Name: Genetik Manipülasyon Δku80 Suşlarının Toxoplasma gondii (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: Öğrenin Toxoplasma gondii'de gen hedefleme protokolünü Δku80 suşları kullanarak. Bu yöntem, homolog rekombinasyon ve HXGPRT seçilebilir belirteci ile gen silme, değiştirme ve etiketleme işlemlerini hızlandırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma DJB için NIH hibe (AI041930, AI073142, AI075931 ve AI091461) tarafından desteklenmiştir.

<ol><li>Fox, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+II+Toxoplasma+gondii+KU80+knockout+strains+enable+functional+analysis+of+genes+required+for+cyst+development+and+latent+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryot.+Cell%22%5BJournal%5D)">Type II Toxoplasma gondii KU80 knockout strains enable functional analysis of genes required for cyst development and latent infection.</a> Eukaryot. Cell. 10, 1193-1206 (2011).</li>
<li>Fox, B. A., Ristuccia, J. G., Gigley, J. P., Bzik, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+replacements+in+Toxoplasma+gondii+strains+deficient+for+nonhomologous+end+joining%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">Efficient gene replacements in Toxoplasma gondii strains deficient for nonhomologous end joining.</a> Eukaryotic Cell. 8, 520-529 (2009).</li>
<li>Fox, B. A., Bzik, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avirulent+uracil+auxotrophs+based+on+disruption+of+orotidine-5%27-monophosphate+decarboxylase+elicit+protective+immunity+to+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Avirulent uracil auxotrophs based on disruption of orotidine-5'-monophosphate decarboxylase elicit protective immunity to Toxoplasma gondii.</a> Infection and Immunity. 78, 3744-3752 (2010).</li>
<li>Hortua Triana, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+and+molecular+characterization+of+the+pyrimidine+biosynthetic+enzyme+dihydroorotate+dehydrogenase+from+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Biochemical+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Biochemical and molecular characterization of the pyrimidine biosynthetic enzyme dihydroorotate dehydrogenase from Toxoplasma gondii.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 184, 71-81 (2012).</li>
<li>Kim, K., Weiss, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+gondii%3A+the+model+apicomplexan%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma gondii: the model apicomplexan.</a> Int. J. Parasitol. 34, 423-432 (2004).</li>
<li>Gajria, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ToxoDB%3A+an+integrated+Toxoplasma+gondii+database+resource%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+research%22%5BJournal%5D)">ToxoDB: an integrated Toxoplasma gondii database resource.</a> Nucleic Acids research. 36, 553-556 (2008).</li>
<li>Kim, K., Weiss, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma%3A+the+next+100+years%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+and+infection+%2F+Institut+Pasteur%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma: the next 100 years.</a> Microbes and infection / Institut Pasteur. 10, 978-984 (2008).</li>
<li>Butcher, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+gondii+rhoptry+kinase+ROP16+activates+STAT3+and+STAT6+resulting+in+cytokine+inhibition+and+arginase-1-dependent+growth+control%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+pathogens%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma gondii rhoptry kinase ROP16 activates STAT3 and STAT6 resulting in cytokine inhibition and arginase-1-dependent growth control.</a> PLoS pathogens. 7, e1002236(2011).</li>
<li>Daher, W., Klages, N., Carlier, M. F., Soldati-Favre, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+Toxoplasma+gondii+formin+3%2C+an+actin+nucleator+dispensable+for+tachyzoite+growth+and+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryot.+Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of Toxoplasma gondii formin 3, an actin nucleator dispensable for tachyzoite growth and motility.</a> Eukaryot. Cell. 11, 343-352 (2012).</li>
<li>Fentress, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+of+immunity-related+GTPases+by+a+Toxoplasma+gondii-secreted+kinase+promotes+macrophage+survival+and+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation of immunity-related GTPases by a Toxoplasma gondii-secreted kinase promotes macrophage survival and virulence.</a> Cell Host Microbe. 8, 484-495 (2010).</li>
<li>Musiyenko, A., Majumdar, T., Andrews, J., Adams, B., Barik, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PRMT1+methylates+the+single+Argonaute+of+Toxoplasma+gondii+and+is+important+for+the+recruitment+of+Tudor+nuclease+for+target+RNA+cleavage+by+antisense+guide+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+microbiology%22%5BJournal%5D)">PRMT1 methylates the single Argonaute of Toxoplasma gondii and is important for the recruitment of Tudor nuclease for target RNA cleavage by antisense guide RNA.</a> Cellular microbiology. 14, 882-901 (2012).</li>
<li>Straub, K. W., Peng, E. D., Hajagos, B. E., Tyler, J. S., Bradley, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+moving+junction+protein+RON8+facilitates+firm+attachment+and+host+cell+invasion+in+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22PLos+Pathog%22%5BJournal%5D)">The moving junction protein RON8 facilitates firm attachment and host cell invasion in Toxoplasma gondii.</a> PLos Pathog. 7, e1002007(2011).</li>
<li>Szatanek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cactin+is+essential+for+G1+progression+in+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Cactin is essential for G1 progression in Toxoplasma gondii.</a> Molecular Microbiology. 84, 566-577 (2012).</li>
<li>Donald, R. G., Carter, D., Ullman, B., Roos, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insertional+tagging%2C+cloning%2C+and+expression+of+the+Toxoplasma+gondii+hypoxanthine-xanthine-guanine+phosphoribosyltransferase+gene.+Use+as+a+selectable+marker+for+stable+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Insertional tagging, cloning, and expression of the Toxoplasma gondii hypoxanthine-xanthine-guanine phosphoribosyltransferase gene. Use as a selectable marker for stable transformation.</a> J. Biol. Chem. 271, 14010-14019 (1996).</li>
<li>Donald, R. G., Roos, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+knock-outs+and+allelic+replacements+in+Toxoplasma+gondii%3A+HXGPRT+as+a+selectable+marker+for+hit-and-run+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Biochemical+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Gene knock-outs and allelic replacements in Toxoplasma gondii: HXGPRT as a selectable marker for hit-and-run mutagenesis.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 91, 295-305 (1998).</li>
<li>Pfefferkorn, E. R., Borotz, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+gondii%3A+characterization+of+a+mutant+resistant+to+6-thioxanthine%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma gondii: characterization of a mutant resistant to 6-thioxanthine.</a> Exp. Parasitol. 79, 374-382 (1994).</li>
<li>Gietz, R. D., Schiestl, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frozen+competent+yeast+cells+that+can+be+transformed+with+high+efficiency+using+the+LiAc%2FSS+carrier+DNA%2FPEG+method%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Frozen competent yeast cells that can be transformed with high efficiency using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method.</a> Nature Protocols. 2, 1-4 (2007).</li>
<li>Oldenburg, K. R., Vo, K. T., Michaelis, S., Paddon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombination-mediated+PCR-directed+plasmid+construction+in+vivo+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Recombination-mediated PCR-directed plasmid construction in vivo in yeast.</a> Nucleic Acids Res. 25, 451-452 (1997).</li>
<li>Fox, B. A., Gigley, J. P., Bzik, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+gondii+lacks+the+enzymes+required+for+de+novo+arginine+biosynthesis+and+arginine+starvation+triggers+cyst+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma gondii lacks the enzymes required for de novo arginine biosynthesis and arginine starvation triggers cyst formation.</a> Int. J. Parasitol. 34, 323-331 (2004).</li>
<li>Roos, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+genetic+tools+for+the+identification+and+analysis+of+drug+targets+in+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Top.+Microbiol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Molecular genetic tools for the identification and analysis of drug targets in Toxoplasma gondii.</a> Curr. Top. Microbiol. Immunol. 219, 247-259 (1996).</li>
<li>Roos, D. S., Donald, R. G., Morrissette, N. S., Moulton, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+tools+for+genetic+dissection+of+the+protozoan+parasite+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular tools for genetic dissection of the protozoan parasite Toxoplasma gondii.</a> Methods in Cell Biology. 45, 27-63 (1994).</li>
<li>Singh, U., Brewer, J. L., Boothroyd, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+tachyzoite+to+bradyzoite+differentiation+mutants+in+Toxoplasma+gondii+reveals+a+hierarchy+of+gene+induction%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of tachyzoite to bradyzoite differentiation mutants in Toxoplasma gondii reveals a hierarchy of gene induction.</a> Molecular Microbiology. 44, 721-733 (2002).</li>
<li>vanden Hoff, M. J., Moorman, A. F., Lamers, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+in+%27intracellular%27+buffer+increases+cell+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Electroporation in 'intracellular' buffer increases cell survival.</a> Nucleic Acids Research. 20, 2902(1992).</li>
<li>Pfefferkorn, E. R., Bzik, D. J., Honsinger, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+gondii%3A+mechanism+of+the+parasitostatic+action+of+6-thioxanthine%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma gondii: mechanism of the parasitostatic action of 6-thioxanthine.</a> Exp. Parasitol. 99, 235-243 (2001).</li>
<li>Mital, J., Meissner, M., Soldati, D., Ward, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+expression+of+Toxoplasma+gondii+apical+membrane+antigen-1+%28TgAMA1%29+demonstrates+that+TgAMA1+plays+a+critical+role+in+host+cell+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Conditional expression of Toxoplasma gondii apical membrane antigen-1 (TgAMA1) demonstrates that TgAMA1 plays a critical role in host cell invasion.</a> Mol. Biol. Cell. 16, 4341-4349 (2005).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.

Burada hedeflenen gen silme, gen yerine, ve / veya etiketli genlerin sahip genetik olarak manipüle döl etkin kurtarma sağlamak için Δ Ku80 parazit suşları hedef verimli gen için bir protokol sağlar. Bu yöntemlerin ardışık yürütüm 1-3 tek veya birden fazla hedef içeren genetik manipülasyonlar parazit mutantların izolasyonu için güvenilir bir yöntem sağlar. Bir delesyonu üretimi birçok faktöre bağlıdır da, sunulan strateji ve protokole Δ Ku80 suşunun kullanımı büyük ölçüde T. kesin olarak tanımlanmış mutant yapma verimliliği ve kolaylığını arttırmaktadır Fonksiyonel çalışmalar için genomik gondii. T. genomu eşeysiz aşamalarında gondii grubu yarı yarıya edilir. Bu nedenle, bir gen silmek için planlama yapmak için bir göz genin in vitro gerekli olmayabilir olmasıdır. Bununla birlikte, küçük kalkan veriminiΔ Ku80 suşları ting gen tırnakları son derece yüksek olduğunu ve bu önemli ölçüde bozulmuş çoğaltma oranları ile mutant suşların izolasyonu sağlar. Bir hedef gen gerekli ise, parazit genellikle seçimi sırasında çoğaltmak için ateşkes. Hedeflenen genetik manipülasyon bir diğer kritik faktör genomik hedef kanadını en az 620 bp tespit hedeflenen entegrasyon 2 elde etmek için gerekli olan mükemmel bir homoloji olduğunu. Homoloji uzun bölgeleri hedefleyen ve yaklaşık 1000 bp DNA yanları hedef 1-4 güvenilir ve verimli bir yaklaşımdır kullanarak yüksek verim üretmek. Bu nedenle, genomik hedef alan yanları T. Aynı soydan üretilen önemlidir genetik olarak manipüle ediliyor gerginlik olarak gondii (RH, Pru). Yeterli homolojiye eksikliği sıklıkla bir genomik hedef alan yan olarak hedeflenen entegrasyonu ile sonuçlanabilir, ancak diğer olamaz. Eksik entegrasyon veya bir nakavt ma elde etmek için başarısızlıky da epizomal sebat nedeniyle. Hemen transfeksiyon sonra, hedef moleküllerin tüm epizomlar nonintegrated ve bazen hedef moleküller nesiller için epizomlar olarak devam edebilir. ~ 1 Kbp hedef DNA yanları kullanarak ve önceki yeniden alt klonlama için seçimi altında parazitler geçmek için devam sık epizomal sebat ile ilgili sorunları giderir. Bir nakavt doğrulanır ve HXGPRT işareti kaldırıldıktan sonra, gen hedeflemesi stratejisi 1-3 tek bir parazit gerginlik birden fazla gen silme oluşturmak için ikinci bir Goa üzerinde tekrarlanabilir. Silme, değiştirme ya da etiketli genlerin üretimi de farklı seçilebilir belirteçler (bleomisin, CAT, primetamin, dayanıklı DHFR, vs) ile yapılabilir. CAT seçilebilir marker şu tip II Δ Ku80 Pru genom 1 mevcut olsa da, bu işaretçi HXGPRT kullanılarak temizlenebilir </em&gt; seçimi Burada açıklanan protokol. Bizim ellerde, HXGPRT seçimi tek kopyasını hedef ekleme MPA + X orta. HXGPRT sağlam seçimi için yeterli olduğu en yüksek hedef verimlilik ile en güvenli ve en verimli işareti aynı zamanda bir hedeflenen silinmesi için sadece şu anda yararlı bir yaklaşım sağlar 6-thioxanthine (6TX) seçimi 2,3 kullanarak seçilebilir işaretleyici (Şekil 3). Böylece bu protokolü birkaç hedeflenen genetik manipülasyonlar ile tanımlanan mutant suşlar geliştirmek için tek geçerli yaklaşım sağlar. Bu protokol, Toxoplasma gondii Δ Ku80 suşları hedeflenen genetik manipülasyon için bir değerli ve etkili bir yöntem sağlar ve tek bir gen, bir gen ailesi veya genom fonksiyonel genomik çalışmaları analizi için de geçerlidir. Önce Δ Ku80 suşları 1,2 durumu için, bu yaklaşımların ine nedeniyle yaygın olarak mümkün değildiBu yöntemlerin Verim. Sonuç olarak, bu protokol Toxoplasma gondii hedeflenen genetik manipülasyon için yaygın olarak uygulanabilir ve parazit biyoloji, konak cevabı, ve işlevsel genomik üzerinde sorular bir dizi ele ilgilenen tüm araştırmacılar için erişilebilir.

Toxoplasma sık sık ortak bir obligat hücre içi protozoandır kronik ve hayvanlarda ve insanlarda 5 geniş bozar. Bu patojen tarafından 1 milyardan fazla insan şu anda olduğu tahmin ve kronik bulaşmıştır. T. neden olduğu hastalığın öneminin yanı sıra in vitro büyüme ve mükemmel fare modellerinde T. yaptık gondii enfeksiyonu, deneysel araçları, güçlü genomik kaynak 6 artan durumu, kolaylığı gondii hücre içi ökaryot patojenler ve sıtma (Plasmodium sp.) ve Cryptosporidiosis (Cryptosporidium) 5,7 gibi yıkıcı hastalıklara neden diğer önemli Apicomplexan parazitlerin daha geniş çalışma için önde gelen bir model sistem. Bir model organizma olarak Toxoplasma gondii önemli bir sınırlama genetik manipülasyonlar hedef taşımak döl verimsiz kurtarma olmuştur. Bu problemin çözümündeGen hedefleme m, T. yabani tip suşları nonhomologous rekombinasyon çok yüksek frekanslı göre homolog rekombinasyon bir düşük frekans nedeniyle yaygın DNA homoloji genetik çalışmalar 2&#39;de kullanılan DNA hedef moleküller sağlanmaktadır gondii bile. Biz son zamanlarda genetik tip nonhomologous rekombinasyon en önemli yolu bloke Ku80 proteini 1,2 kodlayan gen silerek I ve tip II Toxoplasma gondii suşları. I ve tip II Δ Ku80 suşları normal büyüme oranları, boyut ve in vitro ve in vivo, in vitro olarak taşizoit ve bradizoit aşamaları sırasında ve hem de in vivo davranış sergileyen Elde edilen tipi, ancak, bu suşlar esasen% 100 homolog rekombinasyon frekansını ve bu belgedeki fenotip birkaç Tho için birkaç yüz ile hedeflenen genetik manipülasyon hızla izole istenen döl olasılığını artırırusand kat 1,2,4. Son topluluk çapında I ve tip II Δ Ku80 suşları hızını önemli ölçüde hızlandırıldığını sahip tipi kullanımı çeşitliliği, hem de T. hedeflenen genetik yaklaşımların başarı oranı gondii 1-4,8-13. Burada T. Δ Ku80 suşları hedef gen silme, gen değiştirme, ve gen etiketleme için kapsamlı bir protokol açıklar gondii. Biz tasarım ve güvenilir Toxoplasma gondii Δ Ku80 suşları belirli genleri veya genetik lokus için genetik manipülasyonlar hedef göstermek.

<table><tbody><tr><td>Örtüşme Primerleri</td><td>Entegre DNA Teknolojileri</td><td></td><td>4 nmol Ultramer DNA oligos</td></tr><tr><td>Validasyon Primerleri</td><td>Entegre DNA Teknolojileri</td><td></td><td>100 nmole DNA Oligo</td></tr><tr><td>Maya Suşu #90845</td><td>ATCC</td><td></td><td>Tanımı FY834</td></tr><tr><td>Mekik Vektörü pRS416</td><td>ATCC</td><td>87521</td><td></td></tr><tr><td>DH10B E. coli</td><td>Invitrogen</td><td>12033-015</td><td>E. coli</td></tr><tr><td>Yeniden Süspansiyon Tamponu</td><td>ile</td><td></td> kitte <td>SOC suyu QIAprep Spin Miniprep Kiti</td></tr><tr><td>Miniprep Kiti</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td>QIAprep Spin Miniprep Kiti</td></tr><tr><td>Cam</td><td>Boncuklar Bilimsel Endüstriler</td><td>SI-BG05</td><td>0,5 mm asitle yıkanmış</td></tr><tr><td>Qiacube Otomatik Robotik İş İstasyonu</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Elektroporasyon Küveti</td><td>USA Scientific</td><td>9104-5050</td><td>2 mm boşluklu</td></tr><tr><td>BTX600 elektroporatör</td><td>BTX</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Maxiprep Kiti</td><td>Qiagen</td><td>12662</td><td>QIAprep Spin Maxiprep Kiti</td></tr><tr><td>25 cm2 Eğimli boyun tapası conta şişesi</td><td>Corning</td><td>430168</td><td></td></tr><tr><td>150 cm2 Eğimli Boyun tapa conta şişesi</td><td>Corning</td><td>430823</td><td></td></tr><tr><td>İnsan Sünnet Derisi Fibroblastları (HFF) hücreleri</td><td>ATCC</td><td>SCRC1041</td><td></td></tr><tr><td>Swin-lok Filtre Tutucu</td><td>Whatman</td><td>420200</td><td>25 mm Çaplı</td></tr><tr><td>Membran</td><td>Whatman</td><td>110612</td><td>Nucleopore Parça Aşındırılmış Membran 3 mm gözenek boyutu, 25 mm çaplı</td></tr><tr><td>Mikofenolik asit (MPA)</td> <td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ksantin (X)</td> <td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 Kuyulu Doku Kültürü</td><td>Tepsisi Corning Costar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>24 Kuyulu Doku Kültürü</td><td>Tepsisi Corning Costar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MEM Eagle Media</td><td>Lonza Biowhittaker</td><td>12-611F</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>Gibco</td><td>26140-111</td><td></td></tr><tr><td>Antibiyotik-Antimikotik (Anti-Anti)</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>Spin Kolon Prizmi</td><td> Laboratuvarlar</td><td>PAE-100</td><td>Kolay Temizlenen DNA Ekstraksiyon Sıkma Kiti</td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>New England Biolabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>6-tioksantin</td><td>Acros Organics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Doku DNA Minikit</td><td>Qiagen</td><td>51104</td><td>QIAamp DNA Kan Mini</td></tr><tr><td>Kiti Hücre Kültürü Dondurma/Geri Kazanım Ortamı</td><td>Gibco</td><td>126-48-010</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat Tamponlu Salin Hidroklon</td><td></td><td>SH30028.02</td><td>eksi kalsiyum, eksi magensium</td></tr></tbody></table>

genetik manipülasyon<em&gt; Δku80</emfonksiyonel genomik analiz&gt; suşlarının<em&gt; toxoplasma gondii</em

Genetic Manipulation in &Delta;ku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii

Homolog rekombinasyon kullanılarak hedef genetik manipülasyon gen fonksiyonu ve fenotip (ler) daha ayrıntılı bir görünümünü elde etmek için işlevsel genom analizleri için tercih edilen bir yöntemdir. Hedeflenen gen silme, hedef mutasyonlar, tamamlanmaktadır gen fonksiyonu ve / veya etiketli genleri ile mutant suşlar gelişimi bu genetik manipülasyonlar verimli çift tarafından entegrasyon aracılı ile ilgi gen odağı hedeflenebilir özellikle, gen fonksiyonu yönelik güçlü stratejiler sağlar homolog rekombinasyon üzerinde çapraz. Toxoplasma gondii nonhomologous rekombinasyon, fonksiyonel genomik analiz çok yüksek oranları nedeniyle daha önce belirli genetik lokus için gen silme ve gen değiştirmeleri hedef için etkin yöntemler yokluğu ile sınırlı kalmıştır. Son zamanlarda, tip I ve tip II T. suşları nonhomologous rekombinasyon en önemli yolu kaldırıldı Gen encodin silerek gondiig Ku80 proteini 1,2. Δku80 suşları taşizoit (akut) ve in vitro ve in vivo olarak bradizoit (kronik) aşamaları esnasında normal olarak davranır ve homolog rekombinasyon esasen% 100 frekanstan sergiler. Δ Ku80 suşları tek gen yanı sıra genom ölçekli 1-4 fonksiyonel genomik çalışmalar mümkün olun. Burada, I ve tip II Δku80Δhxgprt suşları T. gen hedef yaklaşımlar geliştirmek için türünü kullanarak yöntemleri rapor gondii. Biz hipoksantin-ksantin-guanin phosphoribosyltransferase (HXGPRT) seçilebilir marker hedef ekleme veya silme ile gen silme, gen yerine, ve etiketli genleri oluşturmak için etkin yöntemler özetlemektedir. Protokol hedef geni tarif parazit genomunun fonksiyonel analiz ilerlemek için ve taşıma tek suşları geliştirmek Δku80 suşları çeşitli şekillerde kullanılabilirçoklu genetik manipülasyonlar hedef. Bu genetik yöntem ve sonraki fenotipik testlerin uygulanması T. biyolojisi temel ve eşsiz yönlerini ortaya çıkaracaktır gondii ve sıtma (Plasmodium sp.) ve kriptosproidiyozis (Cryptosporidium) neden ilgili önemli insan patojenleri.

Ayrıntılı bir şablon restriksiyon enzim bölgesi yerleştirilmesi ve bir de HXGPRT arasında sürekli silme için genetik hedefleme ve gen doğrulama hedef, hem de plazmit yapımını kolaylaştırmak primerlerin üretimi de dahil olmak üzere bir gen silmek için bir hedefleme plazmid oluşturmak için sağlanan Tek aşamalı bir süreç (Şekil 1A-C, Şekil 2A, Şekil 3A). Genel şematik olarak, örneğin, bir hedef gen silinmesi (Şekil 2A), bir nakavt silme doğrulamak için kullanılan bir primer çifti yapmak için sunulmuştur, tip I rop18 (Şekil 2B), ve bir PCR doğrulama için temsili sonuçlar gösterilmektedir (Şekil 2C). Bu temsili bir sonuç hedef nispeten zor olan genetik lokus elde edilebilir sonuçlar aralığını göstermek için gösterilir. Başarılı bir şekilde hedeflenen gen silme geninin olmaması ile sonuçlanacaktırzasyonu PCR ürünü (PCR 1), 3 varlığı &#39;genomik hedef kanadını (PCR2) ve düzgün 5 arasında entegre HXGPRT seçilebilir marker varlığı&#39; ve (PCR3 ve PCR4) silme tanımlamak 3 &#39;genomik hedef yanları . Klonlar, 3, 4, 5, 6, 8, 9 ve 11 HXGPRT Goa (Şekil 2C) yerini alan hedefli gen delesyonlu (tırnaklar) doğrulanır. Bir gen silinmesi içermeyen bir klon bantlama desenleri çeşitli ile temsil edilebilir. Tipik olarak, bir gen silinmesi olmayan bir klon PCR1 ve PCR2 için gözlenen bantlar ile ebeveyn suş (ebeveyn deseni) ayna değil, klon 1 ve 2 (Şekil 2C) için görüldüğü gibi PCR3 veya PCR4 süreliğine. Bu &quot;ebeveyn model&quot; birkaç potansiyel mekanizmaları doğar. Bazen, MPA dayanıklı seçilen parazit plazmid hedef pΔGOI bir nonintegrated kalıcı epizomlar taşımak, ve biz devam seçimi genellikle bu epizomlar zorlar unutmayınentegre. Biz de Δ pΔGOI istenmeyen entegrasyonu nedeniyle Ku80 gerilme DHFR 5 &#39;ve 3&#39; promotör elemanları, DHFR lokus ya da içine ya da kısmen silinmiş HXGPRT içine ile ifade edilen bir HXGPRT cDNA ihtiva eden plazmid hedef türü bazı nadir arka gözlemlemek odağı 14. Bu nadir bir olay bir hedef entegrasyon iken, amaçlanan entegrasyon değildi ve herhangi bir gen değiştirme stratejisi tasarımında hatırlamak önemli bir nokta olarak hizmet vermektedir. Hedefleme pΔGOI devam 120 bp daha büyük DNA homoloji plazmid istenmeyen bir arka plan geri verebilir Δ Ku80 suşları 2 rekombinasyon için bir alternatif site sağlayabilir. HXGPRT seçilebilir işaret türü tip II DNA ile karşılaştırıldığında nükleotid polimorfizmleri var ben dizileri dayalı olduğu için tip II Pru Δ Ku80 gerginlik bu arka plan azaltılabilir veya varolmayan tip I ile karşılaştırıldığında hangibüyük ölçüde, tip II Pru Δ Ku80 suşu 1 kullanılarak yapılan deneyler, bu nadir arka azaltır. Bir gen lokusu (silinemez) esastır, ya da lokustaki frekans hedef, ya da son derece düşük bir gen varsa eğer epizomlar kolayca büyüme ve seçim yoluyla ortadan değildir [nonintegrated], bu ebeveyn desen MPA gözlenen desen hakim olacak ısrar dirençli klonlar. Alternatif olarak, hedef DNA molekülü bazen sadece 5 &#39;ya da 3&#39; genomik hedef alan yan ve bir grup (ama ikisini değil) Klon 10 görüldüğü gibi PCR1 ve PCR2 ile birlikte (5 PCR3 veya PCR4 ya da görülmektedir bütünleşmeyen görülmektedir &#39;entegrasyon) ve klon 7 (3&#39; entegrasyon) (Şekil 2C). Bu modeller HXGPRT entegre ama bu hedef entegrasyon ilgi gen silmez lokustaki hedef plazmid entegrasyonu üzerinden tek bir haç pek rastlanmayan öneririz. Bu model (şerit 7 ve Şekil 2C 10) emBu hedeflenen entegrasyon yerine meydana doğrulamak için PCR verileri rapor ihtiyacı phasizes tek homolog üzerinde çapraz ve hedef molekülün bir nonhomologous ikinci entegrasyon. Nadiren, bir ebeveyn desen ve bir hedef silme desen de temsil klon 12 (Şekil 2C) tarafından temsil edilen bir genetik karışım görüyoruz. Bu model büyük olasılıkla iyi bir klonlama aynı yerde mevcut iki parazit genotip gelen vesilesiyle ortaya çıkar. Δ ku80Δgoi ikinci HXGPRT ortadan kaldırılması için genel bir şematik :: HXGPRT suşundan HXGPRT silmek için (Şekil 3A) gösterilmiştir. Klon 4, 7, 9, 11 ve 12 (Şekil 3C) &#39;de görüldüğü gibi Δ Ku80 Δ gra2 :: HXGPRT (Şekil 3B) HXGPRT çıkarılması doğrulamak için kullanılan bir primer çifti PCR5 benzersiz ~ 1.2 Kbp bant güçlendirir. HXGPRT odağı, bir ~ 3 kaldırılır değilse.4 Kbp bant (klon 1, 2, 3, 6, 8, 10, ve ebeveyn kontrolü) görülmektedir. Çeşitli mekanizmalar HXGPRT ortadan kaldırılması (6TX seçimi) daha zorlu ve HXGPRT bütünleştirilmesi (MPA + X seçimi) daha az verimli hale getirmek için hareket ederler. MPA seçimi 6TX seçimi 14,16 daha sadece daha fazla etkilidir. Buna ek olarak, HXGPRT ifade yüksek düzeyde MPA seçim 16,24 için daha 6TX seçimi için ihtiyaç vardır. Sonuç olarak, HXGPRT enzim aktivitesi veya mutasyon ya da bir genin lokus HXGPRT ifade seviyesini azaltmak epigenetik değişiklikler azaltabilir mutasyonlar potansiyel 6TX seçimi etkinliğini ortadan kaldırabilmektedir. Hatta 6TX seçimi bu zorluklarla, Δ Ku80 suşları 6TX seçimi başarı oranı 1-3 ilk denemede% 90 daha büyüktür. Protein kodlayan genlerin doğrudan C-terminal etiketleme için genel bir şeması (Şekil 4) gösterilmiştir. Budüzeni etiketli HXGPRT geninin 3 &#39;arasında homolog rekombinasyon üzerinden çift çapraz yoluyla doğrudan entegrasyon kullanır ve aynı zamanda yukarıda tarif edilenlere benzer bir doğrulama stratejiler kullanılmaktadır. Bir gen Bu plazmid bir bağımsız izole hedef DNA ile ikinci bir transfeksiyon kullanılarak doğrulanabilir önemli bir gen olduğundan şüphelenilen zaman. Bu tür düzenleyicili gen ifadesi için düzenleri gibi alternatif yöntemleri, bir gen 25 gerekli ise daha fazla doğrulamak için kullanılabilir. <img alt="Şekil 1" fo:content-width="6.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50598/50598fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50598/50598fig1.jpg" /> Şekil 1. Plazmid DNA, bir hedefleme tasarımı nedeniyle genel bakış. Tasarımı için bir. Şematik PCR pRS416 servis vektör ve HXGPRT minigen kaset için 33 bp çakışıyor ile 5 &#39;ve 3&#39; hedef yanları yükseltmek için kullanılan astar üst üste. Şematik tasvir Astarlar vardı5 &#39;ve 3&#39; pΔROP18 10 hedef yanları. bir hedef DNA molekülü tasarımı B. Genel strateji oluşturmak için kullanılır. PΔGOI omurgası pRS416 servis vektör içeren urasil (URA) ve ampisilin (AMP) seçilebilir işaretleri olduğunu. Bir ~ 1 Kbp 5&#39;tir pRS416 takılan &#39;F1 ve R1 primerler kullanılarak HXGPRT minigen kaset ve pRS416 için çakışıyor ile genomik DNA amplifiye DNA hedef kanadında, bir ~ 1 Kbp 3&#39; DNA hedef kanadı için çakışıyor ile genomik DNA yükseltilir HXGPRT minigen kaset ve F2 ve R2 astar ve HXGPRT minigen kaset kullanarak pRS416. Aşağıdaki benzersiz kısıtlama enzim sindirimi siteleri astar eklenir: F1 astar RE.X (kısıtlama enzim X kesim sitesi) R2 RE.Y, DNA hedef kanadını 5 &#39;5 sonunda&#39; plazmid kesmek için tüketim HXGPRT min R1 ve F2 astar DNA hedef yan ve RE.Z 3 &#39;3 sonunda&#39; plazmid kesmek için astarrop18 bölgesinin silinmesi için hedef yapı oluşturmak için kullanılan igene kaseti. ° C. Primer dizileri. kalın bölgeler T. uygun gondii&#39;den genomik dizisi ve nonbold bölgeler pRS416 ve HXGPRT minigen kaseti ile üst üste restriksiyon enzim bölgesi ve sekanslarına karşılık gelir. HX_F ve HX_R primer çifti HXGPRT minigen kaset 14 güçlendirir. Primerler 5&#39;ten-3 &#39;okuyun. Fentress ve arkadaşları 10 uyarlanan Tablo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50598/50598fig1large.jpg" target="_blank">büyük rakam görmek için buraya tıklayın</a> . <img alt="Şekil 2," fo:content-width="6.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50598/50598fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50598/50598fig2.jpg" /> Şekil 2. HXGPRT kullanarak bir geninin iptali için protokol genel bir bakış. Bir. Disruption çift çapraz tarafından Δ ku80Δhxgprt gerginlik bir Goa bir ~ 1 Kbp 5 &#39;DNA hedef yan ve bir ~ 1 Kbp 3&#39; plazmid pΔGOI DNA hedef yan kullanarak homolog rekombinasyon olay. Bir PCR PCR1 kullanarak strateji, PCR2, PCR3 ve PCR4 (ölçekli değildir) GOI odağı hedef HXGPRT entegrasyonu ve silme ile klonlar doğrulamak için genotip doğrulama sağlayan gösterilmiştir. B. Örnek primer çiftleri rop18 en silme doğrulamak için tasarlanmıştır . ROP18_DF ve ROP18_DR PCR1, ROP18_ExF ve ROP18_CxR PCR2, ROP18_CxF ve DHFR_CxR PCR4 (Şekil 2A bakınız) yükseltmek PCR3 ve DHFR_CxF ve ROP18_CxR yükseltmek yükseltmek yükseltmek. Primerler 5&#39;ten-3 &#39;okuyun. Tablo Fentress ve ark HXGPRT kullanarak bir hedef gen silme (rop18) doğrulama 10. C. Temsilcisi sonuçları adapte. MPA içinde Δ ku80Δhxgprt ve seçim haline plazmid pΔROP18 takiben transfeksiyon +X, MPA + X dirençli klonlar rop18 en silinmesi için test edildi. Ebeveyn gerginlik kontrolü PCR 3 (~ 1.200 bp) ve PCR için PCR 1 (~ 400 bp) ve PCR 2 (~ 650 bp) ürün için pozitif ve negatif 4 (~ 1.300 bp) ürün. Bir hedef Goa nakavt PCR2, PCR3 ve PCR4 ürünleri için pozitif ve (Şekil 2A bakınız) PCR 1 ürün için negatiftir. Gösterildiği PCR1 ve PCR2 (üst panel) sonuçlarını temsili paneller PCR3 (orta panel) ve PCR4 (alt panel) vardır. Klonlar, 3, 4, 5, 6, 8, 9 ve 11 klon hedeflenen bir gen silinmesi olayları tanımlar PCR 1, PCR2, PCR3 ve PCR4 arasında doğru bir bant deseni gösterir. Klonlar, 1, 2, 7, 10 ve 12 gen silme değildir ve diğer potansiyel temsili sonuçlar karşılık gelmektedir. (C = ebeveyn kontrol suşu Δ ku80Δhxgprt, M = boyutu işaretleri). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50598/50598fig2large.jpg" target="_blank">büyük rakam görmek için buraya tıklayın</a> . <img alt="Şekil 3," fo:content-width="6.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50598/50598fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50598/50598fig3.jpg" /> Şekil 3,. İlgi konusu genin HXGPRT silmek için yeniden hedefleme için protokol bakış. Çift çapraz tarafından HXGPRT seçilebilir marker çıkarılması gerginlik Δ ku80Δgoi homolog rekombinasyon olay :: HXGPRT bir ~ 1 Kbp 5 &#39;DNA hedef yan ve bir ~ 1 Kbp 3&#39; plazmid pΔGOIc DNA hedef yan kullanarak A. Stratejisi. Genotip doğrulama için PCR stratejisi (ölçekli değildir) silme yayılan bir PCR ürünü (PCR5) için test için bir primer çifti kullanılarak tasvir edilmiştir. B. gra2 gelen HXGPRT seçilebilir marker çıkarılması doğrulamak için tasarlanmış bir temsilci primer çifti gerginlik Δ ku80Δgra2 içinde odağı :: HXGPRT. Astarlar GRA2 _CLF ve GRA2_CxR PCR5 yükseltmek. Astarlar<html> 5 ila 6TX içinde Δ ku80Δgoi :: HXGPRT ve seçim plazmid pΔGOIc arasında aşağıdaki transfeksiyon elde edilebilir 6TX dirençli klonların. ° C. Örnek paneli-3 &#39;okuyun. Klonlar 4, 7, 9, 11 ve 12 HXGPRT marker hedef silme (~ 1.2 Kbp ürün olduğunu kanadını &#39;5 ile hafif üst üste yan&#39; ve 3 &#39;dışında 3 açıklıklı karşılık PCR5 en doğru bantlama desen sergilemek yan). Klonlar 1, 2, 3, 6, 8, ve 10 (bu grup hafif) Bu klonlar izin 6TX direnç bir ölçüde sergiledi rağmen, ebeveyn klon genotip karşılık 3.4 Kbp ~ yaklaşık beklenen bant deseni temsil kendi seçimi (bu fenotip zaman (protokol 2.1 (adım 8) olarak not ve Temsilcisi Sonuçlar bölümüne bakın) kapatma HXGPRT ifade ile kendiliğinden ortaya çıkabilir. (C = ebeveyn kontrol suşu Δ ku80Δgoi :: HXGPRT, M = boyutu işaretleri).w.jove.com/files/ftp_upload/50598/50598fig3large.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; büyük rakam görmek için buraya tıklayın. <img alt="Şekil 4," fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50598/50598fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50598/50598fig4.jpg" /> Şekil 4. Bir proteinin C-terminal ucuna etiketlemek için bir hedef DNA molekülünün tasarımı. Stratejisi aynı zamanda bir 3 &#39;alt düzenleyici bölge olarak işlev HXGPRT marker yeteneğine dayanır. PΔGOItag omurgası pRS416 servis vektör içeren urasil (URA) ve ampisilin (AMP) seçilebilir işaretleri olduğunu. DNA hedef kanadını için çakışıyor ile genomik DNA amplifiye bir ~ 1 Kbp 5 &#39;Fgoi ve rtag astar, bir ~ 1 Kbp 3 kullanarak HXGPRT minigen kaset ve pRS416 için çakışıyor ile genomik DNA amplifiye DNA hedef kanadını&#39; olduğunu pRS416 takılı F2 ve R2 ile HXGPRT minigen kaseti ve pRS416astar ve HXGPRT minigen kaset. 5 &#39;DNA hedef yan yerine bitirme kodonunun izlediği etiketi (HA, myc, His, vs) bir sonlandırma kodonu ile değiştirir. MPA + X seçimi ve C-terminal etiketi ve bir alt-HXGPRT entegre ve HXGPRT işaretleyici aşağıdaki bir konuma 3 &#39;UTR hareket eder. Aşağıdaki benzersiz kısıtlama enzim sindirimi siteleri astar eklenir: Fgoi astar RE.X (kısıtlama enzim X kesim sitesi) DNA hedef yan 5 &#39;5 sonunda&#39; plazmid kesilmiş ve RE.Y &#39;de plazmid yapımı için kullanımına yeniden hedef etiketli gen lokusu silmek için HXGPRT minigen kaset tüketim için rtag ve F2 astar olarak DNA hedef kanadını 3 &#39;3 sonunda&#39; plazmid ve RE.Z kesmek için R2 astar 3 &#39;UTR yerleştirilmesi geri yüklenir HXGPRT işareti.

Burada, tip I ve tip II olarak kullanmak için bir yöntem rapor<em&gt; Δku80</emBir&gt; suşları<em&gt; Toxoplasma gondii</em&gt; Verimli bir şekilde işlev genom analizleri için hedeflenen gen silme ve gen yedek elde etmek için.

Genetik Manipülasyon<em&gt; Δku80</emFonksiyonel Genomik Analiz&gt; Suşlarının<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene ...

Bu prosedürün genel amacı, Toxoplasma gondii'nin tip bir ve tip iki delta iki 80 suşlarını kullanarak verimli ve güvenilir gen değişimi gerçekleştirmektir. Bu işlem, öncelikle belirgin beş prime ve üç prime gen hedefleme DNA yan bölgeleri arasında, ileri yönelimde HX GPRT seçilebilir işaretçiyi birleştiren bir hedefleme DNA molekülünün oluşturulmasıyla gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, hedefleme DNA molekülünün tip bir veya tip iki toxoplasma DYI suşuna transfekte edilmesidir.Üçüncü adım, çift çaprazlama homolog rekombinasyon olaylarını sabırla seçmek ve bireysel klonları izole etmektir. Son adım ise izole edilen mutant klonlarda gen hedefleme olayının gerçekleştiğini doğrulamaktır. Nihayetinde, bu prosedürün sonuçları; hedeflenmiş gen nakavtlarının, gen değişimlerinin ve etiketli genlerin çeşitli alt uygulamalar aracılığıyla analizi ile parazit genlerinin fonksiyonlarını ortaya koyabilir.Bu tekniğin, bu parazitin vahşi tip suşlarını kullanan mevcut yöntemlere göre temel avantajı, tip bir ve tip iki delta iki 80 parazit arka planlarının, artık hassas şekilde genetik olarak tanımlanmış suşlar üretmek için hedeflenen çift çaprazlama homolog rekombinasyon olaylarının son derece güvenilir bir şekilde seçilmesine olanak tanımasıdır. Bu teknik, özellikle online@toxodb.org adresinde bulunan iyi tasarlanmış genomik kaynaklarla birlikte kullanıldığında, antitoksin plazma ilaç tedavisi için yeni hedeflerin keşfini ve güvenli ve etkili atenüe aşı suşlarının geliştirilmesini büyük ölçüde hızlandıracaktır. Genel olarak, bu yöntemde yeni olan kişiler, hedeflenen DNA moleküllerinin mühendisliği veya Toxoplasma Gandhi ile yapılan genetik manipülasyonlar konusunda zorluk yaşayabilirler.Ancak, hastaların uygulamaları ve güvenilir hedefleme moleküllerinin tasarımı başarıyı sağlayacaktır. Protokole, ilgilenilen gen için genomik DNA'dan beş prime ve üç prime genomik hedefleme yan bölgelerini PCR ile amplifiye ederek başlayın. Ardından, HX GPRT CD NA mini gen kasetinden HX GPRT seçilebilir marker'ı, beş prime ve üç prime DHFR yan bölgeleriyle birlikte PCR ile amplifiye edin.3D NA moleküllerini, plazmid PRS 416 ile doğru beş prime'dan üç prime yöneliminde birleştirmek için maya rekombinasyonu veya benzeri bir yöntem kullanın; böylece ilgi duyulan gendeki delesyonu hedefleyecek p delta GOI plazmidini oluşturun. Ardından, konfluente HFF hücrelerinin bulunduğu 25 santimetrelik bir flaskın inokülasyonundan 72 ila 68 saat sonra T gia'ya transfekte edilmek üzere, 15 ila 30 mikrogram lineerize edilmiş hedefleme plazmidi içeren 100 mikrolitrelik bir örnek hazırlayın. HFF hücrelerinin %90 ila %95'inin lizis olduğunu görsel olarak onaylayarak yeni lizis olmuş parazitlerin varlığını doğrulayın; gen hedefleme için canlı parazitler esastır.Sıvının kapak içine veya balonun boynuna sıçramamasına dikkat ederek, kapalı balonu kuvvetlice sallayıp canlı parazitleri çözelti içinde homojenize edin. Parazitleri balondan toplayın ve metin protokolünde açıklandığı şekilde transfeksiyon için hazırlayın. Hedefleme plazmidini delta CO 80 toxoplasma sucuna elektroporasyon yöntemiyle aktarın.Elektropore edilmiş karışımı, konfluen HFF hücreleri ve 30 mililitre enfeksiyon besiyeri içeren 150 santimetrelik bir flaska aktarın. Enfekte kültürü 37 degrees Celsius'de gece boyunca inkübe edin; transfeksiyondan yaklaşık 20 saat sonra besiyerini MPA artı X seleksiyon besiyeri ile değiştirin.Şimdi parazitlerin yaklaşık sekiz gün boyunca 37 °C'de inkübe olmasına izin verin. Rahatsız edilmeden. Plaklar görünür hale geldiğinde, hücre tabakasından hücre dışı parazitleri ayırarak bir parazit çözeltisi oluşturmak için balonu sallayın. Parazit çözeltisinin yaklaşık yarım mililitresini, beş mililitre MPA artı X seleksiyon ortamı içeren, konfluent HFF hücreleri bulunan yeni bir 25 cm balona aktarın.Yaklaşık üç gün sonra bu kültürü PAs one A olarak adlandırın. Parazit solüsyonunun yarım mililitresini orijinal flasktan, aynı seleksiyon ortamına sahip başka bir HFF hücre flaskına aktarma işlemini tekrarlayın. Sonraki beş gün boyunca bu kültürü PAs one B olarak adlandırın.pfu için pasaj bir A ve pasaj bir B'yi izleyin. 25'ten fazla enfeksiyon bölgesi şeklinde yeterli sayıda bölgeye dayanarak alt klonlama için pasaj bir A veya pasaj bir B'den birini seçin. Parazitler HFF hücrelerini lizledikçe, kültürü konfllüent HFF hücreleri içeren yeni bir 25 santimetrelik flaska seçici besiyeri ile aktarın; transfeksiyondan üç hafta sonra, parazitleri MPA artı X besiyeri içinde uygun konsantrasyona seyrelterek ve parazit solüsyonunu konfllüent HFF hücreleri içeren 96 kuyucuklu bir taba eşit şekilde dağıtarak taze olarak ekilen parazitlerden alt klonlama yapın.Bir tepsiyi kuyuk başına bir parazit konsantrasyonunda ve ikinci bir tepsiyi kuyuk başına iki parazit konsantrasyonunda hazırlayın. Her iki tepsiyi de orijinal transfeksiyon tarihinden sonra 37 °C'de inkübe edin. Birinci tip parazitler için 20. günden, ikinci tip parazitler için ise 25. günden önce parazitleri subklonlamayın.Nakavt suşu doğrulanana kadar, 25 santimetrelik flaskı çevrimiçi metinde açıklandığı şekilde haftalık programla geçirmeye devam edin. Yaklaşık bir hafta sonra, 96 kuyucuklu plakaları 40 ila 60 x büyütme altında değerlendirin. 50 microliters ayarlı bir pipet kullanarak, tek bir enfeksiyon bölgesi olarak tanımlanan tek bir PFU içeren kuyucukları seçin.Sıvı akışını PFU üzerine yönlendirerek bu kuyucukların içeriğini karıştırın ve parazitleri kuyucuğun etrafına dağıtın. Seçilen kuyucuklar karıştırıldıktan dört ila beş gün sonra, lizis geçirmiş hücrelere sahip bir düzine klon seçin. 96 kuyucuklu tepsiden 12 klonu, 24 kuyucuklu bir tepsinin 12 kuyucuğuna aktarın. Bunu, bir pipet ucuyla kuyucuğun tabanını sıyırarak ve 6 µL çekerek yapın.Çözeltiyi, 1 mL MPA artı X seçici besiyerindeki konfluen HFF hücrelerinin bulunduğu 24 kuyucuklu bir tabağın kuyucuğuna aktarın. 24 kuyucuklu tabağı 37 °C'de inkübe edin ve HFF hücrelerinin lizisini izleyin. 24 kuyucuklu tabaktaki lizis gerçekleşmiş bir kuyucuktan parazitleri haftalık düzenle pasajlayın.Parazit solüsyonundan iki µL'yi, MPA ve X seçilimli yeni bir plakaya aktarmak için çizme ve çizgi çekme tekniğini kullanın. Pasajdan sonra, parazitleri orijinal 24 kuyucuklu tepsiden hasat edin ve DNA toplama işlemi için küçük tüplere aktarın.Bitirmek için, 5' ve 3' hedef flanklarının entegrasyonunu kontrol etmek amacıyla ilgilenilen genin delesyonunu test etmek için PCR kullanın. Ayrıca HX GPRT seçilebilir markörünün varlığını kontrol edin. Bu protokol, manipüle edilmiş delta Q 80 suşundan HX GPRT markörünün uzaklaştırılmasına yöneliktir ve çevrimiçi metinde ana hatları belirtilmiştir.P delta GOYC, altı TX besiyeri kullanılarak yapılan negatif seleksiyon ile parazitten HX GPRT'nin uzaklaştırılmasını hedefler. Ardından, HX GPRT'nin lokustan uzaklaştırılmadığı durumda görülen 1.2 Kilobaz çift bandı ile karşılaştırılarak, kaybın doğrulanması için PCR kullanılır. 3.4 kilobaz çiftlik bir bant bulunmaktadır.Bu protokolün son bölümü olan proteinlerin C-terminali etiketleme işlemi, çevrimiçi metinde ayrıca ayrıntılı olarak açıklanmıştır; hedeflenmiş bir gen delesyonu oluşturmak için ana hatları belirtilen protokol izlendikten sonra, hedeflemesi genellikle zor olan bir bölge olan tip bir R 18'in nakavt delesyonunu doğrulamak için PCR kullanılmıştır. PCR 1, R 18 gen PCR ürününün yokluğunu göstermektedir.PCR 2, 3' uç R 18 genomik hedefleme flankının varlığını göstermektedir; PCR 3 ve PCR 4 ise seçilebilir markörün 5' ve 3' genomik hedefleme flankları arasına düzgün bir şekilde entegre olduğunu göstermekte olup bu durum R 18 delesyonunu tanımlamaktadır. Bir suşta sonraki delesyonları yapmak için seçilebilir markörü yeniden kullanabilmek adına, orijinal HX GPRT önce lokustan uzaklaştırılmalıdır. Belirtilen protokole uyulduktan sonra.Strain delta iki 80 delta GRA iki'de, silinen GRA iki lokusundan HX GPRT uzaklaştırıldı. HX GPRT kaybı, 1.2 kbp'lik bir bant ile gösteren HX GPRT-PCR kullanılarak doğrulandı. HX GPRT uzaklaştırılmadığında, başlangıç gen hedefleme adımını takiben 3.4 kbp'lik bir bant görüldü. Aynı tip bir veya tip iki suşta çoklu nakavtlar oluşturmak veya, "bu protein hücrede nereye yerleşir?" gibi ek soruları yanıtlamak için mutant bir suşu etiketlemek veya tamamlamak amacıyla ek gen hedefleme yöntemleri uygulanabilir.Veya bu proteinin veya yolağın biyolojik fonksiyonunu açıklayan temel alanı veya aktivitesi nedir? Bu teknik, alandaki araştırmacıların model AP kompleksi ve parazit Toxoplasma'da parazit gen fonksiyonu araştırmalarını artırmalarının önünü açmaktadır. Gandhi eye.Toxoplasma ile çalışmanın tehlikeli olabileceğini ve tüm BSL 2 kılavuzlarına uyulması gibi önlemlerin prosedür boyunca sürdürülmesi gerektiğini unutmayın.

genetic-manipulation-ku80-strains-for-functional-genomic-analysis

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

İleri genetik, moleküler düzeyde nasıl aydınlatmak için güçlü bir...

Isolate A Genetik Ekran Toxoplasma gondii Host-hücre çıkış Mutants

Hücre biyolojisinde temel bir arayış ökaryotik hücrelerin yapmak organellerin kimliği altında yatan mekanizmaları belirlemektir. Burada floresan mikroskobu ve yeni nesil dizileme araçlarını kullanarak bitki organel morfolojik ve fonksiyonel bütünlüğü sorumlu genleri tanımlamak için bir yöntem öneriyoruz.

Floresans-mikroskopi Tarama ve nesil Sekanslama: organel Bütünlüğü ile ilgilendim Genlerin belirlenmesi için Faydalı Araçlar

Sistematik, büyük ölçekli sentetik gen (bir gen ya da gen-epistasis) etkileşim ekranlar genetik ve fazlalık yolu çapraz konuşma keşfetmek için kullanılabilir. Burada, yüksek-throughput kantitatif sentetik genetik dizi tarama teknolojisi tarif eSGA biz epistatik ilişkileri durulaştırmada ve genetik etkileşim ağları keşfetmek için geliştirilen...

Bakteriyel Fonksiyonel Ağlar ve tanımında Haritalama<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; Sentetik Genetik Diziler kullanarak

Biz kimyasal mutagenez ve tüm genom dizileme dayalı Chlamydia genetik analiz gerçekleştirmek için bir metodoloji tarif. Buna ek olarak, enfekte olmuş hücrelerde DNA'nın değişimi için bir sistem genetik haritalama için kullanılabilir olduğu tarif edilmektedir. Bu yöntem dönüşüm sistemleri ve moleküler genetik araçları eksik mikrobiyal sistemlerine geniş uygulanabilir.

Ileri Genetik Yaklaşımlar<em&gt; Chlamydia trachomatis</em

İleri genetik, hücre otonom bağışıklığına direnç için önemli olan hücre içi patojenlerdeki genleri tanımlamak için güçlü bir yaklaşımdır. Mevcut yaklaşım, bağışıklık kaçışı için önemli olan yeni Toxoplasma gondii genlerini tanımlamak için doğuştan gelen bağışıklık hücrelerini, özellikle makrofajları kullanır.

İleri Genetik tanımak makrofajlar kullanılarak Ekranlar<em&gt; Toxoplasma gondii</em&gt; Genler önemli direnç için IFN-γ-bağımlı hücre otonom bağışıklık

Coxiella burnetii zoonotik hastalık Q ateşi sorumlu zorunlu hücre içi Gram-negatif bir bakteridir. Burada Coxiella flüoresan transpozon mutantlarının üretimi yanı sıra otomatik tanımlama ve elde edilen içselleştirme, çoğaltma ve sitotoksik fenotipleri analizi için yöntemleri tarif eder.

Üretim ve Çok fenotipik Yüksek içerik Eleme<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Transposon Mutantlar

Detaylar, Toxoplasma gondii'de bir ilaca direnç genini tanımlamak için bütün genom dizisi tabanlı bir genetik harita ile QTL haritalamasının nasıl kullanılacağı ve bunun, bir genomik hedefi verimli bir şekilde düzenleyen CRISPR / Cas9 sistemi ile nasıl doğrulanabileceği üzerine sunulmaktadır; bu durumda Ilaç direnci geni.

QTL Haritalama ve CRISPR / Cas9 Düzenlemesi, bir İlaç Direnç Geninin Belirlenmesi için<emToksoplasma gondii</em

Burada sunulan bir luciferase tabanlı büyüme tsay kullanarak Toxoplasma gondii in vitro hücre içi büyümeye karşı kimyasal bileşiklerin inhibisyon etkinliğini değerlendirmek için bir protokoldür. Bu teknik, ilgili hedef genin genetik olarak silinmesi ile inhibisyon özgüllüğünü doğrulamak için kullanılır. LHVS'nin TgCPL proteaza karşı inhibisyonu örnek olarak değerlendirilmektedir.

Luciferase Tabanlı Büyüme Testini Kullanarak Hücre İçi Toksoplazma Gondii Büyümesine Karşı Kimyasal Inhibitör Verimliliğin Belirlenmesi

Bu protokol, CRISPR/Cas9 gen düzenleme araçlarıyla çalışmak üzere optimize edilmiş Culex quinquefasciatus embriyoları için mikroenjeksiyon prosedürlerini açıklar. Bu teknik, bu yetersiz hastalık vektörde genetik teknolojiler oluşturmak için kullanılabilecek bölgeye özgü, kalıtsal, germline mutasyonlarını verimli bir şekilde üretebilir.

Culex quinquefasciatus'ta Verimli Bölgeye Özgü Mutagenezi için Embriyo Mikroenjeksiyon Teknikleri

Burada, seçilmiş genetik belirteçlerin taşınabilir nanopore dizileme kullanılarak Toxoplasma gondii suşlarını hızlı tanımlama ve genotipleme protokolü sunuyoruz; bu protokol, laboratuvarda bakımı yapılan izolasyonlarda ölçeklenebilir, hedeflenmiş suş tanımlamasını mümkün kılacak ve gelecekte gözetim ortamlarında uygulanabilecek bir yöntemdir.

Toxoplasma gondii için Sürün Tipi için Çok Lokus Dizileme

Öğrenin Toxoplasma gondii'de gen hedefleme protokolünü Δku80 suşları kullanarak. Bu yöntem, homolog rekombinasyon ve HXGPRT seçilebilir belirteci ile gen silme, değiştirme ve etiketleme işlemlerini hızlandırır.

Genetik Manipülasyon

Daha fazla video keşfet