Zebra balığı Larva kas fonksiyonu değerlendirmek için daralma sırasında Kuvvet Ölçümü

Bu prosedürün genel amacı, zebra balığı, larva, gövde kasının maksimum kasılması sırasında kuvvet oluşumunu ölçmektir. Bu, önce kuvvet ölçümleri sırasında larvaları yerinde tutmak için kullanılacak dikiş halkaları yapılarak gerçekleştirilir. Daha sonra, anestezi uygulanmış larvalar deney odasının içine yerleştirilir.

Bir kez yerleştirildikten sonra, maksimum seğirme kasılması sırasında kuvvet kaydedilir. Son adım, gövde kas sisteminin boyutlarını ölçmektir, böylece tepe kuvveti kas kesit alanına normalleştirilebilir. Sonuç olarak, kasılma sırasında kuvvet oluşumunu ölçmek, kas fonksiyonundaki ve genel kas sağlığındaki değişiklikleri göstermek için kullanılır.

Bu yöntemi yabani tip zebra balığı larvaları kullanarak göstermemize rağmen, genetiği değiştirilmiş larvalarla veya ilaçlar veya toksik maddelerle tedavi edilmiş larvalarla da kullanılabilir. Yöntem daha sonra kas hastalığı modellerini karakterize etmek ve tedavileri değerlendirmek veya kas gelişimi, yaralanma veya kimyasal toksisiteyi incelemek için kullanılabilir. İlk adım, larvaları yerinde tutmak için kullanılacak dikiş halkalarını hazırlamaktır.

Kuvvet testi sırasında, steril olmayan sütürü üç ipliğe ayırmak için forseps kullanın. Ayrıldıktan sonra, tellerden birine çift el üstü düğüm atmaya başlayın, ancak küçük bir halka yapmak için düğümü tamamen sıkmadan önce durun. Döngüyü bitirmek yerine, kuyruklardaki fazla sütürü kesmek için makas kullanın.

Döngüyü daha sonra kullanmak üzere yapışkan notun yapışkan tarafına yerleştirin. Test edilecek her larva için iki dikiş halkası yapın. İlk olarak, test cihazını bir stereo mikroskop sahnesine yerleştirin.

Ardından, kuvvet dönüştürücü ve uzunluk kontrol kablolarını test cihazına bağlayın. Kuvvet dönüştürücüsünü ve uzunluk kontrol cihazını açın ve uzunluk kontrol cihazının önündeki anahtarı çevirin. Bu, uzunluk kontrol tüpünü tek kullanımlık bir transferle köprülenmiş hale getirir. Pipet.

Deney odasını test solüsyonu ile doldurun. Kavrama olarak kuyruklardan birinden bir dikiş halkası almak için forseps kullanın. Kavisli kısım üzerindeki ilmek, dikişi bükebilir ve sonraki adımlarda kırılmasına neden olabilir.

Bir halkayı kuvvet dönüştürücü tüpüne ve diğerini uzunluk kontrol cihazına asın: Tek kullanımlık bir transfer pipeti ile bir zebra balığı larvasını test solüsyonu ile doldurulmuş küçük bir Petri kabına aktarın. Anestezik etkisini gösterdikten sonra, dokunma eksikliği olduğunu doğrulamak için kuyruğu hafifçe dürtün. Daha sonra, larvaları forseps ile deney odasına aktarmak için bir cam pipet kullanın.

Larvanın ön kısmını, sütür halkasının her iki kuyruğunu kavrayarak, kuvvet dönüştürücü tüpü üzerindeki sütür halkasından nazikçe yönlendirin. Meşe kesesinin arkasındaki halkayı sıkmak veya forseps ile mesaneyi yüzmek için bunları aynı anda çekin. Bir dikiş kuyruğunu tutun ve çekin, larvaların yan tarafı yukarı bakana kadar tüpün etrafında 90 derece dönmesine neden olun.

Uzunluk kontrol cihazına bağlı X, Y, Z konumlandırma cihazını kullanarak, uzunluk kontrol tüpünü x ekseni boyunca ve larvaların gövdesi ve kuyruğunun altında hareket ettirin. Uzunluk kontrol tüpünün uçları ile kuvvet dönüştürücü tüpü arasında boşluk bırakın. Ardından, dikiş halkasını larvaların kuyruğu üzerinde yönlendirin ve dikiş halkasını sıkın.

Daha önce gösterildiği gibi, larvaların arka kısmını, yan taraf yukarı bakacak şekilde döndürmeniz gerekebilir. Yerleştirildikten sonra, dikiş halkası kuyruklarını kesin. Tüpleri haznenin dibine değene kadar yavaşça indirmek için XY, Z konumlandırma cihazlarını kullanın.

Daha sonra larvaları oda tabanından uygun bir mesafeye kaldırın. Bu, daha sonra kullanılacak ters çevrilmiş bir mikroskop objektifinin çalışma mesafesi içinde olmalıdır. Son olarak, larvaların uzun eksenini kuvvet dönüştürücü tüpünün uzun ekseni ile hizalamak için uzunluk kontrol tüpünü ayarlayın.

Başlamak için, test cihazını ters çevrilmiş bir mikroskop aşamasına getirin. Ardından, su banyosu sirkülatör termometresini ve sıcaklık kontrol cihazını test cihazına bağlayın. Gerekli bileşenleri açın ve sıcaklık kontrol cihazındaki ayarı istenen değere ayarlayın.

Stimülatörden gelen kabloları test cihazına bağlayın. Stimülatörün gücünü açın, ancak bu noktada larvaları uyarmayın. Larvaların hazne tabanına paralel olup olmadığını kontrol etmek için, larvaların tüplerin uçları arasındaki kısmını görüntüleyin.

Paralel ise, gerekirse larvaların her iki ucu da odakta olacaktır. Kuvvet dönüştürücü tüpünü her iki uç da odakta olana ve larva paralel olana kadar ayarlayın. Video sarkomer uzunluk sistemini açın ve video kamerayı, çizgiler video karesinin kenarlarına paralel olacak şekilde döndürün.

Çizgileme aralığı, sarkomer uzunluğunun bir göstergesi olarak kullanılır. Mikroskobu periferik liflere odaklanacak şekilde ayarlayın ve belirtilen sarkomer uzunluğunu not edin. Gerekirse, seğirme kuvvetini optimize etmek için sarkomer uzunluğu optimalden daha az olana kadar larvaları kısaltmak için uzunluk kontrol cihazını ayarlayın.

İlk olarak, stimülatör üzerindeki çıkış akımını düşük büyüklüğe ayarlayın ve ardından akım darbeleri vermek için özel bir yazılım programlayın. Süresi 0.2 milisaniye. İlk darbeyi verin ve en yüksek seğirme kuvvetini ölçmek için osiloskopu kullanın.

Akımı 50 miliamperlik artışlarla artırın ve her yeni akım seviyesinde en yüksek seğirme kuvvetini ölçün. Stimülasyon akımı arttıkça yorgunluğu önlemek için seğirmeler arasında 30 saniye bekleyin. Tepe seğirme kuvveti tipik olarak maksimuma çıkar ve daha sonra larvaların ürettiği akımı kademeli olarak azaltır.

En büyük kuvvet, bir kez tanımlandıktan sonra optimal stimülasyon akımıdır, akım genliğini optimum stimülasyon akımına ayarlayın ve maksimum seğirme kuvveti elde etmek için larvaların uzunluğunu ayarlayın. Son olarak, larva kaslarının seğirmesini sağlayın. Kuvvet tepkisini kaydetmek için osiloskopu kullanın ve kaydı sonraki analiz için kaydedin.

Kas sistemi boyutlarını ölçmek için test cihazını stereo mikroskoba geri getirin. IP ölçeğini kullanarak, yandan bakıldığında kas sisteminin yüksekliğini ölçün. Ölçümleri anatomik bir dönüm noktasında yapın.

Örneğin, ürogenital açıklık burada kırmızı ile işaretlenmiştir. Daha sonra larvaların uzunluğunu değiştirmemeye dikkat edin. Larvaları alttan görmek için dikiş halkası kuyruklarını kullanarak larvaları 90 derece döndürün.

Alttan görüldüğü gibi kas sisteminin genişliğini ölçün. Son olarak sağlıklı yabani tip zebra balığı larvalarında larvaları test cihazından serbest bırakmak için dikiş halkalarını bir mikro bıçak ile kesin, kas lifleri birbirine paralel olmalı, aralarında büyük boşluklar olmalı ve kanıt çizgileri olmalıdır yabani tip zebra balığı larvaları bu özellikleri göstermeyen veya burada görüldüğü gibi kopmuş lifler gibi belirgin hasarı olan yabani tip zebra balığı larvaları buraya atılmalıdır. Stimülasyon akımına karşı en yüksek seğirme kuvveti, tek bir zebra balığı larvaları için çizilir.

Optimal stimülasyon akımı tipik olarak 400 ila 600 miliamper arasındadır. Tek bir larvanın maksimum seğirme kasılması sırasında toplanan temsili bir kuvvet tepkisi burada gösterilmektedir. Burada. Farklı yaşlardaki yabani tip larvalardan elde edilen tepe kuvvet değerlerinin 0.9 ile 1.7 arasında değiştiği gösterilmiştir.

Yaşlı larvalara sahip milli newtonlar, genç larvalardan daha fazla kuvvet üretir. Yaşlı larvalar, tepe kuvvetleri kesitsel kas alanına normalize edildikten sonra bile genç larvalardan daha fazla kuvvet üretir. Bu prosedürü denerken, larvaların kuvvet dönüştürücü ve uzunluk kontrol tüpleri etrafında kolayca dönememesi için dikiş halkalarını yeterince sıkmak önemlidir.

Sütür halkaları çok gevşekse, larva tarafından üretilen kuvvet, kuvvet dönüştürücüsüne tam olarak iletilmeyecek ve maksimum seğirme kuvveti hafife alınacaktır.