Doğrudan Etiketli Problar kullanarak Sağlam 3D DNA BALIK

Aşağıdaki deneyin genel amacı, tek hücrelerdeki spesifik genomik lokusların mekansal organizasyonunu sağlam bir şekilde araştırmaktır. Bu, ilk olarak, ilgilenilen genomik bölgeyi nihai olarak bağlamak ve vurgulamak için floresan olarak etiketlenmiş problar üreterek elde edilir. Sonraki adımlar, prob erişimine izin vermek için ilgilenilen hücreleri bir slayt üzerine yapıştırmak, sabitlemek ve geçirmektir.

Daha sonra, prob ve hücresel DNA'nın eşzamanlı bir ısı denatürasyonunu, spesifik olarak bağlı olmayan probu çıkarmak ve dpi ile karşı durmak için gece boyunca prob hibridizasyon yıkama adımları takip eder. Hücre çekirdeğini görselleştirmek için, floresan mikroskobu ile elde edilen sonuçlar, sonuçta belirli genomik bölgelerin işgal ettiği nükleer pozisyonu ortaya çıkaracaktır. Bu yöntem, genler arasındaki fonksiyonel etkileşimlerin belirlenmesi gibi nükleer organizasyon alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

Bu özel DNA FISH protokolünün ana avantajı, hızlı, sağlam ve çok yönlü olmasıdır. Bu yöntemi E Es hücreleri kullanarak göstermemize rağmen, 100 ila 250 sırttan yapılan doğrudan etiketli problar olan çok sayıda başka hücre tipine de uygulanabilir. Kilobazlar, daha küçük problar gerektiğinde sürekli olarak parlak sinyaller üretir.

40 ila 50 kilobaz smid, hatta beş ila 10 kilobaz kesici uç içeren plazmitler kullanın. Topluluk veya UCSC genom tarayıcılarını kullanarak belirli genlere karşılık gelen arka veya smid klonlarını tanımlayın. Yüksek kaliteli geri DNA hazırlamak için tekrarlanan çökeltme veya ticari olarak temin edilebilen bir kit kullanın, preparatın temizliği gereken prob hacmi ile orantılıdır.

Etiketlemeyi iki adımda gerçekleştirin. İlk olarak, amino alel, DUTP'yi tanıtmak için NIC çevirisini kullanın. İkinci olarak, bir ortalama reaktif boya eklemek için kimyasal birleştirme kullanın.

Güçlü balık sinyalleri için kritik öneme sahip oldukları için parlak sondalar yapmak için zaman ayırmaya değer. Bu işlem, hücrelerin tedavisine paralel olarak yapılabilir ve günün başında yapılması gerekmez. İlk olarak, 10 ila 20 nanogram doğrudan etiketli probu, altı mikrogram için altı mikrolitre CO 1D NA ile karıştırıldı.

Daha sonra 9.7 mikrogram için somon testislerinden bir mikrolitre tek sarmallı DNA ekleyin. Karışımın hacmini su ile 100 mikrolitreye ayarlayın. Daha sonra, 10 mikrolitre üç molar sodyum asetat ve 275 mikrolitre etanol ekleyin ve girdaplama ile karıştırın.

Karışımın eksi 20 santigrat derecede en az bir saat çökelmesine izin verin. Daha sonra, yağışı dört santigrat derecede 30 dakika boyunca maksimum hızda bir mikro füje döndürün. Daha sonra peleti %70 etanol ile yıkayın ve dört santigrat derecede beş dakika boyunca tekrar döndürün.

Daha sonra peleti havayla kurutun. Sonra diriltmek. Beş mikrolitre deiyonize formda askıya alın.

37 santigrat derecede amid, 1000 RPM'de sallarken ışıktan korumak için folyo yaparsınız. 30 dakika sonra, beş mikrolitre dekstrin sülfat karışımı ekleyin ve inkübasyona çalkalama ile devam edin. 10 dakika daha, hücrelerin kaymaya yapışma eğilimi hücre tipine göre büyük ölçüde değişir.

Her hücre tipi için optimum çökelme süresini ve hücre yoğunluğunu ampirik olarak belirleyin. Tutarlı sonuçlar için, hücreler tek bir hücre süspansiyonunda olmalıdır Fare ES hücrelerini bir slayta yapıştırmak için. Slaytta hücrelerin tespit edileceği alanı daire içine alarak başlayın.

Hidrofobik bir kalem kullanarak, normal kültür ortamında 80 ila 100 mikrolitre başına 20 ila 50.000 hücrelik bir süspansiyon hazırladınız, hücre süspansiyonunu daireye ekleyin ve hücrelerin nemlendirilmiş bir inkübatörde yaklaşık üç saat boyunca bağlanmasına izin verin. Sürgü ekinden sonra, sürgüyü 10 dakika boyunca hafifçe %4 PFA'ya batırarak hücreleri sabitleyin. Slayt, uç kutusu gibi bir tepside düz olmalıdır.

Coplan kavanozlarda oda sıcaklığında reaktiflerin kullanılması. İlk olarak, hücreleri 10 dakika boyunca tris klorür ile söndürün. İkinci olarak, 10 dakika boyunca bir sapin ve triton X 100 karışımı kullanarak hücrelere nüfuz edin.

Şimdi hücreleri PBS'de yıkama başına beş dakika boyunca iki kez yıkayın. Yıkamalardan sonra hücreleri en az 20 dakika %20 gliserol içinde inkübe edin. Bu noktada, slaytlar birkaç hafta boyunca eksi 20 santigrat derecede %50 gliserol içinde saklanabilir.

Bir gün veya daha uzun süre depolama, sinyal gücünü artırmalıdır. Devam etmeden önce hücreleri PBS'de% 20 gliserol oda sıcaklığına dengelediğinizden emin olun. Şimdi, sıvı nitrojen kullanarak slaytı üç kez dondurun ve çözün.

Çatırtı sesi durduğunda her seferinde bir slayt. Birkaç saniye sonra, buzunu çözmek için sürgüyü bir kağıt havluya çıkarın, sürgüyü tekrar dondurmadan önce opak donmuş gliserolün kaybolmasını bekleyin, üç donma çözülme döngüsü için dönüşümlü olarak 15'e kadar kayma rahatça yapılabilir. Şimdi slaytları PBS'de yıkama başına beş dakika boyunca iki kez yıkayın.

Daha sonra slaytları 0.1 molar hidroklorik asit içinde 30 dakika inkübe edin. Hidroklorik asit tedavisini PBS'de beş dakikalık bir yıkama ile takip edin. Şimdi hücrelere daha güçlü bir özsu ve Triton X 100 karışımı ile 30 dakika boyunca yüzey aktif maddeleri slaytlardan yıkamak için tekrar nüfuz edin, iki adet beş dakikalık PBS yıkama kullanın.

Slaytlar artık %50 form amid içinde XSSC'ye dengelenmeye hazırdır. Bu, dengeleme sırasında en az 10 dakika sürmeli, probu birkaç kez yukarı ve aşağı pipetlemeli ve ardından hücre noktası başına 10 mikrolitreyi uygun boyutta bir kapak kızağına aktarmalıdır. Form amidinden bir slaytı çıkarın ve hücrelerin etrafındaki fazla sıvıyı bir kağıt havluyla kurulayın, ancak hücre lekesinin kurumasına izin vermeyin.

Şimdi kapağı ters çevirin. Hücrelerin üzerindeki slaydın üzerine kaydırın. Kapak kızağını kızağa kauçuk çimento ile kapatın.

Çimentonun tamamen kurumasını bekleyin ve slaytı ışıktan koruyun. Ardından, slaytları sıcak bir plaka üzerinde tam olarak iki dakika boyunca 78 santigrat dereceye ısıtın. Bu, düzgün bir şekilde gerçekleştirmek için çok önemlidir.

Bu adımda hücreleri ışıktan koruyan bir kapak gerekir Nükleer morfolojiyi mümkün olduğunca korumak için. Hücrelerin kurumasına izin vermemek ve ısı lokalinin doğru sıcaklığa sahip olduğundan emin olmak çok önemlidir. Ardından, slaytları nem sağlamak için nemli kağıt havlularla birlikte hafif ve sıkı bir kutuya koyun ve gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.

Bu prosedüre, kapak kızaklarının etrafındaki kauçuk çimentoyu soyarak başlayın. Ardından, kapak kayana kadar her sürgüyü X fazla SC'ye yerleştirin, gevşetin ve kaydırın. Daha sonra, slaytları 45 santigrat derecede 15 dakika boyunca iki x fazla SC'de% 50 form amid içinde yıkayın.

Işıktan korumak için su banyosunun kapağını kapatın. Ardından slaytları 0.2 XSSC'de 63 santigrat derecede 15 dakika yıkayın. Daha sonra 45 santigrat derecede beş dakika boyunca iki XSSC ve son olarak beş dakika boyunca oda sıcaklığında aşırı SE'ye.

Kalan adımların tümü oda sıcaklığındadır, beş dakikalık bir yıkama ile başlar ve PBS şimdi slaytları iki dakika boyunca dappy ile lekeler ve ardından slaytları PBS ile beş dakika boyunca alıkoyar. Kapak kızağını monte etmek için, doğru boyuttaki kapak kızağına hücre noktası başına 10 mikrolitre montaj ortamı uygulayın. Ardından, hücrelerin kurumasına izin vermeden hücre noktasının etrafındaki fazla PBS'yi kurutun.

Kapağı ters çevirin, bir sürgünün üzerine kaydırın ve balık probu hazırlama protokolünü kullanarak oje ile kapatın. NIC çevirisinden sonra, 150 ila 700 baz çifti arasında çalışan parçaların büyük bir kısmı ile bir DNA lekesi görünmelidir. Kimyasal birleştirmeden sonra, floresan boyanın dahil edilmesi, prob geçişinin spektroskopik analizi ile ölçülebilir.

Prob kalitesini değerlendirmek için bu kalite kontrol adımları, böyle bir prob kullanılarak kritik öneme sahiptir. Epi floresan mikroskobu ile otomatik görüntüleme mümkün oldu. Bu, çok az arka plana sahip keskin, kolayca tanımlanabilir balık sinyalleri gerektirir.

Bu ham bir görüş alanı görüntüsüdür. Aşağıdaki resimler, otomatik olarak tanımlanan ve analiz edilen çekirdekleri temsil etmektedir. Çeşitli inter allelik ve inter lokus mesafeleri sağ üstte ve her çekirdeğin altında her iki tarafta gösterilmiştir.

Bu genişlemede, beyaz noktalar görüş alanı başına tanımlanan çekirdekleri temsil eder. Bu histogramlar, yukarıdaki yeşil sinyaller ile aşağıdaki kırmızı sinyaller arasındaki maksimum alelikler arası mesafeleri gösterir. Tüm veriler, HBB ve HBA genlerini kapsayan farklı kromozomlar üzerinde bulunan problara ve bir histon kümesine sahip P 20 germ hücrelerinden alınmıştır.

Bunlar, mic ve KC ve Q1 genlerini kapsayan sırt probları ile boyanmış fetal karaciğer çekirdeği örnekleridir. Bu görüntülerden, balık sinyallerinin nükleer koordinatları elde edilebilir ve genomik bölgelerin mekansal ilişkileri hesaplanabilir. Alelikler arası mesafeler, çekirdek yarıçapının bir kısmı olarak çizilir.

Bu verilerde kırmızı problar, yeşil problardan önemli ölçüde daha yakındı. Daha yoğun sinyaller gerektiren konfokal mikroskopi de mümkündü. Görüntü yığınları, kromozom bölgelerindeki balık sinyallerinin 3D modellemesi için kullanıldı.

Kırmızı ve beyaz renkteki bu iki prob, fare kromozomunun her iki ucuna yakındır ve yedi tam kromozom boyası yeşil renkle gösterilmiştir. Bu videoyu izledikten sonra, tek hücrelerde belirli genomik lokusların uzamsal konumunu araştırmak için DNA balığının nasıl gerçekleştirileceğini iyi anlamış olmalısınız. Bu prosedürü denerken, tüm tedavilerin nükleer mimariyi etkileyebileceğini unutmamak önemlidir ve bu prosedürü takiben uygun olanı dahil etmek önemlidir.

Genler ve proteinler arasındaki uzamsal ilişkiler gibi ek soruları yanıtlamak için immünobalık gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir.