PCR: Polimeraz Zincir Reaksiyonu
Polimeraz zincir reaksiyonu veya PCR, DNA fragmanlarını çoğaltmak için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. PCR; denatürasyon, bağlanma ve uzama veya elongasyon olarak adlandırılan üç farklı sıcaklıkla reaksiyonun tekrarlanan ısıtma ve soğutma işlemi olan termal döngüleme yöntemini kullanır.
Termal döngü reaksiyonu, PCR reaktifleri reaksiyonu hassas bir şekilde ısıtmak ve soğutmak için programlanmış bir cihaz olan termosaykler'a yerleştirildiğinde başlar.
PCR döngüsü, DNA'nın erime sıcaklığının oldukça üzerinde olan 95 °C'de 20 ila 30 saniye boyunca gerçekleşen denatürasyon ile başlar. Erime sıcaklığı, DNA'nın yarısının çift sarmallı heliks, diğer yarısının ise tek sarmallı rastgele bobin şeklinde olduğu durumdur. Tüm tamamlayıcı baz çiftleri arasındaki hidrojen bağlarının kırılarak yalnızca tek sarmallı DNA'ların elde edilmesini sağlamak için denatürasyon sıcaklığı, erime sıcaklığının çok üzerindedir. Eşleşmiş tek sarmallara sense ve antisense sarmalları denir. Sense veya kodlayan sarmalın dizilimi, nihayetinde proteini kodlayacak olan mRNA'nın dizilimi ile aynıdır. Bu nedenle, "sense" (anlamlı) olarak adlandırılır. Soldan sağa okunduğunda 5’ fosfat ile başlar ve 3’ hidroksil ile sona erer. Antisense sarmalına tamamlayıcı sarmal da denir ve soldan sağa okunduğunda 3’ hidroksil ile başlayıp 5’ fosfat ile sona erer.
İkinci adım olan tavlama (annealing) aşamasında, sense veya antisense sarmallarına özgü olan ve primer adı verilen kısa DNA parçaları hidrojen bağları aracılığıyla bağlanır. Antisense sarmalına bağlanan ve sense sarmalı ile aynı dizilime sahip olan primer, ileri veya sense primerdir. Sense sarmalına bağlanan ve sense sarmalının ters tamamlayıcısı olan dizilime sahip primer ise geri veya antisense primerdir. Kullanılan primerlerin uzunluğuna bağlı olarak, bu adım için tavlama sıcaklığı genellikle iki primerinizden düşük olan erime sıcaklığının 3 ila 5 °C altındadır. Tavlama genellikle 50 ve 65 °C arasında gerçekleşir ve 20 ila 40 saniye sürer.
Primerler DNA'ya bağlandığında, DNA'yı replike eden bir enzim olan polimerazın bağlanacağı bir 3’ hidroksil grup ucu oluşturarak reaksiyonu başlatırlar.
Uzama veya ekleme (elongation/extension) olarak adlandırılan bir sonraki adım, polimeraz aktivitesi için optimal olan 72 °C'de gerçekleşir. Bağlandığında polimeraz, çift sarmallı DNA oluşturmak için serbest nükleotid trifosfatları (dNTP'ler) 5’ ucundan 3’ ucuna doğru tek tek primerlerin uçlarına eklemeye başlar.
Uzama tamamlandığında bir sonraki döngü başlar. Bir sonraki döngüde primerler, önceki uzama ile oluşan tek sarmallı DNA'lara bağlanacaktır. Çoğaltmaya çalıştığınız kısa fragman olan amplikon, polimerazın geri primerle çoğaltılmış bir sarmal üzerindeki ileri primerden uzamasıyla veya tam tersi şekilde nihayetinde oluşur. Oluştuktan sonra, amplikon miktarı sonraki döngülerde eksponansiyel olarak artacaktır. Reaksiyonunuzun amacına bağlı olarak 20 ila 40 döngü gerekecektir.
Uzun amplikonlar için, tüm DNA'nın çift sarmallı olduğundan emin olmak amacıyla genellikle 72 °C'de 5 ila 15 dakika süren son bir uzama adımı uygulanır. Genellikle, DNA'nın termosaykler'dan çıkarılana kadar stabil kalmasını sağlamak için önlem olarak termosaykler'a 4 °C'de son bir bekletme adımı programlanır.
PCR reaksiyonu birkaç temel reaktif gerektirir. İlk olarak, fragmanınızın çoğaltılacağı DNA örneği olan DNA kalıbı gereklidir. Ardından, polimeraz reaksiyonunu başlatan kısa DNA parçaları veya oligonükleotidler olan primerler gelir.
Primer seçimi yapılırken dikkate alınması gereken birkaç önemli husus vardır. İlk olarak, primerler, çoğaltmak istediğiniz diziyi çevreleyen DNA kalıbınızın 5’ ve 3’ bölgeleriyle tamamlayıcı olmalıdır. İkinci olarak, uzunlukları 15 ile 30 baz çifti arasında olmalı ve yaklaşık %50 oranında guanin ve sitozin içermelidir. Üçüncü olarak, her iki primerin erime sıcaklıkları 50 °C'nin üzerinde olmalı ve aynı tavlama sıcaklığında verimli bir şekilde bağlanabilmeleri için birbirlerine bir ila iki derece yakın olmalıdır. Dördüncü olarak, birbirleriyle tamamlayıcı olmamalı ve primer dimerleri oluşturmamalıdırlar. Beşinci olarak, primerlerden birinin kendi içinde tavlanmasıyla oluşan ikincil yapıları içermemelidirler.
Primerlere ve DNA kalıbına ek olarak, PCR reaksiyonu için DNA polimeraz gereklidir. PCR'da en yaygın kullanılan enzim, sıcak su kaynaklarında yaşayan Thermus aquaticus bakterisinden izole edilen termostabil bir enzim olan Taq polimerazdır. Taq polimeraz, 90 °C'den yüksek sıcaklıklara dayanabilir.
Büyüyen zincirlerdeki baz çiftlerini oluşturacak olan dNTP'ler de reaksiyona eklenmelidir. pH'ı koruyan ve manganez, magnezyum ve potasyum gibi önemli iyonlar içeren bir reaksiyon tamponu, reaksiyonu stabilize eden ve polimeraz enzimine önemli kofaktörler sağlayan gerekli bir reaksiyon bileşenidir. Tüm reaksiyonlar gibi PCR'ın da bir çözücüye ihtiyacı vardır; bu nedenle reaksiyonu inhibe edebilecek iyonlardan arındırılmış PCR grade su kullanılır.
Kontaminasyonu önlemek için PCR'a başlamadan önce çalışma ortamının temiz olduğundan emin olun. Her zaman eldiven giyilmelidir.
İhtiyaç duyacağınız çeşitli reaksiyon bileşenlerini takip edebilmek için, kontroller dahil olmak üzere her bir örneğiniz için reaktif hacimlerini ve konsantrasyonlarını içeren bir tablo oluşturun. Hacimler açısından tipik bir reaksiyon; 5μL 10X reaksiyon tamponu, 4μL 25 mM MgCl2, 1μL 10 mM dNTP'ler, 2μL 50 ng/μL ileri ve geri primerler ve 0.3μL 5 U/μL Taq polimeraz içermelidir. Reaksiyonda 100 ng bulunacak şekilde yeterli miktarda kalıp DNA eklemelisiniz. Son olarak, çoğu PCR reaksiyonu toplam 50μL hacimde gerçekleştirilir. Bu nedenle, toplam hacmin gerçekten 50μL olduğundan emin olmak için PCR sınıfı su eklenmelidir.
Reaksiyon planınızı kağıt üzerinde yaptıktan sonra, reaktiflerinizi buz üzerinde hazırlayın.
Ardından, reaktifleri PCR tüpüne ekleyin. Önce suyu, ardından kalıbınızı, primerlerinizi, tamponu, magnezyum klorürü ve dNTP'leri ekleyin; Taq polimerazı en son ekleyip iyice karıştırın.
Reaksiyon kurulumu tamamlandıktan sonra örneğinizi bir termosiklatöre yerleştirin ve PCR programınızı başlatın. Kısaca, cihazın parçaları arasında PCR tüpünün veya plağının yerleştirildiği ve hassas sıcaklık değişimlerine maruz kaldığı bir termoblok; yoğuşmayı önleyerek örnek kaybını engelleyen ısıtmalı bir kapak ve PCR sıcaklıkları ile döngü sürelerini programlamak için bir ekrana sahip bir arayüz bulunur. Programınızı her zaman reaksiyonu hazırlamadan önce kurun.
Termosiklatör işlemini tamamladığında, reaksiyonunuzu çıkarın ve PCR ürününü jel elektroforezi ile doğrulayın. PCR başarılıysa, amplikonu doğru baz çifti boyutunda görmelisiniz.
Şimdi PCR ile çalışırken işe yarayacak bazı ipuçlarına geçelim. Bir dizi farklı şablondan aynı PCR ürününü çoğaltmaya çalıştığınızda ve dolayısıyla kurulumu gereken çok sayıda farklı reaksiyonunuz olduğunda, bir master mix oluşturmak için reaksiyonu ölçeklendirmek faydalıdır. PCR master mix, örnekleriniz arasında ortak olan tüm reaktiflerin büyük hacimli bir karışımıdır ve daha sonra birden fazla reaksiyon tüpüne dağıtılır.
Çoğu PCR reaksiyonu, 95°C'de 1 ila 9 dakika boyunca gerçekleşen bir başlangıç denatürasyon adımıyla başlar. Bu adım, ilk amplifikasyon döngüsü için tüm şablonun tek zincirli olmasını sağlar.
Örneğinizin kontamine olma riski yüksek olduğunda genellikle bir PCR kabini kullanılması tercih edilir. Reaksiyonunuzda herhangi bir kontaminasyon olup olmadığını kontrol etmek için, DNA şablonu içermeyen ve DNA jelinizde ürün oluşturmaması gereken bir negatif kontrol kurmak faydalıdır.
PCR genellikle sıcaklıklar, magnezyum klorür konsantrasyonu ayarlanarak veya yeni primerler denenerek optimize edilmelidir. PCR'ınız çalışır hale geldiğinde, ürün oluşturacağını bildiğiniz bir pozitif kontrol şablonunu her zaman çalıştırmak iyi bir fikirdir.
Çeşitli amaçlar için PCR'ın birçok varyasyonu ve uygulaması mevcuttur.
PCR varyasyonlarından biri olan hot start PCR, polimerazın ilk denatürasyon adımına kadar reaksiyondan uzak tutulmasını içerir; bu durum, döngüler başlamadan önce meydana gelebilecek spesifik olmayan amplifikasyonu önler.
PCR, multiplex PCR olarak adlandırılan tek bir PCR reaksiyonunda birden fazla primer kullanılarak, birden fazla DNA dizisinin aynı anda amplifiye edilmesi için de modifiye edilebilir.
Floresan oligonükleotid problarla kombine edildiğinde PCR, gen ekspresyonunun relatif veya absolut seviyelerini veya belirli bir gen ya da gen grubu için ne kadar mRNA üretildiğini ölçebilen bir tekniğe dönüşebilir. Bu yönteme qPCR denir.
PCR ayrıca bir organizmada belirli bir DNA dizisinin varlığını belirlemek için de kullanılabilir. Bu prosedür genotipleme olarak adlandırılır. Örneğin, bir örnekte türe özgü bir dizinin bulunup bulunmadığı tespit edilerek balık örneklerinin orijinalliğini belirlemek için genotipleme kullanılabilir. Genotipleme, suç mahallinde bulunan DNA'nın bir şüphelininkine uyup uymadığını belirlemek için adli analizlerde de kullanılır.
JoVE'nin PCR giriş videosunu izlediniz. Bu videoda PCR'ın ne olduğunu ve nasıl çalıştığını, PCR reaksiyonunun birçok bileşenini, PCR'ın DNA'yı çoğaltma mekanizmasını ve bu oldukça kullanışlı tekniğin birçok varyasyonunu ve uygulamasını inceledik. İzlediğiniz için teşekkürler!
Polimeraz zincir reaksiyonu veya PCR, sabit zaman aralıklarındaki sıcaklık değişim döngüleri olan termodöngü aracılığıyla DNA'yı çoğaltmak için kullan…
Polimeraz zincir reaksiyonu veya PCR, DNA fragmanlarını çoğaltmak için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. PCR; denatürasyon, bağlanma ve uzama veya elongasyon olarak adlandırılan üç farklı sıcaklıkla reaksiyonun tekrarlanan ısıtma ve soğutma işlemi olan termal döngüleme yöntemini kullanır.
Termal döngü reaksiyonu, PCR reaktifleri reaksiyonu hassas bir şekilde ısıtmak ve soğutmak için programlanmış bir cihaz olan termosaykler'a yerleştirildiğinde başlar.
PCR döngüsü, DNA'nın erime sıcaklığının oldukça üzerinde olan 95 °C'de 20 ila 30 saniye boyunca gerçekleşen denatürasyon ile başlar. Erime sıcaklığı, DNA'nın yarısının çift sarmallı heliks, diğer yarısının ise tek sarmallı rastgele bobin şeklinde olduğu durumdur. Tüm tamamlayıcı baz çiftleri arasındaki hidrojen bağlarının kırılarak yalnızca tek sarmallı DNA'ların elde edilmesini sağlamak için denatürasyon sıcaklığı, erime sıcaklığının çok üzerindedir. Eşleşmiş tek sarmallara sense ve antisense sarmalları denir. Sense veya kodlayan sarmalın dizilimi, nihayetinde proteini kodlayacak olan mRNA'nın dizilimi ile aynıdır. Bu nedenle, "sense" (anlamlı) olarak adlandırılır. Soldan sağa okunduğunda 5’ fosfat ile başlar ve 3’ hidroksil ile sona erer. Antisense sarmalına tamamlayıcı sarmal da denir ve soldan sağa okunduğunda 3’ hidroksil ile başlayıp 5’ fosfat ile sona erer.
İkinci adım olan tavlama (annealing) aşamasında, sense veya antisense sarmallarına özgü olan ve primer adı verilen kısa DNA parçaları hidrojen bağları aracılığıyla bağlanır. Antisense sarmalına bağlanan ve sense sarmalı ile aynı dizilime sahip olan primer, ileri veya sense primerdir. Sense sarmalına bağlanan ve sense sarmalının ters tamamlayıcısı olan dizilime sahip primer ise geri veya antisense primerdir. Kullanılan primerlerin uzunluğuna bağlı olarak, bu adım için tavlama sıcaklığı genellikle iki primerinizden düşük olan erime sıcaklığının 3 ila 5 °C altındadır. Tavlama genellikle 50 ve 65 °C arasında gerçekleşir ve 20 ila 40 saniye sürer.
Primerler DNA'ya bağlandığında, DNA'yı replike eden bir enzim olan polimerazın bağlanacağı bir 3’ hidroksil grup ucu oluşturarak reaksiyonu başlatırlar.
Uzama veya ekleme (elongation/extension) olarak adlandırılan bir sonraki adım, polimeraz aktivitesi için optimal olan 72 °C'de gerçekleşir. Bağlandığında polimeraz, çift sarmallı DNA oluşturmak için serbest nükleotid trifosfatları (dNTP'ler) 5’ ucundan 3’ ucuna doğru tek tek primerlerin uçlarına eklemeye başlar.
Uzama tamamlandığında bir sonraki döngü başlar. Bir sonraki döngüde primerler, önceki uzama ile oluşan tek sarmallı DNA'lara bağlanacaktır. Çoğaltmaya çalıştığınız kısa fragman olan amplikon, polimerazın geri primerle çoğaltılmış bir sarmal üzerindeki ileri primerden uzamasıyla veya tam tersi şekilde nihayetinde oluşur. Oluştuktan sonra, amplikon miktarı sonraki döngülerde eksponansiyel olarak artacaktır. Reaksiyonunuzun amacına bağlı olarak 20 ila 40 döngü gerekecektir.
Uzun amplikonlar için, tüm DNA'nın çift sarmallı olduğundan emin olmak amacıyla genellikle 72 °C'de 5 ila 15 dakika süren son bir uzama adımı uygulanır. Genellikle, DNA'nın termosaykler'dan çıkarılana kadar stabil kalmasını sağlamak için önlem olarak termosaykler'a 4 °C'de son bir bekletme adımı programlanır.
PCR reaksiyonu birkaç temel reaktif gerektirir. İlk olarak, fragmanınızın çoğaltılacağı DNA örneği olan DNA kalıbı gereklidir. Ardından, polimeraz reaksiyonunu başlatan kısa DNA parçaları veya oligonükleotidler olan primerler gelir.
Primer seçimi yapılırken dikkate alınması gereken birkaç önemli husus vardır. İlk olarak, primerler, çoğaltmak istediğiniz diziyi çevreleyen DNA kalıbınızın 5’ ve 3’ bölgeleriyle tamamlayıcı olmalıdır. İkinci olarak, uzunlukları 15 ile 30 baz çifti arasında olmalı ve yaklaşık %50 oranında guanin ve sitozin içermelidir. Üçüncü olarak, her iki primerin erime sıcaklıkları 50 °C'nin üzerinde olmalı ve aynı tavlama sıcaklığında verimli bir şekilde bağlanabilmeleri için birbirlerine bir ila iki derece yakın olmalıdır. Dördüncü olarak, birbirleriyle tamamlayıcı olmamalı ve primer dimerleri oluşturmamalıdırlar. Beşinci olarak, primerlerden birinin kendi içinde tavlanmasıyla oluşan ikincil yapıları içermemelidirler.
Primerlere ve DNA kalıbına ek olarak, PCR reaksiyonu için DNA polimeraz gereklidir. PCR'da en yaygın kullanılan enzim, sıcak su kaynaklarında yaşayan Thermus aquaticus bakterisinden izole edilen termostabil bir enzim olan Taq polimerazdır. Taq polimeraz, 90 °C'den yüksek sıcaklıklara dayanabilir.
Büyüyen zincirlerdeki baz çiftlerini oluşturacak olan dNTP'ler de reaksiyona eklenmelidir. pH'ı koruyan ve manganez, magnezyum ve potasyum gibi önemli iyonlar içeren bir reaksiyon tamponu, reaksiyonu stabilize eden ve polimeraz enzimine önemli kofaktörler sağlayan gerekli bir reaksiyon bileşenidir. Tüm reaksiyonlar gibi PCR'ın da bir çözücüye ihtiyacı vardır; bu nedenle reaksiyonu inhibe edebilecek iyonlardan arındırılmış PCR grade su kullanılır.
Kontaminasyonu önlemek için PCR'a başlamadan önce çalışma ortamının temiz olduğundan emin olun. Her zaman eldiven giyilmelidir.
İhtiyaç duyacağınız çeşitli reaksiyon bileşenlerini takip edebilmek için, kontroller dahil olmak üzere her bir örneğiniz için reaktif hacimlerini ve konsantrasyonlarını içeren bir tablo oluşturun. Hacimler açısından tipik bir reaksiyon; 5μL 10X reaksiyon tamponu, 4μL 25 mM MgCl2, 1μL 10 mM dNTP'ler, 2μL 50 ng/μL ileri ve geri primerler ve 0.3μL 5 U/μL Taq polimeraz içermelidir. Reaksiyonda 100 ng bulunacak şekilde yeterli miktarda kalıp DNA eklemelisiniz. Son olarak, çoğu PCR reaksiyonu toplam 50μL hacimde gerçekleştirilir. Bu nedenle, toplam hacmin gerçekten 50μL olduğundan emin olmak için PCR sınıfı su eklenmelidir.
Reaksiyon planınızı kağıt üzerinde yaptıktan sonra, reaktiflerinizi buz üzerinde hazırlayın.
Ardından, reaktifleri PCR tüpüne ekleyin. Önce suyu, ardından kalıbınızı, primerlerinizi, tamponu, magnezyum klorürü ve dNTP'leri ekleyin; Taq polimerazı en son ekleyip iyice karıştırın.
Reaksiyon kurulumu tamamlandıktan sonra örneğinizi bir termosiklatöre yerleştirin ve PCR programınızı başlatın. Kısaca, cihazın parçaları arasında PCR tüpünün veya plağının yerleştirildiği ve hassas sıcaklık değişimlerine maruz kaldığı bir termoblok; yoğuşmayı önleyerek örnek kaybını engelleyen ısıtmalı bir kapak ve PCR sıcaklıkları ile döngü sürelerini programlamak için bir ekrana sahip bir arayüz bulunur. Programınızı her zaman reaksiyonu hazırlamadan önce kurun.
Termosiklatör işlemini tamamladığında, reaksiyonunuzu çıkarın ve PCR ürününü jel elektroforezi ile doğrulayın. PCR başarılıysa, amplikonu doğru baz çifti boyutunda görmelisiniz.
Şimdi PCR ile çalışırken işe yarayacak bazı ipuçlarına geçelim. Bir dizi farklı şablondan aynı PCR ürününü çoğaltmaya çalıştığınızda ve dolayısıyla kurulumu gereken çok sayıda farklı reaksiyonunuz olduğunda, bir master mix oluşturmak için reaksiyonu ölçeklendirmek faydalıdır. PCR master mix, örnekleriniz arasında ortak olan tüm reaktiflerin büyük hacimli bir karışımıdır ve daha sonra birden fazla reaksiyon tüpüne dağıtılır.
Çoğu PCR reaksiyonu, 95°C'de 1 ila 9 dakika boyunca gerçekleşen bir başlangıç denatürasyon adımıyla başlar. Bu adım, ilk amplifikasyon döngüsü için tüm şablonun tek zincirli olmasını sağlar.
Örneğinizin kontamine olma riski yüksek olduğunda genellikle bir PCR kabini kullanılması tercih edilir. Reaksiyonunuzda herhangi bir kontaminasyon olup olmadığını kontrol etmek için, DNA şablonu içermeyen ve DNA jelinizde ürün oluşturmaması gereken bir negatif kontrol kurmak faydalıdır.
PCR genellikle sıcaklıklar, magnezyum klorür konsantrasyonu ayarlanarak veya yeni primerler denenerek optimize edilmelidir. PCR'ınız çalışır hale geldiğinde, ürün oluşturacağını bildiğiniz bir pozitif kontrol şablonunu her zaman çalıştırmak iyi bir fikirdir.
Çeşitli amaçlar için PCR'ın birçok varyasyonu ve uygulaması mevcuttur.
PCR varyasyonlarından biri olan hot start PCR, polimerazın ilk denatürasyon adımına kadar reaksiyondan uzak tutulmasını içerir; bu durum, döngüler başlamadan önce meydana gelebilecek spesifik olmayan amplifikasyonu önler.
PCR, multiplex PCR olarak adlandırılan tek bir PCR reaksiyonunda birden fazla primer kullanılarak, birden fazla DNA dizisinin aynı anda amplifiye edilmesi için de modifiye edilebilir.
Floresan oligonükleotid problarla kombine edildiğinde PCR, gen ekspresyonunun relatif veya absolut seviyelerini veya belirli bir gen ya da gen grubu için ne kadar mRNA üretildiğini ölçebilen bir tekniğe dönüşebilir. Bu yönteme qPCR denir.
PCR ayrıca bir organizmada belirli bir DNA dizisinin varlığını belirlemek için de kullanılabilir. Bu prosedür genotipleme olarak adlandırılır. Örneğin, bir örnekte türe özgü bir dizinin bulunup bulunmadığı tespit edilerek balık örneklerinin orijinalliğini belirlemek için genotipleme kullanılabilir. Genotipleme, suç mahallinde bulunan DNA'nın bir şüphelininkine uyup uymadığını belirlemek için adli analizlerde de kullanılır.
JoVE'nin PCR giriş videosunu izlediniz. Bu videoda PCR'ın ne olduğunu ve nasıl çalıştığını, PCR reaksiyonunun birçok bileşenini, PCR'ın DNA'yı çoğaltma mekanizmasını ve bu oldukça kullanışlı tekniğin birçok varyasyonunu ve uygulamasını inceledik. İzlediğiniz için teşekkürler!
Polimeraz zincir reaksiyonu veya PCR, DNA fragmanlarını çoğaltmak için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. PCR; denatürasyon, bağlanma ve uzama veya elongasyon olarak adlandırılan üç farklı sıcaklıkla reaksiyonun tekrarlanan ısıtma ve soğutma işlemi olan termal döngüleme yöntemini kullanır.
Termal döngü reaksiyonu, PCR reaktifleri reaksiyonu hassas bir şekilde ısıtmak ve soğutmak için programlanmış bir cihaz olan termosaykler'a yerleştirildiğinde başlar.
PCR döngüsü, DNA'nın erime sıcaklığının oldukça üzerinde olan 95 °C'de 20 ila 30 saniye boyunca gerçekleşen denatürasyon ile başlar. Erime sıcaklığı, DNA'nın yarısının çift sarmallı heliks, diğer yarısının ise tek sarmallı rastgele bobin şeklinde olduğu durumdur. Tüm tamamlayıcı baz çiftleri arasındaki hidrojen bağlarının kırılarak yalnızca tek sarmallı DNA'ların elde edilmesini sağlamak için denatürasyon sıcaklığı, erime sıcaklığının çok üzerindedir. Eşleşmiş tek sarmallara sense ve antisense sarmalları denir. Sense veya kodlayan sarmalın dizilimi, nihayetinde proteini kodlayacak olan mRNA'nın dizilimi ile aynıdır. Bu nedenle, "sense" (anlamlı) olarak adlandırılır. Soldan sağa okunduğunda 5’ fosfat ile başlar ve 3’ hidroksil ile sona erer. Antisense sarmalına tamamlayıcı sarmal da denir ve soldan sağa okunduğunda 3’ hidroksil ile başlayıp 5’ fosfat ile sona erer.
İkinci adım olan tavlama (annealing) aşamasında, sense veya antisense sarmallarına özgü olan ve primer adı verilen kısa DNA parçaları hidrojen bağları aracılığıyla bağlanır. Antisense sarmalına bağlanan ve sense sarmalı ile aynı dizilime sahip olan primer, ileri veya sense primerdir. Sense sarmalına bağlanan ve sense sarmalının ters tamamlayıcısı olan dizilime sahip primer ise geri veya antisense primerdir. Kullanılan primerlerin uzunluğuna bağlı olarak, bu adım için tavlama sıcaklığı genellikle iki primerinizden düşük olan erime sıcaklığının 3 ila 5 °C altındadır. Tavlama genellikle 50 ve 65 °C arasında gerçekleşir ve 20 ila 40 saniye sürer.
Primerler DNA'ya bağlandığında, DNA'yı replike eden bir enzim olan polimerazın bağlanacağı bir 3’ hidroksil grup ucu oluşturarak reaksiyonu başlatırlar.
Uzama veya ekleme (elongation/extension) olarak adlandırılan bir sonraki adım, polimeraz aktivitesi için optimal olan 72 °C'de gerçekleşir. Bağlandığında polimeraz, çift sarmallı DNA oluşturmak için serbest nükleotid trifosfatları (dNTP'ler) 5’ ucundan 3’ ucuna doğru tek tek primerlerin uçlarına eklemeye başlar.
Uzama tamamlandığında bir sonraki döngü başlar. Bir sonraki döngüde primerler, önceki uzama ile oluşan tek sarmallı DNA'lara bağlanacaktır. Çoğaltmaya çalıştığınız kısa fragman olan amplikon, polimerazın geri primerle çoğaltılmış bir sarmal üzerindeki ileri primerden uzamasıyla veya tam tersi şekilde nihayetinde oluşur. Oluştuktan sonra, amplikon miktarı sonraki döngülerde eksponansiyel olarak artacaktır. Reaksiyonunuzun amacına bağlı olarak 20 ila 40 döngü gerekecektir.
Uzun amplikonlar için, tüm DNA'nın çift sarmallı olduğundan emin olmak amacıyla genellikle 72 °C'de 5 ila 15 dakika süren son bir uzama adımı uygulanır. Genellikle, DNA'nın termosaykler'dan çıkarılana kadar stabil kalmasını sağlamak için önlem olarak termosaykler'a 4 °C'de son bir bekletme adımı programlanır.
PCR reaksiyonu birkaç temel reaktif gerektirir. İlk olarak, fragmanınızın çoğaltılacağı DNA örneği olan DNA kalıbı gereklidir. Ardından, polimeraz reaksiyonunu başlatan kısa DNA parçaları veya oligonükleotidler olan primerler gelir.
Primer seçimi yapılırken dikkate alınması gereken birkaç önemli husus vardır. İlk olarak, primerler, çoğaltmak istediğiniz diziyi çevreleyen DNA kalıbınızın 5’ ve 3’ bölgeleriyle tamamlayıcı olmalıdır. İkinci olarak, uzunlukları 15 ile 30 baz çifti arasında olmalı ve yaklaşık %50 oranında guanin ve sitozin içermelidir. Üçüncü olarak, her iki primerin erime sıcaklıkları 50 °C'nin üzerinde olmalı ve aynı tavlama sıcaklığında verimli bir şekilde bağlanabilmeleri için birbirlerine bir ila iki derece yakın olmalıdır. Dördüncü olarak, birbirleriyle tamamlayıcı olmamalı ve primer dimerleri oluşturmamalıdırlar. Beşinci olarak, primerlerden birinin kendi içinde tavlanmasıyla oluşan ikincil yapıları içermemelidirler.
Primerlere ve DNA kalıbına ek olarak, PCR reaksiyonu için DNA polimeraz gereklidir. PCR'da en yaygın kullanılan enzim, sıcak su kaynaklarında yaşayan Thermus aquaticus bakterisinden izole edilen termostabil bir enzim olan Taq polimerazdır. Taq polimeraz, 90 °C'den yüksek sıcaklıklara dayanabilir.
Büyüyen zincirlerdeki baz çiftlerini oluşturacak olan dNTP'ler de reaksiyona eklenmelidir. pH'ı koruyan ve manganez, magnezyum ve potasyum gibi önemli iyonlar içeren bir reaksiyon tamponu, reaksiyonu stabilize eden ve polimeraz enzimine önemli kofaktörler sağlayan gerekli bir reaksiyon bileşenidir. Tüm reaksiyonlar gibi PCR'ın da bir çözücüye ihtiyacı vardır; bu nedenle reaksiyonu inhibe edebilecek iyonlardan arındırılmış PCR grade su kullanılır.
Kontaminasyonu önlemek için PCR'a başlamadan önce çalışma ortamının temiz olduğundan emin olun. Her zaman eldiven giyilmelidir.
İhtiyaç duyacağınız çeşitli reaksiyon bileşenlerini takip edebilmek için, kontroller dahil olmak üzere her bir örneğiniz için reaktif hacimlerini ve konsantrasyonlarını içeren bir tablo oluşturun. Hacimler açısından tipik bir reaksiyon; 5μL 10X reaksiyon tamponu, 4μL 25 mM MgCl2, 1μL 10 mM dNTP'ler, 2μL 50 ng/μL ileri ve geri primerler ve 0.3μL 5 U/μL Taq polimeraz içermelidir. Reaksiyonda 100 ng bulunacak şekilde yeterli miktarda kalıp DNA eklemelisiniz. Son olarak, çoğu PCR reaksiyonu toplam 50μL hacimde gerçekleştirilir. Bu nedenle, toplam hacmin gerçekten 50μL olduğundan emin olmak için PCR sınıfı su eklenmelidir.
Reaksiyon planınızı kağıt üzerinde yaptıktan sonra, reaktiflerinizi buz üzerinde hazırlayın.
Ardından, reaktifleri PCR tüpüne ekleyin. Önce suyu, ardından kalıbınızı, primerlerinizi, tamponu, magnezyum klorürü ve dNTP'leri ekleyin; Taq polimerazı en son ekleyip iyice karıştırın.
Reaksiyon kurulumu tamamlandıktan sonra örneğinizi bir termosiklatöre yerleştirin ve PCR programınızı başlatın. Kısaca, cihazın parçaları arasında PCR tüpünün veya plağının yerleştirildiği ve hassas sıcaklık değişimlerine maruz kaldığı bir termoblok; yoğuşmayı önleyerek örnek kaybını engelleyen ısıtmalı bir kapak ve PCR sıcaklıkları ile döngü sürelerini programlamak için bir ekrana sahip bir arayüz bulunur. Programınızı her zaman reaksiyonu hazırlamadan önce kurun.
Termosiklatör işlemini tamamladığında, reaksiyonunuzu çıkarın ve PCR ürününü jel elektroforezi ile doğrulayın. PCR başarılıysa, amplikonu doğru baz çifti boyutunda görmelisiniz.
Şimdi PCR ile çalışırken işe yarayacak bazı ipuçlarına geçelim. Bir dizi farklı şablondan aynı PCR ürününü çoğaltmaya çalıştığınızda ve dolayısıyla kurulumu gereken çok sayıda farklı reaksiyonunuz olduğunda, bir master mix oluşturmak için reaksiyonu ölçeklendirmek faydalıdır. PCR master mix, örnekleriniz arasında ortak olan tüm reaktiflerin büyük hacimli bir karışımıdır ve daha sonra birden fazla reaksiyon tüpüne dağıtılır.
Çoğu PCR reaksiyonu, 95°C'de 1 ila 9 dakika boyunca gerçekleşen bir başlangıç denatürasyon adımıyla başlar. Bu adım, ilk amplifikasyon döngüsü için tüm şablonun tek zincirli olmasını sağlar.
Örneğinizin kontamine olma riski yüksek olduğunda genellikle bir PCR kabini kullanılması tercih edilir. Reaksiyonunuzda herhangi bir kontaminasyon olup olmadığını kontrol etmek için, DNA şablonu içermeyen ve DNA jelinizde ürün oluşturmaması gereken bir negatif kontrol kurmak faydalıdır.
PCR genellikle sıcaklıklar, magnezyum klorür konsantrasyonu ayarlanarak veya yeni primerler denenerek optimize edilmelidir. PCR'ınız çalışır hale geldiğinde, ürün oluşturacağını bildiğiniz bir pozitif kontrol şablonunu her zaman çalıştırmak iyi bir fikirdir.
Çeşitli amaçlar için PCR'ın birçok varyasyonu ve uygulaması mevcuttur.
PCR varyasyonlarından biri olan hot start PCR, polimerazın ilk denatürasyon adımına kadar reaksiyondan uzak tutulmasını içerir; bu durum, döngüler başlamadan önce meydana gelebilecek spesifik olmayan amplifikasyonu önler.
PCR, multiplex PCR olarak adlandırılan tek bir PCR reaksiyonunda birden fazla primer kullanılarak, birden fazla DNA dizisinin aynı anda amplifiye edilmesi için de modifiye edilebilir.
Floresan oligonükleotid problarla kombine edildiğinde PCR, gen ekspresyonunun relatif veya absolut seviyelerini veya belirli bir gen ya da gen grubu için ne kadar mRNA üretildiğini ölçebilen bir tekniğe dönüşebilir. Bu yönteme qPCR denir.
PCR ayrıca bir organizmada belirli bir DNA dizisinin varlığını belirlemek için de kullanılabilir. Bu prosedür genotipleme olarak adlandırılır. Örneğin, bir örnekte türe özgü bir dizinin bulunup bulunmadığı tespit edilerek balık örneklerinin orijinalliğini belirlemek için genotipleme kullanılabilir. Genotipleme, suç mahallinde bulunan DNA'nın bir şüphelininkine uyup uymadığını belirlemek için adli analizlerde de kullanılır.
JoVE'nin PCR giriş videosunu izlediniz. Bu videoda PCR'ın ne olduğunu ve nasıl çalıştığını, PCR reaksiyonunun birçok bileşenini, PCR'ın DNA'yı çoğaltma mekanizmasını ve bu oldukça kullanışlı tekniğin birçok varyasyonunu ve uygulamasını inceledik. İzlediğiniz için teşekkürler!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What are the three main temperature steps in a PCR cycle?
PCR uses three distinct temperature steps called denaturation, annealing, and extension. Denaturation at 95°C breaks hydrogen bonds between DNA base pairs, creating single-stranded DNA. Annealing at 50-65°C allows primers to bind to the template. Extension at 72°C enables DNA polymerase to synthesize new complementary strands by adding nucleotides.
Q2: Why is Taq polymerase used in PCR reactions?
Taq polymerase is a thermostable enzyme isolated from the bacterium Thermus aquaticus, which lives in hot springs. It can withstand temperatures exceeding 90°C, making it ideal for PCR because it remains active throughout repeated heating and cooling cycles without denaturing, unlike standard DNA polymerases.
Q3: What are the key requirements for designing PCR primers?
Effective primers must be 15-30 base pairs long with approximately 50% guanine and cytosine content. Both primers should have melting temperatures above 50°C and within 1-2 degrees of each other. Primers must be complementary to flanking regions of your target sequence, avoid forming primer dimers, and lack secondary structure from self-annealing.
Q4: How does PCR amplify DNA exponentially?
After each cycle, primers bind to newly synthesized single-stranded DNA. The amplicon forms when polymerase extends from the forward primer on a strand generated by reverse primer amplification, or vice versa. Once created, this amplicon serves as template in subsequent cycles, doubling the target DNA with each cycle and producing exponential amplification after 20-40 cycles.
Q5: What essential reagents must be included in a PCR reaction?
A complete PCR reaction requires DNA template, forward and reverse primers, Taq polymerase, dNTPs (nucleotide building blocks), reaction buffer containing magnesium and other ions, and PCR-grade water. A typical 50-microliter reaction includes specific concentrations of each component. The buffer maintains pH and provides cofactors necessary for polymerase function and reaction stability.
Q6: How do you verify successful PCR amplification?
After PCR completes, verify the product using gel electrophoresis concept procedure and applications to visualize DNA fragments. Successful amplification appears as a band at the correct base pair size matching your expected amplicon. Running negative controls without template and positive controls with known template helps confirm specificity and detect contamination in your reactions.
Q7: What is a PCR master mix and when should you use it?
A PCR master mix is a large-volume mixture of all shared reagents distributed into multiple reaction tubes, useful when amplifying the same product from numerous different templates. This approach reduces setup time and minimizes pipetting errors across many reactions. Each tube receives the master mix plus its specific DNA template, streamlining high-throughput PCR workflows.
Bu videodaki bölümler
0:00
Overview
0:35
The Reaction
4:46
Reaction Components
7:10
Setting up the Reaction
9:54
Helpful Hints
11:23
Applications
12:56
Summary