Bakteriyel Dönüşüm: Elektroporasyon
Bakteriyel dönüşüm, bakterilerin yabancı DNA'yı yuttuğu ve daha sonra onu çoğalttığı veya klonladığı doğal olarak meydana gelen bir süreçtir. Laboratuvarda bu işlem, bakteri hücre zarında plazmit DNA'nın geçebileceği gözenekler oluşturmak için yüksek voltajlı elektrik alan darbeleri kullanılarak yapay olarak indüklenebilir. Elektroporasyon bu yöntemi ifade eder ve aşağıdaki videoda ilkeleri, adım adım prosedürü ve uygulamaları gösterilecektir.
Bakterilerin elektroporasyonu hakkında konuşmadan önce, bu deneylerde kullanılan DNA türünü anlamak önemlidir: plazmit. Bir plazmit, spesifik DNA dizinizin bir taşıyıcısı olan bir vektör görevi gören küçük, dairesel, kromozomal bir DNA parçasıdır.
Bu dizi denizanasındaki bir floresan proteini için bir gen mi yoksa bitkilerden gelen bir enzim mi olsun, çoklu klonlama bölgesi veya MCS adı verilen bir bölge aracılığıyla plazmide yerleştirilir. Bu bölge, restriksiyon endonükleazları veya restriksiyon enzimleri tarafından parçalanan spesifik diziler içerir. Aynı kısıtlama enzimleri, ilgilendiğiniz diziyi kesmek için kullanılabilir, böylece uçlar plazmidin yeni kesilmiş uçlarına tamamlayıcı olur.
Plazmitler ayrıca, kopyalanacağı noktayı gösteren ORI olarak kısaltılmış bir replikasyon kaynağı içerir. Transformasyon söz konusu olduğunda, antibiyotik direnç geni hayati öneme sahiptir. Adından da anlaşılacağı gibi, bu gen, bakterilerin antibiyotiği nötralize eden bir enzim üretmesine izin verir ve antibiyotik içeren ortamlarda hayatta kalmalarını sağlar.
Elektroporasyon, elektroporatör adı verilen özel bir cihaz kullanır. Tipik olarak hücreler, yerleştirildikten sonra makine ile elektrik teması kuran her iki tarafında elektrotlar bulunan bir elektroporasyon küvetine yerleştirilir.
DNA ile karıştırılmış bakteri hücreleri, elektroporasyon küvetine yüklenir ve birkaç milisaniye boyunca santimetre başına 1000 ila 10.000 volt arasında bir elektrik alanı uygulanır. Bu, zar boyunca voltajın 0.5-1 volta ulaşmasına neden olur, bu da hücre zarını oluşturan fosfolipid çift tabakasının gözenekler oluşacak şekilde yeniden düzenlenmesine yol açtığına inanılmaktadır. Bu durumda, plazmit DNA zardan geçecek ve nabız tamamlandığında çift tabaka kendini onaracaktır.
Plazmidi aldıktan sonra, bakteriler daha sonra antibiyotik içeren agar plakalarında büyüyebilir.
Artık plazmitler ve elektroporasyon mekanizması hakkında bilgi edindik. İşlemin nasıl yapıldığına bir göz atalım.
DNA'yı kolayca alabilen hücrelere yetkin hücreler denir. Moleküler biyoloji araştırmalarında dönüştürülen en yaygın yetkin bakteri türü, alt bağırsağınızda yuva yapan prokaryotik bakteriler olan E. coli'dir. Elektroporasyon için hazırlanan E. coli, elektrokompetan hücreler olarak adlandırılır.
Bakterilerle çalışırken, çalışma alanının mümkün olduğunca temiz olduğundan emin olun.
Bakterilerle uğraşmak aynı zamanda aseptik tekniğin uygulanmasını gerektirir. Tipik olarak bu, aletleri sterilize etmek ve havadaki kirleticileri çalışma alanından uzak tutan bir konveksiyon akımı oluşturmak için bir Bunsen brülörünün kullanılmasını içerir.
Elektroporasyondan hemen önce, ortamı oda sıcaklığına önceden ısıtın, antibiyotik içeren agar plakalarını 37 ° C'ye getirin ve elektroporasyon küvetlerini buz üzerinde soğutun.
Daha sonra, yıkanmış elektroyetkin hücreleri buz üzerinde çözdürün.
Bakteri hücrelerine tuzsuz 1-5uL 1ng/μL soğuk plazmit ekleyin, hafifçe karıştırın ve karışımı soğuk küvete ekleyin. Kabarcık olmadığından emin olun.
Elektroporatörün voltajını ve alan gücünü hücreleriniz için doğru ayarlara ayarlayın. Burada 1700 volta ayarlanmış ve 17kV/cm alan kuvveti veren bir elektroporatör görüyorsunuz.
Küvetin dışını kurulayın ve elektroporatörün içine yerleştirin. Bir bip sesi duyana kadar hücreleri nabız atın.
Başarısız darbe, görünür bir kıvılcım ve duyulabilir bir patlama olarak gözlemlenebilen bir elektrik boşalmasına neden olur. Ark olarak adlandırılan bu akıntı, yetkin hücrelerinizde veya DNA'nızda çok fazla tuz bulunmasının bir sonucu olabilir.
Dönüşümünüzün başarısı, darbeyi uyguladıktan sonra voltajın bozulması için geçen süre olan zaman sabitine dikkat edilerek tahmin edilebilir. Tuz mevcut olduğunda ve elektroporasyon çözeltisi çok iletken olduğunda, bozunma hızlı bir şekilde gerçekleşir, boşalmaya neden olur ve böylece hücrelerinizin çoğunu öldürür. Bakteriler için iyi zaman sabitleri 5-10 milisaniye arasında değişir.
Darbeden hemen sonra, küveti çıkarın ve doğrudan hücrelere 1 ml ortam ekleyin. Besiyeri içeren bu hücre bir tüpe yerleştirilir ve hücrelerin iyileşmesi için 37 ° C'de 1 saat boyunca çalkalanarak inkübe edilir.
Daha sonra, aseptik teknik kullanarak, 20-200uL hücreyi antibiyotik içeren bir agar plakasına ekleyin. Plakaları, agar üstte olacak ve yoğuşma hücrelerinize düşmeyecek şekilde ters çevirin ve gece boyunca 37°C'de inkübe edin.
Plazmit ile transforme olan bakteriler koloniler oluşturmalıdır. Kolonileri sayın ve başarılı dönüştürücülerin sayısının kaplanan toplam DNA miktarına bölünmesiyle elde edilen dönüşüm verimliliğini hesaplayın.
Bakterilerinizin beslenmesini sağlayan agar ve besiyeri önceden hazırlanmalı ve otoklavlama ile sterilize edilmelidir. Kullanmadan önce sıvı ortamın oda sıcaklığına soğumasını bekleyin ve agarın antibiyotiğin eklenebileceği ve plakaların dökülebileceği sıcaklık olan 50-55 ° C'ye soğumasını bekleyin. Ardından, plakaların katılaşması için oda sıcaklığına soğumasını bekleyin.
Dönüşümde kullanılan bakteriler dondurucuda saklandığından, önce buz üzerinde çözülmeli, antibiyotiksiz bir agar plakasına yayılmalı ve daha sonra gece boyunca 37°C'de büyütülmelidir.
Aseptik tekniği kullanarak, agar plakasından bir bakteri kolonisi seçin ve çalkalama inkübatöründe 37 ° C'de gece boyunca 500 mL'lik daha büyük bir kültürde büyütün.
Hücreler büyürken, yaklaşık bir litre deiyonize su hazırlayın ve% 10'luk bir gliserol ve su, hacimden hacme çözelti hazırlayın. Solüsyonları otoklavlayın ve 4°C'de soğumaya bırakın.
Absorbans ölçümleri, bakterilerin büyümelerinin orta log aşamasında olup olmadıklarını belirlemek için kullanılır, bu da DNA'yı kolayca alacakları anlamına gelir. Hücreler bu aşamaya ulaştığında, onları buzun üzerine yerleştirin ve prosedür boyunca orada tutun.
Daha sonra, hücreleri iki büyük santrifüj tüpüne ayırarak yıkayın ve 4 ° C'de döndürün, süpernatanı dökün ve soğuk 100 mL steril deiyonize suda yeniden süspanse edin. Bu adımı en az bir kez daha tekrarlayın. Bu adımın özel adımının amacı, elektroporasyon tekniğini güçlü bir şekilde etkileyecek olan tuzu uzaklaştırmaktır.
Suda 50 ml% 10 gliserol içinde iki ek yıkama yapın ve son olarak bakterileri aynı çözeltide yeniden süspanse edin.
Birden fazla Eppendorf tüpüne 50μL hücre ekleyin. Bu hücreler artık elektroporasyonda kullanıma hazırdır ve 4 ° C'de tutulmalıdır. Ya da hızlı dondurulabilir ve -80°C'de saklanabilirler.
Birazdan göreceğiniz gibi, elektroporasyonun birçok uygulaması vardır.
Elektroporasyona bir alternatif, DNA'yı hücrelerinize sokmak için bakterilerin hem kalsiyum klorüre hem de ısıya maruz kalmasına dayanan ısı şoku dönüşümüdür.
Genel olarak, ısı şoku bakterileriniz için elektroporasyondan daha naziktir ve düşük tuz gerektirmez. Hedef geninizi plazmide yerleştirmeyi içeren ligasyon reaksiyonları, doğrudan ısı şoku dönüşümünde kullanılabilir. Isı şoku dönüşümü, elektroporasyondan daha ucuzdur ve pahalı ekipman veya küvetlere dayanmaz. Öte yandan, ısı şoku, elektroporasyondan daha düşük dönüşüm verimliliğine yol açar ve daha uzun sürer. Ayrıca bakteriyel, maya ve bitki protoplastları ile sınırlıdır, memeli hücrelerine ise elektroporasyon uygulanabilir.
Burada fare embriyonik fibroblastlarının bir elektroporasyon küvetine yüklendiğini görüyorsunuz. Elektroporasyon tamamlandıktan sonra, hücrelerin plazmit tarafından kodlanan yeşil bir floresan proteini üretme derecesi gözlemlenerek dönüşüm verimlilikleri belirlenebilir. Transfeksiyon, tipik olarak bakteri hücrelerinden daha düşük alan kuvvetleri ve daha yüksek zaman sabitleri gerektiren memeli hücrelerinin dönüşümüne verilen terimdir.
Elektroporasyon, burada gördüğünüz gelişmekte olan tavuk embriyosu gibi bütün hayvanlarda da yapılabilir. Plazmid DNA, civcivin beynine enjekte edilir ve daha sonra beyin dokusuna bir elektrik alanı uygulamak için bir elektroporasyon probu kullanılır. Bir veya iki gün sonra, plazmit tarafından kodlanan yeşil ve kırmızı floresan proteinler nöronlar tarafından yapılır ve bilim adamları gelişmekte olan civciv beynindeki yapısal değişiklikleri gözlemleyebilirler.
JoVE'un elektroporasyon yoluyla bakteri dönüşümüne girişini az önce izlediniz. Bu video, plazmidi en yaygın transforme edilmiş DNA türü olarak tanıttı, elektroporasyonun altında yatan biyofiziksel mekanizmayı tartıştı, elektroporasyon yapmak için genelleştirilmiş bir prosedür gösterdi ve elektroporasyonun memeli sisteminde nasıl kullanılabileceğini açıkladı. İzlediğiniz için teşekkürler!
"Dönüşüm" terimi, yabancı DNA'nın hücresel olarak yutulmasını ifade eder. Doğada, bazı bakteri türlerinde dönüşüm meydana gelebilir. Bununla birlikte,…
Bakteriyel dönüşüm, bakterilerin yabancı DNA'yı yuttuğu ve daha sonra onu çoğalttığı veya klonladığı doğal olarak meydana gelen bir süreçtir. Laboratuvarda bu işlem, bakteri hücre zarında plazmit DNA'nın geçebileceği gözenekler oluşturmak için yüksek voltajlı elektrik alan darbeleri kullanılarak yapay olarak indüklenebilir. Elektroporasyon bu yöntemi ifade eder ve aşağıdaki videoda ilkeleri, adım adım prosedürü ve uygulamaları gösterilecektir.
Bakterilerin elektroporasyonu hakkında konuşmadan önce, bu deneylerde kullanılan DNA türünü anlamak önemlidir: plazmit. Bir plazmit, spesifik DNA dizinizin bir taşıyıcısı olan bir vektör görevi gören küçük, dairesel, kromozomal bir DNA parçasıdır.
Bu dizi denizanasındaki bir floresan proteini için bir gen mi yoksa bitkilerden gelen bir enzim mi olsun, çoklu klonlama bölgesi veya MCS adı verilen bir bölge aracılığıyla plazmide yerleştirilir. Bu bölge, restriksiyon endonükleazları veya restriksiyon enzimleri tarafından parçalanan spesifik diziler içerir. Aynı kısıtlama enzimleri, ilgilendiğiniz diziyi kesmek için kullanılabilir, böylece uçlar plazmidin yeni kesilmiş uçlarına tamamlayıcı olur.
Plazmitler ayrıca, kopyalanacağı noktayı gösteren ORI olarak kısaltılmış bir replikasyon kaynağı içerir. Transformasyon söz konusu olduğunda, antibiyotik direnç geni hayati öneme sahiptir. Adından da anlaşılacağı gibi, bu gen, bakterilerin antibiyotiği nötralize eden bir enzim üretmesine izin verir ve antibiyotik içeren ortamlarda hayatta kalmalarını sağlar.
Elektroporasyon, elektroporatör adı verilen özel bir cihaz kullanır. Tipik olarak hücreler, yerleştirildikten sonra makine ile elektrik teması kuran her iki tarafında elektrotlar bulunan bir elektroporasyon küvetine yerleştirilir.
DNA ile karıştırılmış bakteri hücreleri, elektroporasyon küvetine yüklenir ve birkaç milisaniye boyunca santimetre başına 1000 ila 10.000 volt arasında bir elektrik alanı uygulanır. Bu, zar boyunca voltajın 0.5-1 volta ulaşmasına neden olur, bu da hücre zarını oluşturan fosfolipid çift tabakasının gözenekler oluşacak şekilde yeniden düzenlenmesine yol açtığına inanılmaktadır. Bu durumda, plazmit DNA zardan geçecek ve nabız tamamlandığında çift tabaka kendini onaracaktır.
Plazmidi aldıktan sonra, bakteriler daha sonra antibiyotik içeren agar plakalarında büyüyebilir.
Artık plazmitler ve elektroporasyon mekanizması hakkında bilgi edindik. İşlemin nasıl yapıldığına bir göz atalım.
DNA'yı kolayca alabilen hücrelere yetkin hücreler denir. Moleküler biyoloji araştırmalarında dönüştürülen en yaygın yetkin bakteri türü, alt bağırsağınızda yuva yapan prokaryotik bakteriler olan E. coli'dir. Elektroporasyon için hazırlanan E. coli, elektrokompetan hücreler olarak adlandırılır.
Bakterilerle çalışırken, çalışma alanının mümkün olduğunca temiz olduğundan emin olun.
Bakterilerle uğraşmak aynı zamanda aseptik tekniğin uygulanmasını gerektirir. Tipik olarak bu, aletleri sterilize etmek ve havadaki kirleticileri çalışma alanından uzak tutan bir konveksiyon akımı oluşturmak için bir Bunsen brülörünün kullanılmasını içerir.
Elektroporasyondan hemen önce, ortamı oda sıcaklığına önceden ısıtın, antibiyotik içeren agar plakalarını 37 ° C'ye getirin ve elektroporasyon küvetlerini buz üzerinde soğutun.
Daha sonra, yıkanmış elektroyetkin hücreleri buz üzerinde çözdürün.
Bakteri hücrelerine tuzsuz 1-5uL 1ng/μL soğuk plazmit ekleyin, hafifçe karıştırın ve karışımı soğuk küvete ekleyin. Kabarcık olmadığından emin olun.
Elektroporatörün voltajını ve alan gücünü hücreleriniz için doğru ayarlara ayarlayın. Burada 1700 volta ayarlanmış ve 17kV/cm alan kuvveti veren bir elektroporatör görüyorsunuz.
Küvetin dışını kurulayın ve elektroporatörün içine yerleştirin. Bir bip sesi duyana kadar hücreleri nabız atın.
Başarısız darbe, görünür bir kıvılcım ve duyulabilir bir patlama olarak gözlemlenebilen bir elektrik boşalmasına neden olur. Ark olarak adlandırılan bu akıntı, yetkin hücrelerinizde veya DNA'nızda çok fazla tuz bulunmasının bir sonucu olabilir.
Dönüşümünüzün başarısı, darbeyi uyguladıktan sonra voltajın bozulması için geçen süre olan zaman sabitine dikkat edilerek tahmin edilebilir. Tuz mevcut olduğunda ve elektroporasyon çözeltisi çok iletken olduğunda, bozunma hızlı bir şekilde gerçekleşir, boşalmaya neden olur ve böylece hücrelerinizin çoğunu öldürür. Bakteriler için iyi zaman sabitleri 5-10 milisaniye arasında değişir.
Darbeden hemen sonra, küveti çıkarın ve doğrudan hücrelere 1 ml ortam ekleyin. Besiyeri içeren bu hücre bir tüpe yerleştirilir ve hücrelerin iyileşmesi için 37 ° C'de 1 saat boyunca çalkalanarak inkübe edilir.
Daha sonra, aseptik teknik kullanarak, 20-200uL hücreyi antibiyotik içeren bir agar plakasına ekleyin. Plakaları, agar üstte olacak ve yoğuşma hücrelerinize düşmeyecek şekilde ters çevirin ve gece boyunca 37°C'de inkübe edin.
Plazmit ile transforme olan bakteriler koloniler oluşturmalıdır. Kolonileri sayın ve başarılı dönüştürücülerin sayısının kaplanan toplam DNA miktarına bölünmesiyle elde edilen dönüşüm verimliliğini hesaplayın.
Bakterilerinizin beslenmesini sağlayan agar ve besiyeri önceden hazırlanmalı ve otoklavlama ile sterilize edilmelidir. Kullanmadan önce sıvı ortamın oda sıcaklığına soğumasını bekleyin ve agarın antibiyotiğin eklenebileceği ve plakaların dökülebileceği sıcaklık olan 50-55 ° C'ye soğumasını bekleyin. Ardından, plakaların katılaşması için oda sıcaklığına soğumasını bekleyin.
Dönüşümde kullanılan bakteriler dondurucuda saklandığından, önce buz üzerinde çözülmeli, antibiyotiksiz bir agar plakasına yayılmalı ve daha sonra gece boyunca 37°C'de büyütülmelidir.
Aseptik tekniği kullanarak, agar plakasından bir bakteri kolonisi seçin ve çalkalama inkübatöründe 37 ° C'de gece boyunca 500 mL'lik daha büyük bir kültürde büyütün.
Hücreler büyürken, yaklaşık bir litre deiyonize su hazırlayın ve% 10'luk bir gliserol ve su, hacimden hacme çözelti hazırlayın. Solüsyonları otoklavlayın ve 4°C'de soğumaya bırakın.
Absorbans ölçümleri, bakterilerin büyümelerinin orta log aşamasında olup olmadıklarını belirlemek için kullanılır, bu da DNA'yı kolayca alacakları anlamına gelir. Hücreler bu aşamaya ulaştığında, onları buzun üzerine yerleştirin ve prosedür boyunca orada tutun.
Daha sonra, hücreleri iki büyük santrifüj tüpüne ayırarak yıkayın ve 4 ° C'de döndürün, süpernatanı dökün ve soğuk 100 mL steril deiyonize suda yeniden süspanse edin. Bu adımı en az bir kez daha tekrarlayın. Bu adımın özel adımının amacı, elektroporasyon tekniğini güçlü bir şekilde etkileyecek olan tuzu uzaklaştırmaktır.
Suda 50 ml% 10 gliserol içinde iki ek yıkama yapın ve son olarak bakterileri aynı çözeltide yeniden süspanse edin.
Birden fazla Eppendorf tüpüne 50μL hücre ekleyin. Bu hücreler artık elektroporasyonda kullanıma hazırdır ve 4 ° C'de tutulmalıdır. Ya da hızlı dondurulabilir ve -80°C'de saklanabilirler.
Birazdan göreceğiniz gibi, elektroporasyonun birçok uygulaması vardır.
Elektroporasyona bir alternatif, DNA'yı hücrelerinize sokmak için bakterilerin hem kalsiyum klorüre hem de ısıya maruz kalmasına dayanan ısı şoku dönüşümüdür.
Genel olarak, ısı şoku bakterileriniz için elektroporasyondan daha naziktir ve düşük tuz gerektirmez. Hedef geninizi plazmide yerleştirmeyi içeren ligasyon reaksiyonları, doğrudan ısı şoku dönüşümünde kullanılabilir. Isı şoku dönüşümü, elektroporasyondan daha ucuzdur ve pahalı ekipman veya küvetlere dayanmaz. Öte yandan, ısı şoku, elektroporasyondan daha düşük dönüşüm verimliliğine yol açar ve daha uzun sürer. Ayrıca bakteriyel, maya ve bitki protoplastları ile sınırlıdır, memeli hücrelerine ise elektroporasyon uygulanabilir.
Burada fare embriyonik fibroblastlarının bir elektroporasyon küvetine yüklendiğini görüyorsunuz. Elektroporasyon tamamlandıktan sonra, hücrelerin plazmit tarafından kodlanan yeşil bir floresan proteini üretme derecesi gözlemlenerek dönüşüm verimlilikleri belirlenebilir. Transfeksiyon, tipik olarak bakteri hücrelerinden daha düşük alan kuvvetleri ve daha yüksek zaman sabitleri gerektiren memeli hücrelerinin dönüşümüne verilen terimdir.
Elektroporasyon, burada gördüğünüz gelişmekte olan tavuk embriyosu gibi bütün hayvanlarda da yapılabilir. Plazmid DNA, civcivin beynine enjekte edilir ve daha sonra beyin dokusuna bir elektrik alanı uygulamak için bir elektroporasyon probu kullanılır. Bir veya iki gün sonra, plazmit tarafından kodlanan yeşil ve kırmızı floresan proteinler nöronlar tarafından yapılır ve bilim adamları gelişmekte olan civciv beynindeki yapısal değişiklikleri gözlemleyebilirler.
JoVE'un elektroporasyon yoluyla bakteri dönüşümüne girişini az önce izlediniz. Bu video, plazmidi en yaygın transforme edilmiş DNA türü olarak tanıttı, elektroporasyonun altında yatan biyofiziksel mekanizmayı tartıştı, elektroporasyon yapmak için genelleştirilmiş bir prosedür gösterdi ve elektroporasyonun memeli sisteminde nasıl kullanılabileceğini açıkladı. İzlediğiniz için teşekkürler!
Bakteriyel dönüşüm, bakterilerin yabancı DNA'yı yuttuğu ve daha sonra onu çoğalttığı veya klonladığı doğal olarak meydana gelen bir süreçtir. Laboratuvarda bu işlem, bakteri hücre zarında plazmit DNA'nın geçebileceği gözenekler oluşturmak için yüksek voltajlı elektrik alan darbeleri kullanılarak yapay olarak indüklenebilir. Elektroporasyon bu yöntemi ifade eder ve aşağıdaki videoda ilkeleri, adım adım prosedürü ve uygulamaları gösterilecektir.
Bakterilerin elektroporasyonu hakkında konuşmadan önce, bu deneylerde kullanılan DNA türünü anlamak önemlidir: plazmit. Bir plazmit, spesifik DNA dizinizin bir taşıyıcısı olan bir vektör görevi gören küçük, dairesel, kromozomal bir DNA parçasıdır.
Bu dizi denizanasındaki bir floresan proteini için bir gen mi yoksa bitkilerden gelen bir enzim mi olsun, çoklu klonlama bölgesi veya MCS adı verilen bir bölge aracılığıyla plazmide yerleştirilir. Bu bölge, restriksiyon endonükleazları veya restriksiyon enzimleri tarafından parçalanan spesifik diziler içerir. Aynı kısıtlama enzimleri, ilgilendiğiniz diziyi kesmek için kullanılabilir, böylece uçlar plazmidin yeni kesilmiş uçlarına tamamlayıcı olur.
Plazmitler ayrıca, kopyalanacağı noktayı gösteren ORI olarak kısaltılmış bir replikasyon kaynağı içerir. Transformasyon söz konusu olduğunda, antibiyotik direnç geni hayati öneme sahiptir. Adından da anlaşılacağı gibi, bu gen, bakterilerin antibiyotiği nötralize eden bir enzim üretmesine izin verir ve antibiyotik içeren ortamlarda hayatta kalmalarını sağlar.
Elektroporasyon, elektroporatör adı verilen özel bir cihaz kullanır. Tipik olarak hücreler, yerleştirildikten sonra makine ile elektrik teması kuran her iki tarafında elektrotlar bulunan bir elektroporasyon küvetine yerleştirilir.
DNA ile karıştırılmış bakteri hücreleri, elektroporasyon küvetine yüklenir ve birkaç milisaniye boyunca santimetre başına 1000 ila 10.000 volt arasında bir elektrik alanı uygulanır. Bu, zar boyunca voltajın 0.5-1 volta ulaşmasına neden olur, bu da hücre zarını oluşturan fosfolipid çift tabakasının gözenekler oluşacak şekilde yeniden düzenlenmesine yol açtığına inanılmaktadır. Bu durumda, plazmit DNA zardan geçecek ve nabız tamamlandığında çift tabaka kendini onaracaktır.
Plazmidi aldıktan sonra, bakteriler daha sonra antibiyotik içeren agar plakalarında büyüyebilir.
Artık plazmitler ve elektroporasyon mekanizması hakkında bilgi edindik. İşlemin nasıl yapıldığına bir göz atalım.
DNA'yı kolayca alabilen hücrelere yetkin hücreler denir. Moleküler biyoloji araştırmalarında dönüştürülen en yaygın yetkin bakteri türü, alt bağırsağınızda yuva yapan prokaryotik bakteriler olan E. coli'dir. Elektroporasyon için hazırlanan E. coli, elektrokompetan hücreler olarak adlandırılır.
Bakterilerle çalışırken, çalışma alanının mümkün olduğunca temiz olduğundan emin olun.
Bakterilerle uğraşmak aynı zamanda aseptik tekniğin uygulanmasını gerektirir. Tipik olarak bu, aletleri sterilize etmek ve havadaki kirleticileri çalışma alanından uzak tutan bir konveksiyon akımı oluşturmak için bir Bunsen brülörünün kullanılmasını içerir.
Elektroporasyondan hemen önce, ortamı oda sıcaklığına önceden ısıtın, antibiyotik içeren agar plakalarını 37 ° C'ye getirin ve elektroporasyon küvetlerini buz üzerinde soğutun.
Daha sonra, yıkanmış elektroyetkin hücreleri buz üzerinde çözdürün.
Bakteri hücrelerine tuzsuz 1-5uL 1ng/μL soğuk plazmit ekleyin, hafifçe karıştırın ve karışımı soğuk küvete ekleyin. Kabarcık olmadığından emin olun.
Elektroporatörün voltajını ve alan gücünü hücreleriniz için doğru ayarlara ayarlayın. Burada 1700 volta ayarlanmış ve 17kV/cm alan kuvveti veren bir elektroporatör görüyorsunuz.
Küvetin dışını kurulayın ve elektroporatörün içine yerleştirin. Bir bip sesi duyana kadar hücreleri nabız atın.
Başarısız darbe, görünür bir kıvılcım ve duyulabilir bir patlama olarak gözlemlenebilen bir elektrik boşalmasına neden olur. Ark olarak adlandırılan bu akıntı, yetkin hücrelerinizde veya DNA'nızda çok fazla tuz bulunmasının bir sonucu olabilir.
Dönüşümünüzün başarısı, darbeyi uyguladıktan sonra voltajın bozulması için geçen süre olan zaman sabitine dikkat edilerek tahmin edilebilir. Tuz mevcut olduğunda ve elektroporasyon çözeltisi çok iletken olduğunda, bozunma hızlı bir şekilde gerçekleşir, boşalmaya neden olur ve böylece hücrelerinizin çoğunu öldürür. Bakteriler için iyi zaman sabitleri 5-10 milisaniye arasında değişir.
Darbeden hemen sonra, küveti çıkarın ve doğrudan hücrelere 1 ml ortam ekleyin. Besiyeri içeren bu hücre bir tüpe yerleştirilir ve hücrelerin iyileşmesi için 37 ° C'de 1 saat boyunca çalkalanarak inkübe edilir.
Daha sonra, aseptik teknik kullanarak, 20-200uL hücreyi antibiyotik içeren bir agar plakasına ekleyin. Plakaları, agar üstte olacak ve yoğuşma hücrelerinize düşmeyecek şekilde ters çevirin ve gece boyunca 37°C'de inkübe edin.
Plazmit ile transforme olan bakteriler koloniler oluşturmalıdır. Kolonileri sayın ve başarılı dönüştürücülerin sayısının kaplanan toplam DNA miktarına bölünmesiyle elde edilen dönüşüm verimliliğini hesaplayın.
Bakterilerinizin beslenmesini sağlayan agar ve besiyeri önceden hazırlanmalı ve otoklavlama ile sterilize edilmelidir. Kullanmadan önce sıvı ortamın oda sıcaklığına soğumasını bekleyin ve agarın antibiyotiğin eklenebileceği ve plakaların dökülebileceği sıcaklık olan 50-55 ° C'ye soğumasını bekleyin. Ardından, plakaların katılaşması için oda sıcaklığına soğumasını bekleyin.
Dönüşümde kullanılan bakteriler dondurucuda saklandığından, önce buz üzerinde çözülmeli, antibiyotiksiz bir agar plakasına yayılmalı ve daha sonra gece boyunca 37°C'de büyütülmelidir.
Aseptik tekniği kullanarak, agar plakasından bir bakteri kolonisi seçin ve çalkalama inkübatöründe 37 ° C'de gece boyunca 500 mL'lik daha büyük bir kültürde büyütün.
Hücreler büyürken, yaklaşık bir litre deiyonize su hazırlayın ve% 10'luk bir gliserol ve su, hacimden hacme çözelti hazırlayın. Solüsyonları otoklavlayın ve 4°C'de soğumaya bırakın.
Absorbans ölçümleri, bakterilerin büyümelerinin orta log aşamasında olup olmadıklarını belirlemek için kullanılır, bu da DNA'yı kolayca alacakları anlamına gelir. Hücreler bu aşamaya ulaştığında, onları buzun üzerine yerleştirin ve prosedür boyunca orada tutun.
Daha sonra, hücreleri iki büyük santrifüj tüpüne ayırarak yıkayın ve 4 ° C'de döndürün, süpernatanı dökün ve soğuk 100 mL steril deiyonize suda yeniden süspanse edin. Bu adımı en az bir kez daha tekrarlayın. Bu adımın özel adımının amacı, elektroporasyon tekniğini güçlü bir şekilde etkileyecek olan tuzu uzaklaştırmaktır.
Suda 50 ml% 10 gliserol içinde iki ek yıkama yapın ve son olarak bakterileri aynı çözeltide yeniden süspanse edin.
Birden fazla Eppendorf tüpüne 50μL hücre ekleyin. Bu hücreler artık elektroporasyonda kullanıma hazırdır ve 4 ° C'de tutulmalıdır. Ya da hızlı dondurulabilir ve -80°C'de saklanabilirler.
Birazdan göreceğiniz gibi, elektroporasyonun birçok uygulaması vardır.
Elektroporasyona bir alternatif, DNA'yı hücrelerinize sokmak için bakterilerin hem kalsiyum klorüre hem de ısıya maruz kalmasına dayanan ısı şoku dönüşümüdür.
Genel olarak, ısı şoku bakterileriniz için elektroporasyondan daha naziktir ve düşük tuz gerektirmez. Hedef geninizi plazmide yerleştirmeyi içeren ligasyon reaksiyonları, doğrudan ısı şoku dönüşümünde kullanılabilir. Isı şoku dönüşümü, elektroporasyondan daha ucuzdur ve pahalı ekipman veya küvetlere dayanmaz. Öte yandan, ısı şoku, elektroporasyondan daha düşük dönüşüm verimliliğine yol açar ve daha uzun sürer. Ayrıca bakteriyel, maya ve bitki protoplastları ile sınırlıdır, memeli hücrelerine ise elektroporasyon uygulanabilir.
Burada fare embriyonik fibroblastlarının bir elektroporasyon küvetine yüklendiğini görüyorsunuz. Elektroporasyon tamamlandıktan sonra, hücrelerin plazmit tarafından kodlanan yeşil bir floresan proteini üretme derecesi gözlemlenerek dönüşüm verimlilikleri belirlenebilir. Transfeksiyon, tipik olarak bakteri hücrelerinden daha düşük alan kuvvetleri ve daha yüksek zaman sabitleri gerektiren memeli hücrelerinin dönüşümüne verilen terimdir.
Elektroporasyon, burada gördüğünüz gelişmekte olan tavuk embriyosu gibi bütün hayvanlarda da yapılabilir. Plazmid DNA, civcivin beynine enjekte edilir ve daha sonra beyin dokusuna bir elektrik alanı uygulamak için bir elektroporasyon probu kullanılır. Bir veya iki gün sonra, plazmit tarafından kodlanan yeşil ve kırmızı floresan proteinler nöronlar tarafından yapılır ve bilim adamları gelişmekte olan civciv beynindeki yapısal değişiklikleri gözlemleyebilirler.
JoVE'un elektroporasyon yoluyla bakteri dönüşümüne girişini az önce izlediniz. Bu video, plazmidi en yaygın transforme edilmiş DNA türü olarak tanıttı, elektroporasyonun altında yatan biyofiziksel mekanizmayı tartıştı, elektroporasyon yapmak için genelleştirilmiş bir prosedür gösterdi ve elektroporasyonun memeli sisteminde nasıl kullanılabileceğini açıkladı. İzlediğiniz için teşekkürler!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What is a plasmid and why is it used in bacterial transformation?
A plasmid is a small, circular, extrachromosomal piece of DNA that acts as a vector to carry your specific DNA sequence into bacterial cells. It contains a multiple cloning site where restriction enzymes insert your target gene, an origin of replication for DNA copying, and an antibiotic resistance gene that allows transformed bacteria to survive on antibiotic-containing media.
Q2: How does electroporation create pores in bacterial cell membranes?
Electroporation applies a high-voltage electric field of 1,000 to 10,000 volts per centimeter for milliseconds, causing the voltage across the membrane to reach 0.5-1 volts. This rearranges the phospholipid bilayer, creating temporary pores through which plasmid DNA passes. Once pulsing stops, the bilayer repairs itself, trapping the DNA inside the cell.
Q3: What are electrocompetent cells and how are they prepared?
Electrocompetent cells are bacteria prepared to readily take up DNA during electroporation. E. coli cells are grown to mid-log phase, then washed multiple times in deionized water and 10% glycerol solution to remove salt. Salt removal is critical because high salt content causes arcing, an electrical discharge that kills cells and indicates transformation failure.
Q4: Why is the time constant important in predicting electroporation success?
The time constant measures how quickly voltage decays after the electric pulse is applied. Good time constants for bacteria range from 5-10 milliseconds. Rapid decay indicates high salt concentration, causing arcing and cell death. Monitoring the time constant helps predict whether your transformation will succeed before observing colony growth.
Q5: How does electroporation compare to heat shock transformation?
Heat shock transformation uses calcium chloride and heat exposure instead of electrical pulses, making it gentler on bacteria and cheaper than electroporation. However, heat shock produces lower transformation efficiencies, takes longer, and works only on bacteria, yeast, and plant protoplasts. Electroporation achieves higher efficiency and applies to mammalian cells through a process called transfection.
Q6: What steps follow electroporation to identify successfully transformed bacteria?
After pulsing, add recovery media to cells and incubate at 37°C for one hour with shaking. Plate cells on antibiotic-containing agar and incubate overnight at 37°C. Only bacteria that successfully took up the plasmid survive the antibiotic. Count resulting colonies and calculate transformation efficiency by dividing successful transformants by total DNA plated.
Q7: What are the applications of electroporation beyond bacterial transformation?
Electroporation applies to mammalian cells through transfection, using lower field strengths and higher time constants than bacterial cells. Scientists also use electroporation in whole organisms like developing chicken embryos by injecting plasmid DNA into brain tissue and applying an electric field. This allows observation of fluorescent protein expression and structural changes in developing neural tissue.
Bu videodaki bölümler
0:00
Overview
0:47
The Plasmid
2:17
Electroporation Basic Principles
3:26
Electroporating Bacteria
7:07
Preparing Electrocompetent Cells
9:36
Applications
11:43
Summary