Sentez, Hücresel Teslimat ve In vivo Dendrimer tabanlı pH Sensörlerin Uygulamaları

Aşağıdaki deneyin genel amacı, canlı hücrelerde ve in vivo olarak in vitro pH görüntüleme için geliştirilmiş özelliklere sahip Dun davulcularına dayalı yeni floresan sensörler geliştirmektir. Bu, ilk olarak pH'a duyarlı boyaların, hassas boyalardaki hedefleme grupları veya pH gibi diğer kısımlarla birlikte bir dendritik iskeleye konjuge edilmesiyle elde edilir. Ve canlı hücrelerde görüntü pH'ının yanında bir pH kalibrasyon eğrisi oluşturmak için in vitro ölçümler yapılır.

Sensör, elektroporasyon ile iletilir ve beynin hücre dışı boşluğundaki pH'ı görüntülemek için konfokal mikroskopi kullanılarak pH haritaları oluşturulur. Fizyolojik ve patolojik nöral aktivite sırasında, sensör anestezi uygulanmış farelerin beynine mikro enjekte edilir. Floresan verileri daha sonra iki foton mikroskobu kullanılarak elde edilir.

Elde edilen sonuçlar, drimmer tabanlı sensörlerin hem canlı hücrelerde hem de in vivo olarak pH değişikliklerini yüksek uzamsal ve zamansal çözünürlükle ölçmeyi başardığını göstermektedir. PH'a duyarlı davranışa sahip birkaç baca boyası halihazırda kullanılmış olmasına rağmen, zayıf hareketlilik ve hücre sızıntısı gibi çeşitli dezavantajlardan muzdariptir. Ayrıca, döküntü metrik mutlak ölçümüne izin vermezler.

Burada, pH'a duyarlı boyaların D genetik iskelesine bağlanmasını gösterdik ve performanslar özel ve zamansal çözünürlükle doğru bir ölçüme izin verdiğinden, bu yöntem canlı hücrelerde pH tarafından düzenlenen fizyolojik ve patolojik süreci incelemek için yararlı bir araç olabilir. Nöro sistemdeki pH regülasyonundaki bozulma, inme ve epilepsi gibi çeşitli durumlarla ilişkilidir ve mevcut pH sensörünün zayıf etkili olduğu kanıtlanmıştır ve bu da sunulan sensörün tasarımına yol açmıştır. Bu met burada pH h görüntülemesi uygulanmış olsa da, genel bir yaklaşımdır ve biyolojik olarak ilgili diğer türlere de uygulanabilir.

Kâr algılama boyasını seçerek, kolay ve çok yönlü sentetik yaklaşım bu prosedürleri basitleştirir. Bugün prosedürü göstermek Giovanni re, Barbara ti, Marco Brody ve Sebastian Suli PH göstergelerini Piam Demers ile konjuge etmek için. Rimeri susuz DMSO'da 50 mikromolar nihai konsantrasyonda çözerek başlayın.

Susuz olarak TMR olarak da bilinen floresein NHS ve Tetraetil RUMINE NHS'nin 10 mikromolar stok çözeltisini, bir mikro santrifüj tüpünde DMSO'yu, sekiz eşdeğeri olan bir mililitre G dört peram dederer çözeltisi veya 40 mikrolitre floresein ve sekiz eşdeğeri veya 40 mikrolitre TMR'yi hazırlayın. Karışımdaki molar oran, demer üzerine yüklenen boya miktarını yansıtacaktır. Çözeltiyi oda sıcaklığında 12 saat karıştırın.

Daha sonra, karışımı bir ila 10 oranında deiyonize su ile seyreltin ve reaksiyon karışımını, deiyonize suya karşı 10 kilodalton diyalize moleküler ağırlık kesimi olan bir diyaliz torbasına yükleyin ve rezervuardaki suyu 24 saat boyunca üç kez değiştirin. Ertesi gün, çözeltiyi bir cam şişeye aktarın ve eksi 80 ° C'de birkaç saat dondurun. Çözelti tamamen donduğunda, şişeyi bir liyofilizatöre aktarın ve 24 saat boyunca dondurarak kurutun.

Mor bir toz elde edilmeli, dalgalı katı elde edilmeli ve mqe suda çözülmelidir. 10 mikromolar final konsantrasyonunda. Çözeltiyi 1.5 mililitrelik mikro santrifüj tüplerinde 50 mikrolitrelik alikotlar halinde dağıtın ve eksi 20 santigrat derecede saklayın.

İn vitro kalibrasyon için, bir kuvars Q veterinerinde iki milimolar PBS'de 500 nanomolar D drummer çözeltisi hazırlayın. Titrasyon sırasında ani pH değişikliklerini önlemek için çok seyreltik bir PBS tamponu kullanılır. Floresein ve TMR'nin emisyon spektrumlarını ölçün ve iyi bir sinyal-gürültü oranı elde etmek için florimetrenin optik ayarlarını optimize edin.

Ardından, küçük hacimlerde 0,1 normal sodyum hidroksit ve 0,1 normal hidroklorik asit ekleyerek bir pH titrasyonu gerçekleştirin. Her eklemeden sonra, karıştırmak için Q veterinerini sallayın. Dengeleme için bir dakika bekleyin ve ardından pH'ı bir pH ile ölçün.

Floresein ve TMR'nin mikro elektrot emisyon spektrumları, herhangi bir değişiklik olmaksızın her adım için kaydedilmelidir. Optik ayarlarda, floresan yoğunluğunu pH'a karşı çizin. Titrasyon için, çubuk domin sinyali pH'dan etkilenmemelidir.

Floresein sinyali sigmoidal bir eğri olmalı ve elektroporasyon için PK değeri 6.4 olan tek bir bağlanma modeli ile donatılmalıdır. 72 mikrolitrede beşinci hela hücrelerine altı kez 10'u 1.5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne yeniden süspanse edilmiş hücrelere aktarın. İki mikromolar konsantrasyonda dendri veya sulu çözelti ekleyin, bir mikro purasyon tüpüne üç mililitre, elektroporasyon tamponu ekleyin.

Daha sonra 10 mikrolitrelik bir elektroporasyon ucu kullanarak hücre ve rimer karışımlarını aspire edin. Ardından, mikro pipeti pipet istasyonuna yerleştirin ve mikro purasyon darbe koşullarını burada ayarlayın. Darbe voltajı 1005 volt olarak ayarlanmıştır.

Darbe genişliği 35 milisaniye olarak ayarlanmıştır ve darbe sayısı, darbe plakasından sonra ikiye ayarlanmıştır. 20 mikrolitre elektroporasyonlu hücreler, antibiyotik içermeyen taze besiyeri ile cam tabanlı tabaklara. Elektroporasyondan 12 saat sonra, floresein ve R domin için standart bir filtre seti kullanarak hücreleri konfokal bir mikroskopla görüntüleyin.

Numuneye odaklanın ve sinyal-gürültü oranını en üst düzeye çıkarmak için lazer gücünü ve dedektör kazancını ayarlayın. Elektroporasyon başarılı olduysa, hücreler her iki kanalda da parlak bir şekilde floresan olmalıdır. Lokalizasyon, kullanılan D'nin boyutuna ve yüküne bağlıdır. Sık sık.

Küçük perinükleer veziküller olarak görülen güneş lizozomal lokalizasyonu, endositoz veya kompartmantalizasyona bağlı olarak mevcuttur. Floresansın çoğunun veziküller içinde lokalize olduğu ve sitozolde gözenek sinyalinin gözlendiği lizozomal lokalizasyon baskındır. Bu, toksisite anlamına gelir ve ölçümler atılmalıdır.

İki kanalı sırayla alın, birkaç görüntü elde edin ve görüntü kalitesini artırmak için görüntülerin ortalamasını alın. Bir pH kalibrasyon eğrisi oluşturmak için, hücre içi ve hücre dışı pH'ı aynı değerde toplamak için farklı ph'larda opfor içeren tamponlar kullanın. pH başına en az 20 hücre görüntüsü elde edin ve pH 5.5 ile pH 7.5 arasında en az beş nokta ölçün.

pH B altısının hücreler için toksik olduğunu, ancak kısa bir süre için tolere edilebileceğini hatırlatır, bu nedenle mümkün olduğunca kısa görüntüler elde edin. Apoptoz belirtisi görürseniz, hücreleri atın ve yeniden başlatın. Satın almanın ardından.

Veri analizi için görüntü J veya benzer bir yazılım kullanın. İlk olarak, yeşil - kırmızı oranını belirleyin. Ardından, gelecekteki deneylerde oranı pH'a dönüştürmek için kullanılabilecek bir kalibrasyon eğrisi verecek doğrusal bir eğilim üretmek için pH'a karşı oranı çizin.

İn vivo numune hazırlama için, doğum sonrası 28 ve 70. günler arasında C 57 siyah altı J ve dişi farelerle başlayın. Fareleri üretanla uyuşturduktan sonra, hayvanın tamamen uyuşturulduğundan emin olmak için bir ayak parmağı çimdikleme yapın ve kortikal stres tepkisini ve serebral ödemi azaltmak için göz merhemi uygulayın. Ameliyat sırasında, vücut ağırlığının kilogramı başına iki miligram deksametazon, sodyum fosfat kas içine enjekte edin.

Daha sonra, cerrahi makas kullanarak hayvanın kafasını tıraş edin, ardından cerrahi bir örtü yerleştirin ve kafa derisine% 2.5 lidokain jeli uygulayın. Her iki yarım kürenin kafatasını kaplayan deri kanadını kesmek için makas kullanın. Açıkta kalan kemiği tuzlu su ile ve forseps ile yıkayın, periosteuumu nazikçe çıkarın.

Bu daha iyi bir yapışma yüzeyi sağlayacaktır. Tutkal ve diş çimentosu için, merkezi bir görüntüleme odasına sahip özel yapım bir çelik kafa direği uygulayın ve siyanoakrilat kullanarak, ilgilenilen kortikal bölge üzerinde kafatasına yaklaşık olarak paralel bir düzlükte yerine yapıştırın. Direği beyaz diş çimentosu ile yerine sabitleyin.

Farenin kafasını sabitleyin ve ilgilenilen bölgeyi delerek iki ila üç milimetre çapında bir kraniyotomi yapın. Delme prosedürü boyunca sıklıkla, ameliyat sırasında korteksin ısınmasını en aza indirmek için kafatasına taze steril A BOS uygulamak için şırınga kullanılır. Kraniyotomiden sonra, başı hala objektifin altında tutmak için hayvanı görüntüleme aşamasına aktarın.

Görüntüleme odasını ayarlanabilir direğe vidalayın. Oksijene bağlı özel yapım plastik bir ağızlık uygulayın. Bu, hayvan solunumuna yardımcı olmak için deney sırasında oksijenle zenginleştirilmiş hava sağlayacaktır.

Sensörü beyin korteksine enjekte etmek için, dört milimetre uç çapına sahip bir cam pipet ve bir gümüş klorür elektrot yükleyin. Bir mikromolar drimmer ER çözeltisi ile elektrot, bir mikroenjeksiyon kurulumu ile hücre dışı alan potansiyellerinin kaydedilmesini kolaylaştıracaktır. Pipeti kortekse yaklaşık 150 mikron derinlikte yerleştirin.

Görüntüleme için optik kurulumu optimize etmek için inç kare başına 0,5 pound basınçta bir ila iki dakika enjekte edin. Fotoğraf ağartmasını ve fotoğraf hasarını en aza indirmek için lazer gücünü ayarlayın. Tipik olarak, kullanılan lazer gücü yaklaşık 20 miliwatt'tır ve PMT kazancı 667 voltta sabit tutulur.

Lazer dalga boyunu sensörü 820 nanometrede uyaracak şekilde ayarlayın ve yazılımı, standart FTSE ve trit filtreleri aracılığıyla aynı anda floresan ve çubuk domin floresansını algılamaya yönlendirin. Ayrıca, arka plan düzeltmesi için alma frekansını iki hertz'lik bir kare hızına ayarlayın. PMT'lerde ve kaidede ortaya çıkan ortalama termal gürültüyü ölçmek için lazer deklanşör kapalıyken karanlık bir çerçeve elde edin.

Son olarak, pH'a bağlı floresan görüntüleri elde edin ve bunları sonraki analizler için saklayın. Floresein ve ruminin in vitro davranışını değerlendirmek için verileri daha önce olduğu gibi analiz edin. Jant üzerine yüklendiğinde, bir florimetre kullanılarak bir pH titrasyonu gerçekleştirildi.

Bu şekil, bir pH sensörünün tipik titrasyonunu göstermektedir. Floresein ve rumin, sırasıyla 488 nanometre ve 550 nanometrede ayrı ayrı uyarılabilir ve açıkça görülebileceği gibi iki kanal arasında minimum karışmaya izin verir. Floresein pH'a bağlı bir davranış gösterirken, R domin sinyali fizyolojik pH aralığında önemli ölçüde değişmez.

Bu nedenle, bu iki sinyalin oranı sensör konsantrasyonuna değil, yalnızca pH'a bağlıdır. İndikatörün hücre içine iletilmesinin ardından hela hücreleri dederer sensörleri ile elektroporasyona tabi tutuldu ve bu videoda anlatıldığı gibi konfokal görüntüleme yapıldı. Bu konfokal görüntüler, solda floresein kanalındaki hücreleri, ortada R domin kanalını gösterir ve sağda bir pH oranı metrik haritası olarak görüntülenir.

Sensör yapısının bütünlüğünü gösteren birlikte lokalize olan güçlü floresein ve r domin sinyalleri gözlenir. Bir oran metrik haritası, iki görüntünün piksel piksel bölünmesiyle yeniden oluşturulur ve sahte bir renk ölçeği ile temsil edilir. Hücrelerin içindeki sensör tepkisini kalibre etmek için, burada gösterildiği gibi iyonoforlarla pH sıkıştırması gerçekleştirildi.

Göstergeler, yeşil-kırmızı oranının değişmesiyle pH'a kolayca yanıt verir. Elde edilen veriler, doğru pH ölçümleri için bir kalibrasyon eğrisi oluşturmak üzere kullanıldı. Kalibrasyondaki doğrusal eğilim, sensörün hücresel ortamdan herhangi bir bozulma olmadan pH'a yanıt verme yeteneğini gösterir.

Dendri tabanlı sensörlerin in vivo görüntüleme için nasıl kullanılabileceğini göstermek için, dendri veya enjekte edilmiş anestezi uygulanmış bir farenin beyninde pH görüntüleme yapıldı. Floresein ve r domin sinyalleri 820 nanometre uyarımı ile eş zamanlı olarak elde edildi ve oran haritası, canlı hücre ölçümlerine benzer şekilde piksel bazında oluşturuldu. Özellikle, göstergeler hücre dışı boşlukta lokalize olur, görüntüdeki floresan olmayan alanlar, sensörün pH'a tepkisini doğrulamak için hücresel cisimleri veya küçük kan damarlarını tanımlar.

Biz hiperkapne kullanımını kullandık. Gerçekten de, karbondioksitin kan ve dokudaki karbonat tamponlarının dengesini değiştirdiği ve dokunun asitleşmesine neden olduğu bilinmektedir. Bu grafikte görüldüğü gibi, %30 karbondioksitin solunması, farenin devir havalandırması üzerine tamamen tersine çevrilebilir olan sensörün güçlü bir tepkisini indüklemek için yeterlidir.

Bu sonuçlar, canlı hücrelerde ve in vivo olarak pH'ın fizyolojik ve patolojik değişikliklerini vurgulamak için sensör tabanlı sensörlerin potansiyelini göstermektedir. A, prosedürümüz elektrofizyolojik kayıtlar gibi diğer ölçümlerle uyumludur. Bu, devam eden biyolojik süreç hakkında aynı anda tamamlayıcı bilgiler elde edilmesine izin verdi.

Bu yöntem, geliştirildikten sonra, hücre biyolojisi ve nörobiyoloji alanındaki araştırmacıların, kültür hücrelerinde ve in vivo olarak pH regüle edilen süreçleri keşfetmesinin yolunu açtı.