Name: Lösin zengin metabolik etiketleme Fosfat ile radyoaktif Kinazlar 1 ve 2, tekrar (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-18T11:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: Öğrenin, LRRK1 ve LRRK2 kinazlarını radyoaktif fosfatlarla metabolik etiketleme yöntemiyle hücresel fosforilasyon düzeylerini nicelendirmeyi. Bu teknik, spesifik fosfo antikorları olmadan da toplam hücresel fosforilasyonu değerlendirmeyi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz de bu çalışmayı destekleyen Michael J. Fox Vakfı&#39;na müteşekkiriz. Flanders FWO (FWO proje G.0666.09, JMT kıdemli araştırmacı bursu), IWT SBO/80020 proje Nöro-TARGET, KU Leuven (OT/08/052A ve IOF-KP/07 / 001) - Biz Araştırma Vakfı&#39;na teşekkür verdikleri destek için. Bu araştırma aynı zamanda JMT için King Baudouin Vakfı tarafından yönetilen Fon Druwé-Eerdekens tarafından kısmen desteklenmiştir.

<ol><li>Hanafusa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leucine-rich+repeat+kinase+LRRK1+regulates+endosomal+trafficking+of+the+EGF+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Leucine-rich repeat kinase LRRK1 regulates endosomal trafficking of the EGF receptor.</a> Nat Commun. 2, 158(2011).</li>
<li>Titz, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+proximal+signaling+network+of+the+BCR-ABL1+oncogene+shows+a+modular+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">The proximal signaling network of the BCR-ABL1 oncogene shows a modular organization.</a> Oncogene. 29, 5895-5910 (2010).</li>
<li>Cookson, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+leucine-rich+repeat+kinase+2+%28LRRK2%29+in+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The role of leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) in Parkinson's disease.</a> Nat Rev Neurosci. 11, 791-797 (2010).</li>
<li>Taymans, J. M., Cookson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+dominant+parkinsonism%3B+the+toxic+triangle+of+LRRK2%2C+alpha-synuclein+and+tau%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of dominant parkinsonism; the toxic triangle of LRRK2, alpha-synuclein and tau.</a> Bioessays. 32, 227-235 (2010).</li>
<li>Lewis, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+function+of+ROCO+proteins+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">The function of ROCO proteins in health and disease.</a> Biol Cell. 101, 183-191 (2009).</li>
<li>Marin, I., van Egmond, W. N., van Haastert, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Roco+protein+family%3A+a+functional+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">The Roco protein family: a functional perspective.</a> FASEB J. 22, 3103-3110 (2008).</li>
<li>Marin, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Parkinson+disease+gene+LRRK2%3A+evolutionary+and+structural+insights%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.Biol.Evol%22%5BJournal%5D)">The Parkinson disease gene LRRK2: evolutionary and structural insights.</a> Mol.Biol.Evol. 23, 2423-2433 (2006).</li>
<li>Marin, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ancient+origin+of+the+Parkinson+disease+gene+LRRK2%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Evol%22%5BJournal%5D)">Ancient origin of the Parkinson disease gene LRRK2.</a> J Mol Evol. 67, 41-50 (2008).</li>
<li>Lobbestael, E., Baekelandt, V., Taymans, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+of+LRRK2%3A+from+kinase+to+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Soc+Trans%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation of LRRK2: from kinase to substrate.</a> Biochem Soc Trans. 40, 1102-1110 (2012).</li>
<li>Gloeckner, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphopeptide+Analysis+Reveals+Two+Discrete+Clusters+of+Phosphorylation+in+the+N-Terminus+and+the+Roc+Domain+of+the+Parkinson-Disease+Associated+Protein+Kinase+LRRK2%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Phosphopeptide Analysis Reveals Two Discrete Clusters of Phosphorylation in the N-Terminus and the Roc Domain of the Parkinson-Disease Associated Protein Kinase LRRK2.</a> J Proteome Res. 9, 1738-1745 (2010).</li>
<li>Nichols, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((14-3-3+binding+to+LRRK2+is+disrupted+by+multiple+Parkinson%27s+disease-associated+mutations+and+regulates+cytoplasmic+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">14-3-3 binding to LRRK2 is disrupted by multiple Parkinson's disease-associated mutations and regulates cytoplasmic localization.</a> Biochem J. 430, 393-404 (2010).</li>
<li>Greggio, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+LRRK2%2Fdardarin+associated+with+Parkinson+disease+are+more+toxic+than+equivalent+mutations+in+the+homologous+kinase+LRRK1%5BTitle%5D)+AND+%22J.Neurochem%22%5BJournal%5D)">Mutations in LRRK2/dardarin associated with Parkinson disease are more toxic than equivalent mutations in the homologous kinase LRRK1.</a> J.Neurochem. 102, 93-102 (2007).</li>
<li>Taymans, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LRRK2+Kinase+Activity+Is+Dependent+on+LRRK2+GTP+Binding+Capacity+but+Independent+of+LRRK2+GTP+Binding%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">LRRK2 Kinase Activity Is Dependent on LRRK2 GTP Binding Capacity but Independent of LRRK2 GTP Binding.</a> PLoS One. 6, 23207-23 (2011).</li>
<li>Daniëls, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insight+into+the+mode+of+action+of+the+LRRK2+Y1699C+pathogenic+mutant%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Insight into the mode of action of the LRRK2 Y1699C pathogenic mutant.</a> J Neurochem. 116, 304-315 (2011).</li>
<li>Civiero, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+characterization+of+highly+purified+leucine-rich+repeat+kinases+1+and+2+demonstrates+formation+of+homodimers%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Biochemical characterization of highly purified leucine-rich repeat kinases 1 and 2 demonstrates formation of homodimers.</a> PLoS One. 7, e43472(2012).</li>
<li>Taymans, J. M., Van den Haute, C., Baekelandt, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+PINK1+and+LRRK2+in+rat+and+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.Neurochem%22%5BJournal%5D)">Distribution of PINK1 and LRRK2 in rat and mouse brain.</a> J.Neurochem. 98, 951-961 (2006).</li>
<li>Lewis, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assaying+the+kinase+activity+of+LRRK2+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Assaying the kinase activity of LRRK2 in vitro.</a> J Vis Exp. , (2012).</li>
<li>Lobbestael, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+detection+of+transgene+expression+in+the+brain+using+small+epitope+tags%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical detection of transgene expression in the brain using small epitope tags.</a> BMC Biotechnol. 10, 16(2010).</li>
<li>Davies, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+Characterization+and+Optimization+of+Leucine+Rich+Repeat+Kinase+2+%28LRRK2%29+Monoclonal+Antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Comprehensive Characterization and Optimization of Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) Monoclonal Antibodies.</a> Biochem J. , (2013).</li>
<li>West, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkinson%27s+disease-associated+mutations+in+LRRK2+link+enhanced+GTP-binding+and+kinase+activities+to+neuronal+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.Mol.Genet%22%5BJournal%5D)">Parkinson's disease-associated mutations in LRRK2 link enhanced GTP-binding and kinase activities to neuronal toxicity.</a> Hum.Mol.Genet. 16, 223-232 (2007).</li>
<li>Sheng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ser1292+autophosphorylation+is+an+indicator+of+LRRK2+kinase+activity+and+contributes+to+the+cellular+effects+of+PD+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Ser1292 autophosphorylation is an indicator of LRRK2 kinase activity and contributes to the cellular effects of PD mutations.</a> Sci Transl Med. 4, 164ra161(2012).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation-dependent+14-3-3+binding+to+LRRK2+is+impaired+by+common+mutations+of+familial+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation-dependent 14-3-3 binding to LRRK2 is impaired by common mutations of familial Parkinson's disease.</a> PLoS One. 6, e17153(2011).</li>
<li>Dzamko, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+LRRK2+kinase+activity+leads+to+dephosphorylation+of+Ser%28910%29%2FSer%28935%29%2C+disruption+of+14-3-3+binding+and+altered+cytoplasmic+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Inhibition of LRRK2 kinase activity leads to dephosphorylation of Ser(910)/Ser(935), disruption of 14-3-3 binding and altered cytoplasmic localization.</a> Biochem J. 430 (910), 405-413 (2010).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Bu çalışma, 32 P-ortofosfat ile metabolik etiketleme kullanılarak hücre hatlarında LRRK1 ve LRRK2 genel fosforilasyonu seviyesinin tahlil için temel bir protokolü sağlar. Genel bir strateji basittir. Affinity LRRK proteinler 32 P-ortofosfat içeren ortama maruz kalan HEK293T hücrelerinde ifade edilmiştir etiketlendi. 32 P-ortofosfat sadece birkaç saat inkübasyon ve fosfatlar içeren hücre içindeki tüm molekülleri sonra hücreler tarafından asimile edilir ve böylece radyoaktif olarak etiketl...

Lösin zengin tekrar kinazlar 1 ve 2 (LRRK1 ve LRRK2) benzer bir etki organizasyon paylaşan multidomain paraloglarıdır. Her iki protein de etkili ROCO protein ailesine 5,6 proteinleri de sınıflandırma, GTPases (Complex Proteinlerin Ras veya ROC) Ras ailesi, hem de etki ROC (COR) bir C-terminaline yakın bir GTPaz dizisini kodlar. Sadece LRRK2 İlave armadillo Domein 6-8 kodlayan ise ROC-COR etki tandem N-terminal, her iki proteinin de, bir lösin-zengini tekrar etki hem de ankirin benzeri alanı kodlar. Sadece LRRK2 C-terminal bölgesinde 8, içinde bir WD40 alanını şifreleyen ise ROC-COR C-terminal, her iki proteinin de, bir serin-tireonin kinaz etki alanını paylaşırlar. LRRK1 ve LRRK2 kesin hücresel rolleri ancak LRRK1 1,2 işaret tirosin kinaz reseptörü implike edilmiştir, henüz aydınlatılamamıştır varken Parkinson hastalığı 3,4 patogenezinde LRRK2 için bir role genetik kanıtlar. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; proteinlerin fosforilasyonu hücrelerinde ortak düzenleyici mekanizmadır. Örneğin, fosforilasyon enzim aktivasyonu için bir sinyal ya da kompleksine protein alımı için gerekli olabilir. LRRK2 hücresel fosforilasyonu yaygın olarak karakterize edilmiştir ve phosphosite eşleme ankirin tekrar ve lösin açısından zengin tekrar etki 9-11 arasında bir küme meydana geldiği hücre fosforilasyon bir çoğunluğu göstermiştir. LRRK1 hücre fosforilasyon siteleri eşlenmesi için henüz rağmen, COS7 hücrelerinden imüno LRRK1 protein lekelerinin fosfoprotein boyaması kullanılarak çalışmalar göstermiştir LRRK1 protein hücrelerinde fosforile 12 olduğunu göstermektedir. Bu çalışma, 32 P-ortofosfat ile metabolik etiketleme kullanılarak hücre hatlarında LRRK1 ve LRRK2 genel fosforilasyonu seviyesinin tahlil için temel bir protokolü sağlar. Genel bir strateji basittir. Affinity LRRK prote etiketlendiins 32 P-ortofosfat içeren ortama maruz kalan HEK293T hücrelerinde ifade edilmiştir. 32 P-ortofosfat sadece birkaç saat inkübasyon ve fosfatlar içeren hücre içindeki tüm molekülleri sonra hücreler tarafından asimile edilir ve böylece radyoaktif olarak etiketlenmiştir. Afinite etiketi (3xflag), daha sonra, immüno-çökeltme ile diğer hücresel bileşenlerden LRRK proteinleri izole etmek için kullanılır. İmmüno-çökeltiler daha sonra SDS-PAGE ile ayrılmış, PVDF membran ve dahil fosfatlar analizine lekelendi blotlar üzerinde proteinlerin otoradyografi (32 P sinyali) ve batı algılama (protein sinyali) ile gerçekleştirilir.

<table><tbody><tr><td>Fosfor-32 Radyonüklid, 1 mCi, 1 ml su içinde tampon disodyumfosfat</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEX011001MC</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#8217; s Modifiye Eagle Medium (D-MEM) (1X), sıvı (yüksek glikoz)</td><td>Invitrogen</td><td>11971-025</td><td>Bu besiyeri fosfat içermez</td></tr><tr><td>Anti Flag M2 afiinty jel</td><td>Sigma</td><td>A2220</td><td>Kırmızı renkli jel içeren eşdeğer bir ürün için (boncukları daha kolay görselleştirmek için kullanışlıdır), kedi kullanın. Hayır. F2426.</td></tr><tr><td>Ekstra kalın kurutma filtresi</td><td>Bio-Rad</td><td>1703965</td><td></td></tr><tr><td>Ponceau S solüsyonu</td><td>Sigma</td><td>P7170</td><td></td></tr></tbody></table>

lösin zengin metabolik etiketleme fosfat ile radyoaktif kinazlar 1 ve 2, tekrar

Metabolic Labeling of Leucine Rich Repeat Kinases 1 and 2 with Radioactive Phosphate

Lösin açısından zengin tekrar kinazlar 1 ve 2 (LRRK1 ve LRRK2), bir serin-tireonin kinaz, kompleks protein etki alanının bir Ras (ROC), ROC etki (COR) bir C-terminali dahil olmak üzere, benzer bir etki organizasyon paylaşan paraloglarıdır ve lösin bakımından zengin ve N-terminalinde ankirin-benzeri tekrarlar. LRRK1 ve LRRK2 kesin hücresel rolleri LRRK2 Parkinson hastalığı 3,4 patogenezinde implike ise ancak LRRK1, 1,2 sinyal tirosin kinaz reseptörü implike edilmiştir, aydınlatılamamıştır henüz. Bu raporda, bu şekilde, bu hücreler 2 proteinlerin genel fosforilasyon seviyelerini ölçmek için bir araç sağlayan, 32P ortofosfat ile hücrelerde LRRK1 ve LRRK2 proteinleri etiketlemek için bir protokol mevcut. Kısacası, afinite LRRK proteinler 32 P-ortofosfat içeren ortama maruz kalan HEK293T hücrelerinde ifade edilir etiketlendi. 32 P-ortofosfat sonra hücreler tarafından asimile sadece bir kaçinkübasyon süresi ve fosfatlar içeren hücre içindeki tüm molekülleri, bu şekilde radyoaktif olarak etiketlenmiştir. Afinite etiketi ile (3xflag) LRRK proteinlerin immüno-çökeltme ile diğer hücresel bileşenlerinden izole edilmiştir. İmmüno-çökeltiler daha sonra SDS-PAGE ile ayrılmış, PVDF membran ve dahil fosfatlar analizine lekelendi blotlar üzerinde proteinlerin otoradyografi (32 P sinyali) ve batı algılama (protein sinyali) ile gerçekleştirilir. Protokol kolayca hücrelerinde ifade edilir ve immüno-çökeltme ile izole edilebilir herhangi bir başka proteinin fosforilasyonunu izlemek için adapte edilebilir.

<html> Hücrelerde LRRK1 ve LRRK2 genel fosforilasyon düzeylerini karşılaştırmak amacıyla, 3xflag LRRK1 etiketli ve LRRK2 HEK293T hücrelerde 15 olarak ifade edildi. Hücreler, 6 oyuklu plakalar içerisinde kültürlendi ve 32 P ile etiketlenmiş ve protokol metinde yukarıda tarif edildiği gibi analiz edildi. Şekil 1, HEK293T hücrelerinde LRRK1 ve LRRK2 metabolik etiketlenmesi için temsili sonuçlar gösterilmektedir. Radyoaktif fosfat birleşme LRRK1 ve LRRK2 her ikisi için gözlemlenmiştir. ...

Lösin açısından zengin tekrar kinazlar 1 ve 2 (LRRK1 ve LRRK2) GTPaz ve kinaz alanları hem kodlama yapan ve hücrelerde fosforile edilmiş olan alanlı proteinlerdir. Burada, bu şekilde genel hücresel fosforilasyonunu seviyelerini ölçmek için bir araç sağlayan 32P ortofosfat ile hücrelerde LRRK1 ve LRRK2 etiketlemek için bir protokol mevcut.

Lösin zengin metabolik etiketleme Fosfat ile radyoaktif Kinazlar 1 ve 2, tekrar

Leucine rich repeat kinases 1 and 2 (LRRK1 and LRRK2) are paralogs which share a similar domain organization, including a serine-threonine kinase domain, ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, proteinleri, hücresel fosforilasyon seviyelerini ölçmek için ilgilenilen proteinleri radyoaktif fosfatlarla etiketlemektir. Bu, hücrelerde eksprese edilen proteinlerin fosfat modifikasyonlarını radyoaktif olarak etiketlemek için fosfor 32 varlığında hücrelerin kültürlenmesiyle elde edilir. İkinci adım olarak, işaretli hücreler parçalanır ve lizatlar, analiz edilecek proteinlerin immüno-saflaştırılması için bir afinite boncukları ile inkübe edilir.Etiketlenmiş ve saflaştırılmış proteinlerin daha sonraki numuneleri, sodyum do desal sülfat, poli akrilamid jel elektroforezi üzerinde çalıştırılır ve poli olain florür membranlarına lekelenir. Radyoaktif fosfat katılımını ve protein seviyelerini tespit etmek için, lösin açısından zengin tekrar kinazlar bir ve iki, kısaltılmış L rrk bir ve L rrk iki, hücrelerde oto radyografi ve immün tespite dayalı olarak karşılaştırılabilir seviyelere fosforile edildiğini gösteren sonuçlar elde edilir. Metabolik etiketleme tekniğinin fosfo, immünoblotlama gibi diğer tekniklere kıyasla önemli bir avantajı, bu tekniğin, fosfo antikorlarının bulunmadığı proteinler de dahil olmak üzere proteinlerin toplam hücresel fosforilasyon

metabolic-labeling-leucine-rich-repeat-kinases-1-2-with-radioactive

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Lösin Zengin Kinaz 2 tekrarlayın büyük bir multidomain kinaz, mutasyonlar olan Parkinson hastalığı, en sık rastlanan genetik nedenidir. Bu protein kinaz aktivitesinin analizi, biyoloji ve bu protein disfonksiyonu anlamada çok önemli bir araç olduğu kanıtlanmıştır. Bu...

LRRK2 Kinaz Aktivitesi Assaying In vitro</em

13 C-izotop etiketleme çeşitli türleri için mikroorganizmaların hücre merkezi metabolizma belirlenmesi için yararlı bir tekniktir. Hücreleri belirli bir substrat ile etiketli kültüre edildikten sonra, GC-MS ölçüm aminoasittir benzersiz etiketleme desen dayalı işlevsel metabolik yollar ortaya çıkarabilir.

Sayesinde Metabolik Pathway Onay ve Keşif 13</supAminoasittir> C-etiketleme

Fosfoinosititler nispi bolluk hızlıca, çeşitli uyarılara cevap olarak değişen lipidleri işaret ediyor. Bu makalede, ekstre etme ve Deaçillendirme ardından 3 H, miyo -inositol ile metabolik etiketlenmesi hücreleri tarafından fosfoinositidlerde bolluğunu ölçmek için bir yöntem tarif edilir. Çıkarılan glisero-inositides daha sonra yüksek performanslı sıvı kromatografisi ile ayrılmıştır ve akış sintilasyon ile nicelendirilir.

Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografi-birleştiğinde Akış Parıldama tarafından Radyoetiketleme ve Fosfoinosititler Hücresel Düzeylerinin Quantification

Burada, Tau proteinini bir vaka çalışması olarak kullanarak, Nükleer Manyetik Rezonans Spektroskopisi (NMR) ile içsel olarak düzensiz bir proteinin çoklu fosforilasyonlarını tanımlamak için bir yöntem açıklıyoruz. Rekombinant Tau, veri toplama ve analizinden önce bir kinaz ile in vitro olarak izotopik olarak zenginleştirilir ve modifiye edilir.

Özünde Düzensiz Proteinlerin Çoklu fosforilasyon Saptanma Nükleer Manyetik Rezonans Spektroskopisi

Protein kinazlar, inter-ve intraselüler sinyal iletimi için kritik olan, oldukça gelişen sinyalleme enzimleri ve iskeletleridir. Radyoaktif işaretli adenosin trifosfatın ([γ- 32 P] ATP) kinaz aktivitesini ölçmek için bir protokol sunuyoruz, bu hücresel sinyal düzenlenmesinin aydınlatılmasına yardımcı olan güvenilir bir yöntemdir.

Protein Kinaz Aktivitesini Radyoaktif Etiketli ATP ile Tahlil

Peptid rekabet testleri, çeşitli moleküler ve immünolojik deneylerde yaygın olarak kullanılır. Bu makale , in vitro oligopeptitle rekabet eden kinaz testi için ayrıntılı bir yöntem ve ilgili fosforilasyon sitelerini bulmak için yararlı olabilen ilişkili validasyon prosedürlerini açıklamaktadır.

Fosforilasyon Saha Tespiti İçin Oligopeptide Rekabet Testi

Bu da çalışmanın Rab10 fosforilasyon endojen düzeyleri lösin yönünden zengin tekrar kinaz 2 algılama basit bir yöntem açıklanır.

Rab10 fosforilasyon algılama SDS-sayfa bir fosfat bağlayıcı etiketi ile kullanarak LRRK2 etkinliğini tarafından

Biz güçlü biyokimyasal yaklaşımlar kullanarak yeni bir kinaz protein karakterize: farklı hücre hatları ve dokularda adanmış spesifik antikor ile Batı Blot analizi, coimmunoprecipitation deneyler ile etkileşimler, Batı tarafından tespit kinaz aktivite Fosho spesifik antikor ve γ [32P] ATP etiketleme kullanarak Blot.

Yeni kinaz proteinin sağlam biyokimyasal yaklaşımlar kullanılarak moleküler düzeyde karakterize edilmesi

Bu protokol, küçük DNA ve RNA yüzeyleri üzerinde polinükleotid kinazların (PNKs) kinaz aktivitesini ölçmek için radyoaktif olmayan bir testi tanımlar.

Küçük Nükleotit Substratlarının Polinükleotid Fosforilasyonunun Ölçülmesini Radyoaktif Olmayan Tsay

Bu video floresan boya ile insan embriyonik kök hücreler ve mezenkimal kök hücreler etiketleme teknikleri gösterir. Bu teknik, in vivo olarak bir optik görüntüleme ile nakledilen kök hücrelerin izleme ve floresan mikroskobu ile histopatolojik korelasyon kullanılabilir.

Optik Görüntüleme ile non-invaziv Algılama için Floresan Boyalar Kök Hücreler Etiketleme

Öğrenin, LRRK1 ve LRRK2 kinazlarını radyoaktif fosfatlarla metabolik etiketleme yöntemiyle hücresel fosforilasyon düzeylerini nicelendirmeyi. Bu teknik, spesifik fosfo antikorları olmadan da toplam hücresel fosforilasyonu değerlendirmeyi sağlar.

Lösin zengin metabolik etiketleme Fosfat ile radyoaktif Kinazlar 1 ve 2, tekrar

Daha fazla video keşfet