2.6: Bakteriyel Dönüşüm: Isı Şoku Yöntemi

Bakteriyel transformasyon, yabancı DNA'nın bir bakteriye sokulduğu ve daha sonra DNA'yı çoğaltabilen veya klonlayabilen yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. Bu DNA'yı kolayca alma yeteneğine sahip hücrelere yetkin hücreler denir. Transformasyon birçok bakteri türünde doğal olarak meydana gelmesine rağmen, bilim adamları bir bakteri hücresinin yetkinliğini yapay olarak indüklemenin ve arttırmanın yollarını bulmuşlardır. Bu videoda bu yollardan biri olan ısı şoku dönüşümünden bahsedeceğiz.

Isı şoku tekniği hakkında konuşmadan önce, bakteri dönüşümünde en yaygın olarak kullanılan DNA türünü tartışalım: plazmit. Bir plazmit, bir hücre zarındaki gözeneklerden kolayca geçebilmesi için süper sarmal yoluyla boyutunu küçültebilen küçük, dairesel, çift sarmallı bir DNA'dır.

Bir plazmit, bahsetmeye değer birkaç önemli bölge içerir. Ticari olarak temin edilebilen plazmitler, çoklu bir klonlama bölgesi veya MCS içerir. Bu bölge, DNA'yı parçalayan restriksiyon endonükleazları veya restriksiyon enzimleri tarafından tanınan spesifik diziler içerir. Araştırmacının ilgisini çeken DNA fragmanları, plazmit ve DNA fragmanı aynı endonükleazlarla kesildiğinde çoklu klonlama bölgesine yerleştirilebilir.

Plazmitler ayrıca, plazmitin replikasyonunun nerede başlaması gerektiği konusunda hücreye bilgi sağlayan bir Replikasyon Kökeni veya ORI içerir.

Replikasyonun kökenine ve çoklu klonlama bölgesine ek olarak, çoğu plazmit bir antibiyotik direnç geni içerecektir. Bu gen, plazmid içeren tüm hücrelere antibiyotik direnci kazandırır ve bu hücrelerin antibiyotik içeren ortamlarda hayatta kalmasına izin verir.

Şimdi plazmitleri tartıştığımıza göre, onların içine sokulacakları hücreler hakkında konuşalım: yetkin hücreler. Moleküler biyoloji araştırmalarında ve transformasyonunda en sık kullanılan bakteri türü, alt bağırsağınızda da yaşayan E. coli'dir. Hücreler tipik olarak kalsiyum açısından zengin bir ortama maruz bırakılarak yetkin hale getirilir.

Kalsiyum iyonlarının pozitif yükleri, hem plazmidin hem de bakteri hücre duvarının negatif yüklerini nötralize eder, elektrostatik itmeyi dağıtır ve hücre duvarını zayıflatır.

Hücreleri ani bir sıcaklık artışına veya ısı şokuna maruz bırakarak, hücrenin dışı ile içi arasında, süper sarmal plazmit DNA'nın girebileceği gözeneklerin oluşumunu indükleyen bir basınç farkı yaratılır. Hücreleri daha normal bir sıcaklığa döndürdükten sonra, hücre duvarı kendi kendini iyileştirecektir.

Hücreler plazmidi aldıktan sonra, antibiyotikle bağlanmış agar plakaları üzerinde büyüyebileceklerdir.

Isı şoku dönüşümüne başlamadan önce çalışma alanını temizleyin ve tüm ekipmanın sterilize edildiğinden emin olun.

Yetkin hale getireceğiniz bakterilerin beslenmesini sağlayan yeterli besiyeri ve agarın hazır olduğundan emin olun. Ayrıca tüm solüsyonları otoklavlama yoluyla sterilize ettiğinizden emin olun. Kullanmadan önce sıvı ortamın oda sıcaklığına soğumasını bekleyin ve agarın 50-55 ° C'ye soğumasını bekleyin. C, antibiyotiğin eklenebileceği ve plakaların dökülebileceği sıcaklık. Plakaların katılaşması için oda sıcaklığına soğumasına izin verin.

Bakterilerle çalışırken, steriliteyi korumak için her zaman aseptik teknik kullanılmalıdır. Aseptik teknik tipik olarak, aletleri ve reaktifleri sterilize etmek ve bir konveksiyon akımı oluşturmak için bir Bunsen brülörünün kullanılmasını içerir. bu da havadaki kirleticileri çalışma alanından uzak tutar.

Isı şoku reaksiyonundan hemen önce, ortamınızı oda sıcaklığına ve antibiyotik içeren LB agar plakalarını 37°C'ye ısıtın. Ayrıca su banyonuzun 42 ° C'de olduğundan emin olun.

Ardından, kimyasal olarak yetkin hücreleri buz üzerinde çözdürün.

Ekle, 1-5uL 1ng/? L bakteri hücrelerine soğuk plazmit, hafifçe karıştırın ve hücre ve plazmit karışımını 30 dakika boyunca buza geri koyun.

Süre dolduğunda, hücre ve plazmit karışımını 42 ° C'lik bir su banyosuna koyarak ısı şoku verin. 30 saniye boyunca C.

Tüpü su banyosundan çıkardıktan hemen sonra buzun üzerine koyun ve 450 ekleyin. L medya. 37 için sallanan bir inkübatöre yerleştirin? Hücrelerin toparlanabilmesi için 225 rpm'nin üzerinde 1 saat C.

Uygun aseptik tekniği kullanarak, bir LB agar plakasına 20-200uL bakteri ekleyin ve ortamı bir bakteri yayıcı ile etrafına yayın. Plakaları gece boyunca 37'de inkübe etmek mi? Bakterilerin yoğuşmaya maruz kalmasını önlemek için C baş aşağı.

Ertesi gün, plazmid içine alınan bakteriler koloniler oluşturur.

Daha sonra, başarılı dönüştürücülerin sayısının kaplanan toplam DNA miktarına bölünmesiyle elde edilen dönüşüm verimliliğini hesaplamak için kolonileri sayın.

Şimdi, daha fazla deney için koloniler seçilebilir.

Dönüşümde kullanılan bakteriler yetkin hale getirilmeden önce dondurucuda saklanır. Buz üzerinde çözülmeli, bir agar plakasına yayılmalı mı? antibiyotiksiz ve izin verilir 37 ° C'de bir gecede büyümek.

Aseptik tekniği kullanarak, agar plakasından bir bakteri kolonisi seçin ve 37 ° C'de bir gecede 500 ml'lik büyük bir kültürde büyütün. Titreyen bir inkübatörde C? Bakterilerin çökelmesini ve hatta besinlerin ortamda dağılmasını önleyen bir alet.

Hücreler büyürken 0.1 molar kalsiyum klorür ve 0.1 molar kalsiyum klorür artı% 15 gliserol çözeltileri yapın, otoklavlayın ve soğumaya bırakın.

Absorbans ölçümleri, bakterilerin orta log büyüme aşamasında olup olmadıklarını belirlemek için kullanılır, bu da DNA'yı kolayca alacakları anlamına gelir. Hücreler bu aşamaya ulaştığında, onları buzun üzerine yerleştirin ve prosedür boyunca orada tutun.

Daha sonra, bakteri hücrelerini iki büyük santrifüj tüpüne ayırın ve 4 ° C'de döndürün. Süpernatanı dökün ve yaklaşık 100 ml 0.1 molar soğuk kalsiyum klorür içinde yeniden süspanse edin. Ardından, hücreleri 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. Bu adım en az bir kez daha tekrarlanır. Dönen ve yeniden askıya alınan hücrelerin döngüleri genellikle hücrelerinizi yıkamak olarak adlandırılır.

Son yıkamadan sonra, hücreleri soğuk 50 mL 0.1 molar kalsiyum klorür ve% 15 gliserol çözeltisinde yeniden süspanse edin. Bu hücreler artık kimyasal olarak yetkindir.

50 dağıtmak? L bakteriyi birden fazla mikrofüj tüpüne koyun ve -80'de saklayın? Isı şokuna hazır olana kadar C.

Bakteriyel dönüşümün birçok uygulaması ve varyasyonu mevcuttur.

Isı şokuna ek olarak, eletroporasyon, dönüşüm için başka bir yaygın tekniktir. Adından da anlaşılacağı gibi, elektroporasyon, DNA'nın geçebileceği bakteri hücre zarında gözenekler oluşturmak için elektrik kullanmayı içerir.

Dönüştürülmüş bakterilerin taranması ile ilgili olarak, plazmitler genellikle taramaya yardımcı olmak için beta-galaktosidaz enzimini kodlayan bir gen içerir. Bu enzim için substrat agar plakalarına dahil edildiğinde, bir ek içeren plazmitlerle dönüştürülmüş bakteriler beyaz koloniler verirken, olmayanlar mavi koloniler verir. Bu yöntem mavi ve beyaz tarama olarak adlandırılır.

Çoğu dönüşüm deneyinde amaç, hedef geninizi içeren plazmidinizin büyük miktarlarını yapmak için hızla bölünen bakterileri elde etmektir. Bakteriyel transformasyonu takiben, bir sonraki adım, antibiyotik içeren sıvı ortamda büyük miktarlarda bakteri yetiştirmek ve adından da anlaşılacağı gibi, plazmitlerin bakterilerden arındırılmasını içeren plazmit saflaştırmasını gerçekleştirmektir. Bu amaçla birçok ticari kit mevcuttur.

Bazen dönüşümün amacı, bakterilerin plazmit tarafından kodlanan büyük miktarlarda protein üretmesini sağlamaktır. Burada, hedef proteini izole etmek için afinite saflaştırması adı verilen bir teknik gerçekleştirilmeden önce bakteri hücrelerinin homojenize edildiğini ve parçalandığını görüyorsunuz. Büyük miktarlarda protein saflaştırıldıktan sonra, daha sonra kristalize edilebilir ve ilgilenilen belirli proteinin yapısı tanımlanabilir.

JoVE'un Isı Şoku Dönüşümlerine Girişini az önce izlediniz. Bu videoda şunları inceledik: ısı şoku dönüşümünün ne olduğu ve nasıl çalıştığı, arkasındaki prensip ve bakterilerin nasıl başarılı bir şekilde dönüştürüleceği. İzlediğiniz için teşekkürler!