SDS-PAGE ile Protein Ayırma

SDS-PAGE, birçok araştırmacı tarafından protein karışımlarını boyutlarına göre ayırmak için kullanılan bir tekniktir. Bu tekniğin başarıyla tamamlanması, immunoblotting gibi birçok protein analiz yöntemi için temel bir ilk adımdır. Tek başına ise, protein boyutunu ve saflığını değerlendirmede yararlı bir araçtır.

SDS-PAGE tekniğini anlamak için öncelikle temel bileşenlerini kavramanız gerekir. SDS-PAGE, Sodyum Dodesil Sülfat Poliakrilamid Jel Elektroforezi anlamına gelir. Bunun ilk kısmı olan Sodyum Dodesil Sülfat veya “SDS”, anyonik bir deterjandır. Bu, SDS'nin net negatif yüklü bir hidrofilik grup ve nötr yüklü uzun bir hidrofobik zincirden oluştuğu anlamına gelir.

Hidrofobik zincir, proteinleri kütleleriyle orantılı olarak, gram protein başına 1,4 gram SDS oranında kaplar. Bu durum, proteinlere bir elektrik alanında boyut odaklı ayrım için gerekli olan itici gücü sağlar.

Poliakrilamid Jel Elektroforezi, poliakrilamidden yapılmış bir hidrojel kullanır. Poliakrilamid, proteinlerin içinden hareket edebileceği çok düzenli bir matriks oluşturan bir polimerdir. Jel ne kadar konsantre olursa, bir elektrik alana maruz kaldıklarında proteinler üzerinden o kadar yavaş geçerler. Bir nesnenin hareketini etkilemek için mekansal olarak homojen bir elektrik alanı kullanma işlemine elektroforez denir.

SDS-PAGE; kültür hücreleri, dokular, kan, idrar ve maya dahil olmak üzere birçok farklı kaynaktan izole edilen proteinlere uygulanır.

Bu çeşitli kaynaklardan elde edilen proteinler, öncelikle homojenizasyon ve santrifüj gibi teknikler kullanılarak ve sıklıkla ardından lizis tamponları uygulanarak diğer hücresel bileşenlerden ayrıştırılmalıdır.

Protein izole edildikten sonra, örneklerin eşit miktarda yüklendiğinden emin olmak için, örnekteki protein miktarı bir Bisinkoninik asit veya BCA kolorimetrik testi ile albümin standartlarıyla karşılaştırılarak konsantrasyonu genellikle ölçülür.

Hatırlanması gereken önemli bir adım, yükleme tamponunun eklenmesidir. Yükleme tamponunun 3 ana işlevi vardır. İlk olarak, SDS ve ek indirgeyici ajanlar sayesinde proteinleri denatüre eder; bu durum temel olarak karmaşık protein yapılarının doğrusal bir amino asit zincirine dönüştürülmesi anlamına gelir. İkinci olarak, örneğin jel kuyucuklarına yüklendiğinde yüzeye çıkmamasını sağlayan gliserin içerir. Son olarak, çoğu ticari yükleme tamponu, elektroforez adımının ilerlemesini ölçmek için takip edilebilen bromofenol mavisi gibi bir boya içerir.

Yükleme tamponu eklendikten sonra, örneklerin karıştırılması ve ardından 5 dakika boyunca kaynatılması gerekir. Bu işlem, proteinlerdeki güçlü disülfit bağlarının beta-merkaptoetanol gibi bir indirgeyici ajan yardımıyla kırılmasını sağlar. Tüm disülfit bağları kırıldığında, SDS proteinleri daha homojen bir şekilde kaplayabilir.

Ardından, örnekler hızlıca santrifüjlenir ve böylece elektroforez için jel sistemine yüklenmeye hazır hale gelir.

Örnekler yüklenmeden önce, jel sisteminin kurulması gerekir. Bu süreç, bir poliakrilamid jelin satın alınması veya hazırlanmasıyla başlar. Akrilamid nörotoksik olduğundan ve beyin hasarına yol açabildiğinden, hazır jeller giderek daha popüler hale gelmektedir. Jel kaseti, örneklerin yüklenmesi için kullanılan kuyucuklar içerir.

Jeller yerine sabitlendikten sonra, iç ve dış hazne, jellerin hazırlanmasında kullanılan iyonlarla aynı konsantrasyona sahip bir tampon çözelti ile doldurulur. Bu işlem, katottan başlayarak jel üzerinden anoda sorunsuz bir şekilde iletilen bir elektrik devresi oluşturur.

Ardından, genellikle jele moleküler ağırlık markerları yüklenir ve bunu örnekler takip eder. Jel çalışırken, marker yayılır ve bilinen boyutlarda görünür protein bantları oluşturur. Son aşamalarda, bu bantlar her bir proteinin boyutunu hesaplamak için kullanılabilir.

Tüm örnekler yüklendikten sonra, jel kutusundaki pozitif ve negatif uçlar, uzun süre boyunca sabit bir voltajı koruyabilen bir güç kaynağına bağlanır. Jeller genellikle, tüm örnek "yığma jeli" (stacking gel) olarak adlandırılan jel bölgesine girene kadar yaklaşık 60V seviyesinde çalıştırılır. Daha sonra voltaj, jelin boyutuna ve konsantrasyonuna ve ilgilenilen proteinin boyutuna bağlı olarak 30 dakika ile 1 saat arasında yaklaşık 200V'a yükseltilir.

Elektroforez tamamlandığında, kaset çıkarılır ve jel açığa çıkarılacak şekilde açılır. Jel içindeki protein bantlarını görselleştirmek için jel, Coomassie blue veya gümüş boyama gibi tipik bir protein boyası ile boyanabilir. Coomassie boyaması 50 nanogram protein kadar düşük miktarlardaki bantları tespit edebilirken, gümüş boyama 1 nanogram protein kadar düşük miktarlardaki bantları tespit edebilir.

İki boyutlu jel elektroforezinde örnekler, jeller üzerinde her seferinde bir boyut olacak şekilde iki ayrı özelliğe göre ayrıştırılır. İlk olarak örnekler yüklenir ve lokalize pH gradyan şeritleri üzerinde izoelektrik noktalarına göre düzenlenir. Şeritteki proteinler daha sonra denatüre edilir ve taze jel çözeltisi ile yerlerine sabitlendikleri tipik bir poliakrilamid jel üzerine yerleştirilirler. Ardından, ikinci boyut ayrıştırması SDS-PAGE ile gerçekleştirilir.

İzoelektrik odaklama, 2-D jel elektroforezi için tek seçenek olmasa da en yaygın olanıdır. İki boyutlu jel elektroforezi, protein kompleksleri ve alt organel organizasyonu hakkında bilgiler sağlayan paha biçilmez bir araçtır.

Jel çalıştırıldıktan sonra, analiz için proteinlerin jelden PVDF veya naylondan yapılmış bir membrana aktarılması çok yaygın bir sonraki adımdır. Daha sonra membranı incelemek ve ilgilenilen proteinleri aramak için spesifik antikorlar kullanabilirsiniz. Burada, araştırmacının bir dizi seri dilüsyon boyunca Pit-1 proteininin varlığını en iyi hangisinin gösterdiğini belirlemek için 3 farklı sinyal amplifikasyon tekniği kullandığı tipik immunoblote sonuçları gösterilmektedir.

SDS-PAGE kullanarak protein ayrıştırması üzerine olan JoVE videosunu izlediniz. Artık bu güçlü teknikle bir proteinin boyutuna göre ayrıştırılmasında yer alan adımları anlamış olmalısınız. Her zaman olduğu gibi, izlediğiniz için teşekkürler!