Genetik Manipülasyon

Bu prosedürün genel amacı, Toxoplasma gondii'nin tip bir ve tip iki delta iki 80 suşlarını kullanarak verimli ve güvenilir gen değişimi gerçekleştirmektir. Bu işlem, öncelikle belirgin beş prime ve üç prime gen hedefleme DNA yan bölgeleri arasında, ileri yönelimde HX GPRT seçilebilir işaretçiyi birleştiren bir hedefleme DNA molekülünün oluşturulmasıyla gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, hedefleme DNA molekülünün tip bir veya tip iki toxoplasma DYI suşuna transfekte edilmesidir.

Üçüncü adım, çift çaprazlama homolog rekombinasyon olaylarını sabırla seçmek ve bireysel klonları izole etmektir. Son adım ise izole edilen mutant klonlarda gen hedefleme olayının gerçekleştiğini doğrulamaktır. Nihayetinde, bu prosedürün sonuçları; hedeflenmiş gen nakavtlarının, gen değişimlerinin ve etiketli genlerin çeşitli alt uygulamalar aracılığıyla analizi ile parazit genlerinin fonksiyonlarını ortaya koyabilir.

Bu tekniğin, bu parazitin vahşi tip suşlarını kullanan mevcut yöntemlere göre temel avantajı, tip bir ve tip iki delta iki 80 parazit arka planlarının, artık hassas şekilde genetik olarak tanımlanmış suşlar üretmek için hedeflenen çift çaprazlama homolog rekombinasyon olaylarının son derece güvenilir bir şekilde seçilmesine olanak tanımasıdır. Bu teknik, özellikle online@toxodb.org adresinde bulunan iyi tasarlanmış genomik kaynaklarla birlikte kullanıldığında, antitoksin plazma ilaç tedavisi için yeni hedeflerin keşfini ve güvenli ve etkili atenüe aşı suşlarının geliştirilmesini büyük ölçüde hızlandıracaktır. Genel olarak, bu yöntemde yeni olan kişiler, hedeflenen DNA moleküllerinin mühendisliği veya Toxoplasma Gandhi ile yapılan genetik manipülasyonlar konusunda zorluk yaşayabilirler.

Ancak, hastaların uygulamaları ve güvenilir hedefleme moleküllerinin tasarımı başarıyı sağlayacaktır. Protokole, ilgilenilen gen için genomik DNA'dan beş prime ve üç prime genomik hedefleme yan bölgelerini PCR ile amplifiye ederek başlayın. Ardından, HX GPRT CD NA mini gen kasetinden HX GPRT seçilebilir marker'ı, beş prime ve üç prime DHFR yan bölgeleriyle birlikte PCR ile amplifiye edin.

3D NA moleküllerini, plazmid PRS 416 ile doğru beş prime'dan üç prime yöneliminde birleştirmek için maya rekombinasyonu veya benzeri bir yöntem kullanın; böylece ilgi duyulan gendeki delesyonu hedefleyecek p delta GOI plazmidini oluşturun. Ardından, konfluente HFF hücrelerinin bulunduğu 25 santimetrelik bir flaskın inokülasyonundan 72 ila 68 saat sonra T gia'ya transfekte edilmek üzere, 15 ila 30 mikrogram lineerize edilmiş hedefleme plazmidi içeren 100 mikrolitrelik bir örnek hazırlayın. HFF hücrelerinin %90 ila %95'inin lizis olduğunu görsel olarak onaylayarak yeni lizis olmuş parazitlerin varlığını doğrulayın; gen hedefleme için canlı parazitler esastır.

Sıvının kapak içine veya balonun boynuna sıçramamasına dikkat ederek, kapalı balonu kuvvetlice sallayıp canlı parazitleri çözelti içinde homojenize edin. Parazitleri balondan toplayın ve metin protokolünde açıklandığı şekilde transfeksiyon için hazırlayın. Hedefleme plazmidini delta CO 80 toxoplasma sucuna elektroporasyon yöntemiyle aktarın.

Elektropore edilmiş karışımı, konfluen HFF hücreleri ve 30 mililitre enfeksiyon besiyeri içeren 150 santimetrelik bir flaska aktarın. Enfekte kültürü 37 degrees Celsius'de gece boyunca inkübe edin; transfeksiyondan yaklaşık 20 saat sonra besiyerini MPA artı X seleksiyon besiyeri ile değiştirin.

Şimdi parazitlerin yaklaşık sekiz gün boyunca 37 °C'de inkübe olmasına izin verin. Rahatsız edilmeden. Plaklar görünür hale geldiğinde, hücre tabakasından hücre dışı parazitleri ayırarak bir parazit çözeltisi oluşturmak için balonu sallayın. Parazit çözeltisinin yaklaşık yarım mililitresini, beş mililitre MPA artı X seleksiyon ortamı içeren, konfluent HFF hücreleri bulunan yeni bir 25 cm balona aktarın.

Yaklaşık üç gün sonra bu kültürü PAs one A olarak adlandırın. Parazit solüsyonunun yarım mililitresini orijinal flasktan, aynı seleksiyon ortamına sahip başka bir HFF hücre flaskına aktarma işlemini tekrarlayın. Sonraki beş gün boyunca bu kültürü PAs one B olarak adlandırın.

pfu için pasaj bir A ve pasaj bir B'yi izleyin. 25'ten fazla enfeksiyon bölgesi şeklinde yeterli sayıda bölgeye dayanarak alt klonlama için pasaj bir A veya pasaj bir B'den birini seçin. Parazitler HFF hücrelerini lizledikçe, kültürü konfllüent HFF hücreleri içeren yeni bir 25 santimetrelik flaska seçici besiyeri ile aktarın; transfeksiyondan üç hafta sonra, parazitleri MPA artı X besiyeri içinde uygun konsantrasyona seyrelterek ve parazit solüsyonunu konfllüent HFF hücreleri içeren 96 kuyucuklu bir taba eşit şekilde dağıtarak taze olarak ekilen parazitlerden alt klonlama yapın.

Bir tepsiyi kuyuk başına bir parazit konsantrasyonunda ve ikinci bir tepsiyi kuyuk başına iki parazit konsantrasyonunda hazırlayın. Her iki tepsiyi de orijinal transfeksiyon tarihinden sonra 37 °C'de inkübe edin. Birinci tip parazitler için 20. günden, ikinci tip parazitler için ise 25. günden önce parazitleri subklonlamayın.

Nakavt suşu doğrulanana kadar, 25 santimetrelik flaskı çevrimiçi metinde açıklandığı şekilde haftalık programla geçirmeye devam edin. Yaklaşık bir hafta sonra, 96 kuyucuklu plakaları 40 ila 60 x büyütme altında değerlendirin. 50 microliters ayarlı bir pipet kullanarak, tek bir enfeksiyon bölgesi olarak tanımlanan tek bir PFU içeren kuyucukları seçin.

Sıvı akışını PFU üzerine yönlendirerek bu kuyucukların içeriğini karıştırın ve parazitleri kuyucuğun etrafına dağıtın. Seçilen kuyucuklar karıştırıldıktan dört ila beş gün sonra, lizis geçirmiş hücrelere sahip bir düzine klon seçin. 96 kuyucuklu tepsiden 12 klonu, 24 kuyucuklu bir tepsinin 12 kuyucuğuna aktarın. Bunu, bir pipet ucuyla kuyucuğun tabanını sıyırarak ve 6 µL çekerek yapın.

Çözeltiyi, 1 mL MPA artı X seçici besiyerindeki konfluen HFF hücrelerinin bulunduğu 24 kuyucuklu bir tabağın kuyucuğuna aktarın. 24 kuyucuklu tabağı 37 °C'de inkübe edin ve HFF hücrelerinin lizisini izleyin. 24 kuyucuklu tabaktaki lizis gerçekleşmiş bir kuyucuktan parazitleri haftalık düzenle pasajlayın.

Parazit solüsyonundan iki µL'yi, MPA ve X seçilimli yeni bir plakaya aktarmak için çizme ve çizgi çekme tekniğini kullanın. Pasajdan sonra, parazitleri orijinal 24 kuyucuklu tepsiden hasat edin ve DNA toplama işlemi için küçük tüplere aktarın.

Bitirmek için, 5' ve 3' hedef flanklarının entegrasyonunu kontrol etmek amacıyla ilgilenilen genin delesyonunu test etmek için PCR kullanın. Ayrıca HX GPRT seçilebilir markörünün varlığını kontrol edin. Bu protokol, manipüle edilmiş delta Q 80 suşundan HX GPRT markörünün uzaklaştırılmasına yöneliktir ve çevrimiçi metinde ana hatları belirtilmiştir.

P delta GOYC, altı TX besiyeri kullanılarak yapılan negatif seleksiyon ile parazitten HX GPRT'nin uzaklaştırılmasını hedefler. Ardından, HX GPRT'nin lokustan uzaklaştırılmadığı durumda görülen 1.2 Kilobaz çift bandı ile karşılaştırılarak, kaybın doğrulanması için PCR kullanılır. 3.4 kilobaz çiftlik bir bant bulunmaktadır.

Bu protokolün son bölümü olan proteinlerin C-terminali etiketleme işlemi, çevrimiçi metinde ayrıca ayrıntılı olarak açıklanmıştır; hedeflenmiş bir gen delesyonu oluşturmak için ana hatları belirtilen protokol izlendikten sonra, hedeflemesi genellikle zor olan bir bölge olan tip bir R 18'in nakavt delesyonunu doğrulamak için PCR kullanılmıştır. PCR 1, R 18 gen PCR ürününün yokluğunu göstermektedir.

PCR 2, 3' uç R 18 genomik hedefleme flankının varlığını göstermektedir; PCR 3 ve PCR 4 ise seçilebilir markörün 5' ve 3' genomik hedefleme flankları arasına düzgün bir şekilde entegre olduğunu göstermekte olup bu durum R 18 delesyonunu tanımlamaktadır. Bir suşta sonraki delesyonları yapmak için seçilebilir markörü yeniden kullanabilmek adına, orijinal HX GPRT önce lokustan uzaklaştırılmalıdır. Belirtilen protokole uyulduktan sonra.

Strain delta iki 80 delta GRA iki'de, silinen GRA iki lokusundan HX GPRT uzaklaştırıldı. HX GPRT kaybı, 1.2 kbp'lik bir bant ile gösteren HX GPRT-PCR kullanılarak doğrulandı. HX GPRT uzaklaştırılmadığında, başlangıç gen hedefleme adımını takiben 3.4 kbp'lik bir bant görüldü. Aynı tip bir veya tip iki suşta çoklu nakavtlar oluşturmak veya, "bu protein hücrede nereye yerleşir?" gibi ek soruları yanıtlamak için mutant bir suşu etiketlemek veya tamamlamak amacıyla ek gen hedefleme yöntemleri uygulanabilir.

Veya bu proteinin veya yolağın biyolojik fonksiyonunu açıklayan temel alanı veya aktivitesi nedir? Bu teknik, alandaki araştırmacıların model AP kompleksi ve parazit Toxoplasma'da parazit gen fonksiyonu araştırmalarını artırmalarının önünü açmaktadır. Gandhi eye.

Toxoplasma ile çalışmanın tehlikeli olabileceğini ve tüm BSL 2 kılavuzlarına uyulması gibi önlemlerin prosedür boyunca sürdürülmesi gerektiğini unutmayın.