Bakteriyel Transformasyon: Isı Şoku Yöntemi

Bakteriyel transformasyon, yabancı DNA'nın bir bakteriye aktarıldığı ve ardından bu DNA'nın çoğaltılabildiği veya klonlanabildiği yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. Bu DNA'yı kolayca bünyesine alma yeteneğine sahip hücrelere kompetan hücreler denir. Transformasyon birçok bakteri türünde doğal olarak gerçekleşse de, bilim insanları bir bakteri hücresinin kompetansını yapay olarak indüklemenin ve artırmanın yollarını bulmuşlardır. Bu videoda, bu yöntemlerden biri olan ısı şoku transformasyonundan bahsedeceğiz.

Isı şoku tekniğinden bahsetmeden önce, bakteriyel transformasyonda en yaygın olarak kullanılan DNA türünü, yani plazmidi ele alalım. Plazmid, süper kıvrımlanma (supercoiling) yoluyla boyutunu küçültebilen, böylece hücre membranındaki gözeneklerden kolayca geçebilen küçük, dairesel, çift sarmallı bir DNA'dır.

Bir plazmid, değinmeye değer birkaç önemli bölge içerir. Ticari olarak temin edilebilen plazmidler, bir çoklu klonlama bölgesine veya MCS'ye sahiptir. Bu bölge, DNA'yı kesen restriksiyon endonükleazları veya restriksiyon enzimleri tarafından tanınan spesifik sekanslar içerir. Plazmid ve DNA fragmanı aynı endonükleazlar ile kesildiğinde, araştırmacının ilgilendiği DNA fragmanları çoklu klonlama bölgesine yerleştirilebilir.

Plazmidler ayrıca, hücreye plazmid replikasyonunun nereden başlaması gerektiğine dair bilgi sağlayan bir Replikasyon Başlangıç Noktası veya ORI içerir.

Replikasyon başlangıç noktası ve çoklu klonlama bölgesine ek olarak, çoğu plazmid bir antibiyotik direnç geni içerir. Bu gen, plazmidi taşıyan tüm hücrelere antibiyotik direnci kazandırarak bu hücrelerin antibiyotik içeren besiyerlerinde hayatta kalmasını sağlar.

Plazmidleri tartıştıktan sonra, plazmidlerin aktarılacağı hücrelerden, yani kompetan hücrelerden bahsedelim. Moleküler biyoloji araştırmalarında ve transformasyonda en yaygın kullanılan bakteri türü, aynı zamanda alt bağırsaklarınızda da yaşayan E. coli'dir. Hücreler tipik olarak kalsiyum açısından zengin bir ortama maruz bırakılarak kompetan hale getirilir.

Kalsiyum iyonlarının pozitif yükleri, hem plazmidin hem de bakteri hücre duvarının negatif yüklerini nötralize ederek elektrostatik itmeyi dağıtır ve hücre duvarını zayıflatır.

Hücreler ani bir sıcaklık artışına, yani ısı şokuna maruz bırakıldığında, hücrenin dışı ve içi arasında bir basınç farkı oluşur; bu da süper kıvrımlanmış plazmid DNA'sının girebileceği gözeneklerin oluşumunu tetikler. Hücreler daha normal bir sıcaklığa döndürüldükten sonra, hücre duvarı kendi kendini onaracaktır.

Hücreler plazmidi aldığında, antibiyotikle hazırlanmış agar plaklarında büyüyebileceklerdir.

Isı şoku transformasyonuna başlamadan önce çalışma alanını temizleyin ve tüm ekipmanların sterilize edildiğinden emin olun.

Kompetan hale getireceğiniz bakterilere besin sağlayacak yeterli miktarda besiyeri ve agar hazırladığınızdan emin olun. Ayrıca tüm çözeltileri otoklavlayarak sterilize ettiğinizden emin olun. Sıvı besiyerinin kullanım öncesinde oda sıcaklığına soğumasını bekleyin ve agarı, antibiyotiğin eklenebileceği ve plakların dökülebileceği sıcaklık olan 50-55˚C'ye kadar soğutun. Plakların katılaşması için oda sıcaklığında soğumasını bekleyin.

Bakterilerle çalışırken, steriliteyi korumak için her zaman aseptik teknik kullanılmalıdır. Aseptik teknik genellikle, enstrümanları ve reaktifleri sterilize etmek ve hava yoluyla gelen kontaminantların çalışma alanına girmesini önleyen bir konveksiyon akımı oluşturmak için Bunsen beki kullanımını içerir.

Isı şoku reaksiyonundan hemen önce, besiyerinizi oda sıcaklığına ve antibiyotik içeren LB agar plaklarını 37°C'ye ısıtın. Ayrıca su banyonuzun 42°C olduğundan emin olun.

Ardından, kimyasal olarak kompetan hücreleri buz üzerinde çözdürün.

Bakteriyel hücrelere 1-5uL 1ng/μL soğuk plazmid ekleyin, nazikçe karıştırın ve hücre-plazmid karışımını 30 dakika boyunca buz üzerinde bekletin.

Süre dolduğunda, hücre ve plazmid karışımını 30 saniye boyunca 42˚C'deki su banyosuna yerleştirerek ısı şoku uygulayın.

Tüpü su banyosundan çıkardıktan hemen sonra buz üzerine koyun ve 450μL besiyeri ekleyin. Hücrelerin toparlanabilmesi için tüpü 37°C'de, 225 rpm'nin üzerinde hızda 1 saat boyunca çalkalamalı inkübatöre yerleştirin.

Uygun aseptik teknik kullanarak, LB agar plağına 20-200uL bakteri ekleyin ve ortamı bir bakteri yayma çubuğu ile yayın. Bakterilerin kondansasyona maruz kalmasını önlemek için plakları ters çevirerek gece boyunca 37˚C'de inkübe edin.

Ertesi gün, plazmidi almış olan bakteriler koloniler oluşturur.

Ardından, başarılı transformant sayısının plaklanan toplam DNA miktarına bölünmesiyle elde edilen transformasyon verimliliğini hesaplamak için kolonileri sayın.

Artık koloniler, ileri deneyler için seçilebilir.

Transformasyonda kullanılan bakteriler, kompetan hale getirilmeden önce dondurucuda saklanır. Bakteriler buz üzerinde çözülmeli, antibiyotik içermeyen bir agar plakasına yayılmalı ve 37˚C'de gece boyunca büyümeye bırakılmalıdır.

Aseptik teknik kullanarak agar plakasından bir bakteri kolonisi seçin ve bunu 500 ml'lik büyük bir kültürde, bakterilerin çökelmesini önleyen ve besinlerin besiyerinde eşit dağılmasını sağlayan bir cihaz olan çalkalamalı inkübatörde 37˚C'de gece boyunca büyütün.

Hücreler büyürken 0.1 molar kalsiyum klorür ve 0.1 molar kalsiyum klorür artı %15 gliserol çözeltileri hazırlayın, otoklavlayın ve soğumaya bırakın.

Bakterilerin, DNA'yı kolayca alabilecekleri büyümenin mid-log fazında olup olmadıklarını belirlemek için absorbans ölçümleri kullanılır. Hücreler bu faza ulaştığında, onları buzun üzerine yerleştirin ve işlem boyunca orada tutun.

Ardından, bakteri hücrelerini iki büyük santrifüj tüpüne ayırın ve 4°C'de santrifüjleyin. Süpernatantı dökün ve yaklaşık 100 ml soğuk 0.1 molar kalsiyum klorür içinde yeniden süspande edin. Daha sonra hücreleri buz üzerinde 30 dakika inkübe edin. Bu adım en az bir kez daha tekrarlanır. Hücrelerin santrifüjlenmesi ve yeniden süspande edilmesi döngüleri genellikle hücrelerin yıkanması olarak adlandırılır.

Son yıkamadan sonra, hücreleri soğuk 50mL 0.1 molar kalsiyum klorür artı %15 gliserol çözeltisinde yeniden süspande edin. Bu hücreler artık kimyasal olarak kompetandır.

50μL bakteriyi birden fazla mikrosantrifüj tüpüne dağıtın ve ısı şokuna hazır olana kadar -80˚C'de saklayın.

Bakteriyel transformasyonun birçok uygulaması ve varyasyonu mevcuttur.

Isı şokunun yanı sıra, elektroporasyon transformasyon için kullanılan bir diğer yaygın tekniktir. Adından da anlaşılacağı üzere elektroporasyon, DNA'nın geçebileceği gözenekler oluşturmak için bakteriyel hücre membranında elektrik kullanımını içerir.

Transforme olmuş bakterilerin taranmasıyla ilgili olarak, plazmidler genellikle taramaya yardımcı olmak amacıyla beta-galaktosidaz enzimini kodlayan bir gen içerir. Bu enzimin substratı agar plakalara eklendiğinde, insert içeren plazmidlerle transforme olmuş bakteriler beyaz koloniler oluştururken, içermeyenler mavi koloniler oluşturur. Bu yöntem, mavi-beyaz tarama olarak adlandırılır.

Çoğu transformasyon deneyinde amaç, hedef geninizi içeren plazmidinizden büyük miktarlarda üretmek için hızla bölünen bakteriler elde etmektir. Bakteriyel transformasyonu takiben bir sonraki adım, antibiyotik içeren sıvı besiyerinde yüksek miktarda bakteri üretmek ve adından da anlaşılacağı üzere plazmidlerin bakterilerden saflaştırılmasını içeren plazmid saflaştırmasını gerçekleştirmektir. Bu amaç için birçok ticari kit mevcuttur.

Bazen transformasyonun amacı, bakterilerin plazmid tarafından kodlanan yüksek miktarda protein üretmesini sağlamaktır. Burada, hedef proteini izole etmek için afinite saflaştırma adı verilen teknik uygulanmadan önce bakteriyel hücrelerin homojenize edildiğini ve liz edildiğini görüyorsunuz. Proteinden büyük miktarlarda saflaştırma yapıldıktan sonra, protein kristalleştirilebilir ve ilgilenilen belirli proteinin yapısı tanımlanabilir.

JoVE Isı Şoku Transformasyonuna Giriş videosunu izlediniz. Bu videoda şunları inceledik: ısı şoku transformasyonunun ne olduğu ve nasıl çalıştığı, arkasındaki prensip ve bakterilerin nasıl başarılı bir şekilde transforme edileceği. İzlediğiniz için teşekkürler!