SDS-PAGE ile Proteinin Ayrılması
SDS-PAGE, birçok araştırmacı tarafından protein karışımlarını boyutlarına göre ayırmak için kullanılan bir tekniktir. Bu tekniğin başarılı bir şekilde tamamlanması, immünoblotlama gibi birçok protein analizi yöntemi için önemli bir ilk adımdır. Kendi başına, protein boyutunu ve saflığını değerlendirmede yararlı bir araçtır.
SDS-PAGE tekniğini anlamak için önce temel bileşenlerini anlamanız gerekir. SDS-PAGE, Sodyum Dodesil Sülfat Poli-Akrilamid Jel Elektroforezi anlamına gelir. Bunun ilk kısmı olan Sodyum-Dodesil Sülfat veya "SDS", anyonik bir deterjandır. Bu, net negatif yüklü hidrofilik bir gruptan ve nötr yüklü uzun bir hidrofobik zincirden oluştuğu anlamına gelir.
Hidrofobik zincir, proteinleri kütleleriyle orantılı olarak, protein gramı başına 1.4 gram SDS oranında kaplar. Bu, proteinlere bir elektrik alanında boyuta dayalı ayırma için gerekli itici gücü sağlar.
Poli-Akrilamid Jel Elektroforezi, poliakrilamidden yapılmış bir hidrojel kullanır. Poliakrilamid, proteinlerin hareket edebileceği çok düzenli bir matris oluşturan bir polimerdir. Jel ne kadar konsantre olursa, proteinler bir elektrik alanına maruz kaldığında o kadar yavaş geçer. Bir nesnenin hareketini etkilemek için uzamsal olarak düzgün bir elektrik alanı kullanma işlemi, elektroforez olarak bilinir.
SDS-PAGE, kültürdeki hücreler, dokular, kan, idrar ve maya dahil olmak üzere birçok farklı kaynaktan izole edilen proteinler üzerinde gerçekleştirilir.
Bu çeşitli kaynaklardan gelen proteinler önce homojenizasyon ve santrifüjleme gibi teknikler kullanılarak diğer hücresel bileşenlerden ayrılmalı, ardından genellikle lizis tamponları kullanılmalıdır.
Protein izole edildikten sonra, numunedeki protein miktarını bir Biskinkoninik asit veya BCA, kolorimetrik testteki albümin standartlarıyla karşılaştırarak, numunelerin eşit yüklenmesini sağlamak için konsantrasyonu sıklıkla ölçülür.
Hatırlanması gereken önemli bir adım, yükleme arabelleğinin eklenmesidir. Yükleme tamponunun 3 ana işlevi vardır. İlk olarak, SDS ve ek indirgeyici maddeler sayesinde, proteinleri denatüre eder, bu da temel olarak karmaşık protein yapılarını doğrusal bir amino asit zincirine dönüştürdüğü anlamına gelir. İkinci olarak, numunenin jelin kuyucuklarına yüklendiğinde yüzmemesini sağlayan gliserin içerir. Ve son olarak, çoğu ticari yükleme tamponu, elektroforez adımının ilerlemesini ölçmek için izlenebilen bromofenol mavisi gibi bir boya içerir.
Yükleme tamponunu ekledikten sonra, numunelerin karıştırılması ve ardından 5 dakika kaynatılması gerekir. Bu, proteinlerdeki güçlü di-sülfür bağlarının beta-merkaptoetanol gibi bir indirgeyici ajan yardımıyla kırılmasını sağlar. Tüm disülfid bağları koptuğunda, SDS proteinleri daha eşit bir şekilde kaplayabilir.
Daha sonra, numuneler hızlı bir şekilde döndürülür ve daha sonra elektroforez için jel sistemine yüklenmeye hazır hale gelir.
Numuneler yüklenmeden önce jel sistemi monte edilmelidir. Bu, bir poliakrilamid jelin satın alınması veya üretilmesi ile başlar. Hazır jeller giderek daha popüler hale geliyor çünkü akrilamid nörotoksik ve beyin hasarına neden olabilir. Jel kaseti, numuneleri yüklemek için kullanılan kuyucukları içerir.
Jeller yerine sabitlendikten sonra, iç ve dış bölmeler, jelleri yapmak için kullanılan aynı konsantrasyonda iyonları içeren bir tampon ile doldurulur. Bu, katottan jelden ve anoda sorunsuz bir şekilde geçen bir elektrik devresi oluşturur.
Daha sonra, moleküler ağırlık merdivenleri tipik olarak jele yüklenir ve ardından numuneler gelir. Jel çalıştıkça, merdiven yayılacak ve bilinen boyutlarda görünür protein bantları oluşturacaktır. Son adımlarda, bu bantlar her bir proteinin boyutunu hesaplamak için kullanılabilir.
Tüm numuneler yüklendikten sonra, jel kutusundaki pozitif ve negatif terminaller, uzun süre sabit bir voltajı koruyabilen bir güç kaynağına bağlanır. Jeller tipik olarak, tüm numune "istifleme jeli" adı verilen jel bölgesine girene kadar yaklaşık 60V'ta başlatılır. Daha sonra voltaj, jelin boyutuna ve konsantrasyonuna ve ilgilenilen proteinin boyutuna bağlı olarak 30 dakika ila 1 saat boyunca yaklaşık 200V'a yükseltilir.
Elektroforez tamamlandığında, kaset çıkarılır ve jeli açığa çıkarmak için açılır. Jel daha sonra jel içindeki protein bantlarını görselleştirmek için coomassie mavisi veya gümüş lekesi gibi tipik bir protein boyası ile boyanabilir. Coomassie boyası 50 nanogram kadar az protein içeren bantları tespit edebilirken, gümüş boyası 1 nanogram kadar az protein içeren bantları tespit edebilir.
İki boyutlu jel elektroforezinde numuneler, jeller üzerinde her seferinde bir boyut olmak üzere iki ayrı özelliğe göre ayrılır. İlk olarak, numuneler lokalize pH gradyan şeritleri üzerindeki izoelektrik noktalarına göre yüklenir ve düzenlenir. Şeritteki proteinler daha sonra denatüre edilir ve tipik bir poliakrilamid jelin üzerine yerleştirilir ve burada taze jel çözeltisi ile yerlerine sabitlenirler. Daha sonra SDS-PAGE ile ikinci boyut ayrımı yapılır.
İzoelektrik odaklama, 2 boyutlu jel elektroforezi için tek seçenek olmasa da, en yaygın olanıdır. İki boyutlu jel elektroforezi, protein kompleksleri ve alt organel organizasyonu hakkında bilgi sağlayan paha biçilmez bir araçtır.
Jeli çalıştırdıktan sonra, çok yaygın bir sonraki adım, proteinleri jelden analiz için PVDF veya naylondan yapılmış bir zara aktarmaktır. Daha sonra zarı araştırmak ve ilgilenilen proteinleri aramak için spesifik antikorlar kullanabilirsiniz. Burada, araştırmacının bir dizi seri seyreltme boyunca Pit-1 proteininin varlığını en iyi hangisinin gösterdiğini belirlemek için 3 farklı sinyal amplifikasyon tekniği kullandığı tipik immünoblot sonuçları gösterilmektedir.
JoVE'nin SDS-PAGE kullanarak protein ayırma hakkındaki videosunu izlediniz. Şimdi, bu güçlü tekniği kullanarak bir proteini boyuta göre çözmenin adımlarını anlamalısınız. Her zaman olduğu gibi, izlediğiniz için teşekkürler!
Sodyum Dodesil Sülfat Poli-Akrilamid Jel Elektroforezi veya SDS-PAGE, protein karışımlarını boyutlarına göre ayırmak için yaygın olarak kullanılan bir…
SDS-PAGE, birçok araştırmacı tarafından protein karışımlarını boyutlarına göre ayırmak için kullanılan bir tekniktir. Bu tekniğin başarılı bir şekilde tamamlanması, immünoblotlama gibi birçok protein analizi yöntemi için önemli bir ilk adımdır. Kendi başına, protein boyutunu ve saflığını değerlendirmede yararlı bir araçtır.
SDS-PAGE tekniğini anlamak için önce temel bileşenlerini anlamanız gerekir. SDS-PAGE, Sodyum Dodesil Sülfat Poli-Akrilamid Jel Elektroforezi anlamına gelir. Bunun ilk kısmı olan Sodyum-Dodesil Sülfat veya "SDS", anyonik bir deterjandır. Bu, net negatif yüklü hidrofilik bir gruptan ve nötr yüklü uzun bir hidrofobik zincirden oluştuğu anlamına gelir.
Hidrofobik zincir, proteinleri kütleleriyle orantılı olarak, protein gramı başına 1.4 gram SDS oranında kaplar. Bu, proteinlere bir elektrik alanında boyuta dayalı ayırma için gerekli itici gücü sağlar.
Poli-Akrilamid Jel Elektroforezi, poliakrilamidden yapılmış bir hidrojel kullanır. Poliakrilamid, proteinlerin hareket edebileceği çok düzenli bir matris oluşturan bir polimerdir. Jel ne kadar konsantre olursa, proteinler bir elektrik alanına maruz kaldığında o kadar yavaş geçer. Bir nesnenin hareketini etkilemek için uzamsal olarak düzgün bir elektrik alanı kullanma işlemi, elektroforez olarak bilinir.
SDS-PAGE, kültürdeki hücreler, dokular, kan, idrar ve maya dahil olmak üzere birçok farklı kaynaktan izole edilen proteinler üzerinde gerçekleştirilir.
Bu çeşitli kaynaklardan gelen proteinler önce homojenizasyon ve santrifüjleme gibi teknikler kullanılarak diğer hücresel bileşenlerden ayrılmalı, ardından genellikle lizis tamponları kullanılmalıdır.
Protein izole edildikten sonra, numunedeki protein miktarını bir Biskinkoninik asit veya BCA, kolorimetrik testteki albümin standartlarıyla karşılaştırarak, numunelerin eşit yüklenmesini sağlamak için konsantrasyonu sıklıkla ölçülür.
Hatırlanması gereken önemli bir adım, yükleme arabelleğinin eklenmesidir. Yükleme tamponunun 3 ana işlevi vardır. İlk olarak, SDS ve ek indirgeyici maddeler sayesinde, proteinleri denatüre eder, bu da temel olarak karmaşık protein yapılarını doğrusal bir amino asit zincirine dönüştürdüğü anlamına gelir. İkinci olarak, numunenin jelin kuyucuklarına yüklendiğinde yüzmemesini sağlayan gliserin içerir. Ve son olarak, çoğu ticari yükleme tamponu, elektroforez adımının ilerlemesini ölçmek için izlenebilen bromofenol mavisi gibi bir boya içerir.
Yükleme tamponunu ekledikten sonra, numunelerin karıştırılması ve ardından 5 dakika kaynatılması gerekir. Bu, proteinlerdeki güçlü di-sülfür bağlarının beta-merkaptoetanol gibi bir indirgeyici ajan yardımıyla kırılmasını sağlar. Tüm disülfid bağları koptuğunda, SDS proteinleri daha eşit bir şekilde kaplayabilir.
Daha sonra, numuneler hızlı bir şekilde döndürülür ve daha sonra elektroforez için jel sistemine yüklenmeye hazır hale gelir.
Numuneler yüklenmeden önce jel sistemi monte edilmelidir. Bu, bir poliakrilamid jelin satın alınması veya üretilmesi ile başlar. Hazır jeller giderek daha popüler hale geliyor çünkü akrilamid nörotoksik ve beyin hasarına neden olabilir. Jel kaseti, numuneleri yüklemek için kullanılan kuyucukları içerir.
Jeller yerine sabitlendikten sonra, iç ve dış bölmeler, jelleri yapmak için kullanılan aynı konsantrasyonda iyonları içeren bir tampon ile doldurulur. Bu, katottan jelden ve anoda sorunsuz bir şekilde geçen bir elektrik devresi oluşturur.
Daha sonra, moleküler ağırlık merdivenleri tipik olarak jele yüklenir ve ardından numuneler gelir. Jel çalıştıkça, merdiven yayılacak ve bilinen boyutlarda görünür protein bantları oluşturacaktır. Son adımlarda, bu bantlar her bir proteinin boyutunu hesaplamak için kullanılabilir.
Tüm numuneler yüklendikten sonra, jel kutusundaki pozitif ve negatif terminaller, uzun süre sabit bir voltajı koruyabilen bir güç kaynağına bağlanır. Jeller tipik olarak, tüm numune "istifleme jeli" adı verilen jel bölgesine girene kadar yaklaşık 60V'ta başlatılır. Daha sonra voltaj, jelin boyutuna ve konsantrasyonuna ve ilgilenilen proteinin boyutuna bağlı olarak 30 dakika ila 1 saat boyunca yaklaşık 200V'a yükseltilir.
Elektroforez tamamlandığında, kaset çıkarılır ve jeli açığa çıkarmak için açılır. Jel daha sonra jel içindeki protein bantlarını görselleştirmek için coomassie mavisi veya gümüş lekesi gibi tipik bir protein boyası ile boyanabilir. Coomassie boyası 50 nanogram kadar az protein içeren bantları tespit edebilirken, gümüş boyası 1 nanogram kadar az protein içeren bantları tespit edebilir.
İki boyutlu jel elektroforezinde numuneler, jeller üzerinde her seferinde bir boyut olmak üzere iki ayrı özelliğe göre ayrılır. İlk olarak, numuneler lokalize pH gradyan şeritleri üzerindeki izoelektrik noktalarına göre yüklenir ve düzenlenir. Şeritteki proteinler daha sonra denatüre edilir ve tipik bir poliakrilamid jelin üzerine yerleştirilir ve burada taze jel çözeltisi ile yerlerine sabitlenirler. Daha sonra SDS-PAGE ile ikinci boyut ayrımı yapılır.
İzoelektrik odaklama, 2 boyutlu jel elektroforezi için tek seçenek olmasa da, en yaygın olanıdır. İki boyutlu jel elektroforezi, protein kompleksleri ve alt organel organizasyonu hakkında bilgi sağlayan paha biçilmez bir araçtır.
Jeli çalıştırdıktan sonra, çok yaygın bir sonraki adım, proteinleri jelden analiz için PVDF veya naylondan yapılmış bir zara aktarmaktır. Daha sonra zarı araştırmak ve ilgilenilen proteinleri aramak için spesifik antikorlar kullanabilirsiniz. Burada, araştırmacının bir dizi seri seyreltme boyunca Pit-1 proteininin varlığını en iyi hangisinin gösterdiğini belirlemek için 3 farklı sinyal amplifikasyon tekniği kullandığı tipik immünoblot sonuçları gösterilmektedir.
JoVE'nin SDS-PAGE kullanarak protein ayırma hakkındaki videosunu izlediniz. Şimdi, bu güçlü tekniği kullanarak bir proteini boyuta göre çözmenin adımlarını anlamalısınız. Her zaman olduğu gibi, izlediğiniz için teşekkürler!
SDS-PAGE, birçok araştırmacı tarafından protein karışımlarını boyutlarına göre ayırmak için kullanılan bir tekniktir. Bu tekniğin başarılı bir şekilde tamamlanması, immünoblotlama gibi birçok protein analizi yöntemi için önemli bir ilk adımdır. Kendi başına, protein boyutunu ve saflığını değerlendirmede yararlı bir araçtır.
SDS-PAGE tekniğini anlamak için önce temel bileşenlerini anlamanız gerekir. SDS-PAGE, Sodyum Dodesil Sülfat Poli-Akrilamid Jel Elektroforezi anlamına gelir. Bunun ilk kısmı olan Sodyum-Dodesil Sülfat veya "SDS", anyonik bir deterjandır. Bu, net negatif yüklü hidrofilik bir gruptan ve nötr yüklü uzun bir hidrofobik zincirden oluştuğu anlamına gelir.
Hidrofobik zincir, proteinleri kütleleriyle orantılı olarak, protein gramı başına 1.4 gram SDS oranında kaplar. Bu, proteinlere bir elektrik alanında boyuta dayalı ayırma için gerekli itici gücü sağlar.
Poli-Akrilamid Jel Elektroforezi, poliakrilamidden yapılmış bir hidrojel kullanır. Poliakrilamid, proteinlerin hareket edebileceği çok düzenli bir matris oluşturan bir polimerdir. Jel ne kadar konsantre olursa, proteinler bir elektrik alanına maruz kaldığında o kadar yavaş geçer. Bir nesnenin hareketini etkilemek için uzamsal olarak düzgün bir elektrik alanı kullanma işlemi, elektroforez olarak bilinir.
SDS-PAGE, kültürdeki hücreler, dokular, kan, idrar ve maya dahil olmak üzere birçok farklı kaynaktan izole edilen proteinler üzerinde gerçekleştirilir.
Bu çeşitli kaynaklardan gelen proteinler önce homojenizasyon ve santrifüjleme gibi teknikler kullanılarak diğer hücresel bileşenlerden ayrılmalı, ardından genellikle lizis tamponları kullanılmalıdır.
Protein izole edildikten sonra, numunedeki protein miktarını bir Biskinkoninik asit veya BCA, kolorimetrik testteki albümin standartlarıyla karşılaştırarak, numunelerin eşit yüklenmesini sağlamak için konsantrasyonu sıklıkla ölçülür.
Hatırlanması gereken önemli bir adım, yükleme arabelleğinin eklenmesidir. Yükleme tamponunun 3 ana işlevi vardır. İlk olarak, SDS ve ek indirgeyici maddeler sayesinde, proteinleri denatüre eder, bu da temel olarak karmaşık protein yapılarını doğrusal bir amino asit zincirine dönüştürdüğü anlamına gelir. İkinci olarak, numunenin jelin kuyucuklarına yüklendiğinde yüzmemesini sağlayan gliserin içerir. Ve son olarak, çoğu ticari yükleme tamponu, elektroforez adımının ilerlemesini ölçmek için izlenebilen bromofenol mavisi gibi bir boya içerir.
Yükleme tamponunu ekledikten sonra, numunelerin karıştırılması ve ardından 5 dakika kaynatılması gerekir. Bu, proteinlerdeki güçlü di-sülfür bağlarının beta-merkaptoetanol gibi bir indirgeyici ajan yardımıyla kırılmasını sağlar. Tüm disülfid bağları koptuğunda, SDS proteinleri daha eşit bir şekilde kaplayabilir.
Daha sonra, numuneler hızlı bir şekilde döndürülür ve daha sonra elektroforez için jel sistemine yüklenmeye hazır hale gelir.
Numuneler yüklenmeden önce jel sistemi monte edilmelidir. Bu, bir poliakrilamid jelin satın alınması veya üretilmesi ile başlar. Hazır jeller giderek daha popüler hale geliyor çünkü akrilamid nörotoksik ve beyin hasarına neden olabilir. Jel kaseti, numuneleri yüklemek için kullanılan kuyucukları içerir.
Jeller yerine sabitlendikten sonra, iç ve dış bölmeler, jelleri yapmak için kullanılan aynı konsantrasyonda iyonları içeren bir tampon ile doldurulur. Bu, katottan jelden ve anoda sorunsuz bir şekilde geçen bir elektrik devresi oluşturur.
Daha sonra, moleküler ağırlık merdivenleri tipik olarak jele yüklenir ve ardından numuneler gelir. Jel çalıştıkça, merdiven yayılacak ve bilinen boyutlarda görünür protein bantları oluşturacaktır. Son adımlarda, bu bantlar her bir proteinin boyutunu hesaplamak için kullanılabilir.
Tüm numuneler yüklendikten sonra, jel kutusundaki pozitif ve negatif terminaller, uzun süre sabit bir voltajı koruyabilen bir güç kaynağına bağlanır. Jeller tipik olarak, tüm numune "istifleme jeli" adı verilen jel bölgesine girene kadar yaklaşık 60V'ta başlatılır. Daha sonra voltaj, jelin boyutuna ve konsantrasyonuna ve ilgilenilen proteinin boyutuna bağlı olarak 30 dakika ila 1 saat boyunca yaklaşık 200V'a yükseltilir.
Elektroforez tamamlandığında, kaset çıkarılır ve jeli açığa çıkarmak için açılır. Jel daha sonra jel içindeki protein bantlarını görselleştirmek için coomassie mavisi veya gümüş lekesi gibi tipik bir protein boyası ile boyanabilir. Coomassie boyası 50 nanogram kadar az protein içeren bantları tespit edebilirken, gümüş boyası 1 nanogram kadar az protein içeren bantları tespit edebilir.
İki boyutlu jel elektroforezinde numuneler, jeller üzerinde her seferinde bir boyut olmak üzere iki ayrı özelliğe göre ayrılır. İlk olarak, numuneler lokalize pH gradyan şeritleri üzerindeki izoelektrik noktalarına göre yüklenir ve düzenlenir. Şeritteki proteinler daha sonra denatüre edilir ve tipik bir poliakrilamid jelin üzerine yerleştirilir ve burada taze jel çözeltisi ile yerlerine sabitlenirler. Daha sonra SDS-PAGE ile ikinci boyut ayrımı yapılır.
İzoelektrik odaklama, 2 boyutlu jel elektroforezi için tek seçenek olmasa da, en yaygın olanıdır. İki boyutlu jel elektroforezi, protein kompleksleri ve alt organel organizasyonu hakkında bilgi sağlayan paha biçilmez bir araçtır.
Jeli çalıştırdıktan sonra, çok yaygın bir sonraki adım, proteinleri jelden analiz için PVDF veya naylondan yapılmış bir zara aktarmaktır. Daha sonra zarı araştırmak ve ilgilenilen proteinleri aramak için spesifik antikorlar kullanabilirsiniz. Burada, araştırmacının bir dizi seri seyreltme boyunca Pit-1 proteininin varlığını en iyi hangisinin gösterdiğini belirlemek için 3 farklı sinyal amplifikasyon tekniği kullandığı tipik immünoblot sonuçları gösterilmektedir.
JoVE'nin SDS-PAGE kullanarak protein ayırma hakkındaki videosunu izlediniz. Şimdi, bu güçlü tekniği kullanarak bir proteini boyuta göre çözmenin adımlarını anlamalısınız. Her zaman olduğu gibi, izlediğiniz için teşekkürler!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What does SDS do to proteins in SDS-PAGE?
SDS is an anionic detergent that coats proteins uniformly at a rate of 1.4 grams per gram of protein. This coating provides a consistent negative charge across the protein's length, enabling size-driven separation in an electric field. The detergent essentially linearizes complex protein structures, allowing them to migrate based solely on their molecular weight.
Q2: Why is the loading buffer important in SDS-PAGE preparation?
The loading buffer serves three critical functions: it denatures proteins into linear amino acid chains using SDS and reducing agents, it contains glycerin to prevent samples from floating out of gel wells, and it includes a dye like bromophenol blue to track electrophoresis progress. Boiling samples for 5 minutes with the buffer breaks disulfide bonds, allowing SDS to coat proteins evenly.
Q3: How does polyacrylamide gel concentration affect protein separation?
The polyacrylamide gel forms a regular matrix through which proteins migrate when exposed to an electric field. Higher gel concentrations create denser matrices that slow protein movement, while lower concentrations allow faster migration. This property enables researchers to optimize separation conditions based on the size of proteins being analyzed.
Q4: What is the purpose of molecular weight ladders in SDS-PAGE?
Molecular weight ladders are protein standards of known sizes loaded alongside samples. As the gel runs, ladder proteins spread and create visible bands at predictable positions. These reference bands allow researchers to calculate the exact size of unknown proteins in their samples by comparing their migration distances.
Q5: How do Coomassie and silver stains differ in protein detection?
Both stains visualize protein bands after electrophoresis, but they differ in sensitivity. Coomassie blue can detect protein bands containing as little as 50 nanograms, while silver stain is more sensitive, detecting bands with as little as 1 nanogram. Silver stain provides greater detection capability for low-abundance proteins.
Q6: What is two-dimensional gel electrophoresis and how does it work?
Two-dimensional gel electrophoresis separates proteins by two distinct properties sequentially. First, samples are arranged by isoelectric point on pH gradient strips, then proteins are transferred to a polyacrylamide gel where SDS-PAGE separation occurs. This dual approach provides insights into protein complexes and sub-organelle organization that single-dimension methods cannot reveal.
Q7: What happens after SDS-PAGE gel electrophoresis is complete?
After electrophoresis, the gel cassette is opened and the gel is stained with protein stains like Coomassie blue or silver stain to visualize protein bands. A common next step is transferring proteins from the gel onto a PVDF or nylon membrane for western blotting western transfer antibody detection analysis using specific antibodies to identify proteins of interest.
Chapters in this video
0:00
Overview
0:29
Principal Components of the SDS-PAGE System
1:55
SDS-PAGE Sample Preparation
3:40
Loading and Running the Gel
5:18
Applications
7:07
Summary
Videos from this collection: