Lösin zengin metabolik etiketleme Fosfat ile radyoaktif Kinazlar 1 ve 2, tekrar

Aşağıdaki deneyin genel amacı, proteinleri, hücresel fosforilasyon seviyelerini ölçmek için ilgilenilen proteinleri radyoaktif fosfatlarla etiketlemektir. Bu, hücrelerde eksprese edilen proteinlerin fosfat modifikasyonlarını radyoaktif olarak etiketlemek için fosfor 32 varlığında hücrelerin kültürlenmesiyle elde edilir. İkinci adım olarak, işaretli hücreler parçalanır ve lizatlar, analiz edilecek proteinlerin immüno-saflaştırılması için bir afinite boncukları ile inkübe edilir.

Etiketlenmiş ve saflaştırılmış proteinlerin daha sonraki numuneleri, sodyum do desal sülfat, poli akrilamid jel elektroforezi üzerinde çalıştırılır ve poli olain florür membranlarına lekelenir. Radyoaktif fosfat katılımını ve protein seviyelerini tespit etmek için, lösin açısından zengin tekrar kinazlar bir ve iki, kısaltılmış L rrk bir ve L rrk iki, hücrelerde oto radyografi ve immün tespite dayalı olarak karşılaştırılabilir seviyelere fosforile edildiğini gösteren sonuçlar elde edilir. Metabolik etiketleme tekniğinin fosfo, immünoblotlama gibi diğer tekniklere kıyasla önemli bir avantajı, bu tekniğin, fosfo antikorlarının bulunmadığı proteinler de dahil olmak üzere proteinlerin toplam hücresel fosforilasyon seviyelerinin belirlenmesine izin vermesidir.