Sox10 içinde Kraniyofasiyal Kalkınma Görselleştirme: kaede Transgenik Zebra balığı Hattı Time-lapse konfokal mikroskopi kullanılarak
30 Eylül 2013
Deneysel verilerin görselleştirilmesi bilimsel topluluk sonuçların sunulması önemli bir unsur haline gelmiştir. Büyüyen embriyoların canlı time-lapse kayıt Üretimi karmaşık bir gelişimsel süreçlerinin daha iyi tanıtımı ve anlaşılmasına katkıda bulunmaktadır. Bu protokol Zebrafish kaede protein Fotoçevrim yoluyla hücre etiketleme için bir adım-adım bir kılavuzdur.
Aşağıdaki deneyin genel amacı, gelişmekte olan kraniyal yüz yapılarının oluşumunu göstermek için nöral krest hücre göçünün canlı bir zaman atlamalı kaydını oluşturmaktır. Bu, deney boyunca hareketi en aza indirmek için önce anestezi uygulanmış bir transgenik SOX 10 KD zebra balığının agaroza monte edilmesiyle gerçekleştirilir. Daha sonra, konfokal bir mikroskop altında, nöral krest hücrelerinde KD'yi yeşilden kırmızıya dönüştürmek için UV foto aktivasyonu gerçekleştirilir.
Ardından fotoğrafa dönüştürülen nöral krest hücrelerine odaklanmak. Hızlandırılmış bir video kaydedilmeden önce gelişen yapıdan bir Zack oluşturulur. Transgenik SOX 10 KD zebra balığı embriyosunda zebra balığı birincil damağına kraniyal nöral krest hücrelerinin gelişimini gösteren sonuçlar elde edilmiştir.
Bu tekniğin statik görüntüleme gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, hücre göçü gibi karmaşık gelişimsel süreçlerin gerçek zamanlı olarak görselleştirilebilmesidir. Bu, sonuçları bilimsel topluluk için daha erişilebilir hale getirir. Bu yöntem, nöro tepe hücresinden türetilmiş yapıların nasıl oluştuğu ve PTO genlerinin gelişimlerini nasıl etkilediği gibi gelişim biyolojisindeki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.
Embriyoları monte etmeye hazırlanmak için, çözeltiyi çözmek için E üç suyunu düşük erime noktalı aeros mikrodalga ile karıştırmak için 125 mililitrelik bir şişe kullanın. Daha sonra trica ekleyin ve şişeyi sıcak tutmak için 50 santigrat derece su banyosuna yerleştirin ve döllenmeden 60 saat sonra bağları parlak floresan transgenik soine KD zebra balığı embriyolarını yuvalayın. Daha sonra her birini kağıt mendil içeren bir hazne slaytına aktarın.
Fazla E üç suyunu emdirin ve ardından embriyoyu kaplamak için agarro solüsyonunu kullanın. Embriyoyu mükemmel bir şekilde dorsal olarak konumlandırmak için bir mikro yükleyici ucu kullanın ve embriyoların tamamen agarroya batırıldığından emin olun. Agarro setlerinden sonra, fotoğraf dönüştürmeyi gerçekleştirmek için hazne slaytını doldurmak için E üç %0.015 trica kullanın.
Embriyoya odaklanmak için 20 x havaya daldırma hedefi kullanarak başlayın. Ardından mikroskop üzerindeki L 100 ışık düğmesine basın ve yazılımdaki kanalları seçin. Simgeleri açın.
Edinme kontrollerini görüntüleyin ve konfokal kurulum düğmesine tıklayın. Ardından, otomatik tıklayın ve pencereyi tekrar kapatmadan önce 4, 88, 561.9 kanalları için sırasıyla DPI 1 2 ve 3'u seçin. Ardından, kilidi kaldır düğmesine tıklamadan ve saniyede bir kare ve HV 200'den başlayarak tarama düğmesine basmadan önce birinci ve üçüncü kanalları kapatın.
İlgilenilen hücrelere odaklanmaya başlayın. Saniyedeki kare sayısını kademeli olarak 32'de bire çıkarmak ve arka plan gürültüsüne bağlı olarak voltajı 100 ila 120'ye düşürmek. Embriyo odaktayken, ekranın sağ kenarındaki yeşil kenarı tutun ve fare ile sağ tıklamadan önce fotoğrafın dönüştürüleceği alana sığacak şekilde küçültün.
Saniyedeki kare sayısını bire ve HV'yi 200'e değiştirin ve tara'ya basın. Fotoğraf dönüştürme alanının yakınlaştırılmış bir görüntüsü artık görünür olacaktır. Sonraki fotoğraf.
Yeşil KD sinyali neredeyse hiç yok olana kadar beş ila 60 saniye arasında herhangi bir yerde birinci kanalı açarak hücreleri dönüştürün. Ardından dappy kanalını kapatın. Orijinal yakınlaştırmaya dönmek için ikinci ve üçüncü kanalları açın.
Yakınlaştırma penceresine sağ tıklayın ve istenen hücrelerin fotoğrafın yeterince dönüştürülüp dönüştürülmediğini kontrol etmek için orijinal boyutuna dön'ü seçin. Menü çubuğundaki Capture Z Series simgesini seçerek Zack'in sınırlarını ayarlayın. Zaman atlamalı çekim ayarlamak için arama tablolarını veya ut'leri ayarlayın.
Basit bir GUI kutusunu seçin ve aşağıdaki ayarları işaretleyin. Saniyede 32 kare başına bir. Boyut 1024 ve bir döngüde alınması gereken Z yığınlarının sayısına bağlı olarak ortalama dört veya sekiz x.
Ardından, edinme kontrollerini görüntülemeye gidin ND dizisi alımını yapın ve zaman dilimini ayarlayın. Ardından devam'a ve ardından Zack'e tıklayın. Kenarlıkları daha önce gösterildiği gibi ayarlayın.
Filmi başlatın, hazneye E üç %0.015 trica solüsyonu ekleyin, gün boyunca kaydırın ve gece boyunca görüntüleme için hazneyi tamamen doldurun. Görüntüleme tamamlandığında, maksimum yoğunluk projeksiyonunu göster'e tıklayarak görüntüleme dosyasından yüksek kaliteli bir video oluşturun. Ardından resme sağ tıklayın ve yeni belge oluşturun.
Gereksiz kareleri silin ve Düğmeleri ayarlayın. Zebra balığında Palato Genesis'i gösteren bu filmde, SOX 10 K transgenik çizgi, birincil damağı oluşturmak için gelişirken kraniyal nöral krest hücrelerini takip etmek için kullanılır. Oluşan damağın en ön hücreleri, döllenmeden 60 saat sonra foto yeşilden kırmızıya dönüştürülür.
Eşleştirilmiş trabeküller birincil damağı oluşturmak için bir araya geldiğinde, bu hücreler nihai hedeflerine ulaşana kadar takip edilir. Bu film, orofasiyal yarık oluşumuna yol açan bozulmuş damak gelişimini, morino aracılı leke yıkımını göstermektedir. Bir lb, eğik yüz yarıklanmasında rol oynayan bir gen örnek olarak kullanılır.
60 HPF'de, en ön etmoid plaka hücrelerinin tek taraflı foto dönüşümü, medyan ve lateral etmoid plaka hücreleri arasında bir başarısızlık efüzyonu gösterir. Bu kusur, lateral nazal süreç ile maksiller belirginlik arasında başarısızlık efüzyonunun meydana geldiği insanlarda eğik fasiyal yarık gelişiminin patogenezine benzer. Bu teknik, gelişim biyolojisi alanındaki araştırmacıların zebra balıklarında nöro tepe hücre gelişimini keşfetmelerinin yolunu açtı.
Bu videoyu izledikten sonra, ilgilendiğiniz gelişimsel süreci yakalamak için bu yöntemi nasıl kullanacağınızı iyi anlamış olmalısınız.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu protokol, zebra balığı embriyolarındaki nöral krist hücre göçünün canlı zaman atlamalı (time-lapse) kayıtlar aracılığıyla görselleştirilmesi için bir yöntem sunmaktadır. Kaede proteininin fotokonversiyonundan yararlanan araştırmacılar, kraniofasiyal yapıların gelişimini daha iyi anlayabilirler.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Gelişimsel Biyoloji
- Embriyoloji
Arka Plan
- Deneysel verilerin görselleştirilmesi, bilimsel iletişim için kritik öneme sahiptir.
- Zaman ayarlı (time-lapse) kayıtlar, karmaşık gelişimsel süreçlerin anlaşılmasını kolaylaştırır.
- Transgenik zebrafish modelleri, nöral krista hücresi dinamiklerini incelemek için değerlidir.
- Fotokonversiyon teknikleri, hücresel değişimlerin hassas bir şekilde izlenmesine olanak tanır.
Çalışmanın Amacı
- Nöral krista hücresi migrasyonunun canlı zaman atımlı kayıtlarını oluşturmak.
- Zebrafish'te kranial fasiyal yapıların oluşumunu göstermek.
- Hücresel süreçlerin geliştirilmiş görselleştirmesi için fotokonversiyonu kullanmak.
Kullanılan Yöntemler
- Anestezize edilmiş transgenik SOX 10 KD zebra balıklarının agarozda sabitlemesi.
- Kaede proteinini yeşilden kırmızıya dönüştürmek için UV fotoaktivasyonun gerçekleştirilmesi.
- Konfokal mikroskop altında foto-konverte olmuş nöral krist hücrelerine odaklanılması.
- Kraniyal yapıların gelişimini kaydetmek için zaman ayarlı (time-lapse) videoların çekilmesi.
Temel Sonuçlar
- Zebrafishlerde nöral krista hücresi migrasyonunun başarılı şekilde görselleştirilmesi.
- Kraniyal nöral krista hücrelerinin primer palate gelişiminin gösterilmesi.
- Hücresel dinamikleri sergileyen bir time-lapse videonun oluşturulması.
- SOX 10'un kraniofasiyal gelişimdeki rolüne dair içgörüler.
Sonuçlar
- Protokol, nöral krist hücre davranışını in vivo olarak etkili bir şekilde göstermektedir.
- Fotokonversiyon, gelişimsel süreçlerin incelenmesi için güçlü bir araçtır.
- Bulgular, kraniofasiyal gelişimin anlaşılmasına katkıda bulunmaktadır.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygunluk Özeti
Zebrafishlerde kranial nöral krist hücre dinamiklerinin görselleştirilmesi, kraniofasial hedef doğrulamasında mekanistik risk azaltma için öngörücü bir model sağlar. sox10:kaede transgenik sistemi, insan yüz morfojenizi ile ilgili migrasyon ve diferansiyasyon olaylarının yüksek çözünürlüklü zamansal takibine olanak tanır. Bu yaklaşım, genetik perturbasyonları hastalıkla ilgili bir sistemdeki fenotipik sonuçlarla ilişkilendirerek erken keşif sürecini destekler.
Biyofarma Ar-Ge'de Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Maksiller ve mandibuler elementlere olan kranial nöral krist katkılarını takip ederek terapötik hipotezleri sorgular.
- Operasyonel Değer: Fotokonvertibl kaede raporlayıcı aracılığıyla hassas soy kısıtlaması sağlayarak boya enjeksiyonuna kıyasla etiketleme belirsizliğini azaltır.
- Öngörücü Değer: Hedef etkileşimini ve yolak modülasyonunu değerlendirmek için kraniofasiyal mutantların fenotipik taramasını destekler.
Tarama & Assay Geliştirme
- Bilimsel Değer: Analiz standardizasyonu için hücre göçü ve doku yakınsamasına ilişkin kantitatif spatiotemporal veriler üretir.
- Operasyonel Değer: Yüksek içerikli görüntüleme hatlarıyla uyumlu, tekrarlanabilir time-lapse çıktılar sağlar.
- Ölçeklenebilirlik: Platformun yeniden kullanımı için transgenik zebra balıklarındaki herhangi bir kaede veya fotokonvertibl raporere uyarlanabilir.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Bilimsel Değer: Zebrafish yüz çıkıntılarının amniyotlarla homolojisini göstererek translasyonel uygunluğu artırır.
- Operasyonel Değer: Fenotipik doğrulama için mutantlarda hem normal hem de anormal kraniofasiyal gelişimi kayıt altına alır.
- Risk Azaltma: İnsan orofasiyal yarık patogenezini modelleyen efüzyon kusurlarının gözlemlenmesine olanak tanır.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu yöntem, bileşik taraması öncesinde nöral krista kaynaklı yapıların canlı görüntülemesini sağlayarak erken keşif iş akışlarına entegre olur.
- Keşif Biyolojisi: Kraniyal nöral krist göçü ve damak oluşumunda gen fonksiyonunun hipotez testlerini destekler.
- Tarama: Bileşiklerin hücre dinamikleri üzerindeki etkilerini değerlendirmek için kantitatif konfokal okumalar sağlar.
- Analitikler: Göç hızının, yakınsama zamanlamasının ve doku sınırı oluşumunun ölçülmesine olanak tanır.
- Translasyonel Araştırma: Biyobelirteç uyumu için zebra balığı damak gelişimini insan kraniyofasiyal homologları ile ilişkilendirir.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Projeler genelinde gelişimsel fenotip değerlendirmesi için yeniden kullanılabilir bir görüntüleme kapasitesi oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Hücre kaderi kararlarının doğrudan görselleştirilmesi yoluyla hedef doğrulamadaki mekanistik belirsizliği azaltır.
- Operasyonel Değer: Tekrarlanabilir nöral krist takibi için fotoaktivasyon ve zaman ayarlı görüntüleme protokollerini standartlaştırır.
- Stratejik Değer: Genetik hedefleri gözlemlenebilir kraniyofasiyal fenotiplerle ilişkilendirerek devam/dur kararlarını iyileştirir.
- Portföy Etkisi: Gelişimsel fenotip şiddetine dayalı olarak hedeflerin riskle uyumlu önceliklendirilmesine bilgi sağlar.
Uygulama Hususları
- Zebrafish embriyolojisi, konfokal mikroskopi ve fotokonvertibl protein kullanımı konularında uzmanlık gerektirir.
- Embriyoların immobilizasyonu için UV kapasiteli konfokal sistemlere ve agaroz gömme altyapısına bağımlıdır.
- Fotoaktivasyon süresinin ve z-yığın (z-stack) alımının kullanıcılar arasında standartlaştırılmasını gerektirir.
- Adaptasyon hususları arasında, farklı promotör güdümlü raporlar ve zebrafish suşları arasındaki gelişimsel evreleme yer alır.
- Pratik kısıtlamalar arasında, uzun süreli UV maruziyeti kaynaklı fototoksisite ve uzun süreli görüntüleme sırasında embriyo canlılığı bulunmaktadır.
