Name: Doğrudan Etiketli Problar kullanarak Sağlam 3D DNA BALIK (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 16 s
Description: Öğrenin, doğrudan etiketli problar kullanarak 3D DNA FISH yöntemiyle tek hücrelerdeki genomik lokusların uzamsal organizasyonunu analiz etmeyi. Bu hızlı ve sağlam protokol, nükleer mimari ve gen etkileşimlerini incelemek için değerlidir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma BBSRC ve Wellcome Trust tarafından finanse edildi. Biz biyoinformatik analizi ile yardım için görüntüleme ve Felix Krueger ile yardım için Simon Walker teşekkür etmek istiyorum.

1. Nick Çeviri tarafından Doğrudan Etiketli DNA Probları oluşturma Not: BAC&#39;ler yapılmış Doğrudan etiketli sondalar (100-250 kb) sürekli parlak sinyalleri üretmek. Küçük prob gerekiyorsa, 5-10 kb ekler içeren fosmids (40-50 kb) ya da plazmid kullanın. BAC veya Ensemble veya UCSC genom tarayıcıları kullanarak belirli genlerin karşılık fosmid klonlar belirleyin. Tekrar yağış tarafından yüksek kaliteli BAC DNA hazırlayın veya ticari kitleri kullanın. Daha az hazırlık bakteriyel genomik DNA ile kontamine olduğu, daha az prob slayt başına gereklidir. Iki adımda etiketleme gerçekleştirin: nick çeviri aminoallyl-dUTP ve bir amin-reaktif boya kimyasal bağlantı tanıtmak. 1.1. Nick Çeviri Nick translation sırasında, DNaz I, tek telli ara oluşturmak için kullanılır. DNA Polimeraz Ben yeni, t mevcut nükleotid yerine, rumuz &#39;&#39; Bunların uçları &#39;3 uzar<html> burada &#39;tercüme&#39; nick ve böylece işaretlenmiş nükleotidlerin dahil fırsatı sağlar. Aminoallyl-dUTP DNA Polimeraz I ile nedeniyle verimli esas seçilir I ve amin-reaktif boyalar ya da haptenler daha sonra kimyasal bağlanma için potansiyel. Bu DNaz I nickleme ve DNA polimeraz ben çeviri arasındaki doğru dengeyi elde etmek için önemlidir; çok fazla DNaz Ben, çok az çeviri başlatmak için polimeraz için yeterli rumuz üretmek değil, düşük verim ve kısa parça boyutları veren aşırı DNA sindirim neden olacaktır büyük parça boyutu ve aminoallyl-dUTP kötü dahil verir. Aşağıdaki protokol, iyi çalışır ancak farklı gruplar veya farklı üreticilerin DNAz I titre etmek için gerekli olabilir. <ol><li> 16 2 saat boyunca buz ve inkübe reaksiyon etiketleme ° C kurun Bu 0.5-1 mg nick-tercüme DNA üretmek gerektiğini ve kadar ölçeklendirilebilir. DNase I tamponu DNase I 01:30 (örneğin 0.3 U / ml) seyreltilir. </li></ol>1 &quot;&gt; <tbody><tr><td> Bileşen </td><td> Stok konsantrasyonu </td><td> Hacim veya miktar </td></tr><tr><td> BAC DNA </td><td></td><td> 5-10 mg </td></tr><tr><td> NTB tampon </td><td> 10x </td><td> 5 ul </td></tr><tr><td> DTT </td><td> 0.1 M </td><td> 5 ul </td></tr><tr><td> dNTP karışımı </td><td> 10x </td><td> 5 ul </td></tr><tr><td> Aminoallyl-dUTP </td><td> 0.5 mM </td><td> 6 ul </td></tr><tr><td> , DNA polimeraz </td><td> 10 U / ml </td><td> 1 ul </td></tr><tr><td> DNase I, </td><td> 10 U / ml </td><td> 1 ul (a 1:30 seyreltme) </td></tr><tr><td> H2O </td><td></td><td> 50 ul </td></tr></tbody></table><ol start="2"><li> Etiketli parçaları büyüklüğü kontrol etmek için bir 2% agaroz jel üzerinde 1 ul çalıştırın. Eğer jel çalıştırırken, buz üzerinde reaksiyon tutun. Başarılı nick translation ~ 1 kb (: Temsilcisi Sonuçlar bakınız KRİTİK ADIM) bazı büyük parçaları ile 150 bp ve 700 bp arasında çalışan parçaları büyük bir kısmı ile bir karalama neden olur. Gerekirse, 15-30 dakika boyunca 16 taze bir DNase I 1:30 seyreltme ve inkübe da 1 ul ° C&#39;de ilave edin. İnkübasyon süresi BAC DNA miktarı ve kalitesine göre değişir. </li><li> 10 dakika boyunca 75 ° C, ısıtılarak DNase I inaktive eder. </li><li> PCR saflaştırma kiti kullanılarak temizleme amin ile modifiye edilmiş DNA. 100 ul H 2 O içinde Zehir </li><li> 10 ul 3 M NaOAc (pH 5.2) ve 275 ul etanol ekleyerek Etanol çökelti DNA. En az 1 saat ya da gece boyunca -20 ° C&#39;de tutun. 4, 30 dakika süreyle maksimum hızda dönmeye ° C 500 ul% 70 etanol ile pelet yıkayın ve kurumaya bırakın. Bu adım, etiketleme reaksiyon engel olacak iz aminler kaldırır. 1x ilk tepki başına 6 ul H 2 O tekrar süspansiyon pelet. </li><li> Amin ile modifiye edilmiş DNA konsantrasyonu belirlemek için 1 ul kullanınmicrovolume UV spektroskopisi ile. </li></ol> 1.2. Floresan Boya Kaplin Probun fluoresan etiketleme boyanın kimyasal bağlanması ile elde edilir. Alexa Fluor süksinimidil ester, boyalar, böylece doğrudan işaretli problar, üretim, kovalent bir bağ oluşturmak üzere bir amino-modifiye allyldUTP DNA aminler ile reaksiyona girerler. Alexa Fluor 488, 555, ve 647 boyalar bu işlem için başarılı olmuştur. <ol><li> 5 ul bir hacme kadar amino-alil değiştirilmiş DNA&#39;nın 4 ug ayarlama, sıcaklık 95 ° C de 5 dakika boyunca buz üzerinde, serin ek ve 0.2 M NaHCO3 3 ul ekleyin. </li><li> Oda sıcaklığında 2 ml susuz DMSO içerisinde amin reaktif boyanın bir alikotu çözdürülür. NaHCO3, girdap, 1 saat boyunca karanlıkta oda sıcaklığında darbe spin ve inkübe ile 8 ul değiştirilmiş DNA ekleyin. </li></ol> Not: amin reaktif boyalar aşağıdaki şemaya göre birden fazla sensör etiketlemek için kullanılabilir. O zamandan beriprob nly 10-20 ng slayt etiketleme başına kullanılır, 1 mg 50-100 slaytlar için yeterli prob verir. Bu, -20 ° C de gelecekte etiketleme reaksiyonlar için amin ile modifiye edilmiş DNA saklamak da mümkündür <table border="1"><tbody><tr><td> DNA miktarı </td><td> DNA hacmi </td><td> 0.2 M NaHCO3 </td><td> Boya Cilt </td><td> Toplam </td><td> Yeter için </td></tr><tr><td> 4 x 1 ug </td><td> 1.25 ul her </td><td> 0.75 ul her </td><td> 0.5 ul her </td><td> 2.5 ul (1/4) </td><td> 50-100 slayt her </td></tr><tr><td> 3 x 1.35 mikrogram </td><td> 1.67 ul her </td><td> 1 ul her bir </td><td> 0.67 ul her </td><td> 3.34 ul (1/3) </td><td> 65-130 slayt her </td></tr><tr><td> 2 x 2 mikrogram </td><td> 2.5 ul her </td><td> 1.5 ul her </td><td> 1 ul her bir </td><td> 5 ul (1/2) </td><td> 100-200Her slaytlar </td></tr><tr><td> 1 x 4 mg </td><td> 5 ul </td><td> 3 ul </td><td> 2 ul </td><td> 10 ul (tam) </td><td> 200-400 slaytlar </td></tr></tbody></table><ol start="3"><li> 90 ul H2O ve bir PCR saflaştırma kiti kullanılarak arındırmak etiketli prob ekleyin. 100 ul 10 mMTris-Cl (pH 8.5) içinde Zehir. </li><li> Beer-Lambert denklemler (Talimatlar Alexa Fluor reaktif boyalar eşlik eden ya da online olarak bulunabilir veri sayfasında verilmiştir) kullanarak microvolume tam spektrum spektroskopisi (bkz. Şekil 2) ile prob konsantrasyonu ve etiketleme verimliliği belirleyin. 100 bp başına 3-6 boyalar içeren problar iyi çalışır. Kuruluş daha düşük derecelerde sondalar zayıf BALIK sinyalleri verebilir. Alternatif olarak, DNA olmadan% 2&#39;lik agaroz jel üzerinde 5 ul çalıştırmak leke ve bir phosphoimager kullanarak floresan boya ile birleşmesiyle kontrol edin. Bromür veya DNA boyama alternatifleri ile jel sonrası-leke ve toplam DNA işaretli DNA karşılaştırmak. </li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 2. DNA BALIK Aşağıdaki adımları ile, ilgi hücreleri slaytlar için sabit ve permeabilize. Hücresel DNA ve doğrudan etiketli probları sonra sıcak bir plaka üzerinde birlikte doğallığından ve bir ışık geçirmez nemlendirilmiş bir odasında gece melezi. 2.1. 1. Gün <ol><li> Probe Yağış Not: 1. Gün boyunca bir noktada Çökelme prob. Bu, konforlu bir şekilde hücrelerin tedaviye paralel olarak yapılabilir ve günün başlangıcında yapılabilir zorunda değildir. <ol><li> 10-20 ng doğrudan etiketli prob, 6 ul C 0 t-1 DNA (6 mg), somon testis 1 ul tek zincirli DNA (9.7 mg) karıştırın ve su ile 100 ul ses seviyesini ayarlamak. </li><li> Vorteks 10 ul 3 M NaOAc ve 275 ul EtOH, ve karışımı ekleyin. -20 ° C&#39;de en az 1 saat boyunca çökeltilmesi </li><li> 4, 30 dakika süreyle maksimum hızda mikrofüjde Spin ° C % 70 EtOH ile pelet yıkayın ve tekrar döndürebilirsiniz. Kuru peletve 5 ul deiyonize formamid içinde süspansiyon haline getirin. Işıktan korunmalıdır 1000 rpm&#39;de (termomikser üzerinde yer folyo) sallayarak ise 37 ° C de 30 dakika tekrar. </li><li> 37 dekstran sülfat karışımı 5 ul ekleyin ve 10 dakika daha sallamak ° C daha ışıktan korunmalıdır. Sadece lamel üzerine pipetleme önce ve aşağı yukarı pipet. Not: BAC probları, uygun bir seçenektir hazır kullanımlı hibridizasyon karışımı sağlanır tüm kromozom boyama probu ile birlikte kromozom boyama için. Süspanse BAC prob çöktürülmüş (C 0 ile somon testislerden t1 DNA ve tek sarmallı DNA) yukarı pipetleme ve aşağı ile 10 ul kromozom boya karışımı. 10 dakika boyunca 300-500 rpm&#39;de çalkalama sırasında 37 ° C&#39;de inkübe edin. Kromozom boya / nokta başına BAC prob karışımı 10 ul kullanın. </li></ol></li><li> Slaytlara Hücreler takılması Not: slaytlar uymak için hücreler eğilimi büyük ölçüde hücre tipine göre değişir. Her hücre tipi için, tespiten iyi ampirik zaman ve hücre yoğunluğu yerleşme. Tutarlı sonuçlar için, hücreler tek bir hücre süspansiyonu içinde olmalıdır. PBS içinde yeniden süspansiyon haline getirildi hücreleri için bu mutlaka gerekli değildir, ancak kullanım kolaylığı için daire hücreleri bölge, bir hidrofobik kalemi ile tespit edilecektir. Bir hidrofobik bariyer, slayt üzerinde yayılmasını süspansiyon engeller slayt güzel ayrılmış başına üç numune kadar tutar ve immün-FISH antikor çözüm çok küçük hacimli kullanımı için izin verir. Hücre sayıları düşük Ayrıca, tespit alanı minimumda tutulabilir. </li><li> Fare fetal karaciğer hücreleri <ol><li> Ve aşağı yukarı pipetleme PBS ve tekrar süspansiyon yaklaşık 1.5 ml her E13.5 fare fetal karaciğer toplayın. 2 dakika 3.000 rpm&#39;de mikrofuge&#39;ye Spin. Tekrar üç kez yıkar. 70 um&#39;lik bir elekten geçen yıkama, şekil hücre. 160 ul PBS içinde bir karaciğer hücreleri tekrar süspansiyon ve nokta başına 50 μ kullanın. Oda sıcaklığında 2 dakika boyunca yerleşmek için hücreler bırakın. </li></ol></li><li> Mouse ES Hücreler 1. Fare ES hücrelerinin slayt kolayca yapışmaz. Bir slayt, daire alan hücrelerin bir hidrofobik kalemi ile tespit edilecektir. Daire içine, normal kültür ortamı, pipet 80-100 ul başına 20,000-50,000 hücre süspansiyonu hazırlamak ve nemlendirilmiş bir inkübatör Not yaklaşık 3 saat boyunca monte ediniz:. Alternatif olarak, ES hücreleri slaytlar üzerinde kültüre edilebilir, ancak daha sonra oluşturacak otomatik görüntüleme engel olabilir koloniler. </li><li> Sabit Hücreler 1. Bazı deneyler kendileri tarafından slaytlar eklemek olmayan sabit hücrelerin kullanılmasını gerektirir. Bir Sitosantrifüj ile 3 dakika 300 rpm&#39;de Nazik iplik hücrelerin üç boyutlu yapısını korur ve hücrelerin düşmek yok olmasını sağlar. </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> Hücre tipi </td><td> Süspansiyon </td><td> Zaman yerleşme </td><td> Yorum </td></tr><tr><td> FareFetal karaciğer </td><td> PBS </td><td> 2 dakika </td><td> Bankta </td></tr><tr><td> Fare ES </td><td> Takviyeleri ile DMEM </td><td> 4 saat </td><td> Nemlendirilmiş bir inkübatör içinde 37 ° C </td></tr><tr><td> Fare lenfositler </td><td> PBS </td><td> 2 dakika </td><td> Bankta </td></tr><tr><td> Fare P20 germ hücreleri </td><td> Çözelti içinde saptamak </td><td> Sitospin </td><td> Bankta </td></tr></tbody></table><ol start="3"><li> 10 dakika: hücreler,% 4 PFA yavaşça daldırın slayt (davlumbaz gerçekleştirmek DİKKAT) düzeltmek için. . Hücrelerin iyi tutma (bir ipucu kutusunun kapağı örneğin 50 ml% 4 PFA) için bir tepside düz slayt Not hücreleri Fix: Bu adım slaytlara eki önce sabit hücreler için geçerli değildir. </li></ol> Tüm sonraki basamaklar, 50 ml veya 100 ml Coplin kavanoz kullanın. Kavanoz arasında slayt taşırken hücreleri kazımak için dikkat edin. <ol start="4"><li> 0.1 M Tris-C QuenchL, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca pH 7.4 &#39;. </li><li> % 0,1 &#39;lik hücre geçirgenliği saponin/0.1% Triton, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca PBS içinde X-100. </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca PBS içinde iki kez yıkayın. </li><li> .% 20 gliserol / oda sıcaklığında PBS Note en az 20 dakika süreyle inkübe edilir: Bu noktada, slaytlar, en az birkaç hafta içinde -20 ° C&#39;de% 50 gliserol / PBS içinde saklanabilir. Bu sinyal kuvveti 9 artışa günde en az bir sonuç için, depolama gözlenmiştir. . Not devam etmeden önce oda sıcaklığında 20% gliserol / PBS içinde yeniden kalibre: Bu sondalar (2.1.1) tetikleyici başlatmak için uygun bir noktadır. </li><li> 3x dondurma / sıvı azot içinde çözülme. Küçük bir Dewar kullanılarak sıvı azot içinde bir seferde bir slayt daldırın. Birkaç saniye ve karakteristik bir patlama sesi sonra geri ve defrost için kağıt havlu üzerine yer. Tekrar dondurmak sonra kaybolur opak dondurulmuş gliserol bekleyin. En fazla 15 slayt üç donma / çözülme döngüsü için rotasyon rahatça yapılabilir. </li><li> WOda sıcaklığında 5 dakika boyunca iki kez PBS içinde kül. </li><li> Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 0.1 M HCl içinde inkübe edin. </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca PBS içinde yıkanır. </li><li> Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca% 0.5% Triton saponin/0.5 X-100/PBS olarak geçirgenliği. </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca PBS içinde iki kez yıkayın. </li><li> , Oda sıcaklığında en az 10 dakika boyunca% 50 formamide/2x SSC dengelenmesi. </li><li> Bir lamel üzerine pipet prob. Kavanoz slayt çıkarın ve bir kağıt havlu ile hücre nokta (lar) etrafında herhangi bir aşırı sıvı kapalı kuru. Formamid çabuk kurur gibi, hücrelerin kurumasına dikkat edin. Iki ya da üç hücre noktalar ile slaytlar için, slaytta yer nokta x 50 mm lamel gelen bir 22 mm üzerine nokta başına prob 10 ul geçerlidir. Nokta (lar) üzerinde slayt üzerine lamel ters. Kauçuk çimento ile Seal ve bu tamamen kurumasını bekleyin. Sonraki tüm aşamalarında ışıktan koruyun. </li><li> 78 Isı slaytlar ° C sıcak bir plaka üzerinde tam 2 dakika (ters ısıtma bloğu, KRİTİK ADIM örneğin: Tartışma bakınız). Bir kapak (karton kutu ya da sim yerleştirin<html> sıcak plaka üzerinde ilar) denatürasyon sırasında ışıktan korumak için. </li><li> Bir ışık geçirmez nemlendirilmiş odası içinde 37 ° C&#39;de gece boyunca inkübe edin. , Nemlendirmek bir ışık geçirmez kutu kağıt havlu koyun ve su ile nemlendirin için. </li></ol> 2.2 2. Gün <ol><li> Sonraki yıkama adımlar için doğru sıcaklıkta çözümlerle Coplin kavanoz hazırlayın. Sonraki tüm adımları sırasında mümkün olduğunca ışıktan slaytlar koruyun. Bir kahve Coplin kavanoz için iyi bir ışık geçirmez kapak yapar olabilir. </li><li> Kauçuk çimento ve 2x SSC yer slayt kalkmasına lamelleri gevşetin ve kapalı slayt kadar. </li><li> 45 ° C&#39;de 15 dakika boyunca en az% 50 formamide/2x SSC ile yıkayın Su banyosunda yerleştirin kapak ışıktan korumak için. </li><li> 63 ° C&#39;de 15 dakika 0.2x SSC ile yıkama ° C </li><li> 45 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 2 x SSC ile yıkanır </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 2 x SSC ile yıkanır. </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca PBS içinde yıkanır. </li><li> RT&#39;de Coplin kavanoz içinde 2 dakika için DAPI (5 ug / 2x SSC mi) ile Leke. </li></ol>içerik &quot;&gt; Not: DAPI çözüm 4 saklanabilir ° 2 ay boyunca karanlıkta C. <ol start="9"><li> Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca PBS içinde destain. </li><li> Lamel monte etmek için, pipet bir lamel üzerine montaj orta. Bir nokta, ve 22 mm Çift üç sıra için x 50 mm lamelleri için 22 mm x 22 mm lamelleri kullanarak, hücre nokta başına 10 ul kullanın. Hücre nokta mümkün olduğu kadar etrafında PBS kapalı kuru ama hücrelerin kurumasına dikkat çekmek. Slayt üzerine lamel ve tırnak cilası ile mühür ters. </li></ol>

<ol><li>Chakalova, L., Debrand, E., Mitchell, J. A., Osborne, C. S., Fraser, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+and+transcription%3A+shaping+the+landscape+of+the+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Replication and transcription: shaping the landscape of the genome.</a> Nat. Rev. Genet. 6, 669-677 (2005).</li>
<li>Misteli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+the+sequence%3A+cellular+organization+of+genome+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Beyond the sequence: cellular organization of genome function.</a> Cell. 128, 787-800 (1016).</li>
<li>de Wit, E., de Laat, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+decade+of+3C+technologies%3A+insights+into+nuclear+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A decade of 3C technologies: insights into nuclear organization.</a> Genes Dev. 26, 11-24 (2012).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+Cloning%3A+A+laboratory+Manual%22">Molecular Cloning: A laboratory Manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York, USA. (2000).</li>
<li>Boyle, S., Rodesch, M. J., Halvensleben, H. A., Jeddeloh, J. A., Bickmore, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+in+situ+hybridization+with+high-complexity+repeat-free+oligonucleotide+probes+generated+by+massively+parallel+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosome+Res%22%5BJournal%5D)">Fluorescence in situ hybridization with high-complexity repeat-free oligonucleotide probes generated by massively parallel synthesis.</a> Chromosome Res. 19, 901-909 (2011).</li>
<li>Brown, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+nuclear+proteins+together+with+transcribed+and+inactive+genes+in+structurally+preserved+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Visualizing nuclear proteins together with transcribed and inactive genes in structurally preserved cells.</a> Methods. 26, 10-18 (2002).</li>
<li>Hewitt, S. L., Yin, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RAG-1+and+ATM+coordinate+monoallelic+recombination+and+nuclear+positioning+of+immunoglobulin+loci%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">RAG-1 and ATM coordinate monoallelic recombination and nuclear positioning of immunoglobulin loci.</a> Nat. Immunol. 10, 655-664 (2009).</li>
<li>Solovei, I., Cavallo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+preservation+of+nuclear+chromatin+architecture+during+three-dimensional+fluorescence+in+situ+hybridization+%283D-FISH%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Spatial preservation of nuclear chromatin architecture during three-dimensional fluorescence in situ hybridization (3D-FISH.</a> Experimental Cell Research. 276, 10-23 (2002).</li>
<li>Solovei, I. FISH on three-dimensionally preserved nuclei. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSolovei%2C+I+%22FISH%3A+A+Practical+Approach%22">FISH: A Practical Approach</a>. Beatty, B., Mai, S., Squire, J. , Oxford University Press. Oxford, UK. (2002).</li>
<li>Krueger, C., King, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pairing+of+homologous+regions+in+the+mouse+genome+is+associated+with+transcription+but+not+imprinting+status%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Pairing of homologous regions in the mouse genome is associated with transcription but not imprinting status.</a> PLoS One. 7, e38983(2012).</li>
<li>Solovei, I., Cremer, M. 3D-FISH on Cultured Cells Combined with Immunostaining. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSolovei%2C+I+%22Fluorescence+in+situ+hybridization+%28FISH%29%3A+Protocols+and+Applications%22">Fluorescence in situ hybridization (FISH): Protocols and Applications</a>. Bridger, J. M., Volpi, E. V. , Humana Press. New York, New York, USA. (2010).</li>
</ol>

Bu makale üretimi kısmen Carl Zeiss ve MetaSystems sponsor oldu.

3D DNA FISH çekirdeğinde mekansal düzenlemeleri analiz etmek için yaygın olarak tanınan bir araç haline gelmiştir. FISH gibi her tekniği ile, görsel ve doğrudan sonuçlar sağlarken, biri kendi sınırlarının farkında olması gerekir. DNA BALIK nispeten sert tedaviler sonuçta analiz edilecek nükleer yapı-çok şey bozan FISH probları için kromatin erişilebilir yapmak için gerekli olduğu doğal sorunla karşı karşıya. Çeşitli stratejiler erişilebilirlik ve yapı koruma dengelemek için takip edilmiştir. Burada açıklanan protokol, kromozomal DNA prob hibridizasyon önce hücreleri ve ısı denatürasyonunun donma-çözülme permeabilization erişilebilir yapılır. Solovei, et al., (2002) benzer tedavi sonrası yapısal değişiklikler analiz ve kromatin etki ortalama yer değiştirme genom 8 kabaca 1 Mb bölgelere yapısal analiz çözümü sınırlar 300 nm olduğunu bulundu. Bu yüksek çözünürlük olmasa da, bunükleer pozisyonunun analiz edilmesi için makul bir ölçektir. FISH analizi için daha pratik göz bu görüntü elde etme ve nükleer mesafeleri ölçümleri analiz edilebilir çekirdeklerin sayısını sınırlamak zaman alıcı süreçleri vardır. Biz yüksek kapasiteli otomatik görüntüleme yapmak amacıyla seyrek olayları incelemek için. Daha sonra, yerde uygun kontroller ile, yeterli sayıda mekansal ilişkilerin sağlam istatistiksel analiz sağlamak için karşılaştırılabilir. Biz rutin olarak biz nükleer hacmi içinde bütün FISH sinyallerinin 3D koordinatlarını belirleyen için veri noktası başına 600 çekirdek analiz. Bu veriler çok az depolama alanı gerektirir ve arası ve içi allelik mesafeler, ya da daha sonraki herhangi bir noktada radyal pozisyonların analizi için izin verir. Ayrıca, otomatik işleme büyük ölçüde bilinçsiz önyargı olasılığını azaltan bir araştırmacı kör bir şekilde yapılabilir. Yüksek verimlilik analizi çalışan bu tür etkinleştirmek için, amacımız DNA FISH yerine hızlı ve verimli bir şekilde kurmaktı edilir. Biz protokol sürekli düşük arka plan ile parlak sinyalleri üreten, son derece sağlam olması için burada açıklanan bulundu. Bu biz slayt hücrelerin bağlama adım adapte sağlanan çalıştığımız tüm hücre tipleri için çalıştı. Ayrıca, bir istisna dışında, biz kullanılan tüm BAC&#39;ler parlak probları haline olabilir. Biz de başarıyla DNA BALIK sonra antikor boyama ile nükleer proteinlerin bir dizi tespit ettik. Bu iyi çalışıyor bazı proteinler için, biz IF ve DNA immün BALIK (11 karşılaştırın) arasındaki antikor boyama desen tutarlılığı sağlamak için geleneksel immünofloresan (IF) ile karşılaştırılması tavsiye ederiz. Genel olarak, farklı renklerde etiketli sondalar, aynı sonuçlar bulundu. Etiketleme boya seçerken Ancak, aşağıdaki hususları dikkate alınmalıdır. İlk olarak, fluorofor renk mikroskop u kadar, algılanabilir olması gerekmektedirsed. İkinci olarak, florofor tarafından yayılan ışığın dalga boyu, diğer kanalın içine akmasını önlemek için yeteri kadar farklı olmalıdır. Bu mikroskop filtre bağlıdır. Ve üçüncü, en azından bizim ellerde, bazı renkler daha tutarlı diğerlerinden daha parlak sinyalleri üretmek. Biz her zaman probları etiketleme için iyi seçimler Alexa Fluor 555 (kırmızı), 488 (yeşil) yapan bir karşı olarak DAPI (mavi) kullanılır ve 647 (en kırmızı) var. Bizim görüntüleme sistemi ile, Alexa Fluor 488 (yeşil) takip parlak sinyalleri, üretmek için Alexa Fluor 555 (kırmızı) bulundu. Alexa Fluor 647 (en kırmızı) bu insan gözü tarafından tespit edilemez ve mikroskop aşağı ararken bu nedenle sinyal görülebilir dezavantajı vardır. Iki renkli FISH yapıyor eğer Böylece, biz kırmızı ve yeşil boya kombinasyonu tavsiye. Iki temel sorun ortaya çıkabilir: hücreler slaytlar ve zayıf sinyaller yıkama. De hücre slayt bağlı Nasıl derece değişken betw olduğunueen hücre tipleri ve hücrelerin tespit edilmesi gerekmektedir / tohum yerleşmek için en iyi protokolü. Biz başarıyla kullanmış ya pozitif yüklü veya Poli-L-lisin kaplı slaytlar (kullanıma hazır aldım), ama hücreler genellikle Poli-L-lisin kaplı slaytlar daha iyi yapıştırılır bulundu. Ayrıca hücreleri otomatik görüntüleme engel oldu ise çok yoğun tüm alanlarda, bir yaprak gibi soyulabilir mi vardı hücreleri çok seyrek olsaydı bulundu. Örnek çok değerli değilse Böylece, farklı hücre sayıları ideal yoğunluğu belirlemek için numaralı seribaşı edilmelidir. Hücreler yıkayın özellikle yatkındır ise, hidrofobik bir bariyer kalem kullanılabilir ve balık adımları dikkatli bir şekilde doğrudan slayt üzerine çözümler pipetleme ile gerçekleştirilebilir. Pipetleme da büyük ölçüde ihtiyaç duyulan reaktif hacimleri azaltır, ancak birden çok slayt yaparken biraz daha uzun sürebilir. Zayıf sinyalleri genellikle kötü prob nedeniyle, ve iyi olanlar içine yapım zaman yatırım değer. Temiz BAC DNA kullanmak olmalıdırtekrar çökeltme ya da ticari olarak temin edilebilen kitler ile elde edilebilir, başlangıç ​​malzemesi olarak d. Bakteriyel genomik DNA ile kirlenme negatif hücre parçalama sırasında prob kalitesi ve dikkatli bir şekilde ele etkiler ve hücre lizatı filtreleme minimumda tutmak için gereklidir. Bu büyük ölçüde verimi azaltır gibi, ancak, lineer DNA sindirimi bir eksonükleaz kullanmak adım gerekli değildir. Prob verimli etiketleme çok önemlidir. Bu adım için en önemli kalite kontrol (Temsilcisi Sonuçlar bakınız) nick çeviri sonra parça boyutu kontrol ediyor. Bir &#39;iyi&#39; smear hemen hemen her zaman parlak renkli bir prob neden olacaktır. Bununla birlikte, zaman zaman, belirli bir BAC, iyi bir prob içine işlenmiş ve farklı bir BAC seçilmiş olması gerekir edilemez olduğunu bulduk. Bir diğer önemli adım ısı denatürasyon olduğunu. Eğer sıcaklık çok düşükse, DNA yalnızca kısmen denatüre olacaktır ve prob hibridizasyon bozulur. Sıcaklığı çok yüksek ise, nükleer yapı wigereğinden fazla tedirgin olacak. Bizim ellerde, ters bir sıcak blokta 78 ° C ideal bir uzlaşma, ancak bu kullanılan ilgili sıcak blok bağlı olarak değişebilir. Biz Vectashield montaj orta kullanarak iyi sonuçlar vardı, ama Slowfade Altın daha az arka planı ve daha uzun süre floresan sinyal korur bulduk. Bu 3D yapısını etkileyen ve zaman içinde hava kabarcıkları oluşturmak için bulduğumuz gibi biz zor-set montaj orta kullanımını tavsiye etmiyoruz. Sonuç olarak, burada tarif edilen DNA FISH protokolü ile birlikte parlak bir flüoresan işaretli problar doğrudan biyolojik soruları geniş bir yelpazede için geçerlidir nükleer mimari sağlam ve çabuk bir analiz için bir çözüm sunar.

In situ hibridizasyon DNA floresan (DNA FISH) hücre döngüsünün tüm aşamalarında bireysel gen loci, subchromosomal etki alanları ve hatta tüm kromozom üç boyutlu görselleştirme sağlar. 3D BALIK yoğun interfaz sırasında genomu ve fonksiyonunun mekansal organizasyon (orada 1,2 ve referanslar) arasındaki ilişkiyi araştırmak için kullanılmıştır ise 2D BALIK metafaz çalışmaları için kullanılır. Tarihsel olarak, ortak ilişkilendirme çalışmaları FISH bireysel loci yüzlerce onlarca soruşturma ile yapıldı. Bu 4C ve Hi-C gibi daha yakın zamanda güçlü yüksek verimlilik 3C-tabanlı teknikler farklı lokus binlerce arasındaki moleküler çapraz konuşma soruşturma izin, 3 geliştirilmiştir. 3C-tabanlı teknikler ve DNA FISH tamamlayıcı yöntemler olabilir, onlar mutlaka aynı soruları cevap yok. 3C tabanlı yöntemler bir probabil sonuçlanan, karışık hücre popülasyonlarının bir topluluk okuma sağlamakortak dernekler için Sığ. Buna karşılık, verim düşük ise, BALIK tabanlı teknikler gelişim veya hücre döngüsü aşamalarında göre tek tek hücrelerin içinde loci ya da kromozom mekansal düzenlemeleri analiz imkanı sunuyoruz. Bu nedenle, BALIK nükleer yapı-işlev ilişkileri sondalama için önemli bir araç olmaya devam edecektir. Başarılı 3D BALIK deneyler iki önemli hususlar vardır. Bunlar; 1. en iyi şekilde işaretli problar ve 2 elde edilmektedir. fiksasyon, öncesi ve sonrası-hibridizasyon adımları, prob hibridizasyon için yeterince erişilebilir DNA yaparken mümkün olduğu kadar nükleer morfolojisi korumak için de dahil olmak üzere hücresel tedaviler, seçimi. Verimli prob etiketleme FISH için çok önemlidir. Geleneksel olarak, takma yapıldı hapten veya fluorofor konjuge nükleotid 4 ya da tanıtmak için kullanılmıştır. Benzer şekilde, ticari nick-çeviri kitleri doğrudan hapten veya fluorofor dahil, met için kullanılabilirT, iki adımlı bir etiketleme için aminoallyl nükleotidler ve amin-reaktif boyalar kullanılarak. İkinci DNA polimeraz ile çalışmak için daha az hacimli molekülü vererek daha verimli boya dahil vermektedir. Daha yakın zamanlarda, DNA, enzimatik olmayan etiketleme için kitler de nükleik asitlere platin koordinatif bağlama yararlanma de geliştirilmiştir. FISH probları bile zaten 5 etiketli satın alınabilir. Kitleri ve ticari olarak üretilen probları şüphesiz kullanım kolaylığı verirken, onlar oldukça içi problar tek tek bileşenler satın alma ve üretim daha pahalı. Biz doğrudan doğruya birden fazla renkte birçok farklı BAC prob etiket için düşük maliyetli bir nick çeviri protokolü optimize edilmiş. Biz çok saf BAC DNA elde 10 ile karşılaştırıldığında, FISH slayt başına prob sadece 10-20 ng için bir gereklilik kritik ve sonuçları olduğunu keşfetti - 20 kat daha kirli DNA kullanıldığında, büyük sonuçlanan maliyet ve zaman- tasarruf. Amino-allyldUTP bölgesinin kullanımı esnek etiketleme sağlar:kullanılabilir amin-reaktif boyalar (örneğin Alexa Fluor veya Cy-boyalar) veya haptenler (örneğin biotin, digoxigenin) ile sondalar. Hapten etiketli probları sinyal yükseltmek ve görselleştirmek için fluorofor-konjuge antikor veya streptavidin tarafından tespit edilir. Parlak doğrudan etiketli probları genellikle daha az arka plan boyama göstermek ve dolayısıyla nükleer lokalizasyon ve odağı morfolojisinin daha doğru bir şekilde temsil sonuçlanan, sinyallerin aşırı amplifikasyon kaçının. NaOH denatürasyon, HCl denatürasyon ile formaldehit tespit ile glutaraldehit tespit ve ısı denatürasyon ile formaldehit tespit 6-9: Farklı fiksatif, ön işlemler, ve post-hibridizasyon yıkar kullanabilirsiniz ancak bu genellikle aşağıdaki kategoriye ayrılır birkaç farklı FISH teknikler vardır . Bunların her biri, avantajları ve dezavantajları vardır. Glutaraldehyde sabitleme iyi nükleer yapısal korunması sonuçları, fakat en aza indirmek için indirgeyici ajanlar ile tedavi gerektirirOrtaya çıkan otofloresans, ve NaOH tedavi dikkatli bir şekilde yeterli bir DNA&#39;nın denatürasyonu ve nükleer yapı 6&#39;ya potansiyel zarar dengelemek için kontrol edilmesi gerekmektedir. Formaldehit tespit nükleer mimari pertürbasyonların bir artış olasılığı veren daha az güçlü, ama aynı zamanda tipik olarak daha güçlü ve daha güvenilir sinyalleri ve 9 otofloresans düşük verir. HCl tedavisi problar için DNA kolay erişim sağlayan, proteinlerin DNA ve şeritler depurinates, aynı zamanda DNA kırıkları tanıtmak olabilir. Isıtma fiziksel olarak iyi hedef hibridizasyon ve güçlü sinyaller ile sonuçlanan iki DNA ipliklerini ayıran ama nükleer yapı 8 bazı pertürbasyon neden olabilir. Bu tekniklerin her biri protein epitoplannın etki eden derecesi deneysel olarak her bir protein immüno-FISH deneylerde kullanılmak üzere uygun protokol belirlemek için gereksinimi ile sonuçlanan, yaygın olarak 6,9 arasında değişir. Hayır &#39;mükemmel&#39; DNA FISH te varkeniyi bir şekilde kontrol eğer NİK, hepsi yararlı olabilir. Amacımız, en güvenilir sinyalleri için ısıtma yöntemi odaklanarak, hücre tipi 10, çeşitli çoklu noktaların uzaysal konumunu araştırmak için sağlam ve tekrarlanabilir DNA FISH için bir protokol optimize etmek için yapıldı. Bu ve otomatik bir görüntüleme sisteminin kullanımı ile, nükleer düzenlemelerin tek bir hücre analizi için verim artırmaya yönelik.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reaktif/Malzeme</td></tr><tr><td>NTB tamponu</td><td></td><td></td><td>Adım 1.1.1 (Aşağıdaki 'FISH tamponları ve reaksiyon karışımları' listesine bakın)</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Invitrogen</td><td>D-1532</td><td>Adım 1.1.1</td></tr><tr><td>dNTP'ler</td><td>Bioline</td><td>BIO-39025</td><td>Adım 1.1.1 (Aşağıdaki 'FISH tamponları ve reaksiyon karışımları' listesine bakın)</td></tr> <tr><td>Aminoallil-dUTP</td><td>Ambion</td><td>AM8439</td><td>Adım 1.1.1</td></tr><tr><td>DNA Polimeraz I</td><td>New England Biolabs</td><td>M02095</td><td>Adım 1.1.1</td></tr><tr><td>DNase I rekombinant RNaz içermeyen</td><td>Roche</td><td>4716728001</td><td>Adım 1.1.1</td></tr><tr><td>QIAquick PCR saflaştırma kiti</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>Adım 1.1.4, 1.2.3</td></tr><tr><td>NaOAc</td><td>VWR</td><td>27653</td><td>Adım 1.1.5, Adım 2.1.1.2</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td>Adım 1.2.1</td></tr><tr><td>Mikroarray Uygulamaları için Alexa Fluor Reaktif Boya Decapack'leri</td><td>Invitrogen (Moleküler Problar)</td> <td>A32750, A32756, A32757</td><td>Adım 1.2.2</td></tr><tr><td>DMSO (susuz) </td><td>Sigma Aldrich</td><td>276855</td><td>Adım 1.2.2</td></tr><tr><td>SYBR Güvenli DNA jel lekesi</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>S33102</td><td>Adım 1.2.4 (etidyum bromüre alternatif)</td></tr> <tr><td>Cot-1 DNA</td><td>İnvitrogen</td><td>18440-016</td><td>Adım 2.1.1.1 (Cot-1 DNA'sı büyük miktarlarda ev yapımı olabilir ve aynı şekilde çalışır)</td></tr><tr><td>Somon testislerinden tek sarmallı DNA </td><td>Sigma</td><td>D7656</td><td>Adım 2.1.1.1</td></tr><tr><td>Deiyonize formamid</td><td>Sigma</td><td>F-9037</td><td>Adım 2.1.1.3 (Sağlık tehlikesi)</td></tr> <tr><td>Dekstran sülfat</td><td>Sigma Yaşam Bilimleri</td><td>D8906</td><td>Adım 2.1.1.4 (Aşağıdaki 'FISH tamponları ve reaksiyon karışımları' listesine bakın)</td></tr> <tr><td>XMP boyama probları</td><td>MetaSystems</td><td>000000-0528-837</td><td>Adım 2.1.1.4 </td></tr><tr><td>Poli-L-lizin kaplı slaytlar</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P0425</td><td>Adım 2.1.2</td></tr><tr><td>Hidrofobik kalem (ImmEdge)</td><td>Vektör Laboratuvarları</td><td>H-4000</td><td>Adım 2.1.2</td></tr><tr><td>70 &mu; m elek (Fare f&#8211; BD</td> <td>Falcon</td><td>352350</td><td>Adım 2.1.2.1</td></tr><tr><td>PFA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6148</td><td>Adım 2.1.3 (Yanıcı, aşındırıcı, akut toksisite, sağlık tehlikesi) (Aşağıdaki 'FISH tamponları ve reaksiyon karışımları' listesine bakın)</td></tr> <tr><td>Tris-Cl</td><td></td><td></td><td>Adım 2.1.3 (Aşağıdaki 'FISH tamponları ve reaksiyon karışımları' listesine bakın)</td></tr> <tr><td>Quillaja kabuğundan saponin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>47036</td><td>Adım 2.1.4, 2.1.11 (Akut toksisite), (Aşağıdaki 'FISH tamponları ve reaksiyon karışımları' listesine bakın)</td></tr> <tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td>Adım 2.1.4, 2.1.11 (Akut toksisite, çevre için tehlikeli)</td></tr><tr><td>10 x PBS</td><td>Yaşam Teknolojileri (GIBCO)</td><td>70011-036</td><td>Adım 2.1.4, 2.1.5, 2.1.6, 2.1.8, 2.1.10, 2.1.11, 2.1.12, 2.2.7, 2.2.9, </td></tr><tr><td>Gliserol</td><td>Fisher Scientific</td><td>G/0650</td><td>Adım 2.1.6</td></tr><tr><td>HCl</td><td>VWR</td><td>20252</td><td>Adım 2.1.9 (Akut toksisite, aşındırıcı)</td></tr><tr><td>Formamid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>47670</td><td>Adım 2.1.14, 2.2.3 (Sağlık tehlikesi)</td></tr><tr><td>SSC</td><td></td><td></td><td>Adım 2.1.14, 2.2.2-2.2.6, 2.2.8 (Aşağıdaki 'FISH tamponları ve reaksiyon karışımları' listesine bakın)</td></tr><tr><td>Lameller 22 x 22</td><td>Menzel-Glaser</td><td>BB022022A1</td><td>Adım 2.1.15</td></tr><tr><td>Lameller 22 x 50</td><td>Menzel-Glaser</td><td>BB022050A1</td><td>Adım 2.1.15</td></tr><tr><td>Kauçuk çimento</td><td>Marabu</td><td>2901 (10 000)</td><td>Adım 2.1.15 (Yanıcı, sağlık tehlikesi, çevre için tehlike)</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen Moleküler Problar</td><td>D3571</td><td>Adım 2.2.8 (Sağlık tehlikesi)</td></tr><tr><td>SlowFade Gold</td><td>Invitrogen</td><td>S36936</td><td>Adım 2.2.10 (montaj ortamı)</td></tr><tr><td>Şeffaf oje</td><td>Herhangi bir tedarikçi</td><td></td><td>Adım 2.2.10</td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>Nanodrop 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Adım 1.1.6, 1.2.4 (mikrohacim spektroskopisi)</td></tr><tr><td>Typhoon FLA 7000 fosfo görüntüleyici</td><td>GE Yaşam Bilimleri</td><td></td><td>Adım 1.2.4</td></tr><tr><td>Coplin kavanozları</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6016 (6EA)/S5516 (6EA)</td><td>Adım 2.1.3 ve sonrası</td></tr><tr><td>Sıvı nitrojen dewar </td><td>Herhangi bir tedarikçi</td><td></td><td>Adım 2.1.7</td></tr><tr><td>Siyah Kapaklı Taban (hafif geçirmez hazne)</td><td>Simport</td><td>M920-2</td><td>Adım 2.1.17</td></tr><tr><td>Termomikser konforu</td><td>Eppendorf</td><td>5355 000.011</td><td>Adım 2.2.3 (veya 37 &° C'de çalkalayıcı kullanın; C odası)</td></tr><tr><td colspan="4">Görüntüleme ve Görüntü işleme</td></tr><tr><td>Metafer - Görüntüleme Otomasyon Platformu</td><td>MetaSystems</td><td></td><td>otomatik görüntüleme yazılımı</td></tr><tr><td>MetaCyte - Otomatik Fazlar Arası FISH analizi</td><td>MetaSystems</td><td></td><td>otomatik görüntüleme yazılımı</td></tr><tr><td>Axio Imager Z2 otomatik</td> görüntüleme ile kullanılan dik <td>Zeiss</td><td></td><td>epifloresan mikroskobu</td></tr><tr><td>IX81 konfokal mikroskop (FV1000)</td><td>Olympus</td><td></td><td>konfokal mikroskop</td></tr><tr><td>Bitplane, versiyon 7.3</td><td>Imaris</td><td></td><td>görüntü analizi ve 3D modelleme yazılımı</td></tr><tr><td>Bilimsel hacim Görüntüleme, versiyon 4.1</td><td>Huygens</td><td></td><td>görüntü analizi ve evrişim çözme yazılımı</td></tr><tr><td colspan="4"> FISH tamponları ve reaksiyon karışımları <table border="1"> <tbody> <tr> <td>Name</td> <td>Composition</td> <td>Comments</td> </tr> <tr> <td> 10 x NTB tamponu</td> <td>0.5 M Tris-HCl, pH 7.5</td> <td></td> </tr> <tr> <td></td> <td>0.05 M MgCl2</td> <td></td> </tr> <tr> <td></td> <td>0.5 mg/ml BSA</td> <td></td> </tr> <> <trtd>dNTP Mix</td> <td>0.5 mM dGTP</td> <td>Store 50 &mu; l alikotlar -20 &°C'de; C</td> </tr> <tr> <td></td> <td>0.5 mM dATP</td> <td></td> </tr> <tr> <td></td> <td>0.5 mM dCTP</td> <td></td> </tr> <tr> <td></td> <td>0.125 mM dTTP</td> <td></td> </tr> <tr> <td>4 % PFA</td> <td>PBS'de 4 g/100 ml PFA ağırlığında ve 62 ° C'ye ısıtın. Kalan PFA'yı çözmek için pH'ı NaOH ile 7.0'a ayarlayın.</td> <td>50 ml alikotları -20 °C'de saklayın; C, tekrar dondurmayın< / td / > < / tr > < tr > < td >% 2 saponin çözeltisi< / td > <td > 100 ml PBS başına 2 g saponini uzun süre karıştırarak çözün. NaOH ile çözün ve pH'ı 7.0'a ayarlayın. ddH20 ve otoklav ile 1 l'ye getirin. </td> <td> 5 ml alikotları -20 °C'de saklayın; C</td> </tr> <tr> <td>20 x SSC</td> <td>175.3 g NaCl ve 88.2 g sodyum sitrat ağırlığında ve 80 ml ddH20'ye ekleyin. NaOH ile çözün ve pH'ı 7.0'a ayarlayın. ddH20 ve otoklav.</td> <td></td> </tr> <tr> <td>Dekstran sülfat karışımı</td> <td>20 x SSC tamponunda %20 dekstran sülfat ile 2 l'ye getirin; Çözeltiyi girdap haline getirin ve gece boyunca bir külbütör üzerinde karıştırın.</td> <td>Store 500 &mu; l alikotlar -20 &°C'de; C</td> </tr> </tbody> </tablo> </td></tr></tbody></table>

doğrudan etiketli problar kullanarak sağlam 3d dna balik

Robust 3D DNA FISH Using Directly Labeled Probes

3D DNA FISH çekirdeğin üç boyutlu organizasyon analiz için önemli bir araç haline gelmiştir ve tekniğin çeşitli varyasyonları yayınlanmıştır. Bu yazıda sağlamlık, tekrarlanabilirlik ve kullanım kolaylığı için optimize edilmiş bir protokol açıklar. Parlak floresan doğrudan etiketli probları boya kimyasal bağlantı takip amino-allyldUTP ile nick-çeviri tarafından oluşturulur. 3D DNA BALIK hücre geçirgenliği için bir donma-çözülme adım ve prob ve nükleer DNA eşzamanlı denatürasyonu için bir ısıtma aşaması kullanılarak gerçekleştirilir. Protokol hücre tipleri, bir dizi ve problar, çeşitli (BAC&#39;ler, plazmidleri, fosmids veya bir bütün olarak Kromozom Boyalar) uygulanabilir ve yüksek verimli otomatik görüntüleme için izin verir. Bu yöntemle rutin üç kromozom bölgelerine kadar nükleer lokalizasyon araştırmak.

Burada açıklanan protokol (genel bakış için Şekil 1) genomik organizasyonu analizi için yüksek verimli görüntü yakalama ile DNA FISH birleştirmek için büyük etkisi için kullanılmıştır. Kaliteli prob nesil (Tartışma) başarısı için çok önemlidir. Şekil 2 FISH probları için iki önemli kalite kontrolleri göstermektedir. Nick-çeviri sonra, DNA bir karalama 150 ila 700 bp (Şekil 2A) çalışan parçaları büyük bir kısmı görünür olmalıdır. Kimyasal Birleştirmeden sonra, floresan boya dahil prob spektroskopik analizi (Şekil 2B) ile ölçülür edilebilir. Iyi bir prob kullanıldığında, söz konusu DNA FISH protokolü takip edilerek, genellikle düşük arka plan üzerinde parlak bir DNA FISH sinyalleri ile sonuçlanır. Biz başarıyla farklı hücre tipleri çeşitli bu protokol kullanılır ve epi-floresan veya konfokal mikroskoplar biriyle var. Bir epi-fluorescenc kullanarak otomatik görüntülemekonfokal mikroskopi daha yoğun sinyalleri gerektirir ise e mikroskop, biraz arka plan (Şekil 3) ile keskin, kolayca tanımlanabilir FISH sinyalleri gerektirir. Şekil 4A temsilcisi işlenmiş görüntüleri gösterir. BALIK sinyallerinin Nükleer koordinatları elde edilebilir, ve genomik bölgelere uzamsal ilişkileri (örnek için bkz Şekil 4B) hesaplanabilir. Biz de onların kromozom topraklarında BALIK sinyallerin 3D modelleme (Film 1) için konfokal mikroskobu ile elde edilen görüntü yığınlarının kullandık. <img alt="Şekil 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50587/50587fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50587/50587fig1.jpg" /> Şekil 1. Prob etiketleme ve DNA FISH için iş akışı. Probe hazırlık mavi gösterilmiştir. DNA FISH prosedürü yeşil verilen ayrıntıları ile siyah gösterilir. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page= &quot;Her zaman&quot;&gt; <img alt="Şekil 2," fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50587/50587fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50587/50587fig2.jpg" /> Şekil 2. Nick-çeviri ve etiketli prob kalite kontrol yoklamaları Etiketleme. DNA merdiveni, şerit 2 ve 3: nick-çeviri sonra BAC&#39;ler) A) Jel DNaz I (şeritli 1 inaktive ısıtma önce ideal bir smear gösteren. Parçaları 150-700 bp aralığında olmalıdır. ~ 1 kb ek bir smear sık başarılı nick-çeviri reaksiyonları ile görülmektedir. Etiketli prob B) Microvolume tam spektrum analizi. Alexa Fluor 488: 495 nm, Alexa Fluor 555: 555 nm, Alexa Fluor 647: 650 nm 260 nm &#39;de bir DNA tepe probu ile etiketlenmiş olan fluorofor soğurma dalga boyuna karşılık gelen ikinci bir tepe noktası ile görülmektedir. Gösterildiği iyi eklenmesi ile üç problarıdır: florofor absorbans pikleri benzer bir boy veya DNA&#39;nın tepe noktalarından daha yüksektir. Alexa Fluor 647 genellikle daha yüksek absorbansıda Alexa Fluor 488 daha yüksek absorbansı Alexa Fluor 555, daha. Alexa Fluor 488 de dolayısıyla bu prob için ilk zirve diğerlerinden daha yüksek olduğu, 260 nm dalga boyunda ışık emer. Kötü birleşme gösterisi fluorofor absorbans ile prob DNA absorbans daha düşük 2-3-katlayın. DNA tepe daha 2 kat daha yüksek fluorofor tepe daha ile probları genellikle FISH arka plan neden olabilir indirekt boya içerir. <img alt="Şekil 3," fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50587/50587fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50587/50587fig3.jpg" /> Şekil 3,. Tipik bir üç renkli FISH deney gösteren MetaCyte 3D FISH görüntüleme yazılımından ekran görüntüsü. Ekran birkaç bölüme ayrılmıştır. Metafer / MetaCyte slayt tarama sistemi tarafından yakalanan A) Ham alan-of-view (FOV) görüntü. B) Galeri un sahip tespit çekirdek görüntüleriBALIK sinyaller için dergone görüntü işleme ve segmentasyon. Veri çeşitli her galeri resim görüntülenebilir. Tarafından taranan alanı ile slayt analizi. D belirlenen çekirdek sayısı ile bu örnekte hücre sayısı çeşitli interallelic ve interlocus mesafeleri sağ üst ve her bir görüntü altında iki tarafında sol üst gösterilir. C) Slayt adı) Tasvir Taranan alanın sistemi. E) Genişleme. Beyaz noktalar FOV başına tespit çekirdekleri temsil eder. F) İşlenmiş veriler. Bu örnekte yeşil sinyalleri (üstte) ve kırmızı sinyaller (alt) arasında maksimum interallelic mesafeler gösterilmiştir. Gösterilen veriler fare P20 germ hücrelerinden olduğunu. Problar Hbb ve HBA gen ve bir histon küme kapsayan farklı kromozomlar üzerinde yer almaktadır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50587/50587fig3large.jpg" target="_blank">büyük rakam görmek için buraya tıklayın</a> . <p class="jove_content" fo:keep-together. Içinde-page = &quot;her zaman&quot;&gt; <img alt="Şekil 4," fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50587/50587fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50587/50587fig4.jpg" /> Şekil 4. Işlenmiş görüntüler ve elde edilen konumsal veri örnekleri. Myc ve Kcnq1 genler (sırasıyla myc ve KvDMR, renkli yeşil ve kırmızı, olarak adlandırılan) interallelic mesafe temsil eden. B) Tukey kutu-bıyık araziler kapsayan farklı kromozom üzerinde bulunan BAC problar ile boyandı E13.5 fare fetal karaciğer hücreleri için) İşlenmiş görüntüleri 600 çekirdekler aynı lokus için dağıtım. Interallelic mesafe nükleer boyutu değişiklikleri dikkate alacak şekilde çekirdeğin yarıçapı (mesafe / yarıçap) bir kısmını olarak çizilir. ES hücre çekirdekleri yaklaşık 5 um arasında bir yarı çapa sahiptir. (: P &lt;0.01, t-test ***) Kırmızı probları yeşil sondaları daha yakın birlikte önemli ölçüde vardır. 10 veri. Film 1. Kendi kromozom t içinde iki lokus 3D modellemeerritory. Fare kromozom 7 ya da sonuna kadar yakınında bulunan iki BAC işaretli prob (kırmızı ve çok kırmızı, (sözde beyaz renkli)) ve fare ES hücrelerinin bir bütün kromozom boya (yeşil) ile birlikte melez edildi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50587/50587movie1.mov" target="_blank">filmi görmek için buraya tıklayın</a> .

Biz doğrudan etiketli floresan problar kullanarak 3D DNA FISH ile nükleer mimarisi analiz için sağlam ve çok yönlü protokol açıklar.

Doğrudan Etiketli Problar kullanarak Sağlam 3D DNA BALIK

3D DNA FISH has become a major tool for  analyzing three-dimensional organization of the nucleus, and several variations  of the technique have been ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, tekil hücrelerdeki spesifik genomik lokusların uzaysal organizasyonunu sağlam bir yöntemle incelemektir. Bu, öncelikle ilgilenilen genomik bölgeye bağlanarak orayı işaretleyecek olan floresan işaretli probların üretilmesiyle gerçekleştirilir. Sonraki adımlar, probların erişimine izin vermek amacıyla ilgilenilen hücrelerin bir lam üzerine yapıştırılması, fikse edilmesi ve permeabilize edilmesidir.Ardından, probun ve hücresel DNA'nın eş zamanlı ısı denatürasyonu, spesifik olmayan şekilde bağlanmış probların uzaklaştırılması için gece boyunca süren prob hibridizasyon yıkama basamakları ve ardından dpi ile karşı boyama ile takip edilir. Hücre çekirdeği sonuçlarını görselleştirmek için floresan mikroskopi kullanılacak ve bu işlem nihayetinde spesifik genomik bölgelerin kapladığı nükleer konumu ortaya çıkaracaktır. Bu yöntem, genler arasındaki fonksiyonel etkileşimlerin belirlenmesi gibi nükleer organizasyon alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.Bu özel DNA FISH protokolünün temel avantajı; hızlı, dayanıklı ve çok yönlü olmasıdır. Bu yöntemi E Es hücrelerini kullanarak göstermiş olsak da, yöntem çok sayıda diğer hücre tipine de uygulanabilir. 100 ila 250 Kilobase boyutundaki parçalardan hazırlanan doğrudan işaretli problar tutarlı bir şekilde parlak sinyaller üretir; daha küçük problar gerekirse bunlar da kullanılabilir.40 ila 50 kilobazlık smid veya beş ila 10 kilobazlık insertler içeren plazmitler kullanın. Spesifik genlere karşılık gelen back veya smid klonlarını Ensemble veya UCSC genom tarayıcılarını kullanarak tanımlayın. Yüksek kaliteli back DNA hazırlamak için tekrarlı çöktürme veya ticari olarak mevcut bir kit kullanın; hazırlığın temizliği, gereken prob hacmi ile orantılıdır.Etiketlemeyi iki adımda gerçekleştirin. İlk olarak, amino aleli DUTP'yi tanıtmak için NIC translokasyonunu kullanın. İkinci olarak, bir AM ortalama reaktif boya bağlamak için kimyasal kenetlenmeyi kullanın.Güçlü balık sinyalleri için kritik olduklarından, parlak problar hazırlamaya zaman ayırmaya değer. Bu prosedür, hücrelerin işlenmesiyle paralel olarak gerçekleştirilebilir ve günün başlangıcında yapılması zorunlu değildir. İlk olarak, 10 ila 20 nanogram doğrudan işaretlenmiş prob, altı mikrogram için altı mikrolitre CO 1D NA ile karıştırıldı.Ardından, 9,7 µg miktarında somon testisi kaynaklı tek zincirli DNA'dan 1 µL ekleyin. Karışımın toplam hacmini su ile 100 µL'ye tamamlayın. Daha sonra, 10 µL 3 M sodyum asetat ve 275 µL etanol ekleyip vorteksleyerek karıştırın.Karışımın -20 °C'de en az bir saat boyunca çökelmesini bekleyin. Ardından, çökeleği bir mikrosantrifüjde 4 °C'de, maksimum hızda 30 dakika boyunca döndürün. Sonrasında peleti %70 etanol ile yıkayın ve 4 °C'de beş dakika boyunca tekrar santrifüjleyin.Ardından pelletin havada kurumasını bekleyin. Sonra yeniden süspanse edin. Pelleti beş µL deiyonize form içinde süspanse edin.Işıktan korumak için folyoya sararak, 1000 RPM'de çalkalarken 37 °C'de inkübe edin. 30 dakika sonra, beş µL dekstrin sülfat karışımı ekleyin ve ajitasyonla inkübasyona devam edin. 10 dakika daha sürdürün. Hücrelerin lametle yapışma eğilimi hücre tipine göre büyük farklılıklar gösterir.Her bir hücre tipi için optimum çöktürme süresini ve hücre yoğunluğunu ampirik olarak belirleyin. Tutarlı sonuçlar elde etmek için hücreler tek hücre süspansiyonunda olmalıdır. Fare ES hücrelerini bir lama yapıştırmak için, öncelikle hücrelerin damlatılacağı alanı lam üzerinde daire içine alarak işaretleyin.Hidrofobik bir kalem kullanarak, normal kültür ortamında 80 ila 100 µL başına 20 ila 50.000 hücre içeren bir süspansiyon hazırlayın, hücre süspansiyonunu dairenin içine ekleyin ve hücrelerin nemlendirilmiş bir inkübatörde yaklaşık üç saat boyunca yapışmasını sağlayın. Lam üzerine yapışma işleminden sonra, lamı 10 dakika boyunca %4 PFA içine nazikçe daldırarak hücreleri sabitleyin. Lam, bir pipet uç kutusu gibi bir tepsi içinde düz durmalıdır.Oda sıcaklığındaki reaktifler coplan kavanozlarda kullanılır. İlk olarak hücreler, tris klorür ile 10 dakika boyunca söndürülür. İkinci olarak hücreler, sapanin ve triton X 100 karışımı kullanılarak 10 dakika boyunca permeabilize edilir.Şimdi hücreleri, her yıkama için beş dakika süreyle iki kez PBS ile yıkayın. Yıkama işlemlerinin ardından hücreleri en az 20 dakika boyunca %20 gliserol içinde inkübe edin. Bu aşamada lamlar, birkaç hafta boyunca minus 20 degrees Celsius'ta %50 gliserol içinde saklanabilir.Bir gün veya daha fazla süre boyunca saklama, sinyal gücünü artırmalıdır. Devam etmeden önce hücreleri PBS içinde %20 gliserol ile oda sıcaklığına getirdiğinizden emin olun. Şimdi, sıvı azot kullanarak lamı üç kez dondurup çözün.Çatırtı sesi durduğunda her seferinde bir lam olacak şekilde ilerleyin. Birkaç saniye sonra, lamı çözülmesi için bir kağıt havlu üzerine alın; lamı tekrar dondurmadan önce opak donmuş gliserolün kaybolmasını bekleyin; üç dondurma-çözme döngüsü için rotasyonda 15 lama kadar rahatlıkla işlem yapılabilir. Şimdi lamları PBS ile her bir yıkama beş dakika sürecek şekilde iki kez yıkayın.Ardından lamları 30 dakika boyunca 0,1 molar hidroklorik asit içinde inkübe edin. Hidroklorik asit işlemini, PBS ile beş dakikalık başka bir yıkama ile takip edin. Şimdi, hücreleri daha güçlü bir saponin ve Triton X 100 karışımı ile 30 dakika boyunca tekrar permeabilize edin; sürfaktanları lamlardan temizlemek için iki adet beş dakikalık PBS yıkaması uygulayın.Slaytlar artık %50 formamid içeren XSSC içinde dengelemeye hazırdır. Bu işlem en az 10 dakika sürmelidir; dengeleme sırasında probu birkaç kez pipetle yukarı aşağı çekin ve ardından her bir hücre noktasına uygun boyuttaki bir lamıle 10 µL aktarın. Bir slaytı formamidden çıkarın ve hücrelerin etrafındaki fazla sıvıyı kağıt havluyla kurulayın, ancak hücre noktasının kurumasını önleyin.Şimdi lameli ters çevirin. Hücrelerin üzerine gelecek şekilde lamın üzerine yerleştirin. Lameli, kauçuk yapıştırıcı ile lama sabitleyin.Çimentonun tamamen kurumasını bekleyin ve lamı ışıktan koruyun. Ardından, lamları bir ısıtıcı tabla üzerinde tam olarak iki dakika boyunca 78 °C'ye ısıtın. Bu işlemin düzgün şekilde gerçekleştirilmesi kritik önem taşımaktadır.Nükleer morfolojiyi mümkün olduğunca korumak için bu adım sırasında hücreler bir örtü ile ışıktan korunmalıdır. Hücrelerin kurumasını önlemek ve ısı bloğunun doğru sıcaklıkta olduğundan emin olmak kritik önem taşır. Ardından, slaytları nem sağlamak amacıyla ıslak kağıt havlularla birlikte ışık geçirmeyen bir kutuya yerleştirin ve 37 °C'de gece boyunca inkübe edin.Bu prosedüre, lamel etrafındaki kauçuk çimentoyu soyarak başlayın. Ardından, lameller gevşeyip kayana kadar her lamı aşırı miktarda SC içerisine yerleştirin. Sonrasında, lamları %50 formamid içeren iki kat aşırı SC içerisinde, 45 °C'de 15 dakika boyunca yıkayın.Slaytları ışıktan korumak için su banyosunun kapağını kapalı tutun. Ardından slaytları 63 °C'de 15 dakika boyunca 0.2 XSSC ile yıkayın. Sonrasında 45 °C'de beş dakika boyunca iki XSSC ile ve son olarak oda sıcaklığında beş dakika boyunca fazla SE ile yıkayın.Kalan adımların tamamı oda sıcaklığında gerçekleştirilir; beş dakikalık bir PBS yıkamasıyla başlanarak lamlar iki dakika boyunca DAPI ile boyanır ve ardından lamlar beş dakika boyunca PBS ile yıkanarak boya uzaklaştırılır. Lamelini yerleştirmek için, uygun boyuttaki lamelin üzerine her bir hücre noktası başına 10 µL montaj medyumu uygulayın. Ardından, hücrelerin kurumasına izin vermeden hücre noktasının etrafındaki fazla PBS'yi kurulayın.Balık prob hazırlama protokolünü kullanarak lam üzerine kapatma camını ters çevirip yerleştirin ve tırnak cilası ile mühürleyin. NIC translasyonundan sonra, fragmanların büyük çoğunluğu 150 ve 700 baz çifti arasında olacak şekilde bir DNA yayması görülmelidir. Kimyasal eşleşmeden sonra, floresan boyanın katılımı, prob geçişinin spektroskopik analizi ile ölçülebilir.Prob kalitesini değerlendirmeye yönelik bu kalite kontrol adımları, böyle bir probun kullanımı için kritik öneme sahiptir. Epi-floresan mikroskop ile otomatik görüntüleme gerçekleştirilebilir durumdaydı. Bu işlem, düşük arka plan gürültüsüne sahip, keskin ve kolayca tanımlanabilir FISH sinyalleri gerektirir.Bu, ham bir görüş alanı görüntüsüdür. Aşağıdaki görüntüler, otomatik olarak tanımlanmış ve analiz edilmiş çekirdekleri temsil etmektedir. Çeşitli alelik arası ve lokus arası mesafeler, her çekirdeğin sağ üst köşesinde ve her iki yanında aşağıda gösterilmiştir.Bu büyütmede, beyaz noktalar görüş alanı başına tanımlanan çekirdekleri temsil etmektedir. Bu histogramlar, üstteki yeşil sinyaller ile alttaki kırmızı sinyaller arasındaki maksimum inter-alelik mesafeleri göstermektedir. Tüm veriler, HBB ve HBA genlerini ve bir histon kümesini kapsayan, farklı kromozomlar üzerinde yer alan probların kullanıldığı P 20 germ hücrelerinden elde edilmiştir.Bunlar, mic, KC ve Q1 genlerini kapsayan geri sondalarla boyanmış fetal karaciğer çekirdeklerinin örnekleridir. Bu görüntülerden, balık sinyallerinin nükleer koordinatları elde edilebilir ve genomik bölgelerin uzamsal ilişkileri hesaplanabilir. Aleller arası mesafeler, çekirdek yarıçapının bir oranı olarak grafiğe dökülmüştür.Bu verilerde kırmızı problar, yeşil problara göre birbirine anlamlı derecede daha yakındır. Daha yoğun sinyaller gerektiren konfokal mikroskopi de uygulanabilirdi. Balık sinyallerinin kromozom bölgeleri içindeki 3B modellemesi için görüntü yığınları kullanılmıştır.Kırmızı ve beyaz renklerdeki bu iki prob, fare kromozom yedilisinin uç kısımlarına yakındır; tüm kromozom boyaması yeşil renkte gösterilmiştir. Bu videoyu izledikten sonra, tek hücrelerde belirli genomik lokusların uzaysal konumlandırmasını araştırmak için DNA FISH işleminin nasıl gerçekleştirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Bu prosedürü uygularken, tüm işlemlerin nükleer mimariyi etkileyebileceğini ve bu prosedürün ardından uygun kontrollerin dahil edilmesinin önemli olduğunu unutmamak gerekir.Genler ve proteinler arasındaki uzamsal ilişkiler gibi ek soruları yanıtlamak için immüno-FISH gibi diğer yöntemler uygulanabilir.

robust-3d-dna-fish-using-directly-labeled-probes

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu yayın Agilent Balık Türleri Tanımlama Sistemi, DNA ayıklanması ve, PCR ve RFLP analizi yapan bir balık türü tanımlamak için nasıl kullanılacağı açıklanmıştır.

DNA tabanlı Balık Türleri Tanımlama Protokolü

Tüm Dağı In situ Moleküler Biyoloji ve organizma Biyoloji Link Hibridizasyon

Kanser hastalarının kanından dolaşımdaki tümör hücrelerinin (CTC) izolasyonu ve karakterizasyonu, invaziv olmayan bir sıvı biyopsi türüdür ve nüks ve hastalığın ilerlemesi ile ilişkilidir. Bu video, ilgilenilen belirli bir geni incelemek için tıbbi bir tel üzerinde yakalanan CTC'ler üzerinde DNA floresan yerinde hibridizasyon (DNA FISH) tekniğini açıklamaktadır.

3D DNA FISH: Bir Kromozom Üzerinde Belirli Bir Geni Bulmak İçin Bir Teknik

Tüm Dağı RNA Floresan<em&gt; In situ</emVe&gt; Hibridizasyon<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriyolar

Burada 3D mikroskopi ve analizler (3D immuno-DNA FISH) izledi DNA FISH immünofloresan ve DNA dizileri tarafından histon modifikasyonları eşzamanlı tespiti için bir protokol açıklar.

3D Nükleer teşkilatında değişiklikler Eğitim için 3D-korunmuş Tane Çekirdekle ilgili Kombine İmmünofloresan ve DNA FISH

Yüksek çözünürlüklü erime analizi (HRMA) ile bir araya PCR zebrafish genotip için hızlı ve etkili bir yöntem olarak gösterilmiştir.

Yüksek çözünürlüklü Melt Analizi ile PCR kullanarak hızlı ve verimli Zebra Genotiplemesi

Zebra balığı embriyo gelişim biyoloji araştırma için mükemmel bir model. Embriyogenez sırasında, zebra balığı örnek gözlem ve analiz için üç-boyutlu zorluklar sunuyor, bir yumurta sarısı kitle ile gelişir. Bu protokol situ (DİLERİZ) lekeli Zebra balığı embriyo örnekleri içinde bütün montaj iki-boyutlu düz monte hazırlıkları nasıl oluşturulacağı açıklanır.

Tüm Dağı ile Zebra balığı Embriyo örnekler Vitray gözlenmesi ve Analiz Daire Dağı Hazırlık<em&gt; In situ</em&gt; Melezleme

Zebra balığı güvenilir genetik canlılar arasında gen düzenleme teknolojileri advent ile özellikle Biyomedikal araştırma olarak kullanılmıştır. Larva fenotipleri bekleniyor, DNA ekstraksiyon ve genotip kimlik zor olabilir. Burada, biz bir verimli Genotipleme zebra balığı larva için kuyruk, 72-h sonrası döllenme gibi erken kırpma tarafından açıklayınız.

Yüksek işlem hacmi DNA ekstraksiyon ve 3dpf zebra balığı larva Fin kırpma tarafından Genotipleme

3D çok renkli DNA FISH, 3B korunmuş çekirdekler içinde birden fazla genomik loci görselleştirmek için bir araç temsil eder, kesin olarak tek bir hücre düzeyinde nükleer alan içinde karşılıklı etkileşimleri ve lokalizasyon tanımlayan. Burada, adım protokol bir adım insan birincil hücrelerin geniş bir yelpazede için açıklanmıştır.

3D Çok Renkli DNA FISH Aracı İnsan Birincil Hücrelerde Nükleer Mimari Çalışma

Genişleme Destekli Yinelemeli Floresan In Situ Hibridizasyon (EASI-FISH), kalın dokuda birden fazla genin ekspresyonunu tespit etmek için genleşme mikroskobunu floresan in situ hibridizasyon (FISH) ile birleştiren sağlam bir tekniktir. Bu protokol, yöntemdeki son gelişmeleri ve bozulmamış Drosophila merkezi sinir sistemini etiketlemek için adaptasyonunu özetlemektedir.

Genişleme Destekli Yinelemeli Floresan In Situ Hibridizasyon Kullanılarak Sağlam Drosophila Beyindeki Gen Ekspresyonunun Multipleks Tespiti

Öğrenin, doğrudan etiketli problar kullanarak 3D DNA FISH yöntemiyle tek hücrelerdeki genomik lokusların uzamsal organizasyonunu analiz etmeyi. Bu hızlı ve sağlam protokol, nükleer mimari ve gen etkileşimlerini incelemek için değerlidir.

Doğrudan Etiketli Problar kullanarak Sağlam 3D DNA BALIK

Daha fazla video keşfet