Name: Rekombinant Proteinlerin Yüksek-düzey Geçici İfade için Bitkiler Verimli Agroinfiltration (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-23T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 50 s
Description: Öğrenin, Agrobacterium tumefaciens kullanarak bitkilerde rekombinant protein üretimi için agroinfiltrasyon yöntemini. Bu teknik, farmasötik proteinlerin hızlı ve ölçeklenebilir üretimi için etkili bir alternatif sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz R. Güneş ve katkılarından dolayı Chen&#39;in Laboratuvarı diğer öğrencilere malzeme üretimi bitki teşekkür ederim. Ayrıca Teknoloji ve Yenilik (CTI) ve College lisans araştırma verdiği destek için Dr D. Yeşil teşekkür ederim. Bu araştırma S. Chen NIH hibe U01 AI075549 ve 1R21AI101329 ve S. Chen için Arizona Devlet Üniversitesi CTI bir SSE hibe ile kısmen desteklenmiştir. K. Leuzinger, M. Dent, J. Hurtado, ve J. Stahnke SSE hibe ile desteklenen lisans öğrencileridir.

1. Bitki Büyüme <ol><li> Bir yayılma tepsiye Sıra 60 turba pelet. Musluk suyu bölgesinin 4 L-ekleyin ve bunları turba peletler, 2 saat için en su emme izin ver. </li><li> 2 N. Ekle bir ekme makinesi kullanarak her bir turba pelet içine benthamiana tohumları, bir şeffaf plastik kubbe ile tepsiyi kapağı, ve onları bir 16/8 saat gündüz / gece döngüsü (Şekil 1A) ile bir 25 ° C, 84% nemli bir ortamda çimlenmeye için izin verir. </li><li> , Iki hafta içinde tohumlama sonra kubbe Filtreyi kaldır kaseti adlı işletmeye su tahliye, ve 1.48 Kullanıcı g / L olarak (Şekil 1B) bölgesinin bir konsantrasyonda Jack at ait Kullanıcı gübre bölgesinin 2 L ekleyin. Bir 16/8 saat gündüz / gece döngüsü ile bir 25 ° C, 50% nemli bir ortamda bitkiler büyümek için devam edin. Jack&#39;in gübre 2 L tepsi başına her 2 gün Tedarik. </li><li> Onlar yaş 6 hafta (Şekil de infiltre edilecek hazır olana kadar hafta 4 anda, daha fazla büyüme (Şekil 1C) için yeterli alan sağlamak için altı bitkiler barındıran bir yeni bir tepsiye turba pelet ile bitkiler transferi1D). </li></ol> 2. A. tumefaciens Kültür Hazırlık Şırınga İnfiltrasyon için 2.1 Hazırlık <ol><li> Streak A. geminiviral Vektörel Çizimler P19, pREP110, pBYGFP, ve kanamisin (100 ug / ml), içeren LB Agar, plakalar ilgili sayısız pBYDsRed ihtiva eden tumefaciens &#39;GV3101 suşlarında rastlanmaktadır. Streak tek bir plaka başına şekil değiştirme ve, 48 saat boyunca 30 ° ° C de büyür. </li><li> Benzer bir şekilde, çizgi ve LB, Agar, ilgili sayısız GV3101 5 en bölgesinin MagnICON Vektörel Çizimler yataklık suşları &#39;modülü (pICH15879), nin 3&#39; GFP ile veya DsRed (PiCh-GFP veya PiCh-DsRed) bölgesinin söz konusu hedef gen ihtiva eden modülünü yüklemekte ve İntegraz (pCH14011 sahip) giderek büyümeye karbenisilin (100 ug / ml), ihtiva eden plakalar için mükemmeldir. </li><li> LB Agar plağı ilgili sayısız, bir tek bir koloni Şu kaynaktan, YENB medya, 3 ml (% 0.75 Bacto maya özü,% 0,8 &#39;i Besin Elementi Broth,, İN NaOH, ile 7.5&#39; pH değeri ayarlamak) içine geminiviral Vektörel Çizimler yataklık GV3101 suşları inoküle edin +, kanamisin (100 İsim: ug / ml) bölgesindeki , bir 15 ml lik yuvarlak-alt kültür tüp, ° C olarak 30 okuyun sıvı kültürü büyümekbir 300 rpm dönme oranı ile bir gecede bir çalkalayıcı. </li><li> Benzer bir şekilde, inoküle ve 30 okuyun, çalkalayıcı gece boyunca otelinin YENB ortamı + karbenisilin (100 ug / ml), otelinin MagnICON Vektörel Çizimler barındıran GV3101 suşları ° ° C. büyümek </li><li> , Bir Spektrofotometre ayarlandıktan ve uygun antibiyotikler ile YENB medya bölgesinin 10 mi bölgesindeki 0.025 &#39;bölgesinin bir başlangıç ​​OD 600 ile birlikte, bir yeni bir kültür için alt-kültürlenmiştir biçimde duyulabilmesi için gerekli ses seviyesi (V alt) hesaplamak almak için aşağıdaki şu formülü kullanınız ile birlikte her bir sıvı kültür için uygun şekilde ölçü ve kayıt OD 600 ile değerleri, . V sub (mi) = (10 mi) x (0.025) daha kötü / OD 600 ile </li><li> Için gecede kültür Devri V alt (ml) (10 - V alt) her bir suş için uygun antibiyotik ile YENB medya ml. , Yeni kültürü 30 okuyun bir gecede bir 250 rpm Eksende Dönme oran na sahip bir çalkalayıcı ° C de OD 600 değeri var 1.7-2.0 bölgesinin olan erim içinde bulunmaktadır e kadar. Büyütün </li><li> Ölçün ve kayıt OD her bir sıvı kültür için 600 değerleri ve kalk için aşağıdaki formülü kullanınher bir suş için 0.12 bölgesinin, bir yarıyıl sonu OD 600 vermek üzere infiltrasyon tamponu bölgesinin to 50 ml &#39;otelinin seyreltilerek kullanılır için en gerekli hacim (V inf) içeren dizine ulate. V Inf (mi) = (50 mi) x (0,12 inç) / OD 600 ile </li><li> Transferi, türbindeki V bir mikrosantrifüj tüp bulundunuz, her kültürün bölgesinin Inf (ml) ve 2 dakika Ülke: boyunca 12.000 xg&#39;de okuyun santrifüj edenler tarafından hücreleri aşağı doğru döndürün, yüzer tabakanın kaldırmak ve daha sonra (10 mM MES, pH = 5.5 10 ml &#39;infiltrasyon tampon içinde hücreleri tekrar süspansiyon haline getirin; 10 mM MgSO 4) kısaca vorteks tarafından. </li><li> Mix pBYGFP + pREP110 + p19 hücreleri yeniden süspanse, 2 dakika süreyle 12.000 xg&#39;de hücreleri aşağı spin, ve infiltrasyon tampon 50 ml toplam tekrar süspansiyon haline getirin. Bu, Agrobacteria&#39;nın bir kombinasyon, GFP bölgesinin geminiviral ekspresyon için olduğunu. </li><li> Benzer şekilde,, Agrobacterium hücrelerin aşağıdaki kombinasyonları karıştırın aşağı spin ve infiltrasyon tampon 50 ml bunları tekrar süspansiyon haline getirin. Bunlar şunlardır (1) pBYDsRed + pREP110 DsRed bir geminiviral ifadesi, (2) pBYGFP + pBYDsRed + pREP110 için + p19GFP ve DsRed, (3) pREp110, GFP bölgesinin MagnICON ekspresyonu, (5) Şunun için geminiviral ekspresyon bölgesinin negatif kontrol olarak B + syf 19, (4) PiCh GFP +-pICH15879 + pCH14011 PiCh-DsRed + pICH15879 + bölgesinin eş-ekspresyonu geminiviral + için syf 19 MagnICON DsRed ifade, ve MagnICON ifade için negatif kontrol olarak (6) pICH15879 + pCH14011 için pCH14011. </li></ol> Vakum İnfiltrasyon için 2.2 Hazırlık <ol><li> Inoküle edin ve kültür, her GV3101, bir to 50 ml &#39;otoklavlanmış şişeye otelinin uygun antibiyotikler ile YENB medya bölgesinin 15 mi içine geminiviral Vektörel Çizimler ya da MagnICON Vektörel Çizimler ihtiva eden şekil değiştirme ve büyümek gibi bir gecede yukarıda bulunan şırınga infiltrasyon için tarif edildiği. </li><li> Bir spektrofotometre ve uygun antibiyotik ile YENB medya 250 ml içinde 0.025 bir başlangıç ​​OD 600 ile bir yeni bir kültür için alt kültürlenmeli için gerekli hacmi (V alt) hesaplamak için aşağıdaki formülü kullanınız ile her bir sıvı kültür için ölçün ve kayıt OD 600 değerleri . V alt </sub&gt; (Ml) = (250 mi) x (0.025) daha kötü / OD 600 ile </li><li> Transferi V için gecede kültür alt (ml) (250 - V alt) her bir suş için uygun antibiyotik ile bir 1 L otoklavlanmış şişesi içinde YENB medya ml ve bir gece boyunca yukarıdaki gibi şırınga infiltrasyon için açıklanan yeni bir kültür büyür. </li><li> Ölçün ve kayıt OD her bir sıvı kültür için 600 değerleri ve her bir suş için 0.12 bir son OD 600 vermek için infiltrasyon tampon 3 L içinde seyreltilerek kullanılır gerekli hacmi (V inf) hesaplamak için aşağıdaki formülü kullanın. V Inf (mi) = (3000 ml) x (0,12 inç) / OD 600 ile </li><li> Pelet ve şırınga bulunduğu infiltrasyon için tarif edildiği ve şırınga bulunduğu infiltrasyon için tarif edildiği her kombinasyonu için bir göre olan yeniden süspanse kültürler kaynaşır olduğu gibi infiltrasyon tamponu içinde, her kültürün bölgesinin Pastör pipetiyle V Inf (ml) eklenmiştir. Repellet karışık Agrobacteria&#39;nın hücreleri ve infiltrasyon tamponu 3 L &#39;si otelinin onları tekrar süspansiyon haline getirin. </li></ol> 3.1 Şırınga Sızma <ol><li> Dört 6-hafta eski N. seçin 5&#39;te ile birlikte benthamiana bitki her bir bırakır. Her bitkinin bölgesinin En iyi adlı işletmeye sayma olanlar önce Herhangi üç yaprak çıkar A. bölgesinin kombinasyonları bölgesinin tek bir tıklamayla tamamen infiltre edilmelidir doyurmaya infiltrasyon tamponu içinde suşları Hüseyin Avni ÖKTEM. Dördüncü yaprak olacak nokta-sızmış geminiviral ifade için tüm dört gerginlik kombinasyonları veya MagnICON ifade için her üç kombinasyonları ile. Her bir bitki üzerinde son yaprak negatif kontrollerin kombinasyonları ile infiltre edilecektir. </li><li> Yaprak arka yüzünde (Şekil 2A) üzerindeki epidermiste bir iğne ile bir küçük bir nick oluşturun. Dikkat: infiltrasyon karışımdaki edildiği gibi Agrobacterium hücrelerin yaprağın diğer tarafına ponksiyon geçecek gibi, her iki tarafın yoluyla yaprak delmek için olarak çok zor çizmemeye emin olun. </li><li> Yaprak ön tarafında sağlam bir tutun alın ve nazik uygularkenbir elin başparmak ile nick için karşı basınç, bir iğne (Şekil 2B) olmadan bir şırınga ile nick içine infiltrasyon tampon içinde Agrobacterium karışımları enjekte. Not: Agrobacterium karışımın yaprak en hücreler arası alanı girer olarak, infiltre alanı (Şekil 2C) gözle görülür bir şekilde koyu yeşile döner. </li><li> Koyu yeşil bir daire genişletmek için durana kadar nick içine Agrobacterium karışımlar enjekte etmek için devam edin. Tüm yaprak sızmış ve bütün yaprak ilk üç yaprak ve son yaprak için daha koyu yeşil döner edilir kadar başka bir nick ve adımları tekrarlayın 3.1.2-3.1.4 oluşturun. </li><li> Her bitkinin dördüncü yaprak için, Tüm dört (geminiviral vektör) ya da üç (MagnICON vektör) kombinasyonları içine sızmış edilecektir. Agrobacterium suşların her bir kombinasyon için bir tane nick yapmak, ve bir kombinasyonu ile her nick sızmak. </li><li> Infiltrasyon sonra, büyüme oda ve monitör için bitkiler geri hareket2-15 gün sonrası infiltrasyon (dpi) arasında tor protein ekspresyonu. </li></ol> 3.2 Vakum Sızma <ol><li> Bir vakum desikatörde ve küvet için Agrobacterium suşları içeren transferi 3 L infiltrasyonu tampon içine bir küvet yerleştirin. , Bir Vacuubrand diyafram vakum pompası (Şekil 3A) için en desikatöre iletişime geç. </li><li> Desikatöre plaka (Şekil 3B) üzerinde baş aşağı bir bitki yerleştirin ve tüm yaprak ve kök sistemi küvet tepesine dinlenme plaka ile infiltrasyon tampon içine batık kadar bitki ile plaka daha düşük. Kenarı boyunca desikatöre O-ring yerleştirin ve odası (Şekil 3C) üzerindeki desikatöre kapak koymak. </li><li> Vakum pompası açın ve vakum 100 mbar ulaştığında zamanlama başlar. Yavaş yavaş sular altında bitki dokusu bölgesinin interstisyel boşluk içine Agrobacteria&#39;nın bölgesinin girişinde izin vermek için 100 İsim: mbar az 1 dakika Ülke: sonra, kurutma cihazı ile ilgili en serbest bırakma valfi açık. Bu adımı bir Additi yılında tekrarlayıniyi infiltrasyon sağlamak için Önal zaman. </li><li> Infiltrasyon sonra, desikatöre en bitki dışarı almak ve dik konuma onu geri koymak. 2-15 dpi arasındaki büyüme oda ve monitör protein ekspresyonu için bitkiler geri hareket ettirin. </li></ol> 4. Floresan Protein Algılama ve Fotoğrafçılık <ol><li> Karanlık bir odada içine dpi, hareket bitkiler 2 başlayarak ve bir el-tutulan UV lamba ile infiltre yaprakların arka tarafında UV ışığı parlaklık. </li><li> GFP veya DsRed en kırmızı floresan en yeşil floresan gözlemlemek. DsRed kısa dalga UV ışığı altında daha güçlü iken GFP, uzun dalga UV ışığı ile bir güçlü bir sinyal kapalı verir. </li><li> Hiçbir flaş ile bir normal bir dijital kamera ile floresan yaprakların foto ¤ raf çekin. </li><li> Gözlem ya da fotoğraf sonra büyüme odasına bitkiler geri hareket ettirin. </li></ol>

<ol><li>Chen, Q. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChen%2C+Q+%22Transgenic+Horticultural+Crops%3A+Challenges+and+Opportunities+-+Essays+by+Experts%22">Transgenic Horticultural Crops: Challenges and Opportunities - Essays by Experts</a>. Mou, B., Scorza, R. , Taylor & Francis. 86-126 (2011).</li>
<li>Chen, Q., Lai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant-derived+virus-like+particles+as+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Vaccines+%26+Immunotherapeutics%22%5BJournal%5D)">Plant-derived virus-like particles as vaccines.</a> Human Vaccines & Immunotherapeutics. 9, 26-49 (2013).</li>
<li>Landry, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+and+clinical+development+of+plant-made+virus-like+particle+vaccine+against+avian+H5N1+influenza%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Preclinical and clinical development of plant-made virus-like particle vaccine against avian H5N1 influenza.</a> PLoS One. 5, e15559(2010).</li>
<li>Lai, H., Chen, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioprocessing+of+plant-derived+virus-like+particles+of+Norwalk+virus+capsid+protein+under+current+Good+Manufacture+Practice+regulations%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Bioprocessing of plant-derived virus-like particles of Norwalk virus capsid protein under current Good Manufacture Practice regulations.</a> Plant Cell Reports. 31, 573-584 (2012).</li>
<li>Chen, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+Purification+of+Pharmaceutical+Proteins+in+Plants%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Engineering%22%5BJournal%5D)">Expression and Purification of Pharmaceutical Proteins in Plants.</a> Biological Engineering. 1, 291-321 (2008).</li>
<li>Chen, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Turning+a+new+leaf%5BTitle%5D)+AND+%22European+Biopharm.+Rev%22%5BJournal%5D)">Turning a new leaf.</a> European Biopharm. Rev. 2, 64-68 (2011).</li>
<li>Chen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChen%2C+Q+%22New+Generation+Vaccines%22">New Generation Vaccines</a>. Levine, M. M. , Informa Healthcare USA, Inc. 306-315 (2009).</li>
<li>Lai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibody+produced+in+plants+efficiently+treats+West+Nile+virus+infection+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibody produced in plants efficiently treats West Nile virus infection in mice.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 2419-2424 (2010).</li>
<li>Buswell, S., Medina-Bolivar, F., Chen, Q., Van Cott, K., Zhang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+porcine+prorelaxin+in+transgenic+tobacco%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Expression of porcine prorelaxin in transgenic tobacco.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1041, 77-81 (2005).</li>
<li>Lico, C., Chen, Q., Santi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+vectors+for+production+of+recombinant+proteins+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Viral vectors for production of recombinant proteins in plants.</a> J. Cell. Physiol. 216, 366-377 (2008).</li>
<li>Chen, Q., He, J., Phoolcharoen, W., Mason, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Geminiviral+vectors+based+on+bean+yellow+dwarf+virus+for+production+of+vaccine+antigens+and+monoclonal+antibodies+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Vaccin%22%5BJournal%5D)">Geminiviral vectors based on bean yellow dwarf virus for production of vaccine antigens and monoclonal antibodies in plants.</a> Hum. Vaccin. 7, 331-338 (2011).</li>
<li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Green+Fluorescent+Protein%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The Green Fluorescent Protein.</a> Annual Review of Biochemistry. 67, 509-544 (1998).</li>
<li>Baird, G. S., Zacharias, D. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemistry%2C+mutagenesis%2C+and+oligomerization+of+DsRed%2C+a+red+fluorescent+protein+from+coral%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Biochemistry, mutagenesis, and oligomerization of DsRed, a red fluorescent protein from coral.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 97, 11984-11989 (2000).</li>
<li>Lai, H., He, J., Engle, M., Diamond, M. S., Chen, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+production+of+virus-like+particles+and+monoclonal+antibodies+with+geminiviral+replicon+vectors+in+lettuce%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Robust production of virus-like particles and monoclonal antibodies with geminiviral replicon vectors in lettuce.</a> Plant Biotechnology Journal. 10, 95-104 (2012).</li>
<li>Giritch, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+high-yield+expression+of+full-size+IgG+antibodies+in+plants+coinfected+with+noncompeting+viral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Rapid high-yield expression of full-size IgG antibodies in plants coinfected with noncompeting viral vectors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 14701-14706 (2006).</li>
<li>Huang, Z., Chen, Q., Hjelm, B., Arntzen, C., Mason, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+DNA+replicon+system+for+rapid+high-level+production+of+virus-like+particles+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">A DNA replicon system for rapid high-level production of virus-like particles in plants.</a> Biotechnol. Bioeng. 103, 706-714 (2009).</li>
<li>Santi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+plant+viral+expression+system+generating+orally+immunogenic+Norwalk+virus-like+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">An efficient plant viral expression system generating orally immunogenic Norwalk virus-like particles.</a> Vaccine. 26, 1846-1854 (2008).</li>
<li>He, J., Lai, H., Brock, C., Chen, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+System+for+Rapid+and+Cost-Effective+Production+of+Detection+and+Diagnostic+Reagents+of+West+Nile+Virus+in+Plants%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedicine+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A Novel System for Rapid and Cost-Effective Production of Detection and Diagnostic Reagents of West Nile Virus in Plants.</a> Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012, 1-10 (2012).</li>
<li>Huang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-level+rapid+production+of+full-size+monoclonal+antibodies+in+plants+by+a+single-vector+DNA+replicon+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">High-level rapid production of full-size monoclonal antibodies in plants by a single-vector DNA replicon system.</a> Biotechnol. Bioeng. 106, 9-17 (2010).</li>
<li>Kuta, D., Tripathi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium-induced+hypersensitive+necrotic+reaction+in+plant+cells%3A+a+resistance+response+against+Agrobacterium-mediated+DNA+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22African+Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium-induced hypersensitive necrotic reaction in plant cells: a resistance response against Agrobacterium-mediated DNA transfer.</a> African Journal of Biotechnology. 4, 752-757 (2005).</li>
<li>Phoolcharoen, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+an+immunogenic+Ebola+immune+complex+in+Nicotiana+benthamiana%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Expression of an immunogenic Ebola immune complex in Nicotiana benthamiana.</a> Plant Biotechnology Journal. 9, 807-816 (2011).</li>
<li>Phoolcharoen, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nonreplicating+subunit+vaccine+protects+mice+against+lethal+Ebola+virus+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">A nonreplicating subunit vaccine protects mice against lethal Ebola virus challenge.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, 20695-20700 (2011).</li>
<li>Herbst-Kralovetz, M., Mason, H. S., Chen, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Norwalk+virus-like+particles+as+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev.+Vaccines%22%5BJournal%5D)">Norwalk virus-like particles as vaccines.</a> Expert Rev. Vaccines. 9, 299-307 (2010).</li>
<li>Chen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agroinfiltration+as+an+effective+and+scalable+strategy+of+gene+delivery+for+production+of+pharmaceutical+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Tech.+Biol.+Med%22%5BJournal%5D)">Agroinfiltration as an effective and scalable strategy of gene delivery for production of pharmaceutical proteins.</a> Adv. Tech. Biol. Med. 1, 103(2013).</li>
</ol>

Yazarlar herhangi bir mali çıkarlarının rakip var.

Protein bazlı ilaç için artan talepleri tüm dünyada sağlam, ölçeklenebilir, düşük maliyetli ve güvenli yeni üretim platformları gerektirir. Bitkiler ilaç protein üretimi için en umut verici alternatif üretim sistemlerinden biri olarak göstermiştir. Son yıllarda, yıkılıp virüs esaslı vektörler geliştirilmesine büyük ölçüde hız ve bitki ekspresyon sistemleri 2,10 verimi artırır bitkilerdeki protein, geçici ifade sağladı. Daha da geçici ifade sisteminin programı optimize etmek için, biz bitki doku içine hedef-ge...

1970&#39;lerden bu yana, bitkiler rekombinant proteinler ve protein tedavi 1 en ticari üretimi için, memeli böcek, ve bakteriyel hücre kültürleri alternatif olarak araştırılmıştır. Biyofarmasötik ifadesi için bitki-tabanlı sistemler klinik çalışmalarda başarı göstermiştir, Gaucher Hastalığı 2, ve kuş H5N1 gribi 3 gibi hastalıklar, için birkaç yeni tedaviler olarak son yıllarda söz göstermiştir. Bu ilk deneyleri yılından bu yana on yıllarda bitkilerde rekombinant protein ekspresyonu için yetkili mekanizmaların gelişimi üç ana nedenden dolayı protein Mevcut üretim paradigma değiştirmek için bitki-tabanlı sistemler için potansiyel yarattı. İlk olarak,, memeli böcek, ve bakteriyel biyoreaktörler hatırı sayılır başlangıç ​​maliyetleri, pahalı büyüme ortamı, ve aşağı akım saflaştırma 4 için karmaşık süreçler gerektiren olarak maliyet yılında kayda değer bir azalma var. Istikrarlı bir transgenik bir bitki bölgesinin yaratılması,hatları da protein ifade bitkilerin yetiştirildiği ve bir tarım ölçeği 5 üzerinde hasat olabilir gibi onları diğer ifade sistemlerinin ölçeklenebilirlik geride için izin verir. İkinci olarak, bitki-tabanlı ifade sistemleri önemli ölçüde kamu güvenliği 6 içinde üstünlüğünü gösteren, insanlara protein-ifade ana bilgisayardan bir insan veya hayvan patojen verici riskini azaltmak. Son olarak, bitkiler glikosilasyon ve birden çok-alt-birimi proteinlerin 7 bölgesinin derleme dahil olmak üzere proteinleri bölgesinin düzgün bir yazılan Mesajı göster-translasyonel modifikasyonu için izin veren, memeli hücreleri için &#39;e benzer olduğunu, bir ökariyotik endomembran sistemi kullanmaktadır. Bu yetenek bir daha karmaşık yapıya sahip ve kapsamlı posttranslasyonel değişiklikler veya montaj 8 gerektiren, monoklonal antikorlar (mAbs) de dahil olmak üzere ilaç rekombinant proteinlerin daha geniş bir dizi, yılından bu yana, bakteriler gibi prokaryotik sistemleri, dayalı olanlar öncesinde bitki-tabanlı sistemler koyar. Iki büyük beğenme vardır Birbitkiler otelinin yeniden birleştirici proteinler ifade eden bulundunuz aşkınla kanıyor. Olanlar önce Herhangi, hedef ilgili protein için kodlama DNA&#39;nın bir ifade kaset içine klonlandı ve nükleer ya da kloroplast, genomların Her iki durumda da için tanıtıldı, bir stabil bir şekilde transgenik hattı ile, bölgesinin bir gelişmedir. Bunu yaparken, yabancı DNA nesiller başarılı yoluyla kalıtsal hale gelir ve kadar diğer ekspresyon sistemleri 1 özelliğinin ötesinde bir, muazzam geliştirilmiş ölçeklenebilirlik için izin verir. Nükleer genom için bunlara dışarıdan ayrıca DNA sokulması; Ortalama gönderim süresi doku, 9 takım arasından mikroprojektil bombardımanı edenler tarafından, daha az sıklıkta,, bir bitki dokusu bölgesinin Agrobacterium tumefaciens&#39;in enfeksiyon edenler tarafından gerçekleştirildiğini ya da edilir. Bitki hormonları O zamanki farklılaşma ve kökleri ve yaprakları gibi bu tür transgenik bir bitki dokusunun bölgesinin büyümesini teşvik etmek için ikinci el uygulanır. Olan kloroplastın genom bölgesinin dönüştürülmesi A ile birlikte elde edilebilir değil, olabilir DNA ile kaplanmış tumefaciens &#39;, fakat altın veya tungsten partikülleri, ilgili sayısız tamamen güvenir bitki hücrelerine yerleştirmek için balistik olarak ateş etti. Recombina ifade İkinci yöntembitkiler otelinin nt protein geçici ifade aracılığıyla 10 olduğunu. Bu senaryoda yılında, faiz bölgesinin edilen geni taşıyan virüs-Türetilmiş bir Vektörel Çizimler A. cihaz aracılığıyla teslim edilir bir süreç yoluyla tam gelişmiş bitkiler için tumefaciens agroinfiltration çağırdı. Bunun yerine, bitki genomuna içine entegre bölgesinin idarelerce, teslim alınan gen yapısı, O zamanki, kısa bir kuluçka bir süre sonra hasat edildi ve izole edilebilir verebiliriz, böylelikle istenilen proteinin, bölgesinin geçici doğrudan üretimde bulunmak bulundunuz başlayacak doyurmaya. Bitkiler agroinfiltration 11 sonra yaklaşık 1-2 hafta hasat için hazır olacak gibi geçici gen ekspresyonu, daha büyük bir genel protein birikimi yanı sıra protein üretim geliştirilmiş bir zaman avantajı sunuyor. Bu, bir yıl için birkaç ay sürebilir istikrarlı transgenik bitki hatları, nesil, seçimi, ve onay süreçleri daha önemli ölçüde daha hızlı olduğunu. Bu genetik olarak istikrarlı bitki li verim olmayacak gibi Ancak bu,, aynı zamanda geçici ifade sisteminin sınırlamasıdırbüyük bir ölçekli ticari üretim için bir tohum bankası oluşturmak için de kullanılabilir olabilir Nes. Bu rağmen, yaklaşımları büyük ölçekli bir geçici ifade iyileştirmek için geliştirilmiştir oylandı oylandı. Burada, biz A. edenler tarafından teslim edilen yapıbozuma viral bir Vektörel Çizimler kullanarak geçici bir proteini-ifade eden Nicotiana benthamiana bitkilerin bölgesinin nesil bölgesinin biri yöntem ortaya koymaktadır tumefaciens. İki büyük Yöntemleri A. bölgesinin Sevkiyat için geliştirilen ediliyor edilmektedir bitki doku içine tumefaciens: vakum odası aracılığı ile şırınga ve büyük ölçekli infiltrasyon aracılığı ile tezgah ölçek infiltrasyonu. Her iki protokol N. kullanıyorsanız burada açıklanmıştır yakından ortak tütün bitki ile ilgilidir benthamiana,, iki floresan proteinleri geçici ifadesi için ev sahibi bitki olarak: denizanası Aequorea victoria ve Discosoma mercan (DsRed) 12,13 gelen kırmızı floresan proteini gelen yeşil floresan proteini (GFP). N. benthamiana için var En sık görülen ev sahibi bitki olduğunubu genetik transformasyon için uygun, çünkü rekombinant protein, hızlı bir şekilde biyokütle yüksek miktarda verim, ve ölçek-up üretim 14 için bir üretken tohum üreticisidir olabilir. N kullanarak bölgesinin bir diğer gibi olanaklar protein ekspresyonu için hosts olarak benthamiana ekspresyon Vektörel Çizimler 2,5 bölgesinin, bir ve çeşitli bölgesinin Rezervasyon durumuna olduğunu. Bu çalışmada, yılında, iki yapıbozuma viral bir Vektörel Çizimler de, bir tütün mozaik virüsü (TMV) RNA dır replikon da içerebilir sistemi (MagnICON Vektörel Çizimler) ve fasulye sarı, cüce bir virüsü (BeYDV), DNA replikon da içerebilir sistemi (geminiviral Vektörel Çizimler) 4,11 adlı işletmeye türeyen diğer, ilgili sayısız dayalı bir 15-18, GFP ve DsRed gen taşımak ve N. içine onları teslim etmek için kullanılan edilir A. yoluyla benthamiana hücreleri tumefaciens &#39;. Üç DNA yapıları GFP ile veya MagnICON Vektörel Çizimler ile birlikte DsRed ekspresyon için ikinci el uygulanmaz doyurmaya. Onlar İlgi bölgesinin ait geni ihtiva eden modülü (PiCh 5 en &#39;, hedef gen, normal gene 3 bölgesinin ifade sürüş için en promotör ve diğer genetik elementler içeren modülü (pICH15879)&#39; include-GFP veya PiCh-DsRed) eklenmiş ve, integraz modülü (pICH14011) ifade 8,15 üzerine doğrudan 5 &#39;ve 3&#39; modüllerin birlikte başarılı çalışmalarını entegre eden bir enzim için kodlama tekniklerinin anlaşılması. Üç DNA yapıları, aynı zamanda geminiviral Vektörel Çizimler ile ilgili yeni biçimler için ihtiyaç vardır. , Hedef genin (pBYGFP ya da pBYDsRed) bölgesinin replikon da içerebilir ihtiva eden Vektörel Çizimler bulundunuz Buna ek olarak yani, çoğaltma proteini (pREP110) Şunun için kodlama yapan bir Vektörel çizim, hedef replikon da içerebilir 11,14,16 bölgesinin amplifikasyonu için gereklidir. Bundan başka, domates bushy stunt virus adlı işletmeye susturma bastırıcı syf 19 kodlayan bir Vektörel çizim bölgesinin eklenmesi yüksek seviyesi hedef gen ekspresyonu 11,16 için arzu edilir. Bitki büyüme, A. de dahil olmak üzere agroinfiltration edenler tarafından bitki hücrelerine yerleştirmek için yeniden birleştirici proteinlerin bölgesinin genlerin bölgesinin tanıtımı yılı için üç büyük adımlar genel olarak, vardır Bir tumefaciens kültür hazırlanması, ve infiltrasyon. Her biri için her adımda Bu yordamı bölgesinin nihai başarısı için kritik öneme sahiptir gibi, bu nedenle, ayrıntılı bir açıklama verilmedi edilmektedirşırınga infiltrasyon ve aşağıda vakum infiltrasyon her ikisi için de.

<table><tbody><tr><td> </td><td></td><td></td><td>Reagents</td></tr><tr><td>GFP </td><td>Invitrogen</td><td>V353-20</td><td><a href="http://www.invitrogen.com/" target="_blank">www.invitrogen.com</a> Referansa bakın: Lico ve Chen, et al 2008</td></tr><tr><td>DsRed</td><td>Clontech</td><td>632152</td><td><a href="http://www.clontech.com/" target="_blank">www.clontech.com</a> Referansa bakın: Baird ve Zacharias, et al 2000</td></tr><tr><td>MagnICON Vector Icon</td><td>Genetics</td><td>n/a</td><td><a href="http://www.icongenetics.com/" target="_blank">www.icongenetics.com</a> Referansa bakın: giritch ve Marillonnet, et al 2006</td></tr><tr><td>Geminiviral Vektör</td><td>Yazarı' s Lab</td><td>n/a</td><td>Referansa bakın: Chen ve He, et al 2011</td></tr><tr><td>N. benthamiana</td><td>Yazar' s Lab</td><td>n/a</td><td><a href="http://www.herbalistics.com.au" target="_blank">herbalistics.com.au</a</td></tr><tr><td>>Agrobacterium tumefaciens strain gv3101</td><td>Yazar' s Lab</td><td>n/a</td><td>Referansa bakın: Lai ve Chen 2012</td></tr><tr><td>LB Agar Carbenicillin-100, plakalar</td><td>Sigma</td><td>L0418</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/" target="_blank">www.sigmaaldrich.com</a></td></tr><tr><td>LB Agar Kanamisin-50, plakalar</td><td>Sigma</td><td>L0543</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/" target="_blank">www.sigmaaldrich.com</a></td></tr><tr><td>Magnezyum sülfat hepa hidrat</td><td>Sigma</td><td>M2773-500 g</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/" target="_blank">www.sigmaaldrich.com</a></td></tr><tr><td>Bacto-Tryptone</td><td>Fisher</td><td>73049-73-7</td><td><a href="http://www.fishersci.com/" target="_blank">www.fishersci.com</a></td></tr><tr><td>Bacto Maya Özü</td><td>Becton, Dickinson CO.</td><td>REF 212750</td><td><a href="http://www.bd.com/" target="_blank">www.bd.com</a></td></tr><tr><td>Difco Besin Suyu</td><td>Becton, Dickinson CO.</td><td>REF 234000</td><td><a href="http://www.bd.com/" target="_blank">www.bd.com</a></td></tr><tr><td>MES hidrat Tamponu</td><td>Sigma</td><td>M8250-1kg</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/" target="_blank">www.sigmaaldrich.com</a></td></tr><tr><td>Carbenicillin</td><td>Sigma</td><td>C1613-1ML</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/" target="_blank"> www.sigmaaldrich.com</a></td></tr><tr><td>Kanamisin</td><td>Sigma</td><td>70560-51-9</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/" target="_blank">www.sigmaaldrich.com</a></td></tr><tr><td>Sodyum Hidroksit</td><td>Sigma</td><td>221465</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/" target="_blank">www.sigmaaldrich.com</a></td></tr><tr><td>Jack' s Gübre</td><td>Hummert International</td><td>Tem-25</td><td><a href="http://www.hummert.com/" target="_blank">www.hummert.com</a></td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>Vacuubrand MD4 Vakum Pompası</td><td>Fisher</td><td>13-878-113</td><td><a href="http://www.fishersci.com/" target="_blank">www.fishersci.com</a></td></tr><tr><td>Vakumlu Hava Regülatör Valfi</td><td>Fisher</td><td>NC9386590</td><td><a href="http://www.fishersci.com/" target="_blank">www.fishersci.com</a></td></tr><tr><td>Kurutucu 12 1/8", O halkalı</td><td>Fisher</td><td>08-594-15C</td><td><a href="http://www.fishersci.com/" target="_blank">www.fishersci.com</a></td></tr><tr><td>3 L Küvet</td><td>Kauçuk Hizmetçi</td><td>n/a</td><td>Rubbermaid Servn' Saver Bowl, 10 fincan çalışacak</td></tr><tr><td>plaka/raf 230ML</td><td>Fisher</td><td>NC9489269</td><td><a href="http://www.fishersci.com/" target="_blank">www.fishersci.com</a></td></tr><tr><td>Turba Pelet</td><td>Hummert Uluslararası</td><td>14-2370-1</td><td><a href="http://www.hummert.com/" target="_blank">www.hummert.com</a></td></tr><tr><td>Yayılma Tepsisi Kubbesi</td><td>hidro çiftlik</td><td>132052</td><td><a href="http://www.hydroponics.net/" target="_blank">www.hydroponics.net</a></td></tr><tr><td>Propagaiton Tepsisi</td><td>hydrofarm</td><td>138758</td><td><a href="http://www.hydroponics.net/" target="_blank">www.hydroponics.net</a></td></tr><tr><td>Virbo El Mibzer</td><td>Gro-Mor INC</td><td>n/a</td><td><a href="http://www.gro-morent.com/" target="_blank" >www.gro-morent.com</a></td></tr><tr><td>Flora Arabası 4 raflı</td><td>Hummert International</td><td>65-6924-1</td><td><a href="http://www.hummert.com/" target="_blank">www.hummert.com</a></td></tr><tr><td>15 ml Yuvarlak Tabanlı Kültür Tüpleri</td><td>Sigma</td><td>CLS430172-500EA</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/" target="_blank">http://www.sigmaaldrich.com</a></td></tr><tr><td>Spektrofotometre</td><td>Bio-Rad</td><td>170-2525</td><td><a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">www.bio-rad.com</a></td></tr><tr><td>Spektrofotometre Küvetleri</td><td>Bio-Rad</td><td>223-9950</td><td><a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">www.bio-rad.com</a></td></tr><tr><td>Mikrosantrifüj Tüpleri</td><td>ABD Bilimsel</td><td>1415-2500</td><td><a href="http://www.usascientific.com/" target="_blank">www.usascientific.com</a></td></tr> Masaüstü <tr><td>Santrifüj</td><td>Bio-Rad</td><td>166-0602EDU</td><td><a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">www.bio-rad.com</a></td></tr><tr><td>İnkübatör/Çalkalayıcı</td><td>Eppendorf</td><td>Excella E25</td><td><a href="http://www.eppendorf.com/" target="_blank"> www.eppendorf.com</a></td></tr><tr><td>Ultraviyole Işık Modeli#: UVGL-25</td><td>UVP</td><td>95-0021-12</td><td><a href="http://www.uvp.com/" target="_blank">www.uvp.com</a></td></tr></tbody></table>

rekombinant proteinlerin yüksek-düzey geçici İfade için bitkiler verimli agroinfiltration

Efficient Agroinfiltration of Plants for High-level Transient Expression of Recombinant Proteins

Memeli hücre kültürü İnsan aşısı ve terapötik proteinler bölgesinin ticari bir üretimi için gerekli ana bir platform olduğunu. Ancak, onun sınırlı ölçeklenebilirlik ve yüksek maliyet nedeniyle ilaç için artan dünya çapında talep karşılamak değildir. Bitkiler sağlam, ölçeklenebilir, düşük maliyetli ve güvenli olan en umut verici alternatif ilaç üretim platformlarından biri olduğu gösterilmiştir var. Virüs-temelli Vektörel Çizimler bölgesinin son gelişme bitkilerde otelinin yeniden birleştirici proteinlerin bölgesinin çabuk ve daha yüksek-düzey geçici ifade izin verdi biriktirdi. Daha da geçici ifade sisteminin yardımcı programı optimize etmek için, biz bu çalışmada bitki doku içine hedef-genini içeren Agrobacterium tanıtmak için bir, basit, verimli ve ölçeklenebilir metodoloji göstermek. GFP ve DsRed; Bizim sonuçlarımız yöntemleri yaprakları ve, iki floresan proteinleri bölgesinin sağlam bir üretim haline Agrobacterium&#39;un bölgesinin etkin bir şekilde giriş sonuçlandı oylandı şırınga ve vakum her ikisi de ile bu agroinfiltration işaret etmektedir. Bundan başka,biz her iki yöntem tarafından sunulan benzersiz avantajlar göstermek. Şırınga infiltrasyon basittir ve pahalı ekipman gerekmez. Bu, aynı zamanda esneklik ya da tek bir hedef geni ile olmak üzere bütün bir izni içine süzülmek maksadıyla, ya da bir yaprak ilgili sayısız birden fazla hedeflere bölgesinin genleri tanıtmak için fiyatları karşılaştırın. Bu nedenle, bu yeniden birleştirici proteinlerin bölgesinin laboratuar ölçekli bir ekspresyonu için yanı sıra tekrarlamalı olarak verim ya da ifade kinetiği, için farklı proteinler ya da Vektörel Çizimler fiyatları karşılaştırırken için ikinci el edilebilir. Şırınga infiltrasyon sadeliği, aynı zamanda biyoteknoloji konusunu için lise ve üniversite eğitimi yılında kendi programını göstermektedir. Buna karşılık yılında, vakum infiltrasyonu ile daha sağlam bir olduğunu ve farmasötik bir proteinlerin bölgesinin ticari bir Üretim yılı için ölçekli-kadar olabilir. Ayrıca bu tür marul ve Arabidopsis olarak şırınga infiltrasyon için mükellef değildir bitki türleri agroinfiltrate mümkün olmanın avantajı sunuyor. Genel olarak değiştirin, şırıngayı ve vakum agroinfiltration bölgesinin bir kombinasyon araştırmacı ve eğitimci tarafından görüşler sağlar, bir, basit, verimli, ve sağlamgeçici protein ekspresyonu için metodoloji. Bu büyük ölçüde ilaç proteinlerin gelişimi kolaylaştırmak ve fen eğitimi teşvik edecektir.

1. Şırınga İnfiltrasyon tarafından Floresan Proteinlerin İfade Geminiviral ve MagnICON - - N. iki farklı yapıbozuma bitki viral vektörler tarafından - GFP ve DsRed - bitki doku içine Agrobacterium şırınga infiltrasyonu etkinliğini göstermek için, biz iki floresan proteinleri ifadesi test benthamiana. N. için tamamen Agrobacteria&#39;nın ihtiva eden geminiviral Vektörel Çizimler ile birlikte infiltre edildi benthamiana yaprakları, GFP ifade gibi erken...

Bitkiler Geçerli ifade paradigmalar göre daha daha fazla, ölçeklenebilir bir maliyet-etkin ve emniyetli olan, bir ticari bir ölçekte ilgili sayısız farmasötik bir proteinlerin bölgesinin üretimi için bir Roman sistem mü tavsiye edeceksiniz. Bu çalışmada, biz içeren hedef-gen tanıtmak için bir basit ve kullanışlı, henüz ölçeklenebilir bir yaklaşım rapor<em&gt; Agrobacterium tumefaciens&#39;in</em&gt; Protein geçici ekspresyonu için bitkiler içine.

Rekombinant Proteinlerin Yüksek-düzey Geçici İfade için Bitkiler Verimli Agroinfiltration

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing ...

Bu deneysel sistem, yüksek düzeylerde rekombinant protein üretimi için gen konstrüktlarını yapraklara etkili bir şekilde iletmek amacıyla agro infiltrasyon yöntemini kullanır. İlk olarak, infiltrasyondan üç gün önce, end hamana bitkilerini kontrollü bir ortamda altı hafta boyunca yetiştirin. Bitkilerde eksprese edilecek hedef geni içeren agrobacterium kültürlerini infiltrasyon günü hazırlayın.Agrobacterium kültürlerini, şırınga veya vakum infiltrasyonu yoluyla bitki dokusuna aktarın. Tütün yapraklarının UV ışığı altında GFP'nin yeşil floresan yoğunluğu gibi sonuçlar, bitkilerde mevcut memeli, bakteriyel ve böcek tabanlı ekspresyon sistemleriyle yarışabilecek düzeyde güçlü bir rekombinant protein ekspresyonu olduğunu göstermektedir. Agro-infiltrasyon, transgenlerin bitki hücrelerine aktarılması için etkili bir yöntemdir ve rekombinant proteinlerin yüksek düzeyde ekspresyonu ile sonuçlanır.Geniş bir bitki türü yelpazesi için kullanılabilir. En önemlisi, farmasötik proteinlerin ticari üretimi için ölçeği büyütülebilir. Dolayısıyla bu yöntem, GFP'nin kinetiği ve ekspresyonu hakkında bilgi sağlayabilir; ayrıca subunit aşılar ve rekombinant monoklonal antikorlar gibi diğer proteinlere uygulanabilir, kanser ve enfeksiyöz hastalıkların tedavilerinde kullanılabilir.Başarılı bir deney, hem bakteri kültürü hem de bitki materyali için optimal koşullar gerektirir. Bu infiltrasyon işlemini, görsel gösterimden sonra tekrarlamak daha kolaydır. İşleme, 60 adede kadar torf peletini bir çoğaltma tepsisine yerleştirerek başlayın.Dört litre musluk suyu ekleyin ve torf peletlerinin suyu iki saat boyunca emmesini bekleyin. Şimdi, her bir torf peletine iki adet hamana tohumu ekleyin ve çimlendirme için tepsiyi şeffaf plastik bir kubbe ile kapatın. Tohumları 25 °C sıcaklık ve %84 nem içeren bir ortama yerleştirin.Ekimden iki hafta sonra kubbeyi kaldırın ve bitkileri yeni bir tepsiye aktarın. Ardından, litre başına 1,48 gramlık Jack gübresinden iki litre ekleyin. Bitkilerin 25 °C'de büyümesine devam edin.Her iki günde bir %50 nemli ortam sağlanır. Tepsi başına iki litre Jack gübresi verilir. Dördüncü haftada, bitkiler torf peletleri ile birlikte, altı haftalık yaşa kadar gelişmeye devam edebilmeleri için altı bitki kapasiteli yeni bir tepsiye aktarılır.Her biri beş ila altı yapraklı olan, altı haftalık dört adet Nicotiana benthamiana bitkisi seçin. İlgilenilen genleri taşıyan agrobakteri suşları ile tam infiltrasyon için üç yaprak, negatif kontrol için bir yaprak ve spot infiltrasyon için bir yaprak ayırın. Yaprağın arka yüzündeki epidermiste, yaprağı her iki taraftan delmediğinizden emin olarak bir iğne ile küçük bir çentik açın.Bir elinizin başparmağıyla boyun kısmına hafifçe karşı basınç uygularken, ilk yaprağın ön tarafını sıkıca tutun. Agrobacterium karışımlarını, infiltrasyon tamponu içerisinde, bir şırınga ve iğne yardımıyla boyun kısmına enjekte edin.Koyu yeşil halka genişlemeyi bırakana kadar agrobacterium karışımlarını çentiğe enjekte etmeye devam edin. Ardından başka bir çentik açın ve tüm yaprak infiltre olup yaprağın tamamı koyu yeşile dönene kadar enjeksiyonları tekrarlayın. İlk üç yaprağın infiltrasyonunu tamamlayın ve her bitkinin dördüncü yaprağı için dört Gemini viral vektörünün tamamı veya üç magcon vektörü içeren vektör kombinasyonlarıyla infiltrasyon yapın.Ayrıca, her bir agrobacterium suş kombinasyonu için bir çentik oluşturun ve her çentiğe bir kombinasyon infiltre edin. İnfiltrasyondan sonra bitkileri büyüme odasına geri taşıyın ve 2 ile 15 gün arasında protein ekspresyonunu izleyin. İnfiltrasyon sonrası, bir küveti vakumlu desikatöre yerleştirin ve içine agrobacterium suşlarını içeren üç litre infiltrasyon tamponu aktarın.Ardından desikatörü bir vakum markası diyafram vakum pompasına bağlayın. Şimdi bir bitkiyi desikatör plakasına ters şekilde yerleştirin ve tüm yaprak ve gövde sistemi infiltrasyon tamponuna batana kadar, plaka küvetin üzerine oturacak şekilde bitkiyle birlikte plakayı indirin. Son olarak desikatör O halkasını kenar boyunca konumlandırın.Desikatör kapağını hazneye yerleştirdikten sonra vakum pompasını çalıştırın ve vakum 100 millibar'a ulaştığında süre tutmaya başlayın. Vakum pompasını kapattıktan sonra, 100 millibar'da bir dakika bekleyip desikatör üzerindeki tahliye valfini yavaşça açarak agro bacteria'nın daldırılmış bitki dokusunun interstisyel boşluklarına girmesini sağlayın. Bu infiltrasyonu tekrarlayın.İyi bir infiltrasyon sağlamak için bir kez bastırın. Ardından bitkiyi desikatörden çıkarın ve tekrar dik konumuna getirin. Bitkileri büyüme odasına geri taşıyın ve infiltrasyondan sonraki iki ila 15 gün arasında protein ekspresyonunu izleyin.Şırınga ile agrobacterium'un bitki dokusuna infiltrasyonunun etkinliğini göstermek için, Gemini viral ve magcon for end şeklindeki iki farklı yapılandırılmış bitki viral vektörü aracılığıyla iki floresan proteinin, GFP ve Ds red'in ekspresyonunu test ettik. Gemini viral vektörler içeren agrobacterium ile tamamen infiltre edilmiş Hamana yapraklarında, UV ışığı altında, 2 DPI kadar erken bir dönemden itibaren tüm yaprak alanında GFP ekspresyonu gözlemlenmiş ve maksimum birikim dört DPI'da gerçekleşmiştir.Buna karşılık, agrobacterium kombinasyonlarını içeren magcon vektörle infiltre edilen yapraklar, ancak beş DPI'dan sonra GFP floresansı göstermiş ve maksimum birikime yedi DPI'da ulaşmıştır. Negatif kontrol agrobacterium karışımları olan EP 10 plus P 19 ile infiltre edilen yapraklarda herhangi bir yeşil floresans gözlenmemiştir; bu durum, floresansın GFP genine özgü olduğunu ve yapraklardan kaynaklanan arka plan floresansının bir sonucu olmadığını göstermektedir. Maksimum birikim noktasında, GFP ifade eden magcon vektörün floresansı, Gemini viral vektörünkine göre daha yoğundur.Her iki floresan protein, Gemini viral vektörleri ve şırınga ile nokta infiltrasyonu aracılığıyla aynı yaprakta eksprese edildiğinde, GFP konstrüktlarının infiltre edildiği yapraklarda belirgin bir nekroz gözlemlenmedi; proteinler, infiltre edildikleri noktada beklenen floresan renklerinde tespit edildi. İlginç bir şekilde, GFP ve DS RED'in birlikte infiltre edilmesi sarımsı bir floresansa yol açtı. Bitki geçici ekspresyon sistemleri kullanılarak rekombinant proteinlerin büyük ölçekli üretimi için ölçeklenebilir bir agro-infiltrasyon yöntemi geliştirmek amacıyla vakum infiltrasyonu da incelenmiştir.Şırınga infiltrasyonuyla karşılaştırıldığında, infiltre edilen bitkinin tüm yapraklarında beklendiği gibi GFP floresansı gözlemlenmiştir. Bu yöntem daha sağlamdır ve her bir bitkinin infiltrasyonunu çok daha kısa bir zaman diliminde gerçekleştirebilir. Uzmanlaşıldığında, bu teknik 48 saat içinde tamamlanabilir.Asıl infiltrasyon süresi sadece birkaç dakika sürdüğü için bu işlem çoğunlukla agro bakteriyel kültür için uygulanır. Optimal agro infiltrasyon verimliliği ve hedeflenen protein ekspresyonu için protokole uyunuz. Bitki biyoteknolojisi alanında; bitki büyüme koşulları, agro bakteriyel konsantrasyon, vakum basıncı ve süre dahil olmak üzere kritik parametreleri kontrol etmeyi unutmayınız.Bu deneysel yaklaşım, geniş bir bitki türü yelpazesinde yeni farmasötik proteinlerin geliştirilmesini ve biyoprodüksiyonunu araştırmak için kullanılabilir. Bu videoyu izledikten sonra, hedef gen konstrüktlarını bitkiye aktarmak ve bitki geçici ekspresyon sistemlerinin, memeli, bakteriyel ve böcek hücre kültürleriyle yarışabilecek düzeyde rekombinant protein üretmesini sağlamak için agro infiltrasyonun nasıl kullanılacağı konusunda iyi bir fikre sahip olmalısınız.

efficient-agroinfiltration-plants-for-high-level-transient-expression

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Agroinfiltrasyon ve PVX agroinfection, bitkilerdeki genlerin geçici ektopik ekspresyonu için rutin fonksiyonel tahlillerdir. Bu yöntemler, efektoromik stratejilerde (hızlı direnç ve avirulence gen keşfi) etkili tahlillerdir ve moleküler bitki patolojisinde modern araştırmalar için çok önemlidir. Tesislerde sağlam yüksek verimli fonksiyonel analiz talebini karşılarlar.

Patates ve Nicotiana benthamiana'da Agroinfiltrasyon ve PVX Agroinfection

Agrobacteria (Tütün mozaik virüsü-esaslı) aşı antijenleri ve terapötik proteinleri üretmek için hızlı ve ekonomik bir yaklaşımdır başlatmak vektörleri taşıma ile vakum infiltrasyonu göre Nicotiana bitkilerinde geçici protein üretimi. Biz prosedürü basitleştirilmiş ve bakteri yetiştirme koşulları optimize konak türlerin seçimi, ve RNA susturulması bastırıcılara ko-tanıtarak hedef birikimini geliştirdi.

Optimizasyon ve Kullanımı<em&gt; Agrobacterium</emIn&gt; aracılı Geçici Protein Üretimi<em&gt; Nicotiana</em

Tütün bitkileri, bir geçici ekspresyon sistemi ile, bir fungal selülaz, TrCel5A üretmek için kullanıldı. Ekspresyon, bir floresan füzyon proteini kullanılarak takip edilebilir, ve protein aktivitesi post-ekspresyon karakterize edilmiştir.

Rekombinant Cellulase Cel5A İfade itibaren<em&gt; Trichoderma reesei</em&gt; Tütün Bitkilerinde

Bu çalışmada, hedef insan rekombinant proteininin farklı üretim platformlarındaki ekspresyonu karşılaştırıldı. Geleneksel fermentör bazlı kültürlere ve bitkilere odaklandık, her bir sistemin kurulumunu açıkladık ve rapor edilen sonuçlara dayanarak her platform için doğal sınırları ve avantajları vurguladık.

Bakteriler, Böcek Hücreleri ve Bitki Sistemleri: Rekombinant Protein Farklı Biofactories İfade Karşılaştırmalı Analizi

Bitki hücreler arası bağlantıları, plasmodesmata (Pd), Fizyoloji ve bitki-virüs etkileşimleri bitki merkezi rol oynarlar. Kritik Pd taşıma olarak proteinler Pd için doğrudan sinyalleri sıralama. Ancak, bu DNA dizileri hakkında bilgimizi henüz emekleme aşamasında olduğunu. Pd yerelleştirme sinyalleri Pd hedeflenmiş proteinler tanımlamak için bir strateji tanımlarlar.

Proteinlerin içinde Planta serilerinde Plasmodesmal yerelleştirme tanımlaması

Nonlytic böcek hücresi ifade sistemleri üretim, selüler trafik / lokalizasyonu ve rekombinant protein, fonksiyonel analiz için atıl edilir. Burada, ticari olarak temin edilebilen bir lepidopteran hücresi çizgilerinde ifade vektörleri ve daha sonra geçici protein sentezlenmesinin üretilmesi için yöntemleri tarif eder. Hücre içi fluoresan işaretleyici proteinleri ile Bemisia tabaci aquaporins eş yerleşimi de sunulmuştur.

Kültürlü Böcek Hücrelerinde Geçici İfade ve Rekombinant Proteinlerin Hücresel Yerelleştirme

Geçici Contegra ifade Nicotiana benthamiana yaprakları biyosentetik enzimlerin 2,3-oxidosqualene yeni yüksek değerli triterpen ürünleri doğru endojen malzemeleri yönlendirebilirsiniz. Burada olduğunu hızlı (5 gün) hazırlık-ölçekli üretim triterpeneler ve bu güçlü bitki tabanlı platformu kullanan analogları için detaylı bir protokol açıklanan.

Partiye Hazırlık bir ölçekte triterpen üretim için geçici Nicotiana Benthamiana ifadede bırakır

Burada açıklanan Nicotiana benthamiana yaprak dokusunda NLR bağışıklık reseptörünün TIR etki alanının etkileşim ortaklarının belirlenmesi için bir yakınlık etiketleme yöntemidir. Ayrıca Nicotiana ve diğer bitki türlerinde bu tekniği kullanarak ilgi diğer proteinler arasındaki etkileşimlerin belirlenmesi için ayrıntılı bir protokol sağlanır.

Protein-Protein Etkileşim Ağlarının Planta Özdeşleştirilmesinde TurboID Tabanlı Yakınlık Etiketlemesi

Burada ifade, çıkarma ve rekombinant insan IgG arınma için basit bir yöntem Nicotiana benthamianaGFP erimiş açıklar. Bu protokol, kolon kromatografisi kullanan çok sayıda proteinin saflaştırılması ve görselleştirilmesi için genişletilebilir. Ayrıca protokol, proje tabanlı keşif ler sağlayan, şahsenn ve sanal üniversite öğretim laboratuvarına uyarlanabilir.

Nicotiana benthamiana'da Geçici Olarak Ifade Edilen IgG Füzyon Proteinlerinin Üretimi

Burada, model olarak AT4G18020 (APRR2)-AirID proteini kullanarak salatalıkta (Cucumis sativus L.) yakınlık etiketleme (PL) deneyini gerçekleştirmek için adım adım bir protokol sunuyoruz. Yöntem, bir vektörün inşasını, agroinfiltrasyon yoluyla bir yapının dönüşümünü, biyotin infiltrasyonunu, protein ekstraksiyonunu ve afinite saflaştırma tekniği ile biyotin etiketli proteinlerin saflaştırılmasını açıklar.

Bitkilerde protein-protein etkileşimi için AirID tabanlı yakınlık etiketlemesi

Burada, büyük boyutlu bitkilerin genetik dönüşümünün in vivo çalışmaları için lokalize vakum infiltrasyonu için ilk protokolü sunuyoruz. Bu metodolojiyi kullanarak, ilk kez kakaonun planta geçici dönüşümünde Agrobacterium aracılı hale getirdik.

İnatçı Bitkilerin Planta Dönüşümü için Vakumla Zorla Agroinfiltrasyon: Bir Vaka Çalışması Olarak Kakao

Öğrenin, Agrobacterium tumefaciens kullanarak bitkilerde rekombinant protein üretimi için agroinfiltrasyon yöntemini. Bu teknik, farmasötik proteinlerin hızlı ve ölçeklenebilir üretimi için etkili bir alternatif sunar.

Rekombinant Proteinlerin Yüksek-düzey Geçici İfade için Bitkiler Verimli Agroinfiltration

Daha fazla video keşfet