Name: Anjiyogenez Araştırma Yenidoğan Fare Retina Tüm Dağı Immunofluorescent Boyama In vivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: Öğrenin yenidoğan fare retinasında anjiyogenez mekanizmalarını immünofloresan boyama ve konfokal mikroskopi ile in vivo görüntüleme yöntemini. Bu teknik vasküler gelişim araştırmaları için güvenilir bir model sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Wellcome Trust ve İngiliz Kalp Vakfı tarafından finanse edildi.

Aksi belirtilmedikçe tüm adımları, oda sıcaklığında gerçekleştirilir. 1. Doğum sonrası Eyes enükleasyon ve Fiksasyon <ol><li> Yan yavru insanca öldürüldü fare yerleştirin, makas ile göz kaplayan deri kaldırmak. </li><li> Göz tanıttılar makas ve forseps kullanın. </li><li> Enüklee göz altında yer makas, optik sinir ve çevresindeki dokuları kesmek ve göz çıkarın. Oda sıcaklığında, 2x PBS içinde oluşur% 4 paraformaldehit (PFA), ihtiva eden bir 24-kuyucuklu plakaya aktarılır. </li><li> Her bir göz için 10 düzeltmek için - 10 dk - 15 dk, daha sonra 5 için buz üzerinde soğuk 2x PBS transfer. Bu sabitleme derecesi her bir göz için eşit olduğundan emin olmak için enucleations ve sonraki sabitleme sendeleyip en iyisidir. </li></ol> 2. Doğum sonrası Murin retina diseksiyonu <ol><li> 2x PBS içeren bir Petri kabı içine transferi gözleri bir disse altında delik ve yer genişletmek için kesilmiş bir plastik Pasteur pipeti kullanarakmikroskop cting. </li><li> Forseps ve makas kullanılarak göz çevresinde herhangi bir yağ çıkarmak. </li><li> Pierce keskin bir makas ile korneanın kenar ve kornea ve iris ve atın etrafını kesin. </li><li> Retina ve sklera arasında forseps yerleştirin ve retina gözyaşı özen sklera çıkarın. Koroid tabakası da kaldırılabilir, ancak bu adımı sırasında meydana gelen retinaya hasar riski varsa, koroid tabakası önemli ölçüde immün kalitesini etkilemez olarak bırakılabilir. </li><li> Lens ve forseps kullanarak vitreus mizah çıkarın. </li><li> Ince forseps ile gözün merkezinde bir araya toplayarak hyaloids gemilerin çıkarın sonra hızlı bir şekilde retinanın merkezi (alternatif olarak ince makas ile hyaloid gemilerin dibinde kelepir) uzak çekin. </li><li> Temiz bir Petri kabındaki PBS ile fincan şeklinde retina durulayın. </li><li> Bahar scisso kullanarak retinanın yarıçapı yaklaşık 2/3 ulaşan 4 ile 5 radyal kesiler olunrs bir &#39;taç yaprağı&#39; şekil oluşturmak için. </li><li> PBS retina düzleştirmek için bir Pasteur pipeti kullanarak, ve sonra emici kağıt küçük bir parça ile herhangi bir aşırı PBS kaldırmak çekişi. </li><li> Yavaşça pipet soğuk (-20 ° C) retina yüzeyine damla metanol damla tamamen ek metanol ile daha sonra sel kaplı ve kadar. Bu retina düzeltmek için ve permeabilization kolaylaştıracaktır yardımcı olacaktır. Retina beyaz dönecek. </li><li> Delik genişletmek için kesilmiş bir plastik Pasteur pipeti kullanarak 2 ml tüp aktarın. </li><li> Immün devam etmeden önce en az 20 dakika soğuk metanol içinde retina bırakın. Burada kullanılan antikorlar, sadece VE-kaderin metanol sabit retina üzerinde başarılı bir şekilde kullanılamaz. Bu durumda retina adım 9 sonra immün doğrudan devam etmek gerekir. </li><li> Gerekirse kadar boyamadan önce bir kaç ay için, retinalar -20 ° C&#39;de metanol içinde saklanabilir. </li></ol> 3. Immuno / Retina Vascu bir isolectin Boyamalature <ol><li> Dikkatle çıkarın / metanol dökün ve yavaşça (bu aşamada retina yukarıdaki adım 11 ile aynı 2 ml&#39;lik bir tüp içinde hala) PBS içinde kısaca retina yıkayın. </li><li> Perm / Blok çözüm 100 ul PBS ve kapak retina çıkarın (PBS +% 0.3 Triton +% 0,2 BSA) + 5 uygun serum% (bkz. Tablo 1) ve 1 saat için hafifçe sallayın. </li><li> Nazik 4 gece sallayarak ° C 100 seçilen primer antikor ul (bkz. Tablo 1) ve / veya IsolectinB4, Perm / Blok seyreltilmesi ile hazırlanan tüm ile retina Blok ve inkübe / Perm çıkarın. </li><li> Antikor / isolectin çıkarın ve retina 4 yıkayın PBS x 10 dk +% 0.3 Triton (PBSTx). </li><li> Bazı durumlarda, IsolectinB4-Alexa488 konjüge ya da doğrudan primer antikor ile örneğin aşağıdaki boyama, ikincil antikorun gerekli değildir ve retina (basamak 7) doğrudan monte edilebilir. Konjuge olmayan bir primer antikor, uygun florun 100 ul, daha sonra adım 3&#39;te kullanılan görmüşseescent ikincil antikor (PBSTx içinde 1/200 seyreltilmiş) ilave edildi ve 4 ° C sıcaklıkta ya da oda sıcaklığında, 4 saat süreyle gece boyunca inkübasyona bırakılmıştır. </li><li> Ikincil antikor çıkarın ve 2 ml PBSTx içinde retina 4 x 15 dakika yıkayın. </li><li> Geniş bir delik plastik Pasteur pipeti kullanarak slayt üzerine retina aktarmak ve emici dokusu ile fazla PBSTx çıkarın. 50 ul ekleyerek Dağı retina retina üzerinde lamel ve yavaşça konumu üzerine mountant uzatır. </li><li> Transferi onlar uzatmak mountant ayarlamak için izin vermek için, düz ve ışıktan korumalı olmasını sağlamak, 4 ° C gecede buzdolabı kayar. </li><li> Görüntü retina bir konfokal mikroskop veya Epifloresans mikroskop kullanılarak. </li></ol>

<ol><li>Carmeliet, P., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+and+clinical+applications+of+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis.</a> Nature. 473 (7347), 298-307 (2011).</li>
<li>Staton, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+methods+for+assaying+angiogenesis+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J.+Exp.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Current methods for assaying angiogenesis in vitro and in vivo.</a> Int J. Exp. Pathol. 85 (5), 233-248 (2004).</li>
<li>Goodwin, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+assays+of+angiogenesis+for+assessment+of+angiogenic+and+anti-angiogenic+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc.+Res%22%5BJournal%5D)">In vitro assays of angiogenesis for assessment of angiogenic and anti-angiogenic agents.</a> Microvasc. Res. 74 (2-3), 172-183 (2007).</li>
<li>Lawson, N. D., Weinstein, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+embryonic+vascular+development+using+transgenic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish.</a> Dev. Biol. 248 (2), 307-318 (2002).</li>
<li>Fruttiger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+retinal+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Angiogenesis%22%5BJournal%5D)">Development of the retinal vasculature.</a> Angiogenesis. 10 (2), 77-88 (2007).</li>
<li>Sawamiphak, S., Ritter, M., Acker-Palmer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+retinal+explant+cultures+to+study+ex+vivo+tip+endothelial+cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Preparation of retinal explant cultures to study ex vivo tip endothelial cell responses.</a> Nat. Protoc. 5 (10), 1659-1665 (1038).</li>
<li>Mahajan, V. B., Skeie, J. M., Assefnia, A. H., Mahajan, M., Tsang, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+eye+enucleation+for+remote+high-throughput+phenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Mouse eye enucleation for remote high-throughput phenotyping.</a> J. Vis. Exp. (57), e3184(2011).</li>
<li>Pitulescu, M. E., Schmidt, I., Benedito, R., Adams, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+gene+targeting+in+the+neonatal+vasculature+and+analysis+of+retinal+angiogenesis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Inducible gene targeting in the neonatal vasculature and analysis of retinal angiogenesis in mice.</a> Nat. Protoc. 5 (9), 1518-1534 (2010).</li>
<li>Allinson, K. R., Lee, H. S., Fruttiger, M., McCarty, J., Arthur, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+expression+of+TGFbeta+type+II+receptor+is+required+to+maintain+vascular+integrity+during+postnatal+development+of+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Endothelial expression of TGFbeta type II receptor is required to maintain vascular integrity during postnatal development of the central nervous system.</a> PLoS One. 7 (9), e39336(2012).</li>
<li>Mahmoud, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+arteriovenous+malformations+in+the+absence+of+endoglin%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of arteriovenous malformations in the absence of endoglin.</a> Circ. Res. 106 (8), 1425-1433 (2010).</li>
<li>Lebrin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thalidomide+stimulates+vessel+maturation+and+reduces+epistaxis+in+individuals+with+hereditary+hemorrhagic+telangiectasia%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Thalidomide stimulates vessel maturation and reduces epistaxis in individuals with hereditary hemorrhagic telangiectasia.</a> Nat. Med. 16 (4), 420-428 (2010).</li>
<li>Pi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+connective+tissue+growth+factor+in+the+retinal+vasculature+during+development+and+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Role of connective tissue growth factor in the retinal vasculature during development and ischemia.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52 (12), 8701-8710 (2011).</li>
<li>Powner, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+gene+expression+in+whole+mouse+retina+by+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Visualization of gene expression in whole mouse retina by in situ hybridization.</a> Nat. Protoc. 7 (6), 1086-1096 (2012).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.

Burada sunulan yöntem anjiogenezin kolay ölçülebilir ve fizyolojik ilgili model yapımı, yenidoğan fare retina lekeli bütün montaj hazırlıkları görüntüler elde etmek için basit ve etkili bir yol sunar. Başlangıçta, fare göz küçük boyutu ve dünya şekli nedeniyle incelemek için oldukça zor olabilir, biraz pratik ve iyi diseksiyon araçları güvenilir sonuçlar için gereklidir bu yüzden. Bu göz su kaybı küçük bir miktar neden olur ve diseksiyon kolaylaştırır içi yörünge basıncı azaltır, çünkü PBS 2x konsantrasyonda hazırlanmış...

Anjiyogenez, önceden mevcut olan damar ağı yeni kan damarlarının oluşumu ile tanımlanan ve çok sayıda sinyal yolları ile düzenlenmiş olan karmaşık bir gelişimsel bir süreçtir. Bunların en önemli VEGF yoldur. VEGF komşu kan damarlarında çimlenme anjiyogenik en başlamadan iskemik hücreleri ve yol tarafından serbest bırakılır. Filiz yeni bir damar önde gelen endotel hücre VEGF kaynağına doğru ulaşmak olduğunu filopodia üreten bir &#39;ipucu&#39; hücre, ve &#39;sap&#39; endotel hücreleri prolifere takip eder. Bu şekilde, aktive edilmiş endotel hücreleri göç eder ve bunlar, yeni damar tüpler oluşturmak burada avasküler bir bölge doğru çoğalır. Kan akışını desteklemek için bu tüpler stabilize etmek amacıyla, endotelial hücreler perisitler ve yeni kan damarlarının 1 çevreleyen yumuşak kas hücreleri ile etkileşime girer. Anjiyogenez, embriyo ve artan doku vaskülarizasyonu için gereklidir. Bununla birlikte, aynı zamanda pek çok patolojik katkıdakanser gibi kalori bozuklukları; anjiyogenez bozukluklar iskemik hastalıkları ile ilişkili ise. Hastalığın tedavisi için bir araç olarak anjiyojenez düzenleyen etkili ilaç tedavilerinin geliştirilmesi büyük ilgi taşımaktadır. Örneğin, etkili bir anti-anjiyojenik faktörler, kanser büyümesini azaltmak pro-anjiyogenik stratejiler iskemik bir hastalığı tedavi etmek için kullanılabilir iken olacaktır. Böylece, anjiyogenez modelleri daha iyi yeni damar oluşumu ve vasküler büyüme artırmak veya azaltmak için yeni tedavi stratejileri geliştirmek için düzenleme anlamak için gereklidir. Anjiyogenez araştırma temel bir unsuru uygun bir damar modelinin seçimdir. In vitro modellerde pek çok tür endotel hücre göçü, çoğalması ve hayatta kalma 2,3 olarak anjiyogenez temel adımları yeniden tasarlanmıştır. Sıklıkla in vitro tahlilinde kullanılan bir rağmen t bir Matrigel matrisi üzerinde endotelyal hücre, bir dallı bir şebeke oluşumuonun endotel hücreleri için spesifik değildir, ne de genellikle perisit ve düz kas hücrelerinin destek dahil etmez. Bu tür vücut embriyoit tahlilinde, aortik halka deneyi ve fetal metatarsal deneyi gibi fare organ kültürü ile ex vivo olarak filizlenme anjiyogenez Değerlendirilmesi ek destek hücreleri bağlamında endotel hücrelerinin damar analizine izin verir. Bununla birlikte, bu testler, ana sınırlamaları analiz için sınırlı bir pencere vererek, kan akışının olmaması ve zaman içinde damarlarının regresyon içerir. Bu nedenle, daha doğru bir anjiyogenez düzenleme anlamak için, in vivo modellerde de arka kol veya bacak iskemisi model olarak, örneğin deri altına implante edilen sünger veya fişleri Matrigel kullanılarak fare geliştirilenlerdir olarak gereklidir. Ancak, bu modeller neovessels karmaşık 3D mimarisi nedeniyle analiz etmek zordur. Buna karşılık, zebrabalıkları embriyo tamamının görüntülenmesi anjiyogenez için mükemmel bir model olduğunu kanıtlamıştırorganizma 4. Bununla birlikte, fare, fare birçok durumda, tercih edilen bir model yapımı evrimsel olarak çok daha yakından zebrabalıkları göre insan ile ilgilidir. Sonuç olarak doğum sonrası fare retinanın anjiyogenez anjiyogenez araştırmalar için tercih edilen bir iyi karakterize yöntem temsil eder. Bu fizyolojik bir ayar, aynı zamanda kolayca uygun floresan lekeleri kullanılarak görüntülendi edilebilir bir 2D vasküler pleksus sağlar sadece. Damar ağı, endotel proliferasyonu, çimlenme, perivasküler hücre toplanması ve gemi yeniden bir mimarisi tüm bu teknik kullanılarak incelenebilir. Neonatal fare retinasında, retinal kan damarlarının gelişimi Postnatal ilk haftasında meydana gelir. Fareler, insanlar farklı, kör doğarlar ve retina sadece doğumdan sonra vaskülarize olur. Retina damarları doğum sonrası gün 0 (P0) de optik sinir retina yakın merkezinde kaynaklanan ve son derece düzenlemek oluşturmak için anjiyogenez tarafından geliştirmekyaklaşık P8 5 ile retina çevre ulaşır d vasküler pleksus. Kan damarları kılcal pleksus yavaş yavaş bir araya kapiller ağı ile arterler ve venler düzenli bir alternatif desen oluşturmak için çevre doğru optik disk dışarı doğru büyüyen karakteristik bir şekilde gelişir. Retina damar böylece nispeten kolay düz montaj hazırlıkları 5 retina damar incelemek için yapım, onlar aslında bir 2D düzlemde ne de büyüdükçe damarlar kolayca tespit edilebilir olarak anjiyogenez çalışmak için ideal bir model sağlar. Birkaç saat ex vivo olarak endotelial fazla uç hücre yanıtlarının analizi için Yeni doğan fare retina izole edilmesi için bir yöntem olup 6 bildirilmiştir. Alternatif olarak, tüm retina damar ve ilişkili vasküler işaretleri daha ayrıntılı bir araştırma farklı gelişim aşamalarında sabit retina örneklerinin immün gerektirir. Burada sağlamakBiz mikroskop altında son görüntüleme için boyama protokolleri ile (ayrıca 7) doğum sonrası gözün ilk enükleasyon gelen fare retina vasküler pleksus, ve tüm montaj boyama için kullandığınız güvenilir ve teknik yalındır yöntemi ayrıntılı bir açıklama.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Malzeme</td></tr><tr><td>Plastik pipetler 3 ml</td><td>Bilimsel Laboratuvar Malzemeleri</td><td>PIP4210</td> Geniş çaplı BD Falcon 24 kuyulu plakalar oluşturmak <td>için ucu makasla çıkarın</td></tr><tr><td></td><td>Bilimsel Laboratuvar Malzemeleri</td><td>353226</td><td></td></tr><tr><td>Belirli Petri kapları TV 90 mm</td><td>Bilimsel Laboratuvar Malzemeleri</td><td>SLS2002</td><td></td></tr><tr><td>Histobond slaytlar</td><td>VWR</td><td>631-0624</td><td></td></tr><tr><td>Lameller 22 x 22 mm</td><td>VWR</td><td>631-1336</td><td></td></tr><tr><td>Dumont Cımbız #5</td><td>Dünya hassas aletleri</td><td>14095</td><td></td></tr><tr><td>Yaylı makas 10,5 cm uzunluğunda, düz 8 mm bıçaklı</td><td>Dünya hassas aletleri</td><td>501235</td><td>Enükleasyon için kullanılır</td></tr><tr><td>8,5 cm uzunluğunda, düz 7 mm bıçaklı ve 0,025 x 0,015 mm çok ince uçlu</td> <td>Vannas makasıDünya hassas aletleri</td><td>500086</td><td>Retinayı incelemek için kullanılır</td></tr><tr><td>8 cm uzunluğunda, düz 3 mm bıçaklar ve 0,015 x 0,015 mm süper ince uçlar Süper ince vannas makası</td> Dünya <td>hassas aletleri</td><td>501778</td> Retina kristal berraklığında <td>diseksiyon için kullanılır</td></tr><tr><td>&#8217; tüpler 2 ml</td><td>Starlab</td><td>E1420-2000</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Reagents</td></tr><tr><td>Sodyum fosfat dibazik</td><td>Sigma</td><td>S0876</td><td>PBS reaktifi</td></tr><tr><td>Potasyum fosfat monobazik</td><td>Sigma</td><td>P5655</td><td>PBS reaktifi</td></tr><tr><td>Sodyum klorür</td><td>Sigma</td><td>S9625</td><td>PBS reaktifi</td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td>2x PBS'de oluşturun ve -20 & # 176'da saklayın; C</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A7638</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Eşek serumu</td><td>Sigma</td><td>D9663</td><td></td></tr><tr><td>Keçi serumu</td><td></td><td>Vektör S-1000</td><td></td></tr><tr><td>Prolong Gold solma önleyici reaktif</td><td>Invitrogen</td><td>P36930</td><td>Montaj reaktifi</td></tr><tr><td>İzolektin GS-IB4-alexa 594</td><td>Invitrogen</td><td>I21413</td><td>Kullanım yeri 1:200 seyreltme</td></tr><tr><td>Isolectin GS-IB4-alexa 488</td><td>Invitrogen</td><td>I21411</td><td>1:200 seyreltmede</td></tr><tr> kullanın<td colspan="4"><güçlü>Primer Antikorlar</td></tr><tr><td>Anti-NG2 (tavşan poliklonal)</td><td>Millipore</td><td>AB5320</td><td>Perisitleri algılar</td></tr><tr><td>Anti-GFAP (klon GA5, fare monoklonal)</td><td>Millipore</td><td>MAB360</td><td>Astrositleri</td></tr><tr><td>Anti-Desmin (klon Y66) algılar, tavşan monoklonal)</td><td>Millipore</td><td>04-585</td><td>Perisitleri algılar</td></tr><tr><td>Anti-Kollajen IV (tavşan poliklonal)</td><td>Chemicon</td><td>AB756P</td><td>Vasküler bazal membranı</td></tr><tr><td>algılar Anti-alfa düz kas aktin-Cy3 (klon 1A4, fare monoklonal)</td><td>Sigma</td><td>C6198</td><td>Vasküler düz kas hücrelerini algılar.</td></tr><tr><td>Anti-Endoglin (klon MJ7/18, sıçan monoklonal)</td><td>BD Pharmingen</td><td>550546</td><td>Endotel hücrelerini algılar</td></tr><tr><td>Anti-CD31 (klon MEC13.3, sıçan monoklonal)</td><td>BD Pharmingen</td><td>553370</td><td>Endotel hücrelerini algılar</td></tr><tr><td>Anti-VE-Cadherin (klon 11D4.1, sıçan monoklonal)</td><td>BD Pharmingen</td><td>550548</td><td>Endotel hücre bağlantılarını tespit eder</td></tr><tr><td>Anti-Alk1 (keçi poliklonal)</td><td>R& D Systems</td><td>AF770</td><td>Endotel hücrelerini</td></tr><tr><td colspan="4"><güçlü>İkincil Antikorlar</güçlü></td></tr><tr><td>Keçi anti-tavşan-Alexa594</td><td>Invitrogen</td><td>A11012</td><td>algılar Tüm ikincil antikorlar varışta hemen aliquote edilir ve -20 &# 176;C'de saklanır.</td></tr><tr><td>Keçi anti-sıçan-Alexa488</td><td>Invitrogen</td><td>A11006</td><td>Tüm ikincil antikorlar varışta hemen aliquotee edilir ve -20 &# 176;C'de saklanır.</td></tr><tr><td>Keçi anti-sıçan-Alexa594</td><td>Invitrogen</td><td>A11007</td><td>Tüm ikincil antikorlar varışta hemen aliquotee edilir ve -20 &# 176;C'de saklanır.</td></tr><tr><td>Keçi anti-fare-Alexa488</td><td>Invitrogen</td><td>A11029</td><td>Tüm ikincil antikorlar varışta hemen aliquotee edilir ve -20 &# 176;C'de saklanır.</td></tr><tr><td>Eşek anti-keçi-Alexa594</td><td>Invitrogen</td><td>A11058</td><td>Tüm ikincil antikorlar varışta hemen aliquotee edilir ve -20 & # 176;C'de saklanır.</td></tr><tr><td colspan="4">Mikroskoplar</strong</td></tr><tr><td>>Diseksiyon mikroskobu</td><td>Zeiss</td><td>Stemi SV6</td><td></td></tr><tr><td>Kamera</td><td>Diseksiyon mikroskobu için</td><td>Zeiss</td><td>Axiocam HRc</td> Kamera</tr><tr><td>Epifloresan Mikroskop</td><td>Apotom</td><td></td>Kameralı Zeiss <td>Axioimager Axioimager</td></tr><tr><td></td><td></td>Konfokal Mikroskop için <td>Zeiss</td><td>Axiocam HRm</td> Kamera</tr><tr><td></td><td>Nikon</td><td>A1R</td><td></td></tr></tbody></table>

anjiyogenez araştırma yenidoğan fare retina tüm dağı immunofluorescent boyama<em&gt; in vivo</em

Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

Anjiyogenez, önceden mevcut olan damar ağı yeni kan damarlarının filizlenmesi tarafından tanımlanan yeni kan damarı oluşumunu ve karmaşık bir süreçtir. Anjiyogenez, kanser, körlük ve iskemik hastalıklar gibi kan damarı oluşumunu düzensiz olduğu birçok hastalık, aynı zamanda, sadece organ ve dokuların normal gelişiminde önemli bir rol oynamaktadır, ancak. Anjiyogenez hastalığında özellikle yeni damar oluşumunu denemek ve düzenlemek için yeni ilaç gelişimi için önemli bir hedef bu yüzden yetişkin yaşamda, kan damarları genellikle sakin olan. Daha iyi anjiyogenez anlamak ve düzenlemek için uygun stratejiler geliştirmek amacıyla, modeller doğru dahil olan farklı biyolojik adımları yansıtan gereklidir. Damar sertliği, damar ve kılcal doğumdan sonraki ilk hafta içinde vasküler pleksus oluşturmak için geliştirmek için fare yenidoğan retina damar mükemmel bir model sunar. Bu model aynı zamanda, iki-di sahip olma avantajına sahiptirmensional (2B) yapısı diğer damar ağları karmaşık 3D anatomisi ile karşılaştırıldığında basit analizi yapma. Doğum sonrası farklı zamanlarda retinal vasküler pleksus analiz ederek, bu mikroskop altında anjiogenez çeşitli aşamalarında gözlemlemek mümkündür. Bu makalede, isolectin ve vasküler spesifik antikorlar ile floresan boyama kullanılarak bir fare retina damar analiz etmek için basit bir işlem ortaya koymaktadır.

Diseksiyon sonra retinanın düz çiçek (Şekil 1) gibi görünmelidir. Yukarıda belirtilen protokol kullanılarak, endotel hücrelerinin, anti-a-düz kas aktin (Şekil 2) kullanılarak görselleştirilmiştir isolectin B4-Alexa488 boyaması kullanılarak ve vasküler kas hücrelerinin destek görülebilir. Şekil 2&#39;de bir 5X objektif kullanarak düşük güç görünümü retinanın damar örgütün genel bir bakış sağlar. Ayrıca, yukarıda verilen protokol antikorlar, farklı bir arada kullanarak, e...

Yenidoğan fare retina bir anjiyogenez modüle farklı genler ya da uyuşturucu rolleri soruşturma izin anjiyogenez bir iyi karakterize fizyolojik modeli sağlar<em&gt; In vivo</em&gt; Bağlam. Doğru vasküler pleksus görselleştirmek için immunofluorescent boyama çalışmaları bu tür başarısı için çok önemlidir.

Anjiyogenez Araştırma Yenidoğan Fare Retina Tüm Dağı Immunofluorescent Boyama<em&gt; In vivo</em

Angiogenesis  is the complex process of new blood vessel formation defined by the sprouting  of new blood vessels from a pre-existing vessel network. ...

Bu prosedürün genel amacı, neonatal fare retinasındaki anjiyogenezi incelemektir. Bu işlem, öncelikle postnatal gözlerin nukleasyonu ile başlar ve ardından bir fiksatif uygulanmasıyla devam eder; üçüncü adım postnatal fare retinasının dikkatlice petal şeklinde diseke edilmesidir ve son adım ise retinal vaskülatürün boyanmasıdır. Nihayetinde, fare retina vaskülatürünün görselleştirilmesi, floresan boyama ve konfokal mikroskopi aracılığıyla gerçekleştirilir.Bu prosedürü, laboratuvarımdaki doktora sonrası araştırmacı Dr. Simon Tlo ve laboratuvarımın eski bir üyesi olan Kathleen Allenson uygulamalı olarak gösterecekler. Bu prosedür boyunca varsayılan sıcaklık oda sıcaklığıdır. İnsani yöntemlerle öldürülmüş bir fare yavrusunu makas yardımıyla yan tarafına yatırarak başlayın.Gözü örten deriyi çıkarın. Ardından, makasla gözün altına yerleşerek optik siniri ve çevre dokuları kesin ve gözü dışarı çıkarın. Enükle edilen gözü, iki katı konsantrasyonda %4 PFA içeren tespit çözeltisi bulunan 24 kuyucuklu bir plakaya aktarın.Bir göz fiksatif içerisindeyken, PBS ile bir sonraki gözün diseksiyonuna geçilir. İki göz diseksiyonu arasındaki zaman farkı yarım dakika olacaktır. Pratik yaptıkça.Her bir gözün 10 ila 15 dakika boyunca fiksasyonuna izin verin. Ardından, gözleri en az beş ila 10 dakika boyunca buz üzerinde soğuk 2x PBS'ye aktarın. Retinaları izole etmeden önce, ağzı genişletmek için kesilmiş plastik bir pastör pipeti kullanarak, PBS içine istenilen miktarda göz toplayın.Gözleri, bir diseksiyon mikroskobu altında, iki katı PBS içeren bir Petri kabına aktarın. Göz çevresindeki tüm yağ dokularını pens ve makas kullanarak temizleyin. Korneanın kenarını keskin bir makasla delin ve kornea ile irisin çevresinden keserek bu dokuları atın.Ardından, penseti retina ile sklera arasına yerleştirin. Retinayı yırtmamaya dikkat ederek sklerayı çıkarın. Retinaya zarar verme riski olmadığı sürece koroid tabakası da çıkarılabilir.Koroid tabakasının bırakılması, immün boyamanın kalitesini önemli ölçüde etkilememelidir. Şimdi bir pens yardımıyla lensi ve vitreus humorü çıkarın. Ardından aloid damarları çıkararak devam edin.İnce uçlu pens kullanarak bunları gözün merkezinde toplayın. Ardından, hızla retinanın merkezinden uzağa çekin. Tüm sarı dikenleri temizlemeye ekstra özen gösterin; çünkü geride kalanlar, mevcut sonuçlarınızı gölgeleyebilir.Çanak şeklindeki retina artık temiz bir Petri kabına aktarılmalı ve PBS ile durulanmalıdır. Şimdi retinanın üzerine, merkeze doğru yaklaşık üçte iki mesafeye ulaşan dört ila beş adet radyal insizyon yapın.Bu pedal şeklindeki retinayı oluşturmak için yaylı makas kullanın. Bu adımın mükemmelleştirilmesi sabır ve pratik gerektirir. Şimdi, bir pastör pipeti kullanarak PBS'nin çoğunu çekin.Bu işlem retinayı düzleştirecektir. Ardından, fazla PBS'yi küçük bir emici kağıt parçasıyla alın. Sonrasında, retina büyük oranda kapanana kadar yüzeye damla damla -20 °C metanol uygulayın ve ardından bol miktarda metanol ekleyin.Retinalar beyazlaşacaktır. Bu adım retinaların fikse edilmesine yardımcı olacak ve permeasyonu kolaylaştıracaktır. Soğuk metanoldaki retinaları küçük bir tüpe aktarın.Geniş ağızlı plastik bir pipet kullanın. Gerekirse soğuk metanol içinde en az 20 dakika inkübe edilmelerine izin verin; retinalar eksi 20 derecedeki metanol içerisinde birkaç ay kalabilir. Antikor burada sadece şu şekilde kullanılır.Kine, maternal fikse retinada başarıyla kullanılamaz. Bu durumda retinanın, taç yaprak şeklinde düzleştirildikten sonra doğrudan immün boyamaya geçirilmesi gerekir. İşleme, retinalardaki metanolü dikkatlice pipetleyerek uzaklaştırarak başlayın.Ardından retinaları 1x PBS ile hızlıca ve nazikçe durulayın. PBS'yi uzaklaştırın ve retinaları %5 oranında uygun serum içeren 100 µL perm blok çözeltisi ile kaplayın. Retinaları bir saat boyunca hafifçe sallanacak şekilde ayarlayın.Perm blok çözeltisini bir pipet yardımıyla uzaklaştırın ve yerine, önceden birincil antikor veya is selectin içeren 100 µL perm blok çözeltisi ekleyin. Ardından, retinaları 4 °C'de, sallanarak bir gece boyunca inkübe olmaya bırakın. Ertesi sabah retinaları, her yıkama 10 dakika sürecek şekilde PBS TX ile dört kez yıkayın.Tüm yıkama adımları boyunca hafifçe sallayarak karıştırın. Birincil antikor konjuge değilse, PBS tx içinde 1:200 oranında seyreltilmiş 100 µL uygun floresan ikincil antikor ekleyin. İkincil antikoru uzaklaştırmak için retinaları dört °C'de gece boyunca veya oda sıcaklığında dört saat boyunca hafif ajitasyon altında inkübe edin.Retinaları, her yıkama için 15 dakika boyunca hafifçe sallayarak PBS TX ile dört kez yıkayın. Şimdi montaj işlemine geçin. Retinaları geniş ağızlı plastik bir pipet kullanarak lamlara aktarın ve fazla P-B-S-T-X'i bir peçete ile alın.Ardından retinaları 50 µL prolonged gold içerisine yerleştirin ve solüsyonu bir lameliyle nazikçe örtün. Prolonged gold'un sabitlenmesi için lamları dört °C'de, ışık korumalı olarak gece boyunca soğutun. Ertesi gün, diseksiyon sonrası retinaların görüntüleme işlemine geçin.ISO selektin B dört Alexa 4 88 kullanılarak retinanın düz bir çiçeğe benzemesi gerekir. Endotelyal hücreler boyanmış olup yeşil renkte görünmektedir. Destekleyici vasküler kas hücreleri Antifa düz kas aktini kullanılarak görselleştirilmiştir; beş kat objektifli düşük güçteki görünüm, farklı antikor kombinasyonları kullanılarak retinanın vasküler organizasyonuna genel bir bakış sağlamıştır.Endotel hücreleri anti CD 31 immün boyama kullanılarak görülebilir, destekleyici parazitler ise NG ikiye karşı bir antikor kullanılarak görselleştirilmiştir. Alternatif olarak, destekleyici parazitler anti desmin ile boyanmıştır. Anti desmin boyaması, parazitlerin parmak benzeri uzantılarını görselleştirir ve endotel hücrelerle yakın ilişkili olup olmadıklarının belirlenmesine yardımcı olur.Buna karşılık, anti NG iki boyaması her bir parazitin çekirdeklerini belirginleştirir; bu durum, damar sistemindeki parazit hücre sayısını belirlerken faydalıdır. Bu prosedürü uygularken, diseksiyon aletleriyle retina yüzeyine dokunmaktan ve buraya zarar vermekten kaçınmayı hatırlamak önemlidir. Bu prosedürün ardından, spesifik hücrelerin proliferasyonunu incelemek amacıyla BD boyaması gibi diğer yöntemler uygulanabilir.

whole-mount-immunofluorescent-staining-neonatal-mouse-retina-to

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Kaynak: Wang, Z.,  et al. Transpupiller İki Fotonlu Fare Retinasının İn Vivo Görüntülemesi.  J. Vis. Uzm. (2021). Bu video, iki foton mikroskobu kullanılarak in vivo retinal görüntüleme için bir tekniği göstermektedir. Anestezi uygulanmış fareler, başlarını sabitleyerek, göz kayganlaştırıcı uygulayarak ve gözün üzerine bir lamel yerleştirerek görüntülemeye hazırlanır. Floresan proteinleri eksprese eden retinal ganglion hücreleri (RGC'ler) ilk olarak hizalama için epifloresan kullanılarak...

Fare Retinasının İki Fotonlu İn Vivo Görüntülemesi

Kaynak: Bosco, A.,  et al.  Nörodejenerasyon Sırasında Retinal Mikroglial Aktivasyonun İn Vivo Dinamiği: Fare Glokomunda Konfokal Oftalmoskopik Görüntüleme ve Hücre Morfometrisi. J. Vis. Uzm. (2015) Bu video, bir fare glokom modelinde retinal mikroglianın in vivo görüntülemesini göstermektedir. Floresan protein eksprese eden retinal mikrogliaya sahip transgenik bir fare, bir oftalmoskop altına yerleştirilir. Kızılötesi aydınlatma, optik sinir başını (ONH) bulmak için kullanılır ve odak düzlemi,...

Glokomun Fare Modelinde Retinal Mikroglia'nın İn vivo Görüntülenmesi

Yenidoğanların İnsan Sitomegalovirüs (HCMV) enfeksiyonu zeka geriliği önemli bir nedeni temsil, henüz virüs kaynaklı patogenezinde yol açan moleküler olayların hala tam olarak anlaşılamamıştır. Beyin enfeksiyon dinamiğini incelemek için, bütün hayvan...

Kullanımı<em&gt; In vivo</em&gt; Görüntüleme Yenidoğanlar Deneysel Fare Sitomegalovirüs Enfeksiyon ilerleme Monitör

Kemirgen retina uzun beyin için erişilebilir bir pencere olarak kabul edilmiştir. Bu teknik yazıda iskemik yaralanma sonrası, merkezi sinir sistemi içinde, vasküler rejenerasyon başarısız olmasına yol mekanizmaları incelemek için oksijen kaynaklı retinopatinin fare modeli kullanan bir protokol sağlar. Anlatılan sistem, aynı zamanda, retina ve CNS içindeki fonksiyonel kan damarlarının büyümesini teşvik etmek için stratejiler keşfetmek için dönüştüğü edilebilir.

Fare Retina kullanma CNS&#39;deki Vasküler Rejenerasyon Değerlendirilmesi

Burada, neovasküler yaşa bağlı makula dejenerasyonunun (AMD) vasküler özelliklerini yeniden yaratan deneysel bir model olan fare lazer kaynaklı koroidal neovaskülarizasyon (CNV) protokolünü sunuyoruz. Bir kez ustalaştıktan sonra, çeşitli deneysel önlemleri test etmek için bir model sistem olarak CNV'yi güvenilir ve etkili bir şekilde indükleyebilir.

Lazer kaynaklı Koroid Neovaskülarizasyonlarında A Fare Modeli

Burada, boyuna vivo içinde görüntüleme kullanışlılığı lazer kaynaklı choroidal neovaskülarizasyon farelerde morfolojik değişiklikler takip içinde mevcut.

Vivo Multimodal görüntüleme ve fare lazer kaynaklı Choroidal neovaskülarizasyon Model analizi

İn vivo görüntüleme, sağlık ve hastalıkta biyoloji çalışmaları için güçlü bir araçtır. Bu protokol, standart iki foton mikroskobu ile fare retinasının transpupiller görüntülemesini tanımlar. Ayrıca, retinanın birden fazla hücresel kohortunu floresan olarak etiketlemek için farklı in vivoimaging yöntemleri göstermektedir.

Transpupiller İki Foton Fare Retinasının In vivo Görüntülenmesi

Bu protokol, farelerin retinal düz montajlarının hazırlanması ve immünofloresan boyanması ve analizi için ayrıntılı bir yöntemi açıklamaktadır. Floresein fundus anjiyografinin (FFA) fare yavruları ve görüntü işleme için kullanımı da ayrıntılı olarak açıklanmaktadır.

Oksijene Bağlı Retinopati Fare Modelinde Retina Damarlarının Dinamik Büyümesinin İzlenmesi

Bu makalede, tüm mount retinal preparatları için iyi kurulmuş ve tekrarlanabilir bir lektin lekesi testi ve proliferatif ve proliferatif olmayan retinopatilerde sıklıkla değiştirilen vasküler parametrelerin nicel ölçümü için gerekli protokoller açıklanmaktadır.

Proliferatif Olmayan ve Proliferatif Retinopatilerle Farelerin Tüm Mount Retinalarında Vasküler Parametrelerin Nicelemesi

Fare retinal damar sistemi, vasküler patern oluşumunun mekanizmalarını anlamada özellikle ilgi çekicidir. Bu protokol, optik diskten sabit bir mesafede floresan anjiyografi fundus görüntülerinden fare retina damarlarının çapını otomatik olarak ölçer.

Fare Floresan Anjiyografi Görüntülerinden Retina Damar Çapının Ölçülmesi

Retinal vasküler sistemdeki perisitler, retroorbital floresan domates lektin enjeksiyonu sonrası trombosit kaynaklı büyüme faktörü reseptörü β ile immünofloresan boyama ile incelendi. Etiketli retina, doku temizleme yöntemi ile daha fazla tedavi edildi ve retina vaskülatürünü çevreleyen perisitlerin üç boyutlu görünümlerini konfokal mikroskop altında görselleştirmek için tamamen monte edildi.

Farelerde Retinal Vasküler Perisitlerin İmmün Boyama ile 3D Görüntülenmesi 

Öğrenin yenidoğan fare retinasında anjiyogenez mekanizmalarını immünofloresan boyama ve konfokal mikroskopi ile in vivo görüntüleme yöntemini. Bu teknik vasküler gelişim araştırmaları için güvenilir bir model sunar.

Anjiyogenez Araştırma Yenidoğan Fare Retina Tüm Dağı Immunofluorescent Boyama

Daha fazla video keşfet