Rekombinant Proteinlerin Yüksek-düzey Geçici İfade için Bitkiler Verimli Agroinfiltration

Bu deneysel sistem, yüksek seviyelerde rekombinant protein üretimi için gen yapılarını yapraklara etkili bir şekilde iletmek için tarımsal infiltrasyon kullanır. İlk olarak, sızmadan üç gün önce, altı hafta boyunca kontrollü bir ortamda son hamana bitkilerini büyütün. Bitkilerde eksprese edilecek hedef geni içeren agrobakteri kültürlerini infiltrasyon gününde hazırlayın.

Agrobakteri kültürlerini şırınga veya vakum infiltrasyonu ile bitki dokusuna sokun. UV ışığı altında tütün yapraklarındaki GFP'nin yeşil floresansının yoğunluğu gibi sonuçlar, bitkilerde mevcut memeli bakteri ve böcek bazlı ekspresyon sistemlerine rakip olan sağlam bir rekombinant protein ekspresyonunu göstermektedir. Agro infiltrasyon, trans genleri bitki hücrelerine sokmanın etkili bir yoludur, bu da rekombinant proteinlerin yüksek düzeyde ekspresyonuna yol açar.

Çok çeşitli bitki türleri için kullanılabilir. En önemlisi, farmasötik proteinlerin ticari üretimi için ölçeklendirilebilir. Dolayısıyla bu yöntem, GFP'nin kinetiği ve ekspresyonu hakkında bilgi sağlayabilir ve alt birim aşılar, rekombinant monoklonal antikorlar gibi diğer proteinlere uygulanabilir ve kanser ve bulaşıcı hastalık tedavilerinde kullanılabilir.

Başarılı bir deney, hem bakteri kültürü hem de bitki materyali için en uygun koşulları gerektirir. Bu sızma işleminin görsel gösterimden sonra tekrarlanması daha kolaydır. Bir çoğaltma tepsisine 60'a kadar turba peleti yerleştirerek başlayın.

Dört litre musluk suyu ekleyin ve bezelye peletlerinin suyu iki saat boyunca emmesine izin verin. Şimdi, her turba peletine iki ve hamana tohumu ekleyin ve çimlenme için tepsiyi şeffaf plastik bir kubbe ile örtün. Tohumları 25 santigrat derece,% 84 nemli bir ortama yerleştirin.

Tohumlamadan iki hafta sonra kubbeyi çıkarın ve bitkileri yeni bir tepsiye aktarın. Sonra litre başına iki litre 1.48 gram ekleyin. Jack'in gübresi Bitkileri 25 santigrat derecede büyütmeye devam edin.

Her iki günde bir% 50 nem ortamı. Tepsi başına iki litre kriko gübresi verin. Dördüncü haftada, turba peletli bitkileri, altı haftalık olana kadar daha fazla büyüme için altı bitkiye ev sahipliği yapan yeni bir tepsiye aktarın.

İlgilenilen genleri barındıran agro bakteri suşları ile tam sızma için her biri üç yapraklı beş ila altı yapraklı dört, altı haftalık ve hamama bitkilerini seçin. Negatif kontrol için bir yaprak ve nokta sızması için bir kanat. Yaprağın arka tarafındaki epidermiste bir iğne ile küçük bir çentik oluşturun ve yaprağı her iki taraftan delmemeye dikkat edin.

Boynunuza hafif bir karşı baskı uygularken ilk yaprağın ön tarafını sıkıca tutun. Bir elin baş parmağıyla. Agrobacterium karışımlarını infiltrasyon tamponunda bir şırınga, bir iğne ile boynuna enjekte edin.

Agrobacterium karışımlarını, koyu yeşil dairenin genişlemesi durana kadar çentik içine enjekte etmeye devam edin. Ardından başka bir çentik oluşturun ve tüm yaprak sızana ve tüm yaprak daha koyu yeşile dönene kadar enjeksiyonları tekrarlayın. Her bitkinin dördüncü yaprağı için ilk üç yaprağın ve son yaprağın tam sızmaları, dört İkizler viral vektörünün tümünün veya üç magcon vektörünün vektör kombinasyonları ile sızar.

Ayrıca, agrobacterium suşlarının her kombinasyonu için bir çentik yapın ve her çentiği bir kombinasyonla sızın. Sızmadan sonra, bitkileri büyüme odasına geri taşıyın ve iki ila 15 gün arasında protein ekspresyonunu izleyin. Sızma sonrası, bir küveti vakumlu bir kurutucuya yerleştirin ve agrobacterium suşlarını içeren üç litre infiltrasyon tamponuna aktarın.

Ardından kurutucuyu bir vakum marka diyaframlı vakum pompasına bağlayın. Şimdi bir bitkiyi kurutma plakasının üzerine baş aşağı yerleştirin ve tüm yaprak ve gövde sistemi, plaka küvetin üzerinde dururken sızma tamponuna daldırılana kadar bitkiyle birlikte plakayı indirin. Ardından, kurutucu O halkasını jant boyunca konumlandırın.

Kurutucu kapağı hazneye koyduktan sonra, vakum pompasını açın ve vakum 100 milibar'a ulaştığında zamanlamaya başlayın. Vakum pompasını kapattıktan sonra, tarımsal bakterilerin batık bitki dokusunun ara boşluklarına girmesine izin vermek için bir dakika sonra 100 milibar'da kurutucu üzerindeki tahliye vanasını yavaşça açın. Bu sızmayı tekrarlayın.

İyi bir sızma sağlamak için adım adımlar. Daha sonra bitkiyi kuruduktan çıkarın ve tekrar dik konuma getirin. Bitkileri büyüme odasına geri taşıyın ve sızmadan iki ila 15 gün sonra protein ekspresyonunu izleyin.

Şırınganın etkinliğini, agrobakterinin bitki dokusuna sızmasını göstermek için, iki farklı yapısız bitki viral vektörü, Gemini, viral ve magcon for end ile GFP ve Ds kırmızı olmak üzere iki floresan proteinin ekspresyonunu test ettik. İkizler viral vektörleri içeren agro bakterilerle tamamen sızmış Hamana yaprakları. GFP ekspresyonu, UV ışığı altında tüm yaprak alanı boyunca, 2D PI kadar erken bir seviyeden başlayarak gözlemlendi ve dört DPI'da en yüksek birikime ulaştı.

Buna karşılık, agrobakteri kombinasyonları içeren magcon vektörü ile sızan yapraklar, yalnızca beş DPI'den sonra GFP floresansı gösterdi ve yedi DPI'da maksimum birikimine ulaştı. EP one 10 artı P 19'un negatif kontrol agro bakteri karışımları ile sızan yapraklardan yeşil floresan gözlenmedi, bu da floresansın GFP genine özgü olduğunu ve yapraklardan gelen arka plan floresansının sonucu olmadığını gösteriyor. En yüksek birikiminde, GFP'ye ifade edilen magcon vektörünün floresansı, Gemini viral vektörününkinden daha yoğundur.

Şırınga nokta infiltrasyonu ile Gemini viral vektörleri aracılığıyla aynı yaprak üzerinde her iki floresan protein eksprese edildiğinde GFP yapıları ile infiltre edilen yapraklarda majör nekroz gözlenmemiş, infiltrasyona uğradıkları noktada beklenen floresan renkleri ile tespit edilmiştir. İlginç bir şekilde, GFP ve DS RED'in birlikte infiltrasyonu sarımsı floresan ile sonuçlandı. Bitki geçici ekspresyon sistemleri tarafından rekombinant proteinlerin büyük ölçekli üretimi için kullanılabilecek ölçeklenebilir bir tarımsal infiltrasyon yöntemi geliştirmek için vakum infiltrasyonu da incelenmiştir.

Beklendiği gibi, şırınga sızmasına kıyasla sızan bitkinin tüm yaprakları için GFP floresansı gözlendi. Daha sağlamdır ve çok daha kısa bir zaman dilimi ile her bitkinin sızmasını sağlayabilir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik 48 saat içinde uygulanabilir.

Çoğu zaman agro bakteri kültürü içindir, çünkü gerçek sızma süresi sadece birkaç dakika uzunluğundadır Optimum agro infiltrasyon verimliliği ve hedeflenen protein ekspresyonu için. Protokolü takip edin. Bitki biyoteknolojisi alanında bitki büyüme koşulları, tarımsal bakteri konsantrasyonu, vakum basıncı ve süre dahil olmak üzere kritik parametreleri kontrol etmeyi unutmayın.

Bu deneysel yaklaşım, çok çeşitli bitki türlerinde yeni farmasötik proteinlerin geliştirilmesini ve biyoüretimini araştırmak için kullanılabilir. Bu videoyu izledikten sonra, bitkiye hedef gen yapılarını iletmek ve bitki geçici ekspresyon sistemlerinin memeli bakteri ve böcek hücre kültürlerine rakip olan rekombinant protein üretmesine izin vermek için tarımsal sızmanın nasıl kullanılacağı hakkında iyi bir fikre sahip olmalısınız.