Floresan Proteinler ifade Canlı Farelerde Görüntüleme hücrealtı Yapıların Intravital Mikroskopi
1 Eylül 2013
Intravital mikroskopi canlı hayvanlarda çeşitli biyolojik süreçleri görüntüleme sağlayan güçlü bir araçtır. Bu yazıda, canlı farelerde tükürük bezlerinde bu salgılama granüller gibi alt-hücresel yapıların, dinamiklerini görüntüleme için ayrıntılı bir yöntem sunuyoruz.
Bu prosedürün genel amacı, murin tükürük bezlerindeki hücre altı yapıları görselleştirmektir. Bu, önce tükürük bezlerine zarar vermeden cerrahi olarak açığa çıkarılarak gerçekleştirilir. İkinci adımda, anestezi uygulanan hayvan mikroskop aşamasında hareketsiz hale getirilir.
Daha sonra, tükürük bezleri, son adımda işlevlerinden ödün vermeyecek şekilde dikkatlice konumlandırılır. Fare, hayvanın kalp atışı veya solunumundan kaynaklanan herhangi bir hareket artefaktını en aza indirmek için özel bir tutucu ile stabilize edilmiştir. Sonuçta, hücre altı yapıların dinamikleri intra vital mikroskopi ile görüntülenebilir.
Anesteziden önce, uygun anestezik dozunu belirlemek için fareleri tartın. Daha sonra, flor inhalasyonu ile ön anesteziyi indükleyin. Hayvanlar bilinçsiz hale geldikten sonra, her 15 dakikada bir pop-pinch ile sedasyonu onaylayın ve fareleri ameliyat süresince ısı lambası altında tutun.
Hayvanların vücut ısısını rektal prob termometresi ile izleyin. Şimdi farenin boynunu bir çift elektrikli makasla tıraş edin ve ardından boynun ventral tarafını silmek için etanole batırılmış bir gazlı bez süngeri kullanın, fazla alkolü kim mendiliyle kurutun. Ardından, massiter kaslarının alt ucundaki küçük bir deri parçasını kaldırmak ve küçük bir kesi yapmak için bir çift donuk kavisli cımbız kullanın.
Makası kesiğe sokun, uçları cildin alt tarafına doğru yukarı doğru tutun ve cilt alttaki dokudan ayrılana kadar bıçakları birkaç kez açın. Daha sonra sinir kanalı ve kan damarlarının bezi vücudun geri kalanına bağladığı tükürük bezlerinin tabanının yakınından başlayarak. Üç milimetre genişliğinde, 10 milimetre uzunluğunda gevşemiş bir cilt şeridi kesmek için makası kullanın.
Yara bölgesini temizledikten sonra, ortaya çıkan açıklık oval şekilli olacak ve kabaca sekiz x 12 milimetre arasında olacaktır. Her iki tükürük bezi de görünür olacaktır. Kesimin ortasına optik birleştirme jeli uygulamak için bir şırınga kullanın ve ardından tüm kan ve gevşek saçlar çıkana kadar jeli açıklığın dışına doğru silmek için yeni steril gazlı bez parçaları kullanın.
Şimdi, sağ tükürük bezinin ucunu bulmak için yedi numara cımbız kullanın ve bağ dokusunu bezin üst kısmından birkaç milimetre yukarıda tutun. Daha sonra parankimi yaralamadan bezin etrafındaki bağ dokusunu yırtın. Bez açığa çıktığında, bağ dokusunu bezden nazikçe ayırın ve kanamayı tuzlu su ile yıkayın.
Tüm bağ dokularının ayrıldığından ve bezin tamamen açığa çıktığından emin olun. Hayvanı mikroskoba getirmeden önce, mikroskop tablasına kalın bir parça gazlı bez ve bir ısı paketi yerleştirin ve ısı paketinin üstünü de ince bir gazlı bezle kaplayın. Sahnenin ortasına bir kapak fişi yerleştirin.
Daha sonra fareyi sağ tarafına, gazlı bezin üzerine yerleştirin, hayvanı ön sağ pençenin ventral tarafında bir parça maskeleme bandı ve kesici dişlerin etrafına sarılmış ipek bir sütür ile sabitleyin. İplik ve pençe arasında biraz gerginlik yaratın ve bunları sahneye takın. Daha fazla maskeleme bandı ile tükürük bezi doğal olarak dinlenmelidir.
Kapak kaymasının ortasında. Farenin kafasını ve göğüs kafesini daha da stabilize etmek için mikroskop aşamasına bağlı plastik takozlar kullanın. Daha sonra bezin üzerine küçük bir parça lens temizleme mendili yerleştirin.
Bezi hafifçe uzatın ve bezin üzerine özelleştirilmiş bir tutucu yerleştirin. Ardından sıkıca, dengeleyiciyi metal bir kelepçe ve maskeleme bandı ile sahneye bağlayın. Hayvanı gazlı bez ve bir ısı yastığı ile örtün ve açıkta kalan bezlerin sıcaklığını esnek bir termal birleştirilmiş prob donanımlı termometre ile izleyin Hayvanı stabilize ettikten hemen sonra, bezin yüzeyine odaklanmak için epi floresan aydınlatması kullanın.
Kılcal damarlardaki kan akışını ve dokunun genel morfolojisini değerlendirin. GFP genini uyarmak için 488 nanometre lazer kullanın. Tandem domates proteini için fotoağartmayı önlemek için tepe gücünü 0,5 miliwatt'a ayarlayın.
En yüksek gücü bir miliwatt'a ayarlayarak 561 nanometre lazer kullanın. Şimdi seçilen alanı önceden tarayarak dokunun stabilitesini değerlendirin. Preparat stabil değilse, uygun odak düzlemini bulmak için hayvanı buna göre ayarlayın.
Ön modda. Aser yapıları, salgı granülleri ve plazma zarı net bir şekilde görünene kadar hedefi kademeli olarak kapak kızağına doğru hareket ettirin. Ardından, salgı granüllerinin dinamiklerini görüntülemek için, kare başına 0,5 ila iki saniyelik bir tarama hızı ve piksel başına 0,2 mikrometre uzamsal ölçekle 256 x 256 piksel kullanın.
Granülleri ve plazma zarını en iyi şekilde görselleştirmek için optik kalınlığı 0,9 ila 1,2 mikrometre arasında ayarlayın. Ardından, referans noktası olarak kullanılacak görüş alanının bir görüntüsünü kaydedin. Son olarak, taze hazırlanmış izoproterenol ve salinin kilogramı başına 0.1 miligram deri altına enjekte ederek ekzositozu uyarın.
Enjeksiyondan bir dakika sonra. Salgı granüllerinin plazma zarı ile füzyonu, granüllerin etrafındaki GFP floresansında bir artış ve tandem domates peptidinin sınırlayıcı zarlarına difüzyonu ile tespit edilecektir. GFPM domates faresinde, asinin, kırık çizgilerle gösterildiği gibi sitozolik GFP ve zar hedefli tandem domates peptidini eksprese eden açıkça farklı yapılar olarak görünür.
Bireysel asininlerde, aser hücreleri, oklarla gösterildiği gibi tandem domates peptidi ile tanımlanır. GFP, aser hücrelerinin içinde açıkça görülebilen çekirdeklerde de tespit edilir. Ok ucu ile gösterilen sitozolik GFP, çapı yaklaşık bir ila 1.5 mikrometre olan koyu dairesel veziküller olarak görünen salgı granüllerinden çıkarılır.
Ekzofitik olayları görselleştirmek için, izoproterenolün enjeksiyonundan sonra yıldız işareti ile gösterildiği gibi salgı granülleri ile zenginleştirilmiş plazma zarının temsili bir alanı gösterilir. Plazma zarına yakın olan bazı salgı granüllerinin etrafındaki yeşil oklarla gösterilen GFP floresan seviyelerinde bir artış gözlemlenebilir. Ek olarak, plazma zarı ile füzyondan sonra, tandem domates peptidi, kırmızı oklarla vurgulandığı gibi salgı granüllerinin sınırlayıcı zarlarına yayılır.
30 ila 40 saniye sonra, sekreter granülleri yavaş yavaş çöker ve sınırlayıcı zarları apikal plazma zarına entegre edilir. Burada sunulan yaklaşım, canlı farelerde belirli bir zar kaçakçılığı sürecinin dinamiklerinin görüntülenmesini sağladığı için hücre biyolojisinde büyük bir atılımı temsil etmektedir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, intravital mikroskopi kullanarak murin tükürük bezlerinde subsellüler yapıları görselleştirmek için detaylı bir yöntem sunmaktadır. Prosedür, bezlerin cerrahi olarak açılmasını, hayvanın hareketsizleştirilmesini ve hareket artefaktlarını en aza indirgemek için dikkatli bir pozisyonlandırmayı içermektedir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Biyoloji
- Görüntüleme Teknikleri
Arka Plan
- Intravital mikroskopi, biyolojik süreçlerin gerçek zamanlı görüntülenmesini sağlar.
- Özellikle dinamik hücresel yapıların incelenmesi için yararlıdır.
- Tükürük bezleri, subsellüler dinamikleri gözlemlemenin bir modeli olarak hizmet eder.
- Bu dinamiklerin anlaşılması, çeşitli fizyolojik süreçlere dair içgörüler sağlayabilir.
Çalışmanın Amacı
- Canlı farelerde subsellüler yapıların dinamiklerini görselleştirmek.
- Sekretuar granülleri görüntülemek için güvenilir bir yöntem geliştirmek.
- Tükürük bezlerindeki hücresel işlevlerin anlaşılmasını artırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Hasar vermeden tükürük bezlerinin cerrahi olarak açılması.
- Anestezi altındaki hayvanın mikroskobun sahnesinde hareketsizleştirilmesi.
- Tükürük bezlerinin işlevini korumak için dikkatli pozisyonlandırılması.
- Fareyi stabilize etmek ve hareket artefaktlarını azaltmak için özel bir tutucu kullanımı.
Ana Sonuçlar
- Canlı tükürük bezlerinde subsellüler yapıların başarılı görüntülenmesi.
- Sekretuar granüllerin dinamiğinin gösterilmesi.
- Canlı hayvan modellerinde gelecekteki çalışmalar için yöntemin doğrulanması.
- Bu yapıların fizyolojik rollerine dair içgörüler.
Sonuçlar
- Yöntem, subsellüler dinamikleri incelemek için sağlam bir yaklaşım sunar.
- Intravital mikroskopi, çeşitli biyolojik araştırma alanlarında uygulanabilir.
- Bu teknik, canlı hücresel süreçler hakkındaki anlayışımızı artırır.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Intravital microscopy enables real-time visualization of subcellular dynamics in live animal models, providing critical mechanistic insights for target validation and pathway analysis. By imaging secretory granule exocytosis and membrane trafficking in salivary glands, this method supports preclinical de-risking of GPCR-mediated signaling pathways relevant to metabolic and secretory disease targets. The approach enhances predictive confidence in early discovery by linking molecular perturbations to functional subcellular outputs in a physiologically relevant context.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables direct observation of beta-adrenergic receptor-stimulated secretory granule fusion, supporting functional validation of GPCR targets in live tissue.
- Operational Value: Provides a reproducible platform to interrogate kinase, phosphatase, or cytoskeletal regulators of exocytosis using fluorescent biosensors.
- Therapeutic Value: Facilitates mechanistic de-risking of compounds targeting cAMP/PKA pathways by quantifying subcellular translocation kinetics in real time.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Stabilized salivary gland preparation allows consistent baseline imaging of GFP and tandem-Tomato signals for compound library screening.
- Quantitative Output: Enables measurement of granule fusion frequency, membrane diffusion rates, and collapse kinetics as functional readouts for pathway modulation.
- Scalability: The surgical stabilization and imaging workflow can be adapted to multi-animal studies with standardized thermal and motion control.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models regulated secretion in exocrine tissues, applicable to pancreatitis, Sjogren’s syndrome, or cystic fibrosis transmembrane regulator (CFTR) dysfunction studies.
- Biomarker Continuity: Fluorescent reporters for granule membranes and cytosol enable correlation of imaging endpoints with biochemical assays of secretion.
- Preclinical De-risking: Supports go/no-go decisions by linking target engagement to functional subcellular outcomes before organ-level phenotyping.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery continuum from target validation through lead optimization, where real-time subcellular imaging informs mechanism of action and pathway selectivity.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of GPCR effector pathways by visualizing downstream effector recruitment and membrane dynamics in intact tissue.
- Screening: Enables assay-ready preparations for evaluating compound effects on exocytosis kinetics with spatial and temporal resolution.
- Analytics: Generates quantitative data on fluorescence intensity shifts, diffusion rates, and vesicle collapse timing to compare experimental conditions.
- Translational Research: Connects molecular targeting to functional secretion in a disease-relevant exocrine model, supporting extrapolation to human pathophysiology.
- Enterprise Reuse: The stabilization and imaging platform can be reused across multiple fluorescent reporters and disease models with minimal revalidation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in signal transduction by providing direct visualization of effector translocation and membrane integration events.
- Operational Value: Standardized immobilization and imaging protocol improves reproducibility across laboratories and study timelines.
- Strategic Value: Enables earlier identification of false-positive hits by confirming functional subcellular activity beyond binding or bulk biochemical assays.
- Portfolio Impact: Increases confidence in target selection by validating pathway engagement in a physiologically intact, dynamic cellular environment.
Implementation Considerations
- Requires expertise in murine surgery, anesthesia, and intravital microscopy setup.
- Dependent on confocal microscope with 488 nm and 561 nm laser lines, thermal stage, and motion stabilization hardware.
- Necessitates standardized animal preparation protocols to ensure gland accessibility and functional stability across experiments.
- Adaptation to other tissues may require modified stabilization approaches due to differences in organ mobility and accessibility.
- Photobleaching limits necessitate careful laser power calibration and frame rate selection for longitudinal imaging.
