Gözenek Gradiyentler Polielektrolitler ve Bunların Dolaylı İzleme ile Metalik İmplant Çok Ölçekli Modifikasyon In vivo

Bu prosedürün genel amacı, in vitro ve in vivo hücre davranışını kontrol etmek için metalik implantları çoklu uzunluk ölçeklerinde değiştirmektir. Bu, ilk olarak üç boyutlu tübüler implantlar içinde bir gözenek boyutu gradyanı üretilerek, Biofreeze ekstraksiyon yöntemi ile gerçekleştirilir. İkinci adım, katman katman metodolojisi ile kollajen ve aljinat bazlı nano fibriller bazal membran taklitlerinin geliştirilmesidir.

Daha sonra, kan plazma analizi kullanılarak implantasyonu takiben bu tür implantları izlemek için dolaylı bir yöntem. HPLC ve müteakip peptit dizilimi, sonuçta farklı alanların gerektiğinde farklı hücre tiplerini barındırabildiği bir implant olarak gösterilmiştir. Bazıları için çok hücreli dokular elde edilebilir, ancak bu sistem metalik implantları değiştirmek için bir yol sağlayabilir.

Yapay doku veya hastalık modelleri gibi 3D hücre kültürü model sistemlerine de uygulanabilir. Bu yöntem için ilk olarak, in vivo olarak gözenekli titanyum implantların etrafındaki hücre hareketini kontrol etmek için bir teknik bulmaya çalışırken aklımıza geldi. Bu prosedüre başlamak için implantları temizleyin ve dondurma ve ekstraksiyon için yazılı metinde açıklandığı gibi Teflon kalıpları tasarlayın ve üretin.

Polimer tozunu organik çözücüye sokarak sentetik polimer PLLA çözeltisini ikili bir dioksin ve su karışımı içinde hazırlayın. Manyetik bir Starr üzerinde, homojen bir çözelti elde etmek için karışımı 60 santigrat dereceye ısıtın. Bu sıcaklık, solüsyonun implantlara sokulması için kullanılacak hassas cam şırıngalar için sıcaklık direncinin üst sınırı olduğu için seçilmiştir.

Bu arada, donmuş çözeltinin hacmindeki değişikliği dikkate alarak implantın gözenekliliğine göre gerekli polimer çözeltisinin hacmini hesaplayın. Daha sonra, 0.1 mikrolitre hassasiyetle hassas cam şırıngalar kullanarak çözeltiyi implantlara yerleştirin. Tekrarlanabilir PO gradyan oluşumu için polimer konsantrasyonu için alt sınır %3'tür veya %6'nın üzerindeki kalın numunelerde homojen dağılım elde etmek zorlaştığından, numuneleri ya doğrudan eksi 80 santigrat derecede ya da oda sıcaklığında 30 dakikalık bir önceki inkübasyon süresi ile dondurun.

Donma koşulları kısmen gözenek oluşumunu belirler. Böylece donma koşulları, hedeflenen gözenekliliğe göre ayarlanabilir. Numuneleri gece boyunca eksi 80 santigrat derecede tutun.

Kalıbın donmuş halde ayrılması çok zor bir adımdır. Donmuş dip solüsyonunun kalıpla temasını azaltmak için bir kafa derisi yardımıyla özen gösterilmelidir, Gözeneklilik gradyanları elde etmek için implantları %80 önceden soğutulmuş etanole daldırın. Mandril dışındaki tüm kalıp parçalarını, boru şeklindeki implantlar için ve disk şeklindeki implantlar için alt kısım dışındaki tüm parçaları çıkarmak için önceden soğutulmuş bir neşter kullanın, ekstraksiyonu gece boyunca eksi 20 santigrat derecede gerçekleştirin.

Ekstraksiyondan sonra kalan kalıp parçalarını çıkarın ve implantları havayla kurutun. Yapının genel gözenekliliğinin karakterizasyonu için. Cıva oksimetresi analizi gereklidir.

Bu örnekte, cıva oksimetresi ölçümleri, implantın her iki tarafındaki gözeneklere ve daha küçük dağılmış gözeneklere karşılık gelen belirgin tepe noktalarını göstermektedir. Bununla birlikte, daha önemli veriler, gözenek boyutu dağılımı için resim J ile analiz edilebilen intraluminal ve ekstraluminal yüzeylerin gözeneklilikleri arasındaki farktır. Numunelerin donma kırılmasını takiben taramalı elektron mikroskobu ile kesit gözlenerek elde edilir.

Kullanılan implantların açık gözenekli yapısı ve titanyumun ışığı yansıtma kapasitesi nedeniyle, gözenekli implantlar içinde etiketli hücrelerin Z yığınlarını yapmak mümkündür. PKH 26 veya kalsiyum ile etiketlenmiş hücreler, çok katmanlı oluşturmak için implantları konfokal lazer mikroskobu ile görselleştirmek için kullanılabilir. Daldırma robotları ile en yüksek tekrarlanabilirlik elde edilir.

Ancak bir daldırma robotu yoksa bu adımlar manuel olarak da yapılabilir. Kollajen çözeltisini hazırlamak için tıbbi sınıf kollajen tip bir ve sodyum aljinat kullanın. Optimize edilmiş konsantrasyonlar, 150 milimolar'ın her biri için litre başına 0,5 gramdır.

pH 3.8'deki sodyum klorür sitrat tamponu, homojenliği sağlamak için kollajen çözeltisini gece boyunca çözer. 3.8'lik çözelti asidik pH'ı, yapı kararsız olduğu için katmanların kararlı bir şekilde birikmesi için gereklidir. Çapraz bağlamadan önce.

Nötr pH tasarımında, polielektrolit çok katmanlı üretimde kullanılan daldırma robotları ile implantların kullanımı için özel bir tutucu tasarlanmıştır. Katmanları ya sadece titanyum implantların ya da metinde açıklandığı gibi modifiye edilmiş implantların yüzeyine yerleştirin. İmplantları önce 15 dakika boyunca bir aljinat çözeltisine daldırarak bir daldırma robotu sistemi kullanın, ardından yapıyı beş dakika boyunca pH 3.8'de 150 milimolar sodyum klorür ile durulayın.

15 dakika boyunca bir kollajen çözeltisine daldırarak devam edin. Önce bazal membranı stabilize etmek için, çapraz bağlama çözeltisini 100 milimolar geninde hazırlayın. ADMSO sitrat tamponunda, bir ila dört hacim hacim oranında, genini DMSO bileşeninde ve daha sonra su bileşeninde çözün, topaklanmayı önlemek için numuneleri 12 ila 24 saat sonra çapraz bağlama çözeltisine daldırarak çapraz bağlayın.

PH 3.8'de bol miktarda sitrat tamponu ile durulayın Adımları yıkadıktan sonra, numuneleri 30 dakika UV tedavisi ile veya antibiyotik antifungal banyosunda sterilize edin. Bazal membran taklidinin kalitesini belirleyen ana parametreler kalınlığı ve liflerin çapıdır. Atomik kuvvet mikroskobu veya temas modunda elde edilen bir FM görüntüsü kullanarak fiber çaplarını hesaplayın.

Numuneleri nitrojen akışıyla kuruttuktan sonra, görüntülemeden önce ortalama fibril kalınlığını belirlemek için görüntü başına en az 10 lifin kalınlığını ölçün. Kollajen aljinat 24 çift katmanlı kollajen çok katmanlı filmlerin kurutulmasının ardından Image J yazılımı ile filmlerin kalınlığı daha sonra çizik testleri ile belirlenebilir. Önce bir FM kullanarak, çiziğin bir ışık mikroskobu ile lokalizasyonundan sonra filmi çizmek için bir şırınga iğnesi kullanın, çizik sınırında 10'a 10 mikron kare yüzeylerde bir FM ile görüntüler elde edin.

Film tabakasının kalınlığını sağlayan A FM yazılımı ile elde edilen profillerden yükseklikleri hesaplayın. Cihazı metinde tarif edildiği gibi tavşanların trakeasına yerleştirdikten sonra, kulak damarlarından kan örnekleri alın, numuneleri dört santigrat derecede 20 dakika boyunca 5.000 RPM'de santrifüjleyin. Tavşan plazmasını% 0.1 trior asetik asit ile ekstrakte ettikten sonra analiz için elde edilen süpernatanı kullanın.

Bir çekirdek hücresi ters faz 305 C 18 sütunu kullanarak ekstraktı saflaştırarak plazma protein içeriğinin ters faz HPLC saflaştırmasını gerçekleştirin. Metin protokolünde bulunan solvent sistemini ve akış hızını kullanarak absorbansı 214 ve 280 nanometrede kaydedin. Buharlaşma yoluyla konsantre etmeden önce tepe fraksiyonlarını toplayın.

Hızlı vakum uygulamasını kullanarak, tam kurumadan önce hızlı vakumun durdurulması önemlidir. İmplantasyon süresi boyunca farklı zaman noktalarında elde edilen zirveleri ilişkilendirin. Otomatik Edmond dizilimi ile tanımlama için implantasyon sırasında tutarlı eğilimler gösteren saflaştırılmış peptitleri kullanın.

Numuneyi poli beyinle muamele edilmiş cam elyaf filtrelere yükleyin, profesyonel hassas bir mikro sıralayıcı kullanarak otomatik Edmond bozunması ile saflaştırılmış peptitlerin uç terminal dizisini belirleyin. Bir sonraki adım, bir C 18 sütunu üzerinde kromatografi ile fenil inci ve bir amino asidin tanımlanmasıdır. Dizi elde edildikten sonra, İsviçre Prote veri tabanı kullanılarak patlatma yazılımı ile tanımlanabilir.

PLLA çözeltisinin konsantrasyonunu değiştirerek, implantların ekstra lümen tarafındaki gözeneklerin boyutunu kontrol etmek mümkündür. Gözenek boyutu ve şekli titanyum implantların varlığından önemli ölçüde etkilenmiştir. Gözenek boyutları 40 ila 100 mikrometre arasında değişirken, daha küçük gözeneklere neden olan daha düşük konsantrasyonların kullanılmasıyla, intraluminal yan gözenek boyutu sınırlı ekstraksiyon tarafından yönetildi ve fibroblastların ortalama boyutundan daha az olan dokuz mikron civarındaydı.

Oda sıcaklığında bir inkübasyon adımı eklenerek, daha büyük gözeneklerin gözenek duvarlarının kendi gözenekliliğine sahip olduğu çift gözenekli yapılar elde edilebilir. Bu özellik, gaz ve besin hareketini kolaylaştıracağı için kalın implantlar için önemlidir. Gözenek gradyanı oluşturulduktan sonra, yapının üzerine kollajen aljinat film tabakasını eklemek mümkündür.

Bu film tabakası, PLLA köpüğünün üzerinde stabildir ve nano ölçekli kollajen liflerinin oluşturduğu köpüğün yokluğunda da yüzeyde tutulabilir. Film tabakası büyüdükçe, filmin büyümesi katlanarak artar. Böylece, birkaç yüz nanometrelik kalın bir film elde edilebilir.

Gözenekli titanyum implantlar, konak doku ile bütünleşir ve ekilen implant kesitlerinde gösterildiği gibi in vivo olarak dört ila altı hafta arasında tamamen doldurulur. Gözenekler içindeki doku, iyi bir damarlanma seviyesine sahip olgun bir bağ dokusudur. Bu süre zarfında, HPLC analizi, implantasyon süresi boyunca dalgalanan belirgin zirveler gösterdi.

İlgilenilen tepe fraksiyonları sıralandı ve C-reaktif protein okumaları ile benzer bir eğilim gösteren alfa ve beta hemoglobin yarım zincirleri olarak belirlendi. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik düzgün bir şekilde yapılırsa bir günde yapılabilir. Bu videoyu izledikten sonra, metalik implantların modifikasyonu ve hücre kültürü deneyleri için 3D çok ölçekli PO gradyanlarının nasıl üretileceğini iyi anlamış olmalısınız.

Dondurarak ekstraksiyon ve film oluşumuna göre katmanlama, hücreler için kendi modifiye implantlarınızı veya mikro ortamlarınızı geliştirmek için basit metallerdir.