Sox10 içinde Kraniyofasiyal Kalkınma Görselleştirme: kaede Transgenik Zebra balığı Hattı Time-lapse konfokal mikroskopi kullanılarak
September 30th, 2013
Deneysel verilerin görselleştirilmesi bilimsel topluluk sonuçların sunulması önemli bir unsur haline gelmiştir. Büyüyen embriyoların canlı time-lapse kayıt Üretimi karmaşık bir gelişimsel süreçlerinin daha iyi tanıtımı ve anlaşılmasına katkıda bulunmaktadır. Bu protokol Zebrafish kaede protein Fotoçevrim yoluyla hücre etiketleme için bir adım-adım bir kılavuzdur.
Aşağıdaki deneyin genel amacı, gelişmekte olan kraniyal yüz yapılarının oluşumunu göstermek için nöral krest hücre göçünün canlı bir zaman atlamalı kaydını oluşturmaktır. Bu, deney boyunca hareketi en aza indirmek için önce anestezi uygulanmış bir transgenik SOX 10 KD zebra balığının agaroza monte edilmesiyle gerçekleştirilir. Daha sonra, konfokal bir mikroskop altında, nöral krest hücrelerinde KD'yi yeşilden kırmızıya dönüştürmek için UV foto aktivasyonu gerçekleştirilir.
Ardından fotoğrafa dönüştürülen nöral krest hücrelerine odaklanmak. Hızlandırılmış bir video kaydedilmeden önce gelişen yapıdan bir Zack oluşturulur. Transgenik SOX 10 KD zebra balığı embriyosunda zebra balığı birincil damağına kraniyal nöral krest hücrelerinin gelişimini gösteren sonuçlar elde edilmiştir.
Bu tekniğin statik görüntüleme gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, hücre göçü gibi karmaşık gelişimsel süreçlerin gerçek zamanlı olarak görselleştirilebilmesidir. Bu, sonuçları bilimsel topluluk için daha erişilebilir hale getirir. Bu yöntem, nöro tepe hücresinden türetilmiş yapıların nasıl oluştuğu ve PTO genlerinin gelişimlerini nasıl etkilediği gibi gelişim biyolojisindeki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.
Embriyoları monte etmeye hazırlanmak için, çözeltiyi çözmek için E üç suyunu düşük erime noktalı aeros mikrodalga ile karıştırmak için 125 mililitrelik bir şişe kullanın. Daha sonra trica ekleyin ve şişeyi sıcak tutmak için 50 santigrat derece su banyosuna yerleştirin ve döllenmeden 60 saat sonra bağları parlak floresan transgenik soine KD zebra balığı embriyolarını yuvalayın. Daha sonra her birini kağıt mendil içeren bir hazne slaytına aktarın.
Fazla E üç suyunu emdirin ve ardından embriyoyu kaplamak için agarro solüsyonunu kullanın. Embriyoyu mükemmel bir şekilde dorsal olarak konumlandırmak için bir mikro yükleyici ucu kullanın ve embriyoların tamamen agarroya batırıldığından emin olun. Agarro setlerinden sonra, fotoğraf dönüştürmeyi gerçekleştirmek için hazne slaytını doldurmak için E üç %0.015 trica kullanın.
Embriyoya odaklanmak için 20 x havaya daldırma hedefi kullanarak başlayın. Ardından mikroskop üzerindeki L 100 ışık düğmesine basın ve yazılımdaki kanalları seçin. Simgeleri açın.
Edinme kontrollerini görüntüleyin ve konfokal kurulum düğmesine tıklayın. Ardından, otomatik tıklayın ve pencereyi tekrar kapatmadan önce 4, 88, 561.9 kanalları için sırasıyla DPI 1 2 ve 3'u seçin. Ardından, kilidi kaldır düğmesine tıklamadan ve saniyede bir kare ve HV 200'den başlayarak tarama düğmesine basmadan önce birinci ve üçüncü kanalları kapatın.
İlgilenilen hücrelere odaklanmaya başlayın. Saniyedeki kare sayısını kademeli olarak 32'de bire çıkarmak ve arka plan gürültüsüne bağlı olarak voltajı 100 ila 120'ye düşürmek. Embriyo odaktayken, ekranın sağ kenarındaki yeşil kenarı tutun ve fare ile sağ tıklamadan önce fotoğrafın dönüştürüleceği alana sığacak şekilde küçültün.
Saniyedeki kare sayısını bire ve HV'yi 200'e değiştirin ve tara'ya basın. Fotoğraf dönüştürme alanının yakınlaştırılmış bir görüntüsü artık görünür olacaktır. Sonraki fotoğraf.
Yeşil KD sinyali neredeyse hiç yok olana kadar beş ila 60 saniye arasında herhangi bir yerde birinci kanalı açarak hücreleri dönüştürün. Ardından dappy kanalını kapatın. Orijinal yakınlaştırmaya dönmek için ikinci ve üçüncü kanalları açın.
Yakınlaştırma penceresine sağ tıklayın ve istenen hücrelerin fotoğrafın yeterince dönüştürülüp dönüştürülmediğini kontrol etmek için orijinal boyutuna dön'ü seçin. Menü çubuğundaki Capture Z Series simgesini seçerek Zack'in sınırlarını ayarlayın. Zaman atlamalı çekim ayarlamak için arama tablolarını veya ut'leri ayarlayın.
Basit bir GUI kutusunu seçin ve aşağıdaki ayarları işaretleyin. Saniyede 32 kare başına bir. Boyut 1024 ve bir döngüde alınması gereken Z yığınlarının sayısına bağlı olarak ortalama dört veya sekiz x.
Ardından, edinme kontrollerini görüntülemeye gidin ND dizisi alımını yapın ve zaman dilimini ayarlayın. Ardından devam'a ve ardından Zack'e tıklayın. Kenarlıkları daha önce gösterildiği gibi ayarlayın.
Filmi başlatın, hazneye E üç %0.015 trica solüsyonu ekleyin, gün boyunca kaydırın ve gece boyunca görüntüleme için hazneyi tamamen doldurun. Görüntüleme tamamlandığında, maksimum yoğunluk projeksiyonunu göster'e tıklayarak görüntüleme dosyasından yüksek kaliteli bir video oluşturun. Ardından resme sağ tıklayın ve yeni belge oluşturun.
Gereksiz kareleri silin ve Düğmeleri ayarlayın. Zebra balığında Palato Genesis'i gösteren bu filmde, SOX 10 K transgenik çizgi, birincil damağı oluşturmak için gelişirken kraniyal nöral krest hücrelerini takip etmek için kullanılır. Oluşan damağın en ön hücreleri, döllenmeden 60 saat sonra foto yeşilden kırmızıya dönüştürülür.
Eşleştirilmiş trabeküller birincil damağı oluşturmak için bir araya geldiğinde, bu hücreler nihai hedeflerine ulaşana kadar takip edilir. Bu film, orofasiyal yarık oluşumuna yol açan bozulmuş damak gelişimini, morino aracılı leke yıkımını göstermektedir. Bir lb, eğik yüz yarıklanmasında rol oynayan bir gen örnek olarak kullanılır.
60 HPF'de, en ön etmoid plaka hücrelerinin tek taraflı foto dönüşümü, medyan ve lateral etmoid plaka hücreleri arasında bir başarısızlık efüzyonu gösterir. Bu kusur, lateral nazal süreç ile maksiller belirginlik arasında başarısızlık efüzyonunun meydana geldiği insanlarda eğik fasiyal yarık gelişiminin patogenezine benzer. Bu teknik, gelişim biyolojisi alanındaki araştırmacıların zebra balıklarında nöro tepe hücre gelişimini keşfetmelerinin yolunu açtı.
Bu videoyu izledikten sonra, ilgilendiğiniz gelişimsel süreci yakalamak için bu yöntemi nasıl kullanacağınızı iyi anlamış olmalısınız.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu protokol, zebra balığı embriyolarında nöral krest hücre göçünü canlı zaman sürekli kayıtları aracılığıyla görselleştirmek için bir yöntem tasvir etmektedir. Kaede proteininin fotokonversiyonunu kullanarak, araştırmacılar kraniyal yüz yapılarının gelişimini daha iyi anlayabilirler.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Gelişimsel Biyoloji
- Embriyoloji
Arka Plan
- Deneysel verilerin görselleştirilmesi, bilimsel iletişim için çok önemlidir.
- Zaman sürekli kayıtları, karmaşık gelişimsel süreçlerin anlaşılmasını artırır.
- Transgenik zebra balığı modelleri, nöral krest hücre dinamiğinin incelenmesi için değerlidir.
- Fotokonversiyon teknikleri, hücresel değişikliklerin hassas bir şekilde izlenmesini sağlar.
Çalışmanın Amacı
- Nöral krest hücre göçünün canlı zaman sürekli kayıtlarını oluşturmak.
- Zebra balığında kraniyal yüz yapılarının oluşumunu göstermek.
- Fotokonversiyonu hücresel süreçlerin daha iyi görselleştirilmesi için kullanmak.
Kullanılan Yöntemler
- Anestezi altında transgenik SOX 10 KD zebra balıklarının agarose'de montajı.
- Kaede proteinini yeşilden kırmızıya dönüştürmek için UV foto aktivasyonunun yapılması.
- Foto-dönüştürülmüş nöral krest hücrelerinin konfokal mikroskop altında odaklanması.
- Kranial yapıların gelişimini yakalamak için zaman sürekli videolarının kaydedilmesi.
Ana Sonuçlar
- Zebra balığında nöral krest hücre göçünün başarılı bir şekilde görselleştirilmesi.
- Kranial nöral krest hücrelerinin primer damak haline gelişiminin gösterilmesi.
- Hücresel dinamiği gösteren bir zaman sürekli videosunun oluşturulması.
- SOX 10'un kraniyal yüz gelişiminde rolü hakkında görüşler.
Sonuçlar
- Protokol, in vivo nöral krest hücre davranışını etkili bir şekilde gösterir.
- Fotokonversiyon, gelişimsel süreçleri incelemek için güçlü bir araçtır.
- Bulgular, kraniyal yüz gelişiminin anlaşılmasına katkıda bulunur.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Visualizing cranial neural crest cell dynamics in zebrafish provides a predictive model for mechanistic de-risking in craniofacial target validation. The sox10:kaede transgenic system enables high-resolution temporal tracking of migration and differentiation events relevant to human facial morphogenesis. This approach supports early discovery by linking genetic perturbations to phenotypic outcomes in a disease-relevant system.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by tracing cranial neural crest contributions to maxillary and mandibular elements.
- Operational Value: Enables precise lineage restriction via photoconvertible kaede reporter, reducing labeling ambiguity compared to dye injection.
- Predictive Value: Supports phenotypic screening of craniofacial mutants to assess target engagement and pathway modulation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative spatiotemporal data on cell migration and tissue convergence for assay standardization.
- Operational Value: Produces reproducible time-lapse outputs compatible with high-content imaging pipelines.
- Scalability: Adaptable to any kaede or photoconvertible reporter in transgenic zebrafish for platform reuse.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Illustrates homology of zebrafish facial prominences to amniotes, enhancing translational relevance.
- Operational Value: Captures both normal and abnormal craniofacial development in mutants for phenotypic validation.
- Risk Mitigation: Enables observation of effusion defects modeling human orofacial cleft pathogenesis.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by providing live imaging of neural crest-derived structures prior to compound screening.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of gene function in cranial neural crest migration and palate formation.
- Screening: Delivers quantitative confocal readouts for assessing compound effects on cell dynamics.
- Analytics: Enables measurement of migration velocity, convergence timing, and tissue boundary formation.
- Translational Research: Connects zebrafish palate development to human craniofacial homologs for biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging capability for developmental phenotype assessment across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in target validation through direct visualization of cell fate decisions.
- Operational Value: Standardizes photoactivation and time-lapse protocols for reproducible neural crest tracking.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by linking genetic targets to observable craniofacial phenotypes.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted prioritization of targets based on developmental phenotype severity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish embryology, confocal microscopy, and photoconvertible protein handling.
- Dependent on UV-capable confocal systems and agarose embedding infrastructure for embryo immobilization.
- Necessitates standardization of photoactivation duration and z-stack acquisition across users.
- Adaptation considerations include varying promoter-driven reporters and developmental staging across zebrafish strains.
- Practical limitations include phototoxicity from prolonged UV exposure and embryo viability during extended imaging.
