein üretimi için gen konstrüktlarını yapraklara etkili bir şekilde iletmek amacıyla agro infiltrasyon yöntemini kullanır. İlk olarak, infiltrasyondan üç gün önce, end hamana bitkilerini kontrollü bir ortamda altı hafta boyunca yetiştirin. Bitkilerde eksprese edilecek hedef geni içeren agrobacterium kültürlerini infiltrasyon günü hazırlayın.

Agrobacterium kültürlerini, şırınga veya vakum infiltrasyonu yoluyla bitki dokusuna aktarın. Tütün yapraklarının UV ışığı altında GFP'nin yeşil floresan yoğunluğu gibi sonuçlar, bitkilerde mevcut memeli, bakteriyel ve böcek tabanlı ekspresyon sistemleriyle yarışabilecek düzeyde güçlü bir rekombinant protein ekspresyonu olduğunu göstermektedir. Agro-infiltrasyon, transgenlerin bitki hücrelerine aktarılması için etkili bir yöntemdir ve rekombinant proteinlerin yüksek düzeyde ekspresyonu ile sonuçlanır.

Geniş bir bitki türü yelpazesi için kullanılabilir. En önemlisi, farmasötik proteinlerin ticari üretimi için ölçeği büyütülebilir. Dolayısıyla bu yöntem, GFP'nin kinetiği ve ekspresyonu hakkında bilgi sağlayabilir; ayrıca subunit aşılar ve rekombinant monoklonal antikorlar gibi diğer proteinlere uygulanabilir, kanser ve enfeksiyöz hastalıkların tedavilerinde kullanılabilir.

Başarılı bir deney, hem bakteri kültürü hem de bitki materyali için optimal koşullar gerektirir. Bu infiltrasyon işlemini, görsel gösterimden sonra tekrarlamak daha kolaydır. İşleme, 60 adede kadar torf peletini bir çoğaltma tepsisine yerleştirerek başlayın.

Dört litre musluk suyu ekleyin ve torf peletlerinin suyu iki saat boyunca emmesini bekleyin. Şimdi, her bir torf peletine iki adet hamana tohumu ekleyin ve çimlendirme için tepsiyi şeffaf plastik bir kubbe ile kapatın. Tohumları 25 °C sıcaklık ve %84 nem içeren bir ortama yerleştirin.

Ekimden iki hafta sonra kubbeyi kaldırın ve bitkileri yeni bir tepsiye aktarın. Ardından, litre başına 1,48 gramlık Jack gübresinden iki litre ekleyin. Bitkilerin 25 °C'de büyümesine devam edin.

Her iki günde bir %50 nemli ortam sağlanır. Tepsi başına iki litre Jack gübresi verilir. Dördüncü haftada, bitkiler torf peletleri ile birlikte, altı haftalık yaşa kadar gelişmeye devam edebilmeleri için altı bitki kapasiteli yeni bir tepsiye aktarılır.

Her biri beş ila altı yapraklı olan, altı haftalık dört adet Nicotiana benthamiana bitkisi seçin. İlgilenilen genleri taşıyan agrobakteri suşları ile tam infiltrasyon için üç yaprak, negatif kontrol için bir yaprak ve spot infiltrasyon için bir yaprak ayırın. Yaprağın arka yüzündeki epidermiste, yaprağı her iki taraftan delmediğinizden emin olarak bir iğne ile küçük bir çentik açın.

Bir elinizin başparmağıyla boyun kısmına hafifçe karşı basınç uygularken, ilk yaprağın ön tarafını sıkıca tutun. Agrobacterium karışımlarını, infiltrasyon tamponu içerisinde, bir şırınga ve iğne yardımıyla boyun kısmına enjekte edin.

Koyu yeşil halka genişlemeyi bırakana kadar agrobacterium karışımlarını çentiğe enjekte etmeye devam edin. Ardından başka bir çentik açın ve tüm yaprak infiltre olup yaprağın tamamı koyu yeşile dönene kadar enjeksiyonları tekrarlayın. İlk üç yaprağın infiltrasyonunu tamamlayın ve her bitkinin dördüncü yaprağı için dört Gemini viral vektörünün tamamı veya üç magcon vektörü içeren vektör kombinasyonlarıyla infiltrasyon yapın.

Ayrıca, her bir agrobacterium suş kombinasyonu için bir çentik oluşturun ve her çentiğe bir kombinasyon infiltre edin. İnfiltrasyondan sonra bitkileri büyüme odasına geri taşıyın ve 2 ile 15 gün arasında protein ekspresyonunu izleyin. İnfiltrasyon sonrası, bir küveti vakumlu desikatöre yerleştirin ve içine agrobacterium suşlarını içeren üç litre infiltrasyon tamponu aktarın.

Ardından desikatörü bir vakum markası diyafram vakum pompasına bağlayın. Şimdi bir bitkiyi desikatör plakasına ters şekilde yerleştirin ve tüm yaprak ve gövde sistemi infiltrasyon tamponuna batana kadar, plaka küvetin üzerine oturacak şekilde bitkiyle birlikte plakayı indirin. Son olarak desikatör O halkasını kenar boyunca konumlandırın.

Desikatör kapağını hazneye yerleştirdikten sonra vakum pompasını çalıştırın ve vakum 100 millibar'a ulaştığında süre tutmaya başlayın. Vakum pompasını kapattıktan sonra, 100 millibar'da bir dakika bekleyip desikatör üzerindeki tahliye valfini yavaşça açarak agro bacteria'nın daldırılmış bitki dokusunun interstisyel boşluklarına girmesini sağlayın. Bu infiltrasyonu tekrarlayın.

İyi bir infiltrasyon sağlamak için bir kez bastırın. Ardından bitkiyi desikatörden çıkarın ve tekrar dik konumuna getirin. Bitkileri büyüme odasına geri taşıyın ve infiltrasyondan sonraki iki ila 15 gün arasında protein ekspresyonunu izleyin.

Şırınga ile agrobacterium'un bitki dokusuna infiltrasyonunun etkinliğini göstermek için, Gemini viral ve magcon for end şeklindeki iki farklı yapılandırılmış bitki viral vektörü aracılığıyla iki floresan proteinin, GFP ve Ds red'in ekspresyonunu test ettik. Gemini viral vektörler içeren agrobacterium ile tamamen infiltre edilmiş Hamana yapraklarında, UV ışığı altında, 2 DPI kadar erken bir dönemden itibaren tüm yaprak alanında GFP ekspresyonu gözlemlenmiş ve maksimum birikim dört DPI'da gerçekleşmiştir.

Buna karşılık, agrobacterium kombinasyonlarını içeren magcon vektörle infiltre edilen yapraklar, ancak beş DPI'dan sonra GFP floresansı göstermiş ve maksimum birikime yedi DPI'da ulaşmıştır. Negatif kontrol agrobacterium karışımları olan EP 10 plus P 19 ile infiltre edilen yapraklarda herhangi bir yeşil floresans gözlenmemiştir; bu durum, floresansın GFP genine özgü olduğunu ve yapraklardan kaynaklanan arka plan floresansının bir sonucu olmadığını göstermektedir. Maksimum birikim noktasında, GFP ifade eden magcon vektörün floresansı, Gemini viral vektörünkine göre daha yoğundur.

Her iki floresan protein, Gemini viral vektörleri ve şırınga ile nokta infiltrasyonu aracılığıyla aynı yaprakta eksprese edildiğinde, GFP konstrüktlarının infiltre edildiği yapraklarda belirgin bir nekroz gözlemlenmedi; proteinler, infiltre edildikleri noktada beklenen floresan renklerinde tespit edildi. İlginç bir şekilde, GFP ve DS RED'in birlikte infiltre edilmesi sarımsı bir floresansa yol açtı. Bitki geçici ekspresyon sistemleri kullanılarak rekombinant proteinlerin büyük ölçekli üretimi için ölçeklenebilir bir agro-infiltrasyon yöntemi geliştirmek amacıyla vakum infiltrasyonu da incelenmiştir.

Şırınga infiltrasyonuyla karşılaştırıldığında, infiltre edilen bitkinin tüm yapraklarında beklendiği gibi GFP floresansı gözlemlenmiştir. Bu yöntem daha sağlamdır ve her bir bitkinin infiltrasyonunu çok daha kısa bir zaman diliminde gerçekleştirebilir. Uzmanlaşıldığında, bu teknik 48 saat içinde tamamlanabilir.

Asıl infiltrasyon süresi sadece birkaç dakika sürdüğü için bu işlem çoğunlukla agro bakteriyel kültür için uygulanır. Optimal agro infiltrasyon verimliliği ve hedeflenen protein ekspresyonu için protokole uyunuz. Bitki biyoteknolojisi alanında; bitki büyüme koşulları, agro bakteriyel konsantrasyon, vakum basıncı ve süre dahil olmak üzere kritik parametreleri kontrol etmeyi unutmayınız.

Bu deneysel yaklaşım, geniş bir bitki türü yelpazesinde yeni farmasötik proteinlerin geliştirilmesini ve biyoprodüksiyonunu araştırmak için kullanılabilir. Bu videoyu izledikten sonra, hedef gen konstrüktlarını bitkiye aktarmak ve bitki geçici ekspresyon sistemlerinin, memeli, bakteriyel ve böcek hücre kültürleriyle yarışabilecek düzeyde rekombinant protein üretmesini sağlamak için agro infiltrasyonun nasıl kullanılacağı konusunda iyi bir fikre sahip olmalısınız.