3-Boyutlu Hücre Kültürü için Self-raporlama iskeleleri

Aşağıdaki deneyin genel amacı, hücresel büyümeyi etkileyen koşulların anlaşılmasına yardımcı olmak amacıyla gerçek zamanlı ve in situ olarak izlenebilen pH duyarlı nanosensörler ve kendi kendini raporlayan iskeleler üretmektir. Bu, öncelikle floresans çıktıları aracılığıyla pH'ı izleyebilen biyouyumlu analit duyarlı nanosensörlerin hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adımda, pH duyarlı nanosensörler, hücrelerin kültüre edilebileceği ve izlenebileceği 3 boyutlu bir ortam oluşturan polimerik elektro eğirme iskelelerine entegre edilir.

Ardından, memeli hücreler elektro eğirme ile üretilmiş iskelelerin üzerine yerleştirilir ve hücre içi pH'ı izlemek amacıyla hücre içi ortamlarına nanosensörler aktarılır. Deneyler sırasında, konfokal mikroskopi ile elde edilen floresans oranlarına dayanarak, hücre içi nanosensörlerin ve kendi kendini raporlayan iskelelerin, doku mühendisliği ortamlarındaki pH'ı izleme yeteneğini gösteren sonuçlar elde edilir. Bu tekniğin, elektronik pH problarının kullanımı gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, hücresel büyümeyi bozmaya gerek kalmadan ölçümlerin in situ ve gerçek zamanlı olarak gerçekleştirilebilmesidir.

Başlamak için, bir balon jojede 1,5 mg fam SE'yi 1 mL dimetilformamid (DMF) içerisinde çözerek floroforları hazırlayın. Ayrıca ikinci bir balon jojede 1,5 mg Tamara SE'yi 1 mL DMF içerisinde çözün. Ardından, her bir balon jojeye 1,5 mL üç amino propil trietil ekleyin ve 21 °C'de, kuru azot atmosferi altında, karanlıkta 24 saat boyunca sürekli karıştırın.

Ardından, altı mililitre etanol ve dört mililitre amonyum hidroksit içeren balon jojeye her iki boya çözeltisinden 250 µL ekleyin. Bu yeni karışımı 21 °C'de bir saat boyunca karıştırın. Karışıma yavaşça 0,5 mL tetraetil ortosilikat ekleyin ve iki saat daha karıştırmaya devam edin.

Bu süre zarfında karışımın bulanıklaşması beklenir; ardından nanosensörler döner evaporasyon ile toplanır ve gelecekteki kullanımlar için dört santigrat derecede bir cam flakonda saklanır. Sonra, kurutulmuş pH nanosensörleri, pH 5.5 ile pH 7.5 arasında 0.5'lik pH artışları olan sorenson fosfat tamponlarına mililitre başına beş miligram olacak şekilde ekleyin. Örnekleri üç dakika boyunca vorteksleyerek nanosensörleri yeniden süspande edin ve ardından beş dakika boyunca veya çözelti bulanık hale gelene kadar sonikasyona tabi tutun.

FAM için 488 nanometre ve Tamara için 568 nanometre eksitasyon dalga boylarında örnekleri ölçerek kalibrasyon verilerini toplayın. FAM için 500 ile 530 nanometre, Tamara için ise 558 ile 580 nanometre aralığında emisyonları toplayın ve her pH değerinde üretilen emisyon maksimumlarının oranını hesaplayın. Ardından, nanosensör örneğini karbon kaplı bir elektron mikroskobu tablasına yerleştirerek ve parçacıkları argon atmosferi altında beş dakika boyunca altınla püskürtme kaplama (sputter coating) işlemine tabi tutarak örneği SEM görüntüleme için hazırlayın.

Kaplama işlemi tamamlandıktan sonra, elektron şarjlanmasını minimize etmek ve çeker ocak içerisinde en iyi görüntüleri elde etmek için numuneleri elektron mikroskobuna yerleştirin; çalışma mesafesini, voltajı ve büyütmeyi ayarlayın. Diklorometan içerisinde %1 perinyum format içeren %20'lik bir PLGA çözeltisi hazırlayın. Çözeltiyi, 18 gauge kör uçlu dolum iğnesi takılı 10 mililitrelik bir şırıngaya doldurun ve şırınga pompasına güvenli bir şekilde sabitleyin.

Bu çözelti, kontrol PLGA iskeleleri hazırlamak için kullanılacaktır; iğne ucu, 20 x 15 santimetrelik bir alüminyum toplama plakasından 20 santimetre uzağa yerleştirilmelidir. Ardından, yüksek voltajlı bir güç kaynağının elektrodu şırınganın ucuna bağlanmalı ve tel, alüminyum toplama plakasına topraklanmalıdır. Daha sonra güç kaynağı açılmalı ve voltaj 12 kilovolt değerine ayarlanmalıdır. Son olarak şırınga pompası çalıştırılmalı ve çözelti, iki saat boyunca saatte 3,5 mililitre sabit akış hızıyla iletilmelidir.

Bu işlem yaklaşık 60 mikronluk bir iskele derinliği oluşturacaktır. İşlem tamamlandığında, cihazı kapatın ve çözücü kalıntılarının buharlaşması için iskeleyi 24 saat boyunca çeker ocakta bırakın. pH duyarlı nanosensörler içeren iskeleler hazırlamak için, PLGA çözeltisini daha önce olduğu gibi hazırlayın, ancak bu kez çözeltiye mililitre başına beş miligram nanosensör ekleyin.

Ardından, pH duyarlı yapıyı daha öncekiyle aynı ayarlar kullanılarak elektrospin yöntemiyle üretin. Sonrasında, nano-sensörler içeren kurutulmuş iskeleden alınan küçük örnekleri 35 milimetrelik kültür plakalarına yerleştirip konfokal mikroskop altında pH 5.5 ile 7.5 arasında 0.5'lik artışlarla hazırlanan iki mililitre Sorensen fosfat tamponlarına daldırarak iskelenin pH duyarlılığını kalibre edin. Nano-sensörler içindeki FAM'i uyarmak için 488 nanometre argon lazeri, Tamara'yı uyarmak için ise 568 nanometre kripton lazeri kullanın.

FAM için 500 ila 530 nanometre, Tamara için ise 558 ila 580 nanometre aralığında emisyonu gözlemleyin ve ardından her pH değerinde üretilen emisyon maksimumlarının oranını hesaplayın. İlk olarak, iskelelerin yüzeylerini sekiz santimetre mesafedeki bir UV ışık kaynağı ile her iki taraf için 15 dakika boyunca sterilize edin. Daha sonra iskeleleri steril bir şekilde 12 kuyucuklu bir kültür plakasına aktarın ve iskelenin üzerine iç çapı bir santimetre, dış çapı iki santimetre olan bir çelik halka yerleştirin.

Ardından, çelik halkanın içine ve dışına %5 pen strip içeren PBS ekleyin ve örnekleri gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün, %5 pen strep içeren PBS'yi uzaklaştırın ve iskeleleri PBS ile yıkayın.

Ardından, çelik halkanın içine ve dışına 500 µL hücre kültür ortamı ekleyin ve plakayı bir inkübatörde ön ısıtmaya tabi tutun. Sonrasında, ilgili hücreleri hasat edin ve mililitre başına 1 × 10⁶ hücre içeren bir hücre süspansiyonu hazırlayın. Hücreler hazır olduğunda, kuyucuktaki ortamı uzaklaştırın ve çelik halkanın dışına 1 mL taze ortam ekleyin.

Ardından, çelik halkanın içine 300 µL hücre süspansiyonu ekleyin ve hücrelerin eşit şekilde dağılması için plakayı nazikçe sallayın. Plakayı %5 CO2 içeren 37 °C'lik bir inkübatöre yerleştirin ve hücreleri gerekli süre boyunca inkübe edin. Besiyerini her iki ila üç günde bir yenileyerek hücreleri önceki bölümde açıklandığı şekilde iskelelere ekleyin ve 72 saat boyunca kesintisiz büyümelerine izin verin.

Ardından hücreleri PBS ile durulayın, halkanın dış kısmına 500 microliters serumsuz besiyeri ve halkanın içine 300 microliters ekleyin. Plakayı inkübasyon sırasında 37 degrees Celsius'de bir saat boyunca inkübe edin. Beş milligrams nanosensörü 50 microliters optimum ile ekleyerek ve kısa süreli vorteksleyerek çözelti A'yı hazırlayın.

Ardından, 45 µL Optum'a beş mikrolitre lipectomy 2000 ekleyerek çözelti B'yi hazırlayın ve karışımı oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. Daha sonra, çözelti A'yı çözelti B karışımına ekleyin ve nanosensör lipozom kompleksi olan çözelti C'yi oluşturmak için oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin. Plakayı inkübatörden çıkarın ve çelik halkanın içine 100 µL kompleks çözeltisi ekleyin.

Ardından plakayı tekrar inkübatöre yerleştirin ve hücreleri, inkübasyonu takiben üç saat boyunca lipektomi reaktif kompleksleri ile inkübe edin. Besiyerini aspire edin ve hücrelerin yerleştiği iskale farklı pH değerlerindeki tamponlara daldırarak nanosensörlerin yanıtını izlemeden önce hücreleri ısıtılmış PBS ile iki kez yıkayın. Şimdi hücrelerin içinde, nanosensörlerin memeli hücreler içindeki konumunu takip etmek için floresan konfokal mikroskopi kullanarak hücreleri görüntüleyin.

İlk olarak, yalnızca nanosensör içeren fam'ı hazırlayın ve PLGA iskeleler üzerinde yer alan hücrelere uygulayın. Ardından, 300 µL medyumun içine 2 µL 50 nM LysoTracker Red ekleyin ve inkübasyon süresini takiben 37 °C'de bir saat boyunca inkübe edin. Medyumu uzaklaştırın ve hücreleri PBS ile iki kez yıkayın.

Ardından, konfokal görüntüleme sırasında hücreleri kaplamak için iki µL PBS veya fenol kırmızısı içermeyen başka bir besiyeri ekleyin. Sonra, PBS'ye beş µM nükleer boya olan drac5 ekleyin ve hücrelerle birlikte 37 °C'de üç dakika boyunca inkübe edin. Üç dakika sonra, plakayı inkübatörden çıkarın ve görüntüleme için konfokal sahneye yerleştirin; beraberindeki metin protokolünde açıklandığı üzere, eksitasyon dalga boylarının toplanmasını önlemek için ardışık tarama kullanarak çeşitli eksitasyon ve emisyon dalga boyları ile nanosensörleri, asidik organelleri ve çekirdeği görüntüleyin. Hazırlanan pH duyarlı nanosensörlerin boyut dağılımı SEM kullanılarak karakterize edilmiş olup, görüntülenen nanosensör popülasyonunun ölçümleri yapılmış ve nanometre boyutlarının 240 ile 470 nm arasında olduğu bulunmuştur.

Solda elektro eğirme yöntemiyle üretilmiş PLGA liflerinin bir görüntüsü, sağda ise nanosensör içeren elektro eğirme PLGA lifleri gösterilmektedir. Liflerin SEM mikrografları, nanosensörlerin lif yüzeyine tutunduğuna dair kanıt sağlamaktadır. Bununla birlikte, nanosensörler iskele liflerinin içine de dahil edilmiş olabilirler.

Elektroçeğirme işlemi sonrası nanosensörler, optik ve kimyasal olarak aktif kalma özelliklerini korurlar ve burada iskele lifleri ile ilişkilendirilmiş halde gösterilmiştir. Solda yeşil renkte görülen FAM boyası, sağda ise kırmızı renkte görülen Tamara boyası yer almaktadır. Floresan yoğunluk oranı, burada gösterildiği gibi bir kalibrasyon eğrisi oluşturur.

Tek başına ve elektro eğirme yöntemiyle üretilen PLGA iskelelere entegre edildiğinde değerlendirilen nanosensörler birbirini yansıtmış ve nanosensörlerin iskelelere entegrasyon sonrası optik aktivitelerini koruduklarını göstermiştir. Entegre edilen nanosensörler ayrıca, tampon çözelti pH 5.5 ve 7.5 arasında değiştirildiğinde değişen pH değerlerine tersinir şekilde iyi yanıt vermiştir. Fam Tamra oranı, gösterilen her seferinde öngörüldüğü şekilde yanıt vermiştir.

Burada, transfeksiyon reaktifi aracılığıyla hücre içine nanosensörler aktarılmış fibroblastların konfokal görüntüleri yer almaktadır. Fam ve Tamara boyalarının noktasal kolokalizasyonu, boyaların nanosensör matrisi içinde hapsolmuş halde kaldığını göstermektedir. Nanosensörlerin hücre içine aktarımı, çeşitli tampon çözeltilere yerleştirilen hücrelerin fam/Tamara oranı ölçülerek doğrulanabilir.

Burada görebileceğiniz üzere, iskele tabanlı nanosensörler ölçüldüğünde oran artmakta, ancak hücre içindeki sensörler ölçüldüğünde sabit kalmaktadır. Bu tekniğin geliştirilmesinin ardından, doku mühendisliği alanındaki araştırmacılar, devam eden deneye müdahale etmeden 3D hücresel yapılar içindeki mikroçevresel hücre içi pH değişimlerini in situ ve gerçek zamanlı olarak inceleyebilirler.