Doğrudan Etiketli Problar kullanarak Sağlam 3D DNA BALIK

Aşağıdaki deneyin genel amacı, tekil hücrelerdeki spesifik genomik lokusların uzaysal organizasyonunu sağlam bir yöntemle incelemektir. Bu, öncelikle ilgilenilen genomik bölgeye bağlanarak orayı işaretleyecek olan floresan işaretli probların üretilmesiyle gerçekleştirilir. Sonraki adımlar, probların erişimine izin vermek amacıyla ilgilenilen hücrelerin bir lam üzerine yapıştırılması, fikse edilmesi ve permeabilize edilmesidir.

Ardından, probun ve hücresel DNA'nın eş zamanlı ısı denatürasyonu, spesifik olmayan şekilde bağlanmış probların uzaklaştırılması için gece boyunca süren prob hibridizasyon yıkama basamakları ve ardından dpi ile karşı boyama ile takip edilir. Hücre çekirdeği sonuçlarını görselleştirmek için floresan mikroskopi kullanılacak ve bu işlem nihayetinde spesifik genomik bölgelerin kapladığı nükleer konumu ortaya çıkaracaktır. Bu yöntem, genler arasındaki fonksiyonel etkileşimlerin belirlenmesi gibi nükleer organizasyon alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

Bu özel DNA FISH protokolünün temel avantajı; hızlı, dayanıklı ve çok yönlü olmasıdır. Bu yöntemi E Es hücrelerini kullanarak göstermiş olsak da, yöntem çok sayıda diğer hücre tipine de uygulanabilir. 100 ila 250 Kilobase boyutundaki parçalardan hazırlanan doğrudan işaretli problar tutarlı bir şekilde parlak sinyaller üretir; daha küçük problar gerekirse bunlar da kullanılabilir.

40 ila 50 kilobazlık smid veya beş ila 10 kilobazlık insertler içeren plazmitler kullanın. Spesifik genlere karşılık gelen back veya smid klonlarını Ensemble veya UCSC genom tarayıcılarını kullanarak tanımlayın. Yüksek kaliteli back DNA hazırlamak için tekrarlı çöktürme veya ticari olarak mevcut bir kit kullanın; hazırlığın temizliği, gereken prob hacmi ile orantılıdır.

Etiketlemeyi iki adımda gerçekleştirin. İlk olarak, amino aleli DUTP'yi tanıtmak için NIC translokasyonunu kullanın. İkinci olarak, bir AM ortalama reaktif boya bağlamak için kimyasal kenetlenmeyi kullanın.

Güçlü balık sinyalleri için kritik olduklarından, parlak problar hazırlamaya zaman ayırmaya değer. Bu prosedür, hücrelerin işlenmesiyle paralel olarak gerçekleştirilebilir ve günün başlangıcında yapılması zorunlu değildir. İlk olarak, 10 ila 20 nanogram doğrudan işaretlenmiş prob, altı mikrogram için altı mikrolitre CO 1D NA ile karıştırıldı.

Ardından, 9,7 µg miktarında somon testisi kaynaklı tek zincirli DNA'dan 1 µL ekleyin. Karışımın toplam hacmini su ile 100 µL'ye tamamlayın. Daha sonra, 10 µL 3 M sodyum asetat ve 275 µL etanol ekleyip vorteksleyerek karıştırın.

Karışımın -20 °C'de en az bir saat boyunca çökelmesini bekleyin. Ardından, çökeleği bir mikrosantrifüjde 4 °C'de, maksimum hızda 30 dakika boyunca döndürün. Sonrasında peleti %70 etanol ile yıkayın ve 4 °C'de beş dakika boyunca tekrar santrifüjleyin.

Ardından pelletin havada kurumasını bekleyin. Sonra yeniden süspanse edin. Pelleti beş µL deiyonize form içinde süspanse edin.

Işıktan korumak için folyoya sararak, 1000 RPM'de çalkalarken 37 °C'de inkübe edin. 30 dakika sonra, beş µL dekstrin sülfat karışımı ekleyin ve ajitasyonla inkübasyona devam edin. 10 dakika daha sürdürün. Hücrelerin lametle yapışma eğilimi hücre tipine göre büyük farklılıklar gösterir.

Her bir hücre tipi için optimum çöktürme süresini ve hücre yoğunluğunu ampirik olarak belirleyin. Tutarlı sonuçlar elde etmek için hücreler tek hücre süspansiyonunda olmalıdır. Fare ES hücrelerini bir lama yapıştırmak için, öncelikle hücrelerin damlatılacağı alanı lam üzerinde daire içine alarak işaretleyin.

Hidrofobik bir kalem kullanarak, normal kültür ortamında 80 ila 100 µL başına 20 ila 50.000 hücre içeren bir süspansiyon hazırlayın, hücre süspansiyonunu dairenin içine ekleyin ve hücrelerin nemlendirilmiş bir inkübatörde yaklaşık üç saat boyunca yapışmasını sağlayın. Lam üzerine yapışma işleminden sonra, lamı 10 dakika boyunca %4 PFA içine nazikçe daldırarak hücreleri sabitleyin. Lam, bir pipet uç kutusu gibi bir tepsi içinde düz durmalıdır.

Oda sıcaklığındaki reaktifler coplan kavanozlarda kullanılır. İlk olarak hücreler, tris klorür ile 10 dakika boyunca söndürülür. İkinci olarak hücreler, sapanin ve triton X 100 karışımı kullanılarak 10 dakika boyunca permeabilize edilir.

Şimdi hücreleri, her yıkama için beş dakika süreyle iki kez PBS ile yıkayın. Yıkama işlemlerinin ardından hücreleri en az 20 dakika boyunca %20 gliserol içinde inkübe edin. Bu aşamada lamlar, birkaç hafta boyunca minus 20 degrees Celsius'ta %50 gliserol içinde saklanabilir.

Bir gün veya daha fazla süre boyunca saklama, sinyal gücünü artırmalıdır. Devam etmeden önce hücreleri PBS içinde %20 gliserol ile oda sıcaklığına getirdiğinizden emin olun. Şimdi, sıvı azot kullanarak lamı üç kez dondurup çözün.

Çatırtı sesi durduğunda her seferinde bir lam olacak şekilde ilerleyin. Birkaç saniye sonra, lamı çözülmesi için bir kağıt havlu üzerine alın; lamı tekrar dondurmadan önce opak donmuş gliserolün kaybolmasını bekleyin; üç dondurma-çözme döngüsü için rotasyonda 15 lama kadar rahatlıkla işlem yapılabilir. Şimdi lamları PBS ile her bir yıkama beş dakika sürecek şekilde iki kez yıkayın.

Ardından lamları 30 dakika boyunca 0,1 molar hidroklorik asit içinde inkübe edin. Hidroklorik asit işlemini, PBS ile beş dakikalık başka bir yıkama ile takip edin. Şimdi, hücreleri daha güçlü bir saponin ve Triton X 100 karışımı ile 30 dakika boyunca tekrar permeabilize edin; sürfaktanları lamlardan temizlemek için iki adet beş dakikalık PBS yıkaması uygulayın.

Slaytlar artık %50 formamid içeren XSSC içinde dengelemeye hazırdır. Bu işlem en az 10 dakika sürmelidir; dengeleme sırasında probu birkaç kez pipetle yukarı aşağı çekin ve ardından her bir hücre noktasına uygun boyuttaki bir lamıle 10 µL aktarın. Bir slaytı formamidden çıkarın ve hücrelerin etrafındaki fazla sıvıyı kağıt havluyla kurulayın, ancak hücre noktasının kurumasını önleyin.

Şimdi lameli ters çevirin. Hücrelerin üzerine gelecek şekilde lamın üzerine yerleştirin. Lameli, kauçuk yapıştırıcı ile lama sabitleyin.

Çimentonun tamamen kurumasını bekleyin ve lamı ışıktan koruyun. Ardından, lamları bir ısıtıcı tabla üzerinde tam olarak iki dakika boyunca 78 °C'ye ısıtın. Bu işlemin düzgün şekilde gerçekleştirilmesi kritik önem taşımaktadır.

Nükleer morfolojiyi mümkün olduğunca korumak için bu adım sırasında hücreler bir örtü ile ışıktan korunmalıdır. Hücrelerin kurumasını önlemek ve ısı bloğunun doğru sıcaklıkta olduğundan emin olmak kritik önem taşır. Ardından, slaytları nem sağlamak amacıyla ıslak kağıt havlularla birlikte ışık geçirmeyen bir kutuya yerleştirin ve 37 °C'de gece boyunca inkübe edin.

Bu prosedüre, lamel etrafındaki kauçuk çimentoyu soyarak başlayın. Ardından, lameller gevşeyip kayana kadar her lamı aşırı miktarda SC içerisine yerleştirin. Sonrasında, lamları %50 formamid içeren iki kat aşırı SC içerisinde, 45 °C'de 15 dakika boyunca yıkayın.

Slaytları ışıktan korumak için su banyosunun kapağını kapalı tutun. Ardından slaytları 63 °C'de 15 dakika boyunca 0.2 XSSC ile yıkayın. Sonrasında 45 °C'de beş dakika boyunca iki XSSC ile ve son olarak oda sıcaklığında beş dakika boyunca fazla SE ile yıkayın.

Kalan adımların tamamı oda sıcaklığında gerçekleştirilir; beş dakikalık bir PBS yıkamasıyla başlanarak lamlar iki dakika boyunca DAPI ile boyanır ve ardından lamlar beş dakika boyunca PBS ile yıkanarak boya uzaklaştırılır. Lamelini yerleştirmek için, uygun boyuttaki lamelin üzerine her bir hücre noktası başına 10 µL montaj medyumu uygulayın. Ardından, hücrelerin kurumasına izin vermeden hücre noktasının etrafındaki fazla PBS'yi kurulayın.

Balık prob hazırlama protokolünü kullanarak lam üzerine kapatma camını ters çevirip yerleştirin ve tırnak cilası ile mühürleyin. NIC translasyonundan sonra, fragmanların büyük çoğunluğu 150 ve 700 baz çifti arasında olacak şekilde bir DNA yayması görülmelidir. Kimyasal eşleşmeden sonra, floresan boyanın katılımı, prob geçişinin spektroskopik analizi ile ölçülebilir.

Prob kalitesini değerlendirmeye yönelik bu kalite kontrol adımları, böyle bir probun kullanımı için kritik öneme sahiptir. Epi-floresan mikroskop ile otomatik görüntüleme gerçekleştirilebilir durumdaydı. Bu işlem, düşük arka plan gürültüsüne sahip, keskin ve kolayca tanımlanabilir FISH sinyalleri gerektirir.

Bu, ham bir görüş alanı görüntüsüdür. Aşağıdaki görüntüler, otomatik olarak tanımlanmış ve analiz edilmiş çekirdekleri temsil etmektedir. Çeşitli alelik arası ve lokus arası mesafeler, her çekirdeğin sağ üst köşesinde ve her iki yanında aşağıda gösterilmiştir.

Bu büyütmede, beyaz noktalar görüş alanı başına tanımlanan çekirdekleri temsil etmektedir. Bu histogramlar, üstteki yeşil sinyaller ile alttaki kırmızı sinyaller arasındaki maksimum inter-alelik mesafeleri göstermektedir. Tüm veriler, HBB ve HBA genlerini ve bir histon kümesini kapsayan, farklı kromozomlar üzerinde yer alan probların kullanıldığı P 20 germ hücrelerinden elde edilmiştir.

Bunlar, mic, KC ve Q1 genlerini kapsayan geri sondalarla boyanmış fetal karaciğer çekirdeklerinin örnekleridir. Bu görüntülerden, balık sinyallerinin nükleer koordinatları elde edilebilir ve genomik bölgelerin uzamsal ilişkileri hesaplanabilir. Aleller arası mesafeler, çekirdek yarıçapının bir oranı olarak grafiğe dökülmüştür.

Bu verilerde kırmızı problar, yeşil problara göre birbirine anlamlı derecede daha yakındır. Daha yoğun sinyaller gerektiren konfokal mikroskopi de uygulanabilirdi. Balık sinyallerinin kromozom bölgeleri içindeki 3B modellemesi için görüntü yığınları kullanılmıştır.

Kırmızı ve beyaz renklerdeki bu iki prob, fare kromozom yedilisinin uç kısımlarına yakındır; tüm kromozom boyaması yeşil renkte gösterilmiştir. Bu videoyu izledikten sonra, tek hücrelerde belirli genomik lokusların uzaysal konumlandırmasını araştırmak için DNA FISH işleminin nasıl gerçekleştirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Bu prosedürü uygularken, tüm işlemlerin nükleer mimariyi etkileyebileceğini ve bu prosedürün ardından uygun kontrollerin dahil edilmesinin önemli olduğunu unutmamak gerekir.

Genler ve proteinler arasındaki uzamsal ilişkiler gibi ek soruları yanıtlamak için immüno-FISH gibi diğer yöntemler uygulanabilir.